KR0162517B1

KR0162517B1 - 재조합 인간 에리스로포이에틴의 정제방법

Info

Publication number: KR0162517B1
Application number: KR1019940032993A
Authority: KR
Inventors: 하병집; 김현수; 오명석; 이동억; 유리안; 김석준; 박완제; 우구
Original assignee: 김정순; 제일제당주식회사
Priority date: 1994-12-06
Filing date: 1994-12-06
Publication date: 1998-11-16
Also published as: KR960023054A

Abstract

본 발명은 블루 세파로스 칼럼, 하이드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼을 이용한 크로마토그래피 법을 이용하여 생물학적 활성을 갖는 인간 EPO를 생산 및 분비할 수 있도록 EPO를 코드화하는 유전자로 형질전환된 세포주의 배양액으로부터 인간 EPO 단백질을 순수하게 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합 인간 에리스로포이에틴 정제방법

제1도는 정제된 에리스로포이에틴을은 염색한 결과를 나타낸 것이다.

제2도는 정제된 에리스로포이에틴의 웨스턴 분석결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 인간 에리스로포이에틴(이하, EPO로 약칭한다)의 정제방법에 관한 것이다.

좀더 구체적으로, 본 발명은 블루 세파로스 칼럼, 하이드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼을 이용한 크로마토그래피 법을 이용하여 생물학적 활성을 갖는 인간 EPO를 생산 및 분비할 수 있도록 EPO를 코드화하는 유전자로 형질전환된 세포주의 배양액으로부터 인간 EPO 단백질을 순수하게 정제하는 방법에 관한 것이다.

EPO는 고등 생물체내에서 적혈구 형성을 자극 하는 순환 당단백질로서 적혈구 형성 자극인자로 불리운다.

인간 적혈구의 수명은 약 120일이므로 전체 적혈구 중 약 1/120이 매일 세망내피 조직계 내에서 파괴되는 동시에 일정 수의 적혈구가 매일 생성되어 건강한 사람은 체내 적혈구의 농도가 거의 일정하게 유지되는데, 이러한 적혈구의 생성은 골수에서 적아구의 성숙 및 분화에 의하여 이루어지며 이때 EPO는 덜 분화된 세포에 작용함으로써 적혈구로의 분화를 유도하는 작용을 한다(참조 : Guyton, Textbook of Medical Physiology, pp 42-50,1986). 따라서, EPO는 빈혈, 특히 신장성 빈혈의 임상적 치료에 유용한 치료제로 이용된다.

치료제로 사용하기 위해 EPO를 수득하는 방법으로서 종래에 제시되어 온 것은 일본 모리나가유업의 방법(참조 : 일본특개소 제 61-200920호)등에서 보여주는 것처럼 혈장이나 뇨에서 부터 EPO를 정제하는 것이었다. 그러나 혈장이나 뇨에서 EPO를 정제하여 수요를 충족하기에는 여러 가지 면에서 한계가 있으며 그 양도 극히 미미할수 밖에 없으므로 이러한 한계를 극복하기 위한 노력이 여러곳에서 시도 되었고 그러한 노력에 의해 유전자 재조합 법으로 EPO를 대량 생산 하는 것이 최근에 가능해졌다.(WO85/02610).

그러나, 유전자 재조합 법에 의해 생산된 EPO 단백질을 인체에 사용하기 위해서는 극히 엄격한 안전성 확인 절차를 거쳐야 하며, 그러기 위해서는 극히 고순 도의 정제 과정이 필요하게 된다. 즉, 재조합 단백질에는 보통 배양액 혹은 기존 세포주로부터 혼입된 DNA나 각종의 이종 단백질이 혼합되어 있으므로 이들을 제거하여 목적 단백질을 고순도로 정제할 필요가 있는 동시에 충분한 정제수율이 확보됨으로써 경제성이 보장되어야만 비로서 산업적으로 이용할 수 있게 되는 것이다.

EPO에 대한 정제방법으로 언급할 수 있는 선행 기술로는 일본 스미또모사(참조 : 일본국 특허 공개 제 1165393호)의 방법이 있는데, 이 방법에서는 이온교환수지, 하이드록시아파타이트, 및 HPLC를 이용한 겔여과 크로마토그래피 법을 순서대로 적용함으로써 EPO를 정제하고 있다. 그러나, 이 방법에서는 비교적 고가의 장비를 사용해야 하고 대량 정제가 까다로운 HPLC을 이용하여야 하므로 산업적 적용이 쉽지 않다.

또한, 세포 배양법에 의해 생산된 재조합 단백질의 정제에서 문제가 되는 것은 사용된 혈청의 제거에 관한 것이다. 근래에는 이와 같이 제거하기 까다로운 혈청이 아예 배제된 무혈청배지를 사용하여 형질전환된 세포를 배양함으로써 정제를 훨씬 간편하게 할 수는 있으나, 무혈청배지를 사용하는 경우에는 배양 중간에 배지를 교환해야 하는 번거로움 및 오염발생 문제 등 그자체의 문제점이 발생하게 되며 특히, 가격이 고가이어서 생산원가에 지대한 영향을 주므로 혈청배지의 사용이 계속 유지되고 있다. 따라서 혈청에 함께 존재하는 이종 단백질인 알부민 등의 제거는 정제과정에서 중요한 문제가 된다.

EPO정제에 관한 지금까지의 기술에 상기한 바와 같은 문제점이 있으므로 본 발명자들은 보다 간편하고 경비가 절감되는 저렴한 방법을 적용하면서도 고순도로 EPO를 정제할수 있는 방법을 확립하고자 노력한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 구성을 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 형질전환된 동물세포주로 부터 생산된 재조합 인간 EPO를 EPO중합체, 엔도톡신, 이종 단백질 및 핵산 등의 불순물이 제거된 순수한 상태로 정제하기 위한 것으로서 블루 세파로스 칼럼, 하이드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼의 순서로 구성된 일련의 크로마토그래피 법을 일정한 조건하에 수행하는 것을 특징으로 한다.

특히, 본 발명에서 첫 번째로 사용한 칼럼에 충진된 블루 세파로스 레진은 일반적으로 정제대상물에서 혈청알부민을 제거하기 위해 사용하는 것으로서 레진 ㎖당 약 10㎎의 혈청알부민을 흡착 시킬 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 이와 같이 레진에 직접 혈청알부민을 흡착시키는 방법으로는 통상3 내지 10%의 혈청이 함유된 혈청배지로 부터 특정 물질을 대량으로 정제할 경우 혈청알부민 양에 따라 레진의 사용량을 늘려야 하는 등의 문제가 발생한다. 따라서, 본 발명자들은 혈청배지에 포함된 알부민 대신 훨씬 적은 양으로 함유되어 있는 EPO를 직접 레진에 흡착시킴으로써 레진 양을 크게 늘리지 않으면서도 알부민을 효과적으로 제거시키는 새로운 방법을 고안하게 되었다. 일반적으로 블루 세파로스 레진을 사용하는 경우, 카탈로그 등에서 제시되는 방법은 완충용액의 pH를 7.0으로 유지하는 것인데, 본 발명자들은 흡착시키는 대상을 달리하여 새로운 효과를 거두고자 노력하는 과정에서 완충용액(예를들어, 트리스-HCI)의 pH를 9.0로 유지시키면 상기한 바와 같은 효과를 달성할 수 있음을 발견하였다. 즉, 블루 세파로스 칼럼은 pH가 높아짐에 따라 일반적으로 단백질의 흡착이 저해되지만 EPO는 흡착이 유지되는 성질을 이용하여 상기의 효과를 얻을 수 있다. 이러한 구성상의 변경은 본 발명에 따라 EPO를 정제함에 있어 커다란 잇점으로 작용하며, 또한 본 발명의 특징이 된다.

본 발명에서 두 번째로 사용한 칼럼은 하이드록시아파타이트 레진이 충진된 것으로서 이 레진은 통상 DNA등 핵산의 제거용으로 많이 사용하고 있는 것이다. 특히, 레진을 평형화시킨 인산 완충용액의 농도가5 내지 10mM이상일때는 EPO 단백질이 레진에 흡착되지 않고 그대로 용출되므로 이종 단백질 및 핵산이 거의 제거된 90%이상의 순도로 EPO를 수득할 수 있으며, 또한 이 과정에서 불완전한 EPO도 제거된다. 따라서, 본 발명에서는 블루 세파로스 칼럼 및 하이드록시아파타이트 칼럼 과정을 통하여 EPO중합체, 엔도톡신 및 핵산물질을 거의 완전히 제거하는 동시에 이종 단백질의 대부분을 제거하여 95%이상의 순도를 확보하며 별다른 처리 없이 곧바로 다음의 이온교환수지 칼럼에 적용함으로써 정제의 단순화, 자동화 등을 도입할 수 있도록 하였다.

마지막으로 EPO 단백질은 이온교환수지 크로마토그래피 법에 적용시킴으로써 99%이상의 순도로 수득하였는데, 최종적으로 수득한 EPO는 단위역가 (specific acticity)가 220단위/㎕이상으로서 인체에 적용하기에 충분한 순도를 지니고 있으며, LAL테스트 결과 엔도톡신의 양도 EPO활성 1만 단위당 1EU이하인 것으로 확인되었다. 정제된 EPO의 은 염색한 결과 및 웨스턴 분석결과는 각각 제1도 및 제2도에 나타내었다.

한편, 본 발명에서 원료 물질로 사용한 조 EPO액으로는 EPO를 코드화하는 유전자에 의해 형질전환된 진핵세포를 소태아 혈청이 5% 포함된 DMEM : F12혼합배지에서 3일간 배양한 배양액 10ℓ를 원심분리(Sorvall, 4,000 rpm, 15분)한 다음 얻어진 상등액을 사용하였는데, 이때 진핵세포로는 CHO(Chinese H-amster Ovary)세포가 바람직하고, 특히 EPO를 코드화하는 유전자에 의해 형질전환되고 이에 따라 기탁이 완료된 CHOEp-cfc33(기탁번호 : KCLRF-BP-00007)를 사용하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에서 용액중의 단백질 함량은 혈청알부민을 표준물질로 하여 브래드포드 방법(참조 : Bradford,M.M. Anal. Biochem. 72, 248-254, 1976)에 따라 측정하며, 정제도는 라에믈리 방법(참조:Laemmli, U. K., Nature 227, 680-683, 1970)에 따라 SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 후 은 염색(Silver staining)하여 확인 한다. 이때 필요하다면, β-머캅토 에탄올이 들어있지 않은 비환원 조건하에서 측정할 수도 있다.

이하, 본 발명의 공정을 하기 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

[블루 세파로스 칼럼에 의한 EPO의 정제]

블루 세파로스(Blue sepharose Pharmacia 사)레진 100㎖를 칼럼에 충진 시킨후, 완충용액(10mM 트리스-HCI, pH9.0+0.002% 트윈 20)0.5ℓ를 사용하여 평형화 시켰다. 조 EPO액 5ℓ를 한외여과막(아미콘사, 분자량 10,000)을 사용하여 5배 농축하였다. 이때, 총 EPO 단백질의 역가는 7,385,000단위이고 단백질은 10520.5㎎이었다. 농축된 액 1ℓ를 칼럼에 통과시킨후, 칼럼은 0.3M NaCI이 함유된 완충용액 0.5ℓ를 사용하여 세척하였다. 용리용액(10mM 소듐 포스페이트+1.0M Naci, pH7.0)210㎖를 사용하여 EPO를 용리시킨후, 다음 정제 단계인 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피를 위해 용출액을 투석막에 넣고 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피의 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH7.0)에서 24시간 동안 평형화시켰다. 용리된 EPO 단백질의 총역가는 6,218,000단위로서 수율이 84.2%인 것으로 계산되었고 단위역가는 9.8단위/㎍으로서 순도가 조 EPO액에 비해 14배 증가하였다.

[실시예 2]

[하이드록시아파타이트 칼럼에 의한 EPO의 정제]

하이드록시아파타이트(Bio Rad 사)50㎖를 칼럼에 충진시킨 후, 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH7.0)300㎖를 사용하여 평형화시켰다. 완충용액으로 평형화된 블루 세파로스 칼럼의 용출용액 210㎖를 칼럼에 통과시켰다. 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH7.0)150㎖를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 이 세척된 분획 즉, 레진에 흡착되지 않고 빠져나온 분획에 EPO 단백질이 함유되어 있으며 EPO의 총역가는 4,415,000단위인 것으로 측정되었으므로 이로 부터 수율은 71%인 것으로 계산되었다. 또한, 단위역가는 101.2단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할 때 순도가 144배 가량 증가된 것이다.

한편, 여기서 모아진 분획은 2,207,000단위씩 둘로 나누어 하기 실시예 3과 4에서 각각 사용하였다.

[실시예 3]

[QAE 세파로스 칼럼에 의한 EPO의 정제]

QAE 세파로스(Pharmacia 사)50㎖를 칼럼에 충진시킨 후, 완충용액(10mM 소듐 포스페이트, pH7.0)300㎖를 사용하여 평형화 시켰다. 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피에서 얻어진 EPO 단백질 함유 분획을 칼럼에 통과 시킨후 40mM의 NaCI이 포함된 완충용액 100㎖를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 세척이 끝난 후, 용리용액(50mM 소듐 포스페이트+200mM NaCI)150㎖를 사용하여 EPO를 용리시켰다. 수득된 EPO는 총 1,655,000단위로서 이로 부터 수율은 75%로 계산되었다. 또한, 단위역가는 218단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할 때 순도가 310배 가량 증가된 것이다.

[실시예 4]

[SP-토요펄 칼럼에 의한 EPO의 정제]

SP-토요펄(토요하스사)50㎖를 칼럼에 충진시킨고 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH5.1)300㎖를 사용하여 칼럼을 평형화 시켰다. 하이드록시아파타이트 칼럼 크로마토그래피에서 얻어진 EPO 단백질 함유 분획을 동일한 완충용액으로 평형화시킨 후 칼럼에 통과 시켰다. 40mM의 NaCI이 포함된 완충용액 100㎖를 사용하여 칼럼을 세척하였다. 세척이 끝난 후, 용리용액(20mM 소듐 시트레이트, pH5.1+200mM NaCI)150㎖를 사용하여 EPO를 용리시켰다. 수득된 EPO는 총 1,611,000단위로서 이로 부터 수율은 73%로 계산되었다. 또한, 단위역가는 244단위/㎍로 측정되었는데, 이는 조 EPO액을 기준으로 할 때 순도가 320배 가량 증가된 것이다.

[실시예 5]

[EPO의 역가 검정]

EPO 단백질의 역가검정은 ELISA(Enzyme Linked Immuno Sorbant A-ssay)방법을 사용하여 다음과 같이 수행하였다.

96웰의 플라스틱 플레이트에 항 EPO 단일클론 항체(1994년 10월 26일자로 서울대학교 의과대학 부설 한국 세포주 연구 재단(Korean Cell Line Research Foundation Director)에 부다페스트 조약하의 기탁을 완료(기탁번호는 KCLRF-BP-00009)한 융합 세포주 cfc-9으로 부터 수득한 것)를 2시간동안 흡착시킨 다음 검정시료를 가하여 2시간 동안 37℃에서 방치하였다. 여기에 항 EPO 토끼항체를 가하고 60분 동안 상온에 방치하였다. 다시 세척한 다음 퍼옥시다제가 표지된 항 토끼 항체(베링거맨하임 사)를 처리하고 발색시약(4-클로로-1-나프톨)을 가하여 색깔을 나타내었다. 표준품으로는 베링거맨하임(Boerin-ger Manheim)사의 EPO를 사용하였다.

[실시예 6]

[정제된 EPO중의 엔도톡신 검출]

최종 정제된 EPO에 엔도톡신이 함유되어 있는지 여부를 LAL(Limulus Amebocyte Lysate)테스트로 확인하기 위해 다음과 같이 실험하였다.

엔도톡신은 LAL에 존재하는 전구효소(proenzyme)의 활성화를 촉매하며 활성화된 효소는 다시 무색의 기질인 Ac-I-E-G-R-pNA로 부터 p-니트로아닐리드를 절단해 내는 작용을 촉매하는데, 이때 활성화의 초기속도는 존재하는 엔도톡신의 농도에 비례하므로 이를 이용하여 엔도톡신의 양을 측정하였다. 즉, 최종 정제된 EPO와 표준시료를 각각 100㎕씩 취하여 37℃로 항온화되고 파이로겐이 없는(pyrogen-free)것으로 확인된 튜브에 넣은 후, 각각의 튜브에 LAL을 100㎕씩 가하고 잘 혼합하였다. 10분 경과후에 다시 기질용액 200㎕를 가하고 잘 혼합하였다. 3분 경화후 50% 초산용액 20㎕를 가하고, 405nm에서 각 튜브의 흡광도를 측정한 후, 표준곡선을 작성하였다. 정제액의 흡광도 값을 표준곡선에 대입하여 엔도톡신의 양을 계산하였다. 검출된 엔도톡신의 양은 1만 단위의 EPO 활성당 1 EU이하로 측정되었다.

Claims

에리스로포이에틴을 함유하는 세포배양액을 블루 세파로스 칼럼, 하이드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼에 연속적으로 통과시킴을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 분리 및 정제 방법.
제1항에 있어서, 세포배양액이 CHOEp-cfc33세포의 배양액임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 이온교환수지 칼럼이 QAE 세파로스 칼럼 및 SP-토요펄 칼럼 중에서 선택되는 방법.