KR100900013B1 - 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법 - Google Patents

유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 (i) 친화성 크로마토그래피, (ii) 히드록시아파타이트 크로마토그래피, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (iv) 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 상기 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법으로서, 상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 단계 중 하나 이상의 단계 후에 얻어진 용액을 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활화하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
에리스로포이에틴, 요소, 바이러스 불활화

Description

유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법{Method of purifying recombinant human erythropoietin from a fluid}
본 발명은 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법 및 바이러스가 불활성화된 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 제조하는 방법을 관한 것이다.
재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법에는 예를 들면, 한국특허 제0162517호 및 제0297927호에 개시된 방법이 알려져 있다. 한국특허 제0162517호에는 에리스로포이에틴을 함유하는 세포 배양액을 블루 세파로즈 칼럼, 히드록시아파타이트 칼럼, 이온교환수지 칼럼에 연속적으로 통과시킴을 특징으로 하는 인간 에리스로포이에틴의 분리 및 정제 방법이 개시되어 있다. 한국특허 제0162517호의 개시 내용은 참조에 의하여 본 명세서에 포함되어 진다.
또한, 바이러스 불활화 방법의 예로서, 미국특허 제5,770,199호, 미국특허공개 제2005/0250935호가 개시되어 있다. 미국특허 제5,770,199호에는 생물학적 제제를 생산하는 방법으로서, (a) 혈장 단백질을 포함하는 용액을 폴리에테르 및 카오트로픽제 (chaotrophic agent)와 접촉시켜 계면활성제 (detergent)를 사용하지 않 고, 물리화학적 또는 화학적 처리에 의하여 오염 감염원을 불활화하는 단계; 및 (b) 상기 폴리에테르 및 카오트로픽제 (chaotrophic agent)를 제거하여 감염제 및 변성 산물이 실질적으로 없는 약제학적 제제를 얻는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다. 미국특허공개 제2005/0250935호에는 출발 용액 (starting solution)을 오염시키는 바이러스 및/또는 프리온을 분배 (partition) 및 불활화하는 방법으로서, 초원심분리 (ultracentrifugation)가 분배 과정에 사용되고, 원심분리 튜브의 바닥에 층을 형성하고 있는 높은 몰 농도의 요소 용액이 상기 불활화 성분으로서 사용되는 방법이 개시되어 있다.
그러나, 상기한 종래 기술에 의하더라도, 보다 효율적인 대안적인 EPO 정제 방법 및 바이러스 불활화 방법이 요구되고 있다.
본 발명의 목적은, 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 효율적으로 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 바이러스가 불활성화된 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 (i) 친화성 크로마토그래피, (ii) 히드록시아파타이트 크로마토그래피, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (iv) 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 상기 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법으로서,
상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 단계 중 하나 이상의 단계 후에 얻어진 용액을 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활화하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 단계 중 하나 이상의 단계 후에 얻어진 용액을 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활화하는 단계를 포함한다.
상기 요소의 농도는 2M 내지 7M인 것일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 요소 처리는 2℃ 내지 24℃에서 수행될 수 있으며, 바람직하게는 2℃ 내지 8℃, 또는 16℃ 내지 24℃에서 수행되는 것이다.
본 발명의 방법은 에리스로포이에틴을 고농도의 요소 예를 들면, 2M 내지 10M, 더욱 바람직하게는 2M 내지 7M의 농도에 접촉시키더라도 변성되지 않고, 바이러스는 불활성화될 수 있다는 것을 이용한 것이다. 상기 바이러스에는 레트로바이러스 또는 파라믹소바이러스가 포함될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 레트로바이러스에는 생쥐 백혈병 바이러스 (MLV : murine leukaemia virus)가 포함되고, 파라믹소바이러스에는 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 (PI3: parainfluennza virus type 3)가 포함된다.
상기 접촉은 pH 3.0 내지 8.0에서 수행되는 것이 바람직하다. 상기 접촉은 예를 들면, 상기 pH 범위의 버퍼, 예를 들면 포스페이트 버퍼 중에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법은, 상기 접촉 단계 후에 요소를 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 제거 단계는 투석일 수 있으며, 이는 상기 접촉 단계에서 얻어지는 용액 중에 존재하는 요소를 제거하기 위한 것이다. 투석 용액으로는 포스페이트 버퍼가 될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다
본 발명의 방법은, 음이온 교환 크로마토그래피를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 바람직하게는, 상기 접촉 단계 후에 수행되는 것이다. 음이온 교환 크로마토그래피에 사용되는 음이온 교환물질에는, DEAE 세파로즈, QAE 세파덱스, Q 세파로즈가 포함된다. 바람직하게는. DEAE 세파로즈이다.
상기 음이온 교환 크로마토그래피는 2M 내지 7M의 요소를 포함하는 pH 3.0 내지 8.0의 버퍼로 음이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 세척은 6 칼럼 부피 이상, 바람직하게는 6 내지 12 칼럼 부피로 세척하는 것이다. 음이온 교환물질에 결합된 에리스로포이에틴의 용출은 10mM 내지 30mM 소듐 포스페이트 버퍼 (pH 7.5 내지 8.5) 및 0.05M 내지 0.2M 소듐 클로라이드를 조합하여 용출함으로써 이루어질 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법은, 또한 나노여과를 수행하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 나노여과는 겔 여과 크로마토그래피 후에 수행되는 것일 수 있다.
상기 나노여과는 상기 겔 여과 크로마토그래피 후에 얻어지는 여과액 (filtrate)을 0.1㎛ 내지 0.45㎛ 여과기로 여과하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 0.2㎛ 여과기 및 0.1㎛ 여과기 (filter)로 이루어진 두 개의 여과기에 순차로 통과시키거나, 0.2㎛ 여과기와 0.1㎛ 여과기가 붙어 있는 0.2㎛+0.1㎛ 여과기 (filter) 에 통과시키는 것일 수 있다. 상기 나노여과는 1 내지 3 bar의 압력에서 수행되는 것일 수 있다.
또한, 상기 나노여과는 10mM 내지 50mM 포스페이트 및 50mM 내지 200mM 소듐클로라이드를 포함하는 pH 6.5 내지 7.5의 버퍼 중에 에리스로포이에틴을 0.5 내지 2mg/ml의 농도로 포함하는 용액을 나노 여과하는 것일 수 있다.
상기 나노 여과는 2℃ 내지 8℃의 저온 또는 16℃ 내지 24℃의 상온에서 수행될 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 염료 (dye) 크로마토그래피인 것일 수 있다. 상기 염료 (dye) 크로마토그래피에는 블루 세파로즈 수지, 레드 세파로즈 수지 또는 엘로우 세파로즈 수지, 예를 들면, Yellow HE-4R, Red HE-3B 등이 포함되며, 바람직하게는 블루 세파로즈 수지를 이용한 크로마토그래피이다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 타입 1 및 타입 2로 이루어지는 2개 타입의 히드록시아파타이트 수지를 사용하는 것일 수 있다. 순서는 타입 1 및 타입 2, 또는 타입 2 및 타입 1의 순서로 진행될 수 있다. 바람직하게는, 타입 2 및 타입 1의 순서로 진행되는 것이다.
상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 pH 6.8 내지 7.8의 5mM 내지 30mM 포스페이트 버퍼로 평형화하고 세척하는 것을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 겔 여과 크로마토그래피에서 겔 물질로는, 세파크릴 S-200TM, S-200 HRTM, S-100TM 등이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 겔 여과 크로마토그래피 전에 시료를 농축하는 과정을 더 포함할 수 있다. 상기 농축에는 접선 흐름 한외여과 (trangential flow ultrafiltration), 원심 한외여과 (centrifugal ultrafiltration), 아미콘 농축 (amicon concentration) 등이 포함되며, 바람직하게는 접선 흐름 한외여과 방법이다.
본 발명의 방법에 있어서, (i) 친화성 크로마토그래피, (ii) 히드록시아파타이트 크로마토그래피, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (iv) 겔 여과 크로마토그래피는 임의의 순서대로 수행될 수 있다. 바람직하게는, (i) 친화성 크로마토 그래피, (ii) 히드록시아파타이트 크로마토그래피, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (iv) 겔 여과 크로마토그래피의 순서대로 수행되는 것이다.
본 발명은 또한, (i) 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 2M 내지 7M의 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및 (ii) 얻어진 용액으로부터 요소를 제거하는 단계;를 포함하는, 바이러스가 불활성화된 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 제조하는 방법을 제공한다.
(i) 단계에서 상기 접촉은 2℃ 내지 8℃에서 수행되는 것일 수 있다. (i) 단계에서 상기 접촉은 1분 내지 4시간 동안 수행되는 것일 수 있다. (i) 단계에서 상기 접촉은 pH 3.0 내지 8.0에서 수행되는 것일 수 있다.
상기 바이러스는 레트로바이러스 또는 파라믹소바이러스일 수 있으나, 여기에 한정되는 것은 아니다. 레트로바이러스에는 생쥐 백혈병 바이러스 (MLV : murine leukaemia virus)가 포함되고, 파라믹소바이러스에는 파라인플루엔자 바이러스 타입 3 (PI3: parainfluennza virus type 3)가 포함된다.
(ii) 단계에서, 상기 요소를 제거하는 것은 투석에 의하여 이루어지는 것일 수 있다. 여기서 제거란 요소의 농도를 낮추는 것을 포함한다. 상기 투석은 pH 6.5 내지 7.5의 5mM 내지 30mm 포스페이트 버퍼로 수행되는 것일 수 있다.
재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체 (fluid)는 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 것이면 어떠한 유체이어도 된다. 예를 들면, 세포 배양액 (예, CHO 세포 배양액), 혈액, 조직, 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 생물학적 시료로부터 부분적으로 또는 완전하게 단리된 유체일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법에 따르면, 유체 중의 바이러스를 안정적으로 불활화하면서 재조합 인간 에리스로포이에틴를 고순도 정제할 수 있다.
본 발명의 바이러스가 불활성화된 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 제조하는 방법에 의하면, 유체 중의 바이러스를 효율적이고 안정적으로 불활화할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 친화성 크로마토그래피 및 투석
블루 세파로즈 수지 (Blue Sepharose resin TM: Pharmacia 사) 100ml를 칼럼에 충진하고, PBS (phosphate buffered saline; pH 7.45)를 300ml를 흘려주어 평형화하였다. 상기 칼럼에 EPO를 포함하는 배양액 300ml를 로딩하였다. 상기 배양액은 EPO를 코딩하는 유전자에 의하여 형질전환된 CHO DG44를 Excel 301 배지 (JRH)에서 3일 동안 배양한 배양액의 0.22㎛ 필터 통과액이다. 여과액 중의 EPO의 비활성은 약 100,000 IU/mg이다. 로딩이 완료되면 2 칼럼 부피 (column volume:CV)의 PBS로 칼럼을 평형화시킨 후, 0.7M NaCl/PBS pH 7.0 버퍼 300ml로 EPO를 용출시켰다. 얻어진 용출액 300ml를 분자량 컷오프 (molecular cutt off) 값이 10,000막에 넣고, 다음 단계인 히드록아파타이트 칼럼 크로마토그래피의 완충용액 (10mM 소듐 포스페이트, pH 6.8)으로 투석하였다. 시료를 RP-HPLC 분석한 결과, EPO의 순도는 66%이었다.
실시예 2: 히드록시아파타이트 크로마토그래피
히드록시아파타이트 타입 2 (Bio Rad 사) 50ml를 칼럼에 충진하고, 이를 히드록시아파타이트 타입 1 (Bio Rad 사) 50ml이 충진된 칼럼 전단에 연결하여, 히드록시아파타이트 타입 2와 타입 1이 순서대로 되도록 칼럼을 연결하였다. 상기 칼럼을 완충용액 (10mM 소듐 포스페이트, pH 6.8)를 사용하여 평형화하였다.
실시예 1에서 얻어진 용출액 300ml를 상기 칼럼에 통과시켰다. 이때 통과된 용액을 용출액 1이라고 한다. 다음으로, 10mM 포스페이트 버퍼 (pH 6.8) 4 칼럼 부피를 상기 칼럼에 통과시키고, 용출되는 용출액 2를 회수하였다. 용출액 1과 2를 혼합하고, 이 혼합액을 0.2 ㎛ 여과기에 통과시켜 여과하였다. 여과액을 RP-HPLC 분석한 결과, 용출된 EPO의 순도는 86%이었다.
실시예 3: 요소 접촉
4℃에서, 실시예 2에서 얻어진 여과액 900ml가 포함되어 있는 5,000ml 유리 용기에 10mM 포스페이트/6M 요소 (pH 6.8) 버퍼를 1:1의 부피로 첨가하고, 교반하면서 혼합하였다. 혼합 용액을 4℃에서, 약 3 시간 동안 교반하며 방치하였다. 다음으로, 상기 혼합액 1,800ml를 분자량 컷오프 (molecular cutt off) 값이 10,000 막에 넣고, 10mM 소듐 포스페이트 (pH 6.8)로 10배 이상 투석하였다. 투석 완료액을 0.2㎛ 여과기에 통과시켜 여과하였다. 여과액 중의 EPO의 비활성은 100,000IU/mg 이상이었고, 이는 유럽에서 제시하고 있는 100,000IU/mg을 만족시키는 값이다. 여과액을 RP-HPLC 분석한 결과, 용출된 EPO의 순도는 96.7%이었다. 따라서, 요소와의 접촉에 의하여 EPO는 변성되지 않는 것으로 확인되었다. 용출 전후 RP-HPLC의 분석 패턴이 동일하였으며, 역가의 경우 요소 처리 전과 후 모두 100,000IU/mg 이상으로 활성의 차이가 거의 없음을 확인하였다.
또한, 본 실시예에서는 요소와의 접촉에 의하여 바이러스를 불활화시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, MLV와 PI3를 출발 물질에 첨가하고 (spike), 요소와 접촉하는 시간별로 시료를 채취하였다. 채취된 시료에 대하여 바이러스 역가를 확인하였다. 바이러스 역가의 분석은 세포 감염용량 (TCIC50) 법으로 확인하였다. TCID50 측정은 ICH 5Qa에 기재된 바와 같이 플레이트 법 (plate method)으로 실행하여 포와송 (poisson) 분포로 계산하였다. 엔벨로프가 없는 바이러스인 MMV와 REO3는 요소에 의하여 거의 불활화되지 않는 것이 예비 시험에 의하여 판명되어, 이들 바이러스는 실험에서 제외하였다.
TCID50 법에 의한 분석 결과, MLV와 PI3의 바이러스 감소 인자 (log10)는 다음과 같다. 표 1의 결과는, 3시간 접촉 후의 시료에 대한 결과이며, 2회 반복실험한 결과이다.
표 1.
바이러스 바이러스 감소 인자 (virus reduction factor) (log10)
1회 2회
MLV >4.5 >4.0
PI3 >7.0 >7.0
실시예 4: 음이온 교환 크로마토그래피
실시예 3에서 얻어진 요소와 접촉되고, 투석 및 여과된 용액을 10mM Tris-HCl/20mM NaCl (pH 7.0) 버퍼로 평형화된 DEAE 세파로즈 칼럼에 로딩하였다.
다음으로, 10mM Tris-HCl/20mM NaCl (pH 7.0) 버퍼를 2.5 칼럼 부피를 흘려주어 재평형화시키고, 50mM 아세트산/1mM 글리신/6M 요소 버퍼 (pH 4.4)를 9 칼럼 부피를 흘려주어 세척하였다. 20mM 소듐 포스페이트 버퍼/15mM NaCl (pH 6.5) 버퍼를 9 칼럼 부피로 흘려주어 2차 세척하였다. 2차 세척 후, 20mM 소듐 포스페이트 버퍼/70 mM NaCl 버퍼 (pH 8.0)로 인간 에리스로포이에틴을 용출하였다. 여과액을 RP-HPLC 분석한 결과, 용출된 용출액 EPO의 순도는 99%이었다.
또한, 본 실시예에서는 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 바이러스를 불활화시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, MLV, PI3, MMV, 및 REO3를 출발 물질에 첨가하고 (spike), 음이온 교환 크로마토그래피의 각 단계에서 시료를 채취하였다. 채취된 시료에 대하여 바이러스 역가를 확인하였다. 바이러스 역가의 분석은, MMV, 및 REO3은 세포 감염용량 (TCID50) 법으로 확인하고, MLV과 PI3는 정량 중합효소연쇄반응 (qPCR) 법으로 확인하였다.
TCID50 측정은 ICH 5Qa에 기재된 바와 같이 플레이트 법 (plate method)으로 실행하여 포와송 (poisson) 분포로 계산하였다. qPCR의 경우에는 내부 TaqManTM 프 로브를 이용하여, 리포터 염료와 형광흡수 분자 (quencher molecule)가 표지된 것을 사용하였다.
TCID50 법에 의한 분석 결과, MMV 및 REO의 바이러스 감소 인자 (log10)는 다음과 같다. 표 2의 결과는, 용출액에 대한 결과이며, 2회 반복실험한 결과이다.
표 2.
바이러스 바이러스 감소 인자 (virus reduction factor) (log10)
1회 2회
MMV >2.5 >2.5
REO >7.0 >8.0
qPCR 법에 의한 분석 결과, MLV 및 PI3의 바이러스 감소 인자 (log10)는 다음과 같다. 표 3의 결과는, 용출액에 대한 결과이며, 2회 반복실험한 결과이다.
표 3.
바이러스 바이러스 감소 인자 (virus reduction factor) (log10)
1회 2회
MLV >5.0 >5.0
PI3 >3.0 >3.0
실시예 5: 겔 여과 크로마토그래피
실시예 4에서 음이온 교환 크로마토그래피에 의하여 용출된 용출액 600ml를 인간 에리스로포이에틴 농도가 0.5 내지 20mg/ml이 되도록 접선 흐름 한외여과 방법에 의하여 농축하였다.
농축액을 20 mM 포스페이트/0.1M NaCl (pH 7.0) 버퍼로 평형화된 Sephacryl S-200 TM 컬럼 (GE, 미국)에 적용하고, 주 피크 (main peak)에 해당하는 용출액을 모았다.
용출액 중의 EPO의 비활성은 약 150,000IU/mg이며, 여과액을 RP-HPLC 분석한 결과, 용출된 EPO의 순도는 99.9%이었다.
실시예 6: 나노여과
실시예 5에서 겔 여과 크로마토그래피에 의하여 용출된 용출액 중의 인간 에리스로포이에틴의 농도를 20mM 포스페이트/0.1M NaCl (pH 7.0)를 사용하여 약 1 내지 1.5mg/ml로 맞춘 후, 0.2+0.1㎛ 여과기와 Sartorius CPV가 장착된 나노 여과 시스템에 용액을 채웠다. 압력이 2 bar가 되면, 나노 여과를 진행하였으며, 여과기를 통과한 여과액을 멸균 용기에 담았다. 이때 압력은 3 bar가 넘지 않도록 하였다.
또한, 본 실시예에서는 나노여과에 의하여 바이러스를 불활화시킬 수 있는지를 확인하기 위하여, MLV, PI3, MMV, 및 REO3를 출발 물질에 첨가하고 (spike), 나노여과의 각 단계에서 시료를 채취하였다. 채취된 시료에 대하여 바이러스 역가를 확인하였다. 바이러스 역가의 분석은, MLV, PI3, MMV, 및 REO3 모두 세포 감염용량 (TCIC50) 법으로 확인하였다. TCID50 측정은 ICH 5Qa 인 비트로 (in vitro) 검사 방법에 기재된 바와 대로 사람 바이러스 및 관련 동물 바이러스를 광범위하게 검출할 수 있는 감수성 세포에 검사물질을 접종하여 세포병변 (cytopathy) 현상을 확인하는 방법을 사용하였다. 실험은 플레이트 법 (plate method)으로 실행하여 포와송 (poisson) 분포로 계산하였다.
TCID50 법에 의한 분석 결과, MLV, PI3, MMV, 및 REO3의 바이러스 감소 인자 (log10)는 다음과 같다. 표 4의 결과는, 나노 여과 후 얻어지는 여과액에 대한 결 과이며, 2회 반복실험한 결과이다.
표 4.
바이러스 바이러스 감소 인자 (virus reduction factor) (log10)
1회 2회
MMV >6.0 >6.0
REO >6.0 >6.0
MLV >5.5 >6.0
PI3 >7.0 >7.0
나노여과 후, 최종적으로 얻어진 여과액에 대하여 역가시험 (normocythamic mice)을 한 결과, EPO의 비활성은 149,000 IU/mg으로, SE-HPLC 및 RP-HPLC의 결과가 EPO 단일 피크의 순도가 99.8%이었다. 따라서, EPO의 비활성은 유럽 약전의 기준 100,000 IU/mg을 초과하는 것으로 확인되었다.
도 1은 본 발명의 방법의 일 구체예로서, 실시예에 기재된 공정에 따른 정제 흐름도를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 6에 따라 얻어진 EPO 용액을 SE-HPLC한 결과를 나타내는 도면이다.
도 1은 본 발명의 방법의 일 구체예로서, 실시예에 기재된 공정에 따른 정제 흐름도를 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1 내지 6에 따라 얻어진 EPO 용액을 SE-HPLC한 결과를 나타나내는 도면이다.

Claims (18)

  1. 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 (i) 친화성 크로마토그래피, (ii) 히드록시아파타이트 크로마토그래피, (iii) 음이온 교환 크로마토그래피, 및 (iv) 겔 여과 크로마토그래피를 수행하는 단계를 포함하는, 상기 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법으로서,
    상기 (i), (ii), (iii) 및 (iv) 단계 중 하나 이상의 단계 후에 얻어진 용액을 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활화하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 요소의 농도는 2M 내지 7M인 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접촉은 2℃ 내지 8℃에서 수행되는 것인 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 접촉 단계 후에 투석하는 단계를 더 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 접촉은 pH 3.0 내지 8.0에서 수행하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 음이온 교환 크로마토그래피는 2M 내지 7M의 요소를 포함하는 pH 3.0 내지 8.0의 버퍼로 음이온 교환 물질을 세척하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 나노여과를 수행하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 나노여과는 겔 여과 크로마토그래피 후에 수행되는 것인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 나노여과 후에 얻어지는 여과액 (filtrate)을 0.2㎛ 여과기 및 0.1㎛ 여과기 (filter)로 이루어진 두 개의 여과기에 순차로 통과시키거나, 0.2㎛+0.1㎛ 여과기 (filter)에 통과시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 나노여과는 10mM 내지 50mM 포스페이트 및 50mM 내지 200mM 소듐클로라이드를 포함하는 pH 6.5 내지 7.5의 버퍼 중에 에리스로포이에틴을 0.5 내지 2mg/ml의 농도로 포함하는 용액을 나노 여과하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 친화성 크로마토그래피는 염료 (dye) 크로마토그래피인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 타입 1 및 타입 2로 이루어지는 2개 타입의 히드록시아파타이트 수지를 사용하는 것인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 pH 6.8 내지 7.8의 5mM 내지 30mM 포스페이트 버퍼로 평형화하고 세척하는 것을 포함하는 것인 방법.
  14. (i) 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 2M 내지 7M의 요소와 접촉시켜, 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및
    (ii) 얻어진 용액으로부터 요소를 제거하는 단계;를 포함하는, 바이러스가 불활성화된 재조합 인간 에리스로포이에틴을 포함하는 유체를 제조하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, (i) 단계에서 상기 접촉은 2℃ 내지 8℃에서 수행되는 것인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, (i) 단계에서 상기 접촉은 1분 내지 4시간 동안 수행되는 것인 방법.
  17. 제14항에 있어서, (ii) 단계는 투석인 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 투석은 pH 6.5 내지 7.5의 5mM 내지 30mM 포스페이트 버퍼로 수행되는 것인 방법.
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