CN105219741A - 一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法 - Google Patents

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易丹
吕斌
谢昌彬
宋侠侠
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Abstract

本发明提供一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法,包括以下几个步骤:步骤A:收集慢病毒原液,过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样;步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化;步骤C:将收集的初纯病毒液加入超滤系统样品杯,再通过凝胶过滤纯化柱纯化;步骤D:用过滤除菌,取适量样品进行纯度检测,感染滴度检测。本发明的有益效果是:通过初级纯化和精细纯化工艺,获得高纯度慢病毒颗粒,达99%以上;可实现更高的浓缩倍数;处理量大,实现规模化生产;采用改良的离子交换层析缓冲液,能保证终产物的高活性,减少纯化过程中慢病毒的失活。

Description

一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法
技术领域
本发明属于临床基因治疗,尤其涉及一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法。
背景技术
慢病毒是由人类免疫缺陷病毒(HIV),通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒(vesicularstomatitisvirus)G糖蛋白(VSV-G)来代替HIV-1的包膜进行包装,从而更安全,宿主范围更广,还能增加病毒的滴度。目前,基因治疗已经被广泛用于治疗囊性纤维化、血友病、肌营养不良症和镰状细胞贫血等基因遗传性疾病、血液病,以及肿瘤疾病当中。
在基因治疗的环节中,早期应用的是腺病毒载体和逆转录病毒载体,但腺病毒不能整合至宿主细胞,且免疫原性高,逆转录病毒只能感染分裂细胞。慢病毒载体不仅能感染分裂细胞,也能感染静止期细胞,并且能稳定整合至宿主细胞,实现长期表达。在造血干细胞移植治疗应用方面,慢病毒由于能感染大部分处于静止期的造血干细胞,已经成为一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具,因此慢病毒载体将能广泛地应用于基因治疗领域。
用于基因治疗的病毒载体在纯度及滴度方面有极高的要求,通常在慢病毒载体的生产制备过程中,收集的慢病毒原液含有培养基残留、包装质粒残留、包装细胞残留等成分,而且滴度仅能达到1×107Tu/mL,实验室小量制备慢病毒一般采用高速离心或超滤浓缩管方法,但这些方法处理量小,不适合大规模制备,且这些简单方法制备的慢病毒纯度和滴度远不能满足基因治疗制剂要求,因此,为解决这个难题,需要开发一种新的慢病毒纯化制备工艺,能够实现大规模制备高纯度,高滴度的慢病毒载体。为解决未来基因治疗中所需的病毒载体提供了一种高效率的生产方案。
发明内容
为了解决以上技术问题,本发明提供了一种改良的大规模获得高纯度,高活性慢病毒的工艺方法,包括以下几个步骤:
步骤A:收集慢病毒原液,过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化:
步骤C:将收集的初纯病毒液加入超滤系统样品杯,再通过凝胶过滤纯化柱纯化;
步骤D:用过滤除菌,取适量样品进行纯度检测,感染滴度检测。
优选的,所述步骤A中,采用0.8/0.45μm囊式滤器。
优选的,所述步骤B中,包括:
步骤B1:用水冲洗DEAEFF弱阴离心纯化柱;
步骤B2:再用上样缓冲液平衡该弱阴离纯化柱;
步骤B3:将澄清后的病毒原液上样;
步骤B4:用上样缓冲液冲洗该弱阴离纯化柱,直至基线平稳,以除非特异性结合的蛋白;
步骤B5:用低盐洗脱液冲洗纯化柱,以去除非特异性结合的蛋白;
步骤B6:用洗脱液冲洗纯化柱,收集目的病毒,即为初纯病毒液;
步骤B7:用水和无水乙醇冲洗纯化柱。
优选的,所述步骤C中,超滤系统样品杯中生物泵转速为50转/分钟。
优选的,所述步骤C中,凝胶过滤纯化柱纯化包括以下几个步骤:
步骤C1:采用PBS缓冲液平衡凝胶过滤柱;
步骤C2:用浓缩后的样品上样,再用PBSBuffer冲洗,收集第一个分离峰。
优选的,采用0.22μmPVDF针头滤器过滤除菌。
优选的,所述步骤B2和B4中的缓冲液为50mMTris-HCl,质量浓度为2%蔗糖,pH=7.5,步骤B5中缓冲液为50mMTris-HCl,150mMNaCl,质量浓度2%蔗糖pH=7.5,步骤B6中,缓冲液为50mMTris-HCl,1MNaCl,质量浓度2%蔗糖,pH=7.5。
其中,50mMTris-HCl,质量浓度为2%蔗糖,pH=7.5,是指:Tris-HCl占整个所述缓冲液中浓度为50mM,pH=7.5,蔗糖占整个缓冲液的质量浓度为2%;50mMTris-HCl,150mMNaCl,质量浓度2%蔗糖pH7.5,是指Tris-HCl占整个所述缓冲液中浓度为50mM,pH=7.5,NaCl占整个所述缓冲液的浓度为150mM;50mMTris-HCl,500mMNaCl,质量浓度2%蔗糖,pH7.5,是指Tris-HCl占整个所述缓冲液中浓度为50mM,NaCl占整个所述缓冲液的浓度为500mM,蔗糖占整个缓冲液的质量浓度为2%;
优选的,所述步骤B1、B2、B7和B8的流速为3cm/min,所述步骤B3-B6的流速为3cm/min。
优选的,所述步骤C1中的流速设为1ml/min。
本发明的有益效果是:通过初级纯化和精细纯化工艺,获得高纯度慢病毒颗粒,纯度达99%以上;可实现更高的浓缩倍数,从而达到更高的滴度;处理量大,可规模化生产;采用改良的离子交换层析缓冲液,能保证终产物的高活性,减少纯化过程中慢病毒的失活。
附图说明
图1是本发明一种实施例的工艺流程示意图;
图2SDS-PAGE检测纯度,其中lane1为不含蔗糖缓冲液纯化的慢病毒样品,lane2为含2%蔗糖缓冲液纯化慢病毒样品。
图3:含2%蔗糖缓冲液纯化的慢病毒样品感染HEK293细胞
图4:不含蔗糖缓冲液纯化慢病毒样品感染HEK293细胞
图5.western-blot检测P17蛋白含量及SV40largeT蛋白残留图,其中,Lane1,3:不含蔗糖缓冲液纯化终产物;Lane2,4:含2%蔗糖缓冲液纯化终产物;A:p17检测显色后的化学发光图和相应的白光图;B:SV40largeT显色后的化学发光图和相应的白光图。
图6SDS-PAGE检测纯度。
图7 慢病毒颗粒感染滴度检测。
图8western-blot检测P17蛋白含量及SV40largeT蛋白残留;A为p17检测显色后的化学发光图和相应的白光图;B为SV40largeT显色后的化学发光图和相应的白光图。
具体实施方式
下面结合附图,对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明:
实施例1:使用改良缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化,如图1所示:
步骤A:收集1L慢病毒原液,用0.8/0.45μm囊式滤器过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化:
1.先用200mLddH2O冲洗100mLDEAEFF弱阴离子纯化柱,流速设为3cm/min。
2.再用200mL上样缓冲液(50mMTris-HCl,质量浓度2%蔗糖,pH7.5)平衡该弱阴离纯化柱,流速设为3cm/min。
3.将澄清后的病毒原液上样,流速设为2cm/min。
4.用1L上样缓冲液(50mMTris-HCl,质量浓度2%蔗糖,pH7.5)冲洗该弱阴离子纯化柱,直至基线平稳,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
5.用3L低盐洗脱液(50mMTris-HCl,150mMNaCl,质量浓度2%蔗糖,pH=7.5)冲洗纯化柱,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
6.用500ml洗脱液(50mMTris-HCl,500mMNaCl,质量浓度2%蔗糖,pH=7.5)冲洗纯化柱,收集目的病毒,即为初纯病毒液,流速设为2cm/min。
7.用1LddH2O冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
8.最后用1L20%的无水乙醇冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
步骤C:超滤浓缩:将收集的50mL初纯病毒液加入超滤系统(100KD)样品杯,生物泵转速设置为50转/分钟,期间更换两次PBS缓冲液,通过S-500HR凝胶过滤纯化柱纯化:
1.先用240mlPBS缓冲液平衡凝胶过滤柱,流速设为1ml/min。
2.用浓缩后的样品30mL上样,再用PBSBuffer冲洗,流速设为1ml/min。
3.收集第一个分离峰,样品约10mL,即浓缩100倍。
步骤D:用0.22umPVDF针头滤器过滤除菌,取适量样品进行纯度检测,感染滴度检测,western-blot检测P17蛋白含量,western-blot检测SV40largeT蛋白残留。
实施例2:使用常规缓冲液进行DEAE弱阴离子纯化柱纯化
步骤A:收集1L慢病毒原液,用0.8/0.45um囊式滤器过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化:
1.先用200mLddH2O冲洗100mLDEAE弱阴离子纯化柱,流速设为3cm/min。
2.再用200mL上样缓冲液(50mMTris-HCl,pH=7.5)平衡该弱阴离子纯化柱,流速设为3cm/min。
3.将澄清后的病毒原液上样,流速设为2cm/min。
4.用1L上样缓冲液(50mMTris-HCl,pH=7.5)冲洗该弱阴离子纯化柱,直至基线平稳,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
5.用3L低盐洗脱液(50mMTris-HCl,150mMNaCl,pH=7.5)冲洗纯化柱,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
6.用500mL洗脱液(50mMTris-HCl,500mMNaCl,pH=7.5)冲洗纯化柱,收集目的病毒,即为初纯病毒液,流速设为2cm/min。
7.用1LddH2O冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
8.最后用1L20%的无水乙醇冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
步骤C:超滤浓缩:将收集的50mL初纯病毒液加入超滤系统(100KD)样品杯,生物泵转速设置为50转/分钟,期间更换两次PBS缓冲液,通过S-500HR凝胶过滤纯化柱纯化:
1.先用240mlPBS缓冲液平衡凝胶过滤柱,流速设为1ml/min。
2.用浓缩后的样品30mL上样,再用PBSBuffer冲洗,流速设为1ml/min。
3.收集第一个分离峰,样品约10mL,即浓缩100倍。
步骤D:用0.22umPVDF针头滤器过滤除菌,取适量样品进行纯度检测,感染滴度检测,western-blot检测P17蛋白含量,及SV40largeT蛋白残留。
实验结果:
1.SDS-PAGE检测结果表明纯度可达99%以上(图2),表明该纯化工艺可获得高纯度的慢病毒颗粒;
2.荧光法测定感染滴度(图3和4),用1μL纯化的病毒在相同条件下感染细胞,表明改良缓冲液的纯化产物慢病毒颗粒感染滴度高于常规缓冲液的纯化产物;
3.western-blot检测P17蛋白含量(图5),可反映出改良缓冲液的纯化产物慢病毒颗粒浓度高于常规缓冲液的纯化产物慢病毒颗粒;western-blot检测SV40largeT蛋白残留,可反映出终产物中宿主细胞蛋白残留情况,两种方法均未检测到宿主细胞蛋白残留,表明该纯化工艺可有效去除蛋白杂质。
实施例3:
步骤A:收集10L慢病毒原液,用0.8/0.45um囊式滤器过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样。
步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化:
1.先用1LddH2O冲洗500mLDEAE弱阴离子纯化柱,流速设为3cm/min。
2.再用1L上样缓冲液(50mMTris-HCl,2%蔗糖,pH=7.5)平衡该弱阴离子纯化柱,流速设为3cm/min。
3.将澄清后的病毒原液上样,流速设为2cm/min。
4.用1L上样缓冲液(50mMTris-HCl,2%蔗糖pH=7.5)冲洗该弱阴离子纯化柱,直至基线平稳,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
5.用3L低盐洗脱液(50mMTris-HCl,150mMNaCl,2%蔗糖pH=7.5)冲洗纯化柱,以去除非特异性结合的蛋白,流速设为2cm/min。
6.用500ml洗脱液(50mMTris-HCl,500mMNaCl,2%蔗糖,pH=7.5)冲洗纯化柱,收集第二个洗脱峰,即为初纯病毒液,流速设为2cm/min。
7.用1LddH2O冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
8.最后用1L20%的无水乙醇冲洗纯化柱,流速设为3cm/min。
步骤C:超滤浓缩:将收集的500mL初纯病毒液加入超滤系统(100KD)样品杯,生物泵转速设置为50转/分钟,期间更换两次500mLPBS缓冲液
通过S-500凝胶过滤纯化柱纯化:
1.先用640mLPBS缓冲液平衡凝胶过滤柱,流速设为1ml/min。
2.用浓缩后的样品30mL上样,再用PBSBuffer冲洗,流速设为1ml/min。
3.收集第一个分离峰,样品约50mL,即浓缩100倍。
步骤D:用0.22umPVDF针头滤器过滤除菌,取适量样品进行纯度检测结果如图6-8所示:图6结果表明纯度可达99%;用1μL纯化的病毒感染细胞,荧光率达90%以上,感染滴度达1×109Tu/mL;图7中,western-blot检测P17蛋白含量,结果显示纯化产物含慢病毒的结构蛋白p17;图8中,western-blot检测宿主细胞中SV40largeT蛋白残留情况,结果表明样品中未检测到SV40largeT,进一步表明纯度高。
纯度及滴度检测结果见表1,均符合要求。
表1病毒纯化样品检测结果
※1FIO:forinformationonly
※2LOQ:limitofquantification
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种大规模获得高纯度、高活性慢病毒的工艺方法,其特征在于,包括以下几个步骤:
步骤A:收集慢病毒原液,过滤去除细胞碎片,澄清后的样品用于DEAE弱阴离子纯化柱上样;
步骤B:通过DEAE弱阴离子纯化柱纯化:
步骤C:将收集的初纯病毒液加入超滤系统样品杯,再通过凝胶过滤纯化柱纯化;
步骤D:用过滤除菌,取适量样品进行纯度检测,感染滴度检测。
2.如权利要求1所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤A中,采用0.8/0.45μm囊式滤器。
3.如权利要求1所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤B中,
步骤B1:用水冲洗DEAEFF弱阴离子纯化柱;
步骤B2:再用上样缓冲液平衡该弱阴离纯化柱;
步骤B3:将澄清后的病毒原液上样;
步骤B4:用上样缓冲液冲洗该弱阴离子纯化柱,直至基线平稳,以去除非特异性结合的蛋白;
步骤B5:用低盐洗脱液冲洗纯化柱,以去除非特异性结合的蛋白;
步骤B6:用洗脱液冲洗纯化柱,收集目的病毒,即为初纯病毒液;
步骤B7:用水和无水乙醇冲洗纯化柱。
4.如权利要求1所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤C中,超滤系统样品杯中生物泵转速设置为50转/分钟。
5.如权利要求1所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤C中,凝胶过滤纯化柱纯化包括以下几个步骤:
步骤C1:采用PBS缓冲液平衡凝胶过滤柱;
步骤C2:用浓缩后的样品上样,再用PBSBuffer冲洗,收集第一个分离峰。
6.如权利要求1所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤D中,采用0.22μmPVDF针头滤器过滤除菌。
7.如权利要求3所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤B2和B4中的缓冲液为50mMTris-HCl,质量浓度为2%蔗糖,pH=7.5,步骤B5中缓冲液为50mMTris-HCl,150mMNaCl,质量浓度2%蔗糖pH7.5,步骤B6中,缓冲液为50mMTris-HCl,500mMNaCl,质量浓度2%蔗糖,pH=7.5。
8.如权利要求3所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤B1、B2、B7和B8的流速为3cm/min,所述步骤B3-B6的流速为3cm/min。
9.如权利要求5所述的工艺方法,其特征在于,所述步骤C1中的流速设为1ml/min。
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