CN116855461A - 一种呼肠孤病毒3型的纯化方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种呼肠孤病毒3型的纯化方法及应用，该方法包括如下步骤：S1、将含Reo‑3病毒的上清液通过0.1μmPES滤膜过滤；S2、过滤后的上清液用中空纤维柱切向流浓缩，浓缩液加入全能核酸酶消化；消化后的浓缩液用层析平衡缓冲液进行洗滤置换；中空纤维柱为300‑500KD，切向流的工艺参数为跨膜压为2‑4psi，浓缩倍数为5‑10倍，核酸酶活性60‑80U/ml，洗滤换液体积为浓缩液总体积的2‑10倍；S3、将CaptoQimpres强阴离子填料装入层析柱，控制置换后的病毒上清液进入层析填料的线性流速为30‑70cm/min，然后经线性洗脱得到高纯度的Reo‑3病毒液。

Description

一种呼肠孤病毒3型的纯化方法及应用

技术领域

本发明涉及病毒纯化技术领域，特别涉及一种呼肠孤病毒3型的纯化方法及应用。

背景技术

随着生物科技的发展，单克隆抗体和重组蛋白类等生物制品，以靶向性强，副作用小且疗效显著等特点，也成为生物医药行业发展的重要方向。这些生物制品通常是源于微生物、细胞、动物或人源组织和体液等活体，如使用CHO细胞来作为蛋白表达生产系统，生物制品在多个环节都有可能产生病毒污染的风险，产品若受到病毒污染，对患者将造成重大的伤害。因此，国内外的相关法规都要求生物制品在生产过程中应包含至少一步或多步具备灭活/去除病毒能力的生产工艺步骤，以确保无论是用于临床试验患者，还是推向市场的产品，均不会出现病毒污染的情况。病毒清除/灭活验证研究是通过添加指示病毒来评估纯化工艺中各个步骤清除/灭活病毒的能力。呼肠孤病毒3型(reovirus type 3,reo-3)是一种常用的指示病毒，是呼肠孤病毒科的正呼肠孤病毒属的代表株，是一种非包膜双链RNA病毒，大小为60-80nm，是CHO细胞中内源性病毒样颗粒以及其他囊膜病毒的模型病毒。

同时已有报道表明呼肠孤病毒在缺氧TME中能够维持其复制和溶瘤能力，呼肠孤病毒3型Dearing毒株，已在KRAS激活的恶性肿瘤中显示出强大的细胞毒性；其与化学疗法、放射疗法和免疫疗法的组合已在各种临床试验中得到评估。

无论是在病毒清除灭活工艺验证领域，还是在溶瘤领域，都需要制备大量高纯度的Reo-3病毒，传统的病毒纯化方式无论是超速离心，密度梯度离心，超滤等方式都耗时较长，处理量较小，无法进行大规模制备；传统工艺使用的分子筛层析填料，层析填料需求往往达到上样体积的25～100倍，层析填料需求大，生产成本较高且上样量小，流速慢，容易对病毒造成挤压，使病毒活性丧失；目前现有的复合层析填料，如Core700，Reo-3病毒往往在流穿峰与洗脱峰中均含有目标病毒，不易分离且导致病毒损失大收率低等问题。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种Reo-3病毒纯化方法，旨在解决此病毒生产量小、生产成本高、易失活、纯度低、收率低等技术问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种呼肠孤病毒3型的纯化方法，该方法包括如下步骤：

S1、将含Reo-3病毒的上清液通过0.1μm PES滤膜过滤；

S2、过滤后的上清液用中空纤维柱切向流浓缩，浓缩液加入全能核酸酶消化；消化后的浓缩液用层析平衡缓冲液进行洗滤置换；

中空纤维柱为300-500KD，切向流的工艺参数为跨膜压为2-4psi，浓缩倍数为5-10倍，核酸酶活性60-80U/ml，洗滤换液为2-10倍；

S3、将Capto Q impres强阴离子填料装入层析柱，控制置换后的病毒上清液进入层析填料的线性流速为30-70cm/min，然后经线性洗脱得到高纯度的Reo-3病毒液。线性洗脱，收集洗脱后溶液变为黄色后的最后一个峰，产品冻存于-80℃或液氮中。

本发明中，超滤使用中空纤维柱，用切向流工艺浓缩病毒；层析采用强阴离子层析，利用带正电的电荷基团，平衡液平衡后，与平衡缓冲溶液中带负电的平衡离子相结合。待分离溶液中可能有正电基团、负电基团与中性基团。加样后，负电基团可以与平衡离子进行可逆得置换反应，而结合到离子交换剂上，而正电基团与中性基团则不能与离子交换剂结合，随流动相流出而被去除。

本方法通过使用中空纤维柱进行切向流浓缩，可以快速将大体积上清液缩小至2-10倍，通过一步阴离子层析，即可得到纯度相对较高的病毒液。

作为优选，S1中，所述含Reo-3病毒的上清液的制备方法：经Reo-3病毒感染BHK-21细胞后收集的细胞与上清液，经反复冻融，离心去除细胞碎片后得到上清液。本发明中Reo-3细胞培养液可以采用本领域的常规方法获得。

作为优选，S3中，置换是在300-500KD的中空纤维柱中切向流置换，跨膜压为1-2psi，置换体积为2-10倍浓缩液体积。

作为优选，其特征在于：层析填料为Cytiva的Capto Q impres填料。该型号填料具备良好的流速操作范围，高通量同时具备良好的分辨率。

作为优选，层析平衡缓冲液为pH 6-8、浓度为0-50mM的含氯化钠的磷酸盐缓冲液。

作为优选，S3置换后的病毒上清液的上样体积与所述层析填料的体积比不超过3:1。

作为优选，S3洗脱采用的洗脱缓冲液为pH 6-8，浓度为20-50mM的含0.6-0.9M氯化钠的磷酸盐缓冲液，洗脱溶液体积为10-20个柱体积。

一种本发明所述的呼肠孤病毒3型的纯化方法在溶瘤、病毒清除灭活中的应用。已发现未经基因修饰的非致病性的呼肠孤病毒，可克服中和抗体作用，通过激活人体自身免疫系统，选择性地感染和摧毁肿瘤细胞，用于治疗多种实体瘤和血液恶性肿瘤，呼肠孤病毒药物大规模生产应用；抗体纯化工艺验证中病毒清除灭活实验，需要Reo-3病毒进行纳滤层析实验，进行工艺的评估。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明的纯化方法综合采用了切向流超滤浓缩法，切向流反复洗滤法，核酸酶消化法，阴离子层析法等一系列工艺，最大限度保证了Reo-3病毒的收率，纯度，大大降低了生产成本。

2、本发明较目前的现有工艺生产的病毒，具有均一性好，损失少回收率高，纯净度高等特点，同时，本发明操作简便，成本低廉，应用范围广，具有突出的大规模化生产应用前景。

附图说明

图1是本发明所述纯化方法的流程示意图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。

实施例所用仪器如下：

切向流系统：Repligen，KR2i超滤系统，

中空纤维柱：Repligen，S02-E750-05N，

层析设备：Cytiva，AKTAavant，

层析柱：Cytiva，16mm*200mm。

实施例所用试剂如下：

Benzonase Nuclease全能核酸酶，购自普健生物(武汉)科技有限公司。

实施例1：

一种呼肠孤病毒3型的纯化方法，具体步骤是：

②上清处理：Reo-3病毒感染BHK-21细胞后，48-72h后，细胞病变80％以上时收取上清液与细胞，4000rpm离心10分钟，收集上清放入2-8℃冰箱中暂存，细胞沉淀放入-80℃或液氮中冻存，待样品完成冰冻后，取出方法37℃水浴锅中水浴融解，重复两次，4000rpm离心10分钟，收集上清，将培养液上清和细胞冻融后上清经0.1μmPES滤膜过滤。

②超滤浓缩：切向流设备装入500KD的中空纤维柱，清洗切向流设备，设置跨膜压为2psi，上样体积为600mL，体积浓缩5倍，加入终浓度为50U/mL的全能核酸酶，室温消化1.5h。

③超滤置换：将消化后的浓缩液经装有500KD中空纤维柱的切向流设备换液，换液体积为500mL。

④层析准备：使用16mm*200mm层析柱，装柱体积30ml，使用5倍柱体积的25mM的磷酸盐缓冲液预平衡层析柱。

⑤层析上样：使用线性流速为50cm/min进行上样，上样100mL，使用25mM的磷酸盐缓冲液上样至UV不再下降。

⑥洗脱：使用10倍柱体积，含有1M氯化钠的25mM的磷酸盐缓冲液进行线性洗脱，收集最后一个洗脱峰。

⑦滴度检测：使用BHK-21作为检测细胞，应用TCID₅₀方法进行滴度检测，按Reed-Muench法计算检测病毒滴度。

⑧最终纯化后的Reo-3病毒滴度为8.35LgTCID₅₀/0.1mL。

实施例2：

一种呼肠孤病毒3型的纯化方法，该方法与实施例1相同，不同之处是：

400mL病毒上清进行切向流浓缩，浓缩至100mL，层析上样后，收集32mL病毒液，初始病毒上清滴度为7.5LgTCID₅₀/0.1mL，层析后滴度7.20LgTCID₅₀/0.1mL。

计算结果如下：

病毒回收率＝(10^8.35*32)/(10^7.50*400)*100％＝54.87％，

切向流浓缩步骤蛋白去除率＝1-96000/396000＝75.76％，

层析步骤蛋白去除率＝1-5792/96000＝93.97％，

整体纯化步骤蛋白去除率＝1-5792/396000＝98.54％。

实施例3：

一种呼肠孤病毒3型的纯化方法，该方法与实施例1相同，不同之处是：

上样层析柱规格为Cytiva的Capto Q impres 5mL预装柱，层析上样体积为5mL，最终回收10mL。

层析前病毒滴度7.62LgTCID₅₀/0.1mL，层析后滴度7.20LgTCID₅₀/0.1mL。

病毒回收率＝(10^7.20*10)/(10^7.62*5)*100％＝76.04％。

应用例

实施例1所得呼肠孤病毒3型在病毒清除验证-纳米膜过滤实验中，使用Pegasus.SV40型号纳滤膜，按照总体积0.5％加入纯化后的病毒，施加3.0bar压力进行纳米膜过滤，加入病毒和未加入病毒样品过滤速度无明显差异。过滤速度见表1。

表1

综上，本发明的呼肠孤病毒3型纯化方法，与传统工艺相比，本发明采用中空纤维柱浓缩及洗滤，核酸酶消化处理，阴离子层析纯化，因本发明采用纤维管状中控纤维柱进行切向流过滤浓缩及洗滤换液，使病毒的上清处理体积可以达到生产级别要求，且本发明参数，剪切力较低条件温和，可有效保证病毒完整性，防止病毒聚集并完成病毒部分除杂；浓缩后进行核酸酶消化，节约生产成本，并使上清中核酸有效去除，降低上清的粘度，提高层析上样流速；层析采用的阴离子梯度洗脱层析，上样量可达到柱体积的4-5倍，且梯度洗脱病毒纯度达到90％以上，收率达到95％。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

以上对本发明所提供的一种呼肠孤病毒3型的纯化方法及应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种呼肠孤病毒3型的纯化方法，其特征在于该方法包括如下步骤：

S1、将含Reo-3病毒的上清液通过0.1μmPES滤膜过滤；

S2、过滤后的上清液用中空纤维柱切向流浓缩，浓缩液加入全能核酸酶消化；消化后的浓缩液用层析平衡缓冲液进行洗滤置换；

中空纤维柱为300-500KD，切向流的工艺参数为跨膜压为2-4psi，浓缩倍数为5-10倍，核酸酶活性60-80U/ml，洗滤换液体积为浓缩液总体积的2-10倍；

S3、将CaptoQimpres强阴离子填料装入层析柱，控制置换后的病毒上清液进入层析填料的线性流速为30-70cm/min，然后经线性洗脱得到高纯度的Reo-3病毒液。

2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：S1中，所述含Reo-3病毒的上清液的制备方法：经Reo-3病毒感染BHK-21细胞后收集的细胞与上清液，经反复冻融，离心去除细胞碎片后得到上清液。

3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：S3中，置换是在300-500KD的中空纤维柱中切向流洗滤换液，跨膜压为1-2psi，洗滤换液体积为2-10倍浓缩液体积。

4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：层析填料为Cytiva的CaptoQ impres填料。

5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：层析平衡缓冲液为pH6-8、浓度为0-50mM的含氯化钠的磷酸盐缓冲液。

6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：S3置换后的病毒上清液的上样体积与所述层析填料的体积比不超过3:1。

7.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于：S3洗脱采用的洗脱缓冲液为pH6-8，浓度为20-50mM的含0.6-0.9M氯化钠的磷酸盐缓冲液，洗脱溶液体积为10-20个柱体积。

8.一种权利要求1所述的呼肠孤病毒3型的纯化方法在在溶瘤、病毒清除灭活中的应用。