CN110904276A - 噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用。本发明以噬菌体作为病毒清除工艺验证中的指示病毒，具有指示病毒体积小、滴度高，纯化简单，进行添加少量即可符合生物制品验证法规的检测要求，节省实验材料，并且检测时间短，从而可以加快工艺验证速度，节省经济成本和人力成本。
Description
技术领域
本发明属于生物制品安全性领域，具体涉及噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用。
背景技术
目前，国内外生物药领域申报上市前必须经过病毒去除\灭活工艺验证，来源于细胞培养等来源的生物制品具有病毒污染的危险性，这种污染会在临床中导致严重后果，污染可能来源于原细胞系本身，也可能来自生产过程中偶然带入的外源病毒，为了保证生物技术制品的安全，需要在生产过程中对病毒进行消除和灭活以降低每剂量单位中的病毒样颗粒含量至10-6《ICH Q5A(R1)中附录5评定病毒检测结果的统计学问题》，在《生物组织提取制品和真核细胞表达制品的病毒安全性评价技术审评一般原则》中要求将病毒感染性滴度减少≥4log的处理步骤为有效的工艺步骤。
目前，病毒清除工艺所使用的指示病毒类型基本上包括X-MuLV(鼠白血病病毒)、PRV(伪狂犬病毒)、MVM(鼠细小病毒)、Reo-3(呼肠孤病毒3型)，这些病毒分别代表着病毒的不同种类、大小、抗性。
现有的生物安全二级实验室内，病毒扩增受限于病毒感染的局限性(依托于细胞感染，单位体积内的细胞数量恒定，导致病毒扩增的数目恒定)，病毒的滴度普遍不高，最高达到107PFU/mL，再经过纯化浓缩最高可达108PFU/mL，并且，纯化浓缩一般需要超高速离心及层析步骤，此项步骤仪器成本高，时间长，人员实验操作技能要求高。因此，目前培养这些病毒并纯化病毒、提高病毒滴度需要大量的时间及经济成本。
另外，目前使用的这些指示病毒的检测时间一般需要7天～21天，从而使得生物制品注册申报时间较长。
发明内容
本发明的一个目的是将噬菌体应用于生物制品病毒清除工艺验证中，从而节省时间及经济成本。
为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：
噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用。
进一步地，所述的噬菌体作为病毒清除工艺验证中的指示病毒。
优选地，所述的噬菌体的滴度≥1013PFU/mL。
优选地，所述的噬菌体为经过培养纯化后的噬菌体MS2。
进一步优选地，所述的噬菌体是以美国典型培养物保藏中心的ATCC 15597-B1的噬菌体MS2，采用美国典型培养物保藏中心的ATCC 13706的大肠埃希菌作为宿主细菌进行扩增培养，然后经纯化得到。
本发明中，所述的病毒清除工艺包括微滤、超滤、纳滤、柱层析。
优选地，所述的噬菌体与所述的生物制品的添加体积比为1:1000～10000。
优选地，所述的噬菌体的滴度采用双层琼脂平板法测定。
噬菌体体积小，滴度高，特别是MS2噬菌体是一种特殊的小RNA病毒，只感染细菌作为宿主，具有体积小(26nm)，滴度高(纯化前粗品可达1012PFU/mL)，纯化简单(超声破碎，核酸酶处理，分子筛纯化)，最终滴度可达1014PFU/mL及以上，在生物制品病毒清除实验中，MS2噬菌体作为指示病毒添加少量至样品中可以减少病毒本身在工艺过程中对工艺验证的干扰，并且可以控制噬菌体MS2的聚集情况，在工艺完成后直接快速测定MS2的滴度，并且，在清除工艺良好的情况下，MS2噬菌体添加少量即可达到清除效率6～8log病毒滴度降低量(LRV，以下简称LRV)值的结果，满足生物制品验证法规的检测要求前提下大大提高LRV的值，法规要求LRV≥4log，在本试验方法内LRV值≥6log，提高了生物药病毒去除安全性的要求，另外缩短了检测时间(其他病毒检测时间为7天～21天，本方法检测时间为1天)及节省了大量的实验材料，达到工艺验证快速推进的效果，节省经济成本和人力成本，加快生物制品注册申报的进度。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优势：
本发明以噬菌体作为病毒清除工艺验证中的指示病毒，具有指示病毒体积小、滴度高，纯化简单，进行添加少量即可符合生物制品验证法规的检测要求，节省实验材料，并且检测时间短，从而可以加快工艺验证速度，节省经济成本和人力成本。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明的基本原理、主要特征和优点，而本发明不受以下实施例的限制。实施例中采用的实施条件可以根据具体要求做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
实施例1、纯化噬菌体MS2的制备
从ATCC(美国典型培养物保藏中心)购进噬菌体MS2(ATCC 15597-B1)以及宿主细菌：大肠埃希菌(ATCC 13706)，经过细菌建库后得到主代、工作库大肠埃希菌，在此基础上进行噬菌体扩增，具体步骤如下：1.在预先配置好的LB培养液中加入工作库大肠埃希菌进行培养16～24小时；2.将MS2原液与培养好的大肠埃希菌1：3均匀混合，静置15分钟感染；3.将混合液接至LB培养液中，于摇床震荡培养37℃、200RPM、6小时；4.加入诱导剂(IPTG，1mM)37℃、200RPM、18～24小时；5.4℃离心、4000RPM、5分钟，弃去上清，收集细菌；6.按照1：20比例加入PBS缓冲液，超声(300W、工作时间10s、间隔10s、循环40次)；7.将超声裂解后溶液中加入Benzonase核酸酶室温孵育30分钟；8.4℃离心、6000RPM、10分钟，去除细胞碎片；9.将上述样品用0.22μm滤器过滤上清液；9.将PBS缓冲液预处理的分子筛装柱，MS2上清过分子筛；10.PBS缓冲液洗掉杂质，10mM NaCl洗脱MS2；11.收集洗脱液得到纯化MS2溶液。
将得到的纯化MS2溶液进行双层琼脂平板法(测定时间一天)测定噬菌体滴度。双层琼脂平板法测定MS2滴度操作规程如下：1.将大肠埃希菌加入LB培养基中进行培养16～24小时；2.将含MS2噬菌体的样品100μL与上述培养好的大肠埃希菌菌悬液300μL均匀混合；3.将上述混合液0.2mL加入冷却至45℃的0.9％琼脂培养基10ml中，将其倒入已经配制好下层1.2％琼脂的培养板中，待其完全凝固；4.放入30℃恒温培养箱中培养16～24小时观察结果。
经测定，纯化MS2的滴度为1014PFU/mL。
实施例2、纳滤去除牛血清白蛋白(BSA)中的MS2噬菌体的病毒去除验证工艺。
1、以市售的BSA标准溶液(0.48mg/ml)为样品，取250ml，经过0.22um的滤器过滤去除杂质。
2、按照1：1000的比例取0.25ml的纯化MS2溶液(滴度1014PFU/ml)，加入到上述BSA溶液中，充分混匀后取样。
3、取Millipore公司生产的纳米膜(型号：Viresolve NFP)，表面积为3.5cm2，经过润湿，加压测试膜完整性后，装在纳米膜过滤器上。
4、将上述混有MS2的BSA溶液按照2psi的压力进行纳米膜过滤。
5、在过滤50mL、100mL、150mL、200mL、250mL时间点及MS2原液分别进行取样。
6、将前一天已经制好的双层琼脂平板取出，并将上述样品进行10倍数的系列稀释，将稀释好的样品加入到双层琼脂平板中，具体方法同实施例1。
7、第二天观察结果，得到上样前的样品中MS2滴度为1010.5PFU/mL；病毒原液为1014PFU/mL；50mL、100mL、150mL、200mL、250mL时间点中均未检测出MS2滴度。
由此可知在本次纳滤工艺验证过程中，MS2的去除效果LRV达到10log，远远超过了指导原则的要求的4log，提高了对生物制品的安全性的要求。
实施例3、DEAE阴离子交换树脂去除牛血清白蛋白(BSA)中的MS2噬菌体的病毒去除验证工艺。
1、装柱
取沉降后的DEAE树脂12mL加入到有机玻璃层析柱中，并组装至AKTA蛋白纯化系统，用50mL去离子水进行冲洗至平衡。
2、填料清洗
用50mL的0.5M NaOH溶液以1.0mL/min的速度清洗柱子。
3、离子交换层析平衡
用120mL平衡缓冲液以2.0mL/min的流速平衡层析柱，A280基线平稳后，将UV值置零。
4、上样
取100mL市售的BSA标准溶液(0.48mg/mL)，按1：10000的比例加入纯化MS2溶液，混匀后取样标记为待检样品1，将剩余样品以2.0mL/min流速进行上样。当UV值开始上升时，开始收集流穿液。
5、冲洗
上样结束后，用60mL的平衡缓冲液以2.0mL/min流速进行冲洗柱子，当UV值开始下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的流穿液为待检样品2。
6、洗脱
用50mL洗脱液以2.0mL/min流速进行洗脱，当UV值开始上升时开始收集洗脱液，等UV值下降至趋于平缓时结束收集，此时收集的洗脱液为待检样品3。
7、清洗
用50mL去离子水以2.0mL/min流速清洗柱子，然后用50mL 0.5M NaOH溶液以1.0mL/min的速度清洗柱子，再用120mL去离子水以2.0mL/min流速清洗柱子，最后用25mL20％乙醇保存层析柱。
8、检测
将上述待检样品1至3分别进行10倍数的系列稀释，将稀释好的样品加入到前一天已制好的双层琼脂平板中进行检测。具体方法同实施例1。
9、观察结果
待检样品1中MS2滴度为109PFU/mL，待检样品2中MS2的滴度为106PFU/mL，待检样品3中MS2的滴度未检出。由此可知，本次层析验证工艺中MS2的LRV值为8log，超过了指导原则的要求的4log，保证了工艺的生物安全性的要求。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.噬菌体在生物制品病毒清除工艺验证中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体作为病毒清除工艺验证中的指示病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体的滴度≥1013PFU/mL。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体为经过培养纯化后的噬菌体MS2。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体是以美国典型培养物保藏中心的ATCC 15597-B1的噬菌体MS2，采用美国典型培养物保藏中心的ATCC 13706的大肠埃希菌作为宿主细菌进行扩增培养，然后经纯化得到。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的病毒清除工艺包括微滤、超滤、纳滤、柱层析。
7.根据权利要求1或6所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体与所述的生物制品的添加体积比为1:1000～10000。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的噬菌体的滴度采用双层琼脂平板法测定。
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| CN (1) | CN110904276A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115181816A (zh) * | 2022-08-10 | 2022-10-14 | 杭州纽创生物检测有限公司 | 一种超低病毒滴度体系中病毒滴度的检测方法及其应用 |
Citations (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN104774974A (zh) * | 2015-05-07 | 2015-07-15 | 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 大肠杆菌噬菌体ms2标准样品及其制备方法 |
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2019
- 2019-12-23 CN CN201911335183.1A patent/CN110904276A/zh active Pending
Patent Citations (1)
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