CN107384877B

CN107384877B - 一种慢病毒的纯化方法

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Publication number: CN107384877B
Application number: CN201710711477.4A
Authority: CN
Inventors: 肖永强; 王巍; 陈彦平; 黄伟东
Original assignee: Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Yuanxing Gene Technology Co ltd
Priority date: 2017-08-18
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2020-09-08
Anticipated expiration: 2037-08-18
Also published as: CN107384877A

Abstract

本发明提供了一种慢病毒的纯化方法，其包括以下步骤：步骤S1，病毒培养；步骤S2，病毒纯化预处理；将扩增得到的慢病毒进行离心分离，收集上清液为病毒收获液；先对病毒收获液进行第一次过滤处理，将过滤得到的病毒液经过第二次过滤处理，收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心，收集上清液，再进行第三次过滤处理，收集滤过液；步骤S3，将收集的病毒纯化预处理样品进行膜层析处理，然后经过超滤处理后，再采用分子筛层析纯化；所述膜层析中，使用的层析膜的基质为再生纤维素骨架。采用本发明的技术方案，在保证了慢病毒活性的基础上，提高了病毒回收效率；操作简便，易于放大，可大规模处理收获的病毒液，具备良好的重复性和稳定性。

Description

一种慢病毒的纯化方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种慢病毒的纯化方法。

背景技术

近年来，基因治疗的基础研究取得了很大的进展，很多研究成果在多种疾病的临床试验中得到了应用，如肝癌、肺癌、黑色素瘤、鼻咽癌、心脑血管系统疾病、糖尿病以及一些罕见疾病，并且取得了令人瞩目的研究成果，展示了其广阔的临床应用前景。病毒载体是一种常见高效的基因递送系统。由于病毒载体基因转移技术发展迅猛，采用基因转移技术来预防和治疗人类疾病，已从理论和实验室研究进入临床实用研究阶段。病毒载体的研究开发和制备，需要生产工艺、质量控制等相关药学研究的支持，制备出符合基因治疗制品要求的病毒载体，对于有效的将外源基因导入细胞，开展后续的个体化基因治疗具有极其重要的意义，同时由于病毒载体基因转移技术发展迅猛，病毒载体类药物和疫苗的研发和生产也得到了迅速发展，只有通过对生产工艺、质量控制等进行不断优化，制备出临床应用质量和数量要求的病毒载体基因疫苗和基因治疗药物才能满足日益增加的此类药物的开发需求。

用于基因治疗的病毒颗粒的上游工艺主要集中在病毒扩增和收获，而下游工艺集中在病毒纯化。值得注意的是，基因治疗病毒产品的下游纯化占整个生产工艺研究的绝大部分，并且常成为病毒生产工艺研发的瓶颈。可放大的下游工艺包括几个步骤：澄清(微滤)，浓缩(超滤/渗滤)，纯化(离子交换层析(IEX)和亲和层析(AF))和进一步纯化凝胶过滤层析(分子筛和超滤)。

因为每种病毒具有不同的生物、化学和物理特性，所以病毒的纯化必须进行相应的调整。需要通过优化纯化工艺以保护并最大的恢复病毒感染性。在确定纯化方法时应考虑病毒粒径和稳定性，pH值和相对颗粒稳定性等特征。

慢病毒(Lentivirus)载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体，区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达，在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

用于基因治疗的慢病毒载体在纯度和滴度方面要求较高，在小量制备慢病毒的方法中常采用高速离心等方式进行纯化，但这些方法处理量小，对病毒的滴度影响较大，且回收率低，难以满足临床试验的需求。

发明内容

针对以上技术问题，本发明公开了一种慢病毒的纯化方法，采用膜层析结合分子筛层析的方法对慢病毒收获液进行纯化，最终获得慢病毒原液，解决了规模化制备收获的慢病毒培养液的纯化问题，在保证了慢病毒活性的基础上，提高了慢病毒的回收效率。

对此，本发明采用的技术方案为：

一种高效的慢病毒的纯化方法，其包括以下步骤：

步骤S1，病毒培养；

根据不同质粒系统，采用相应的方法培养慢病毒，培养基可以是无血清或有血清培养基，培养方式可以是悬浮培养或贴壁培养，培养规模可以是培养瓶、细胞工厂或生物反应器。

步骤S2，病毒纯化预处理；将经步骤S1包装得到的慢病毒进行离心分离，收集上清液，即为病毒收获液；对病毒收获液进行预处理，先对病毒收获液进行第一次过滤处理，将过滤得到的病毒液经过第二次过滤处理，收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心，收集上清液，再进行第三次过滤处理，收集滤过液进行下一步纯化；

步骤S3，病毒纯化；将步骤S2收集的病毒纯化预处理样品进行膜层析处理，然后经过超滤处理后，再采用分子筛层析纯化；所述膜层析中，使用的层析膜的基质为再生纤维素骨架。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中，所述病毒收获液的收集步骤包括：经步骤S1包装扩增慢病毒后，采用4℃2000-4000g离心20-30min，分离培养物上清和沉淀，收集病毒培养物上清，即为病毒收获液。

作为本发明的进一步改进，对病毒收获液进行预处理时，所述第一次过滤处理采用0.6μm的滤器，所述第二次过滤处理采用0.45μm的滤器，所述第三次过滤处理采用0.45μm的滤器。

作为本发明的进一步改进，步骤S2中，收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心的条件为：4℃2000g-4000g离心5-10min。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中，所述膜层析包括以下步骤：采用10-20倍CV的pH值为7.5的、含0.15mol/L NaCl缓冲液平衡膜柱，平衡后上样，上样流速15-75ml/min，上样后用pH值为7.5的含0.4mol/L NaCl缓冲液清洗直至紫外吸收值回到基线，再用pH值为7.5的1.5mol/L NaCl缓冲液进行洗脱，清洗，洗脱流速为20-50ml/min。

作为本发明的进一步改进，膜层析中使用的层析膜为美国Pall公司的Mustang Q，进一步优选的，使用的层析膜为德国Sartoruius公司的

Q。

作为本发明的进一步改进，步骤S3中，分子筛层析使用的凝胶过滤层析填料为Sepharose 4 Fast Flow，以3-5倍CV的病毒保存液平衡层析柱，流速2-4ml/min；用超滤浓缩后获得的样品上样，上样体积2％-20％CV，流速2-4ml/min；以病毒保存液洗脱，洗脱流速为2-4ml/min，观察紫外吸收，慢病毒特征峰出现后开始收样，收集目标峰，送样检测。

上述技术方案中，首先对病毒收获液进行预处理，经过离心、过滤、DNA酶处理等步骤后采用膜层析进行纯化，经膜层析处理后的样品再经超滤等处理后用分子筛层析法纯化。观察不同的纯化条件下慢病毒的纯化效率。

步骤S1病毒包装结束后，通过离心、过滤、收集上清，利用蛋白核酸层析系统进行病毒的分离纯化；纯化是慢病毒规模化制备工艺中关键的下游工艺，不恰当的纯化方法常常会成为提高病毒产量及质量的瓶颈。本发明采用的膜层析所使用的层析膜的基质由稳定化的再生纤维素为骨架，可以应用于病毒与病毒样颗粒及其他生物大分子的纯化，由于层析膜具有大孔径结构，能够让大分子及病毒进入膜内并结合至孔内表面，因此与传统柱层析相比，膜吸附层析技术具有以下诸多优点：无需填装，即插即用，易于操作处理；流速高，比柱层析提高10-30倍；传质扩散效应低；载量高；非特异性吸附低，硬件投资更少；缓冲液消耗更少，易于放大，借助其大孔径膜结构优势，有效克服了传统层析的分子排阻限制，因此能够获得更好的纯化效果。在同等条件下通量更高，工艺时间更短，流速可达5-30倍层析膜体积/min。在工艺放大过程中更加灵活。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

采用本发明的技术方案，在保证了慢病毒活性的基础上，提高了病毒回收效率；操作简便，易于放大，可大规模处理收获的病毒液，能满足慢病毒基因治疗的生产需求，具备良好的重复性和稳定性；经该方法纯化后的慢病毒在内毒素、宿主细胞蛋白残留、宿主DNA残留、纯度和滴度上均能达到基因治疗的临床要求。

附图说明

图1为膜层析法纯化上样量与流穿病毒量比较图。

图2为膜层析法和离子交换柱层析法纯化样品DNA残留检测结果。

图3为慢病毒SDS-PAGE蛋白电泳图。

具体实施方式

下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。

本发明提供了一种高效的慢病毒纯化方法，包括如下步骤：

步骤S1：病毒培养

根据不同质粒系统，采用相应的方法培养慢病毒，培养基可以是无血清或有血清培养基，培养方式可以是悬浮培养或贴壁培养，培养规模可以是培养瓶、细胞工厂或生物反应器。具体的，用于生产慢病毒的哺乳动物细胞是本领域已知的。本步骤中使用的细胞是本领域所公知的人胚肾(HEK)293细胞衍生物293T细胞。复苏一支工作库293T细胞，采用225cm²培养瓶传代，传代前观察细胞状态，弃去培养液，加入15ml左右的PBS洗涤一次，除去PBS，加入消化液消化直至细胞层分散，用细胞培养液中和，将细胞悬液轻轻转移至无菌离心管中，800rpm离心3min，小心弃去上清，加入培养液，轻轻混匀后接种至225cm²培养瓶中，每瓶约30ml。轻轻晃动细胞培养瓶使细胞分散均匀，置37℃，饱和湿度，5％CO₂培养箱中培养过夜，传代直至细胞数量可以满足后续病毒包装所需。将准备好的细胞接种至细胞工厂中，37℃，5％CO₂条件下培养48h后准备转染。去除旧培养基用OPTI-MEM漂洗细胞层，除去漂洗液，加入新鲜OPTI-MEM置37℃，10％CO₂培养箱中孵育30min以上。将各质粒按照目的基因质粒:P1:P2:P3＝4:2:1:1的比例混匀，将质粒混合物加入2×BBS溶液中配制成质粒DNA混合物，混匀。同时用无菌去离子水将2.5M CaCl₂稀释至167mM。将制备好的质粒DNA混合物加入至质粒DNA混合物中，震荡混匀，室温孵育10-20min，孵育结束后将制备的DNA-CaPO₄混合物加入细胞工厂，轻轻混匀后37℃5％CO₂培养3-5h，3-5h后加入10％牛血清的DMEM培养基，置同样条件下培养24h后换液。换液时除去旧培养基，用新鲜的DMEM培养基清洗，除去洗液后加入新鲜的DMEM-B培养基，置同样条件继续培养24h，收集所有上清进行进一步纯化。

步骤S2：病毒纯化预处理

经步骤S1包装扩增慢病毒后，采用4℃2000-4000g离心20-30min，分离培养物上清和沉淀，收集病毒培养物上清，即为病毒收获液。对病毒收获液进行预处理，首先采用0.6μm的滤器对病毒收获液进行过滤处理，再将过滤所得病毒液经0.45μm的滤器再次过滤。过滤时采用正压过滤的方式。收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心，离心条件为4℃2000g-4000g离心5-10min。离心后收集上清，再次用0.45μm的过滤器过滤，收集滤过液进行下一步纯化。

步骤S3：病毒纯化

将步骤S2收集的病毒纯化预处理样品依次进行膜层析和分子筛层析进行进一步的纯化。在膜层析过程中。优选的，所述膜层析使用的层析膜为美国Pall公司的Mustang Q，进一步优选的，所述膜层析使用的层析膜为德国Sartoruius公司的

Q。包括以下步骤：采用10-20倍CV的含0.15mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)平衡膜柱，平衡后上样，上样流速15-75ml/min，上样后用含0.4mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)清洗直至紫外吸收值回到基线，再用1.5mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)进行洗脱，清洗，洗脱流速为20-50ml/min。洗脱后加入缓冲液将洗脱液中NaCl浓度稀释至150mmol/L左右，接下来将收获的样品进行超滤浓缩。

超滤浓缩后采用分子筛层析法再次纯化，本步骤使用的凝胶过滤层析填料为Sepharose 4 Fast Flow，以3-5倍CV的病毒保存液平衡层析柱，流速2-4ml/min。用超滤浓缩后获得的样品上样，上样体积2％-20％CV，流速2-4ml/min。以病毒保存液洗脱，洗脱流速为2-4ml/min，观察紫外吸收，慢病毒特征峰出现后开始收样，收集目标峰，送样检测。

实施例1膜层析纯化法病毒上样量的优化。

采用步骤S1所述方法进行慢病毒包装和扩增，收获病毒液。采用步骤S2所述方法对病毒收获液进行预处理。本实施例中采用3ml的

Q进行膜层析纯化法病毒上样量优化，对不同上样量阶段的流穿液进行取样检测，纯化过程的具体操作参照步骤S3。采用Real-time荧光定量PCR测定慢病毒物理滴度，根据VP titer＝病毒拷贝数/2的关系将经试剂盒检测的慢病毒的拷贝数换算成物理滴度VP/ml。结果见图1。

由图1可知，当样品开始经过膜柱，病毒完全被膜柱吸附，此时流穿病毒VP滴度非常低，不被检测出。随着上样体积增加，膜柱不断吸附病毒直至饱和，流穿病毒VP滴度也就不断增加，最终和起始上样VP滴度相当，说明此时上样已严重过载。本次上样病毒起始VP滴度为7.47×10¹¹VP/ml，当流穿VP滴度是起始VP滴度的十分之一时，通常我们认为样品已经穿透，吸附已饱和，应停止上样。

为确定病毒上样量对病毒回收率的影响，参照前述所述步骤和方法，分别采用饱和上样量和过载上样量进行纯化。对两种不同上样体积纯化后的病毒回收率计算后进行比较，结果见表1。由表1可知本次实施例中当上样量为44ml时层析膜载量达到饱和，此时上样病毒量为3.62×10¹²VP，回收率为50.1％，当上样量为90ml时，层析膜过载，此时上样病毒量为6.71×10¹²VP，此时回收率为26.8％。由此可见，本发明使用的膜层析方法纯化慢病毒，当使用饱和载量进行纯化时，病毒回收率可达到50％左右。

表1不同上样量对病毒回收率的影响

实施例2膜层析法与传统离子交换柱层析法对慢病毒纯化效果的比较。

宿主DNA残留是评价慢病毒载体质量的关键指标之一，而DNA很难通过常规的纯化方法去除，在以往的纯化过程中往往采用添加核酸酶的方法将DNA降解后去除，虽然取得了一定效果，但该处理方法过程中引入了新的外源生物试剂，需要在后续的处理过程中加以除去，这不仅增加了慢病毒载体制剂的检测指标，同时还增加了慢病毒制剂的质量安全风险。采用膜层析法纯化慢病毒可以在一定程度上去除宿主DNA。为评价膜层析法对宿主DNA的去除效果以及比较膜层析法与常规的柱层析法对慢病毒纯化的回收效果，特进行此实施例。具体如下：

参照步骤S1进行病毒包装和扩增，参照S2进行病毒纯化预处理。将处理后的病毒液平均分成A、B两组，分别按照下述步骤进行后续纯化：

A组：将收获的病毒液4℃2000-4000g离心20min，收集上清液用0.6μm的滤器对病毒收获液进行过滤处理，再将过滤所得病毒液经0.45μm的滤器再次过滤。过滤时采用正压过滤的方式。收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心，离心条件为4℃2000g-4000g离心5-10min。离心后收集上清，再次用0.45μm的过滤器过滤，连接真空泵，抽真空过滤，观察抽滤情况及时更换滤瓶，抽滤结束后将滤液倒入储液瓶中混合均匀。采用膜层析结合分子筛层析法对超滤浓缩后的病毒液进行进一步的纯化。本实施例采用的层析膜柱Sartoruius公司的

Q。包括以下步骤：采用10-20倍CV的含0.15mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)平衡膜柱，平衡后上样，上样流速15-75ml/min，上样后用含0.4mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)清洗直至紫外吸收值回到基线，再用1.5mol/L NaCl缓冲液(pH 7.5)进行洗脱，清洗，洗脱流速为20-50ml/min。洗脱后加入缓冲液将洗脱液中NaCl浓度稀释至150mmol/L左右，接下来将收获的样品进行超滤浓缩。超滤浓缩后采用分子筛层析法再次纯化，本步骤中使用的层析柱填料类型为Sepharose 4 Fast Flow，以3-5倍CV的病毒保存液平衡层析柱，流速2-4ml/min。用超滤浓缩后获得的样品上样，上样体积2％-20％CV，流速2-4ml/min。以病毒保存液洗脱，洗脱流速为2-4ml/min，慢病毒特征峰出现后开始收样。送样检测。

B组：将收获的病毒液4℃2000-4000g离心20min，收集上清液倒入0.45μm过滤瓶上层杯中，连接真空泵，抽真空过滤，观察抽滤情况及时更换滤瓶，抽滤结束后将滤液倒入储液瓶中混合均匀。连接超滤装置，对滤过液进行超滤浓缩。浓缩后的样品进行后续纯化。本步骤中采用的层析填料为GE公司的Q Sepharose XL，先后以1倍CV的0.5M NaOH洗柱，1倍CV的注射用水，以及1～2倍CV的BB液冲洗色谱柱。最后，用2～4倍CV的AB液平衡色谱柱。上样，上样流速20-50ml/分钟。上样后梯度洗脱，洗脱流速10-30mL/min，洗脱梯度为30％B，2-4CV，30-60％B，4-6CV，100％B，1-2CV。慢病毒特征峰出现后开始收样，保存收集的样品用于下一步的分子筛层析。使用的分子筛层析柱填料类型为Sepharose 4Fast Flow，步骤参照A组。送样检测。

以慢病毒的纯化前后的物理滴度作为评价两种纯化方法回收率的质量指标，检测和换算方法如实施例1。宿主DNA残留采用Southern Blot法。

检测结果见表2和图2，表2结果显示，A组采用膜层析法纯化，回收率可达48.3％，高于B组所采用的离子交换柱层析法纯化。由图2可知，在不经核酸酶处理的情况下采用

Q进行慢病毒的膜层析纯化能有效去除病毒收获液中的宿主DNA。经本发明所述纯化方法纯化后样品中的宿主DNA残留小于2ng/ml，与经Q Sepharose XL离子交换层析柱相比，DNA去除效果明显。因此，采用本发明所述纯化方法纯化慢病毒能获得理想的慢病毒纯化效果，与传统的柱层析相比不仅获得了较高的回收率，且能在纯化过程中去除大部分宿主残留DNA，避免引入外源生物试剂。此外，膜层析法能够节省纯化时间，在工艺放大时能较好的节约时间成本。

表2两组纯化方法纯化后慢病毒检测结果

实施例3膜层析法慢病毒纯化工艺放大。

参照步骤S1进行慢病毒包装和扩增，参照S2和S3进行纯化。纯化后的病毒样品送质量部门检测各项指标。结果见表3。从实验结果可见，采用本发明的纯化工艺获得的重组慢病毒原液质量符合2015版《中国药典》以及《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》的相关规定。

表3采用确定的纯化工艺纯化后慢病毒原液检测结果

检测项目	质量标准	检测结果
			物理性滴度vp/ml	≥2×10<sup>9</sup>	2.33×10<sup>10</sup>
转染滴度TU/ml	≥3×10<sup>8</sup>	1.93×10<sup>9</sup>
			SDS-PAGE	与参照标准一致	符合规定
蛋白浓度	＞20ug/ml	121.36ug/ml
			无菌	阴性	符合规定
支原体	阴性	符合规定
			宿主细胞DNA残留	＜100ng/ml	＜100ng/ml
宿主细胞蛋白残留	＜100ng/ml	12.43ng/ml
			牛血清白蛋白残留	＜100ng/ml	1.48ng/ml
复制型慢病毒	阴性	符合规定

实施例4工艺稳定性实验。

参照步骤S1-S3进行连续三批次的慢病毒包装培养和纯化，三批次纯化样品分别为S1、S2、S3，纯化后样品产量信息和质检结果分别见表4和表5，慢病毒SDS-PAGE蛋白电泳图对比图如图3所示。可以看出，三批样品的总物理滴度在1.0-4.0×10¹³VP之间，批次之间产量相对稳定，病毒回收率在40％-50％之间，说明本发明的纯化方法具有良好的稳定性和可重复性。由表5可以看出，采用本发明工艺制备的慢病毒原液质量能够满足药学研究和临床申报需求。

表4三批样品产量和收率统计表

表5三批原液质量检测统计表

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种慢病毒的纯化方法，其特征在于：其包括以下步骤：

步骤S1，病毒培养；

步骤S3，病毒纯化；将步骤S2收集的病毒纯化预处理样品进行膜层析处理，然后经超滤处理后，再采用分子筛层析纯化；所述膜层析中，使用的层析膜的基质为再生纤维素骨架；

步骤S3中，所述膜层析包括以下步骤：采用10-20倍CV的pH值为 7.5的、含0.15mol/LNaCl缓冲液平衡膜柱，平衡后上样，上样流速15-75ml/min，上样后用pH 值为7.5的含0.4mol/L NaCl缓冲液清洗直至紫外吸收值回到基线，再用pH 值为7.5的1.5mol/L NaCl缓冲液进行洗脱，清洗，洗脱流速为20-50ml/min。

2. 根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于：步骤S2中，所述病毒收获液的收集步骤包括：经步骤S1包装扩增慢病毒后，采用4℃ 2000-4000g离心20-30min，分离培养物上清和沉淀，收集病毒培养物上清，即为病毒收获液。

3.根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于：对病毒收获液进行预处理时，所述第一次过滤处理采用0.6μm的滤器，所述第二次过滤处理采用0.45μm的滤器，所述第三次过滤处理采用0.45μm的滤器。

4. 根据权利要求3所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于：步骤S2中，收集病毒滤过液进行超滤浓缩后离心的条件为：4℃ 2000g-4000g离心5-10min。

5. 根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于：膜层析中使用的层析膜为Mustang Q或Sartobind® Q。

6. 根据权利要求1所述的慢病毒的纯化方法，其特征在于：步骤S3中，分子筛层析使用的凝胶过滤层析填料为Sepharose 4 Fast Flow，以3-5倍CV的病毒保存液平衡层析柱，流速2-4ml/min；用超滤浓缩后获得的样品上样，上样体积2%-20% CV，流速2-4ml/min；以病毒保存液洗脱，洗脱流速为2-4ml/min，观察紫外吸收，慢病毒特征峰出现后开始收样，收集目标峰，送样检测。