一种用于临床级慢病毒的稳定剂及其使用方法
技术领域
本发明涉及生化医药领域,尤其涉及一种用于临床级慢病毒的稳定剂及其使用方法,本发明可应用于细胞治疗及其他需要对慢病毒进行长期储存的领域。
背景技术
慢病毒是由人类免疫缺陷病毒(HIV),通过去除env、vif、vpr、vpu、nef等毒性基因改造而来。复制缺陷型HIV载体通常用水泡口炎病毒(vesicular stomatitis virus)G糖蛋白(VSV-G)来代替HIV-1的包膜进行包装,从而更安全,宿主范围更广,还能增加病毒的滴度。慢病毒载体不仅能感染分裂细胞,也能感染静止期细胞,并且能稳定整合至宿主细胞,实现长期表达。在造血干细胞移植治疗应用方面,慢病毒由于能感染大部分处于静止期的造血干细胞,已经成为一种有效的感染HSCs和进行基因治疗的工具。另外,慢病毒载体是Car-T治疗方法中常用到的载体。因此,慢病毒载体的临床应用范围将越来越广泛。
慢病毒载体的低稳定性严重影响生产,使得慢病毒载体的临床制备变成一个很难达到的目标。用细胞培养基来储存慢病毒载体是提高稳定性的一个有效方法,但细胞培养基成分多,对于临床应用的质量控制不利,且在使用过程中,不得不成倍增加慢病毒载体的体积,从而降低了成品的滴度,影响后续的临床应用。
纯化后的高纯度临床级慢病毒载体由于经过多步骤的纯化,在-80℃非常容易失活,一周内的损失高达20%-70%。另外,解冻过程对滴度的影响大且不稳定。目前没有能增加慢病毒载体的稳定性且符合临床应用要求的稳定剂的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于临床慢病毒的稳定剂及其使用方法,应用于慢病毒的储存领域,既能够增加慢病毒的稳定性,又能符合临床应用要求。
本发明是这样实现的:一种用于临床慢病毒的稳定剂,包括10-20g/ml蔗糖、40-100mg/L生育酚和10-20g/ml人血白蛋白,余量为PBS缓冲液。
其中,蔗糖:非渗透性保护剂,减少冷冻及解冻过程中渗透压改变对慢病毒包膜VSVG的影响,具有膜稳定的作用,从而保证病毒感染细胞的能力即滴度。
生育酚(D-α-tocopherol acetate):抗氧化能力强,可减少氧化应激反应对慢病毒包膜VSVG的影响。
人血白蛋白(rHSA):减少在冷冻环境下及温度变化过程中对慢病毒的影响。
PBS缓冲液:慢病毒载体的冻存过程提供合适的离子平衡和pH等环境,减少环境对慢病毒的影响。
上述蔗糖、生育酚、人血白蛋白和PBS缓冲液的原料均要求符合GMP要求。
采用上述技术方案,因为稳定剂的成分简单,临床应用时容易进行质量控制;稳定效果好:蔗糖、生育酚、人血白蛋白、PBS缓冲液保证了慢病毒的稳定性,减少环境对慢病毒的影响,确保慢病毒的感染细胞的能力。
作为本发明的进一步改进,所述PBS缓冲溶液为pH7.4的0.01mol/L PBS缓冲液。
作为本发明的进一步改进,所述用于临床慢病毒的稳定剂通过0.22μm的滤器过滤。采用此技术方案,保证了用于临床慢病毒的稳定剂符合GMP生产中除菌的要求。
本发明还提供了一种用于临床慢病毒的稳定剂的使用方法,包括以下步骤:
步骤S1,进行慢病毒包装,收集慢病毒原液;
步骤S2,将慢病毒原液纯化,获得临床级慢病毒悬浊液;
步骤S3,临床级慢病毒悬浊液与所述用于临床慢病毒的稳定剂以9:1的体积比例轻轻混匀,并进行分装。
步骤S4,将分装后的临床级慢病毒悬浊液在-80℃环境下储存。
采用上述技术方案,该用于临床慢病毒的稳定剂只需要与临床级慢病毒悬浊液按照比例混合后分装使用,使用步骤简单,不需要使用额外的仪器设备。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:(1)因为稳定剂的成分简单,临床应用时容易进行质量控制;稳定效果好:蔗糖、生育酚、人血白蛋白和PBS缓冲液保证了慢病毒的稳定性,减少储存环境对慢病毒的影响,确保慢病毒的感染细胞的能力;
(2)使用步骤简单,不需要使用额外的仪器设备;
(3)采用0.22μm的滤器过滤,并选取符合GMP要求的原料配制;有利于质量控制,符合临床应用要求。
附图说明
图1-图3依次是实施例3中第一次、第二次、第三次冻融后在稀释梯度为3的荧光图;
图4-图6依次是实施例4中第一次、第二次、第三次冻融后在稀释梯度为3的荧光图;
图7-图9依次是实施例5中第一次、第二次、第三次冻融后在稀释梯度为3的荧光图;
图10-图14依次是实施例3中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图;
图15-图19依次是实施例4中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图;
图20-图24依次是实施例5中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图。
其中,图9、图23、图24由于荧光细胞数少,呈现暗色调。
具体实施方式
借助以下实施例对本发明进行进一步描述,这些具体的实施例仅在不违背本发明精神下的有限举例,本领域的一般技术人员亦可根据本发明的方案和实际情况,确定具体的实施方案。
实施例1
1.配制或者使用市售的0.01mol/L的PBS缓冲溶液(pH7.4);
2.将10克蔗糖溶解于100ml的上述缓冲溶液中;
3.将10g重组白蛋白加入上述缓冲溶液中,充分溶解;
4.将4mg生育酚加入上述溶液中,充分混匀;
5.用0.22μm的滤器将上述缓冲溶液过滤至无菌瓶中。
实施例2
1.配制或者使用市售的0.01mol/L的PBS缓冲溶液(pH7.4);
2.将20克蔗糖溶解于100ml的上述缓冲溶液中;
3.将20g重组白蛋白加入上述缓冲溶液中,充分溶解;
4.将10mg生育酚加入上述缓冲溶液中,充分混匀;
5.用0.22μm的滤器将上述溶液过滤至无菌瓶中。
实施例3
步骤1.按常规方法包装慢病毒rLV-zsGreen正确。
步骤2.收集细胞上清液即病毒原液。
步骤3.按临床级大规模制备慢病毒的方法纯化,获得临床级慢病毒rLV-zsGreen。
步骤4.取实施例1获得的用于临床慢病毒的稳定剂1ml,加入到9ml临床级慢病毒rLV-zsGreen中,轻轻混合均匀后分装,储存于-80℃。步骤5.通过滴度测定来检测反复冻融(1次,2次,3次)及储存时间(1周,1月,3月,6月,12月)对慢病毒稳定性的影响。
5.1在滴度测定前一天取一块96孔板,加入1×104cells/孔的HEK293细胞。
5.2加polybrene(聚凝胺)到DMEM完全培养基中,使用终浓度为8μg/ml。
5.3用含有polybrene的培养基10倍梯度稀释慢病毒。具体做法如下:取一块96孔板,每孔含有90ul含有polybrene的培养基,第一横排孔每孔加入10μl待测病毒原液,混匀后吸取10μl混合液至第二横排孔(混匀时尽量不要产生气泡),如此稀释至第八横排孔,详情见表1。
5.4吸10μl病毒混合液加入到相对应的96孔板中,在37℃培养中孵育过夜,次日换液(换成完全培养基)。
5.5经72小时感染后,用荧光显微镜计数荧光细胞情况(如果观察不清楚可以先换用PBS缓冲液再进行观察)。一般情况下,在最高稀释梯度m的孔数出N(N<10)个带荧光的细胞,则病毒滴度为N×10m TU/ml(m为稀释梯度)。
表1病毒的梯度稀释
实施例4
本实施例与实施例3的区别仅在于,在步骤4中,将“实施例1获得的用于临床慢病毒的稳定剂”替换为“实施例2获得的用于临床慢病毒的稳定剂”。
实施例5
本实施例与实施例3的区别仅在于,在步骤4中,本实施例不使用稳定剂进行储存。
下列对实施例1-5进行数据分析。
通过实施例1-5,获得的实验数据如表2、表3,以及图1-图24所示。
其中,表2为反复冻融后的滴度结果;
表3为不同储存时间下的滴度结果;
图1-图3依次是实施例3中第一次、第二次、第三次冻融后在稀释梯度为3的荧光图;
图4-图6依次是实施例4中第一次、第二次、第三次冻融后在稀释梯度为3的荧光图;
图7-图9依次是实施例5中第一次、第二次、第三次冻融后在稀
释梯度为3的荧光图。
图10-图14依次是实施例3中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图;
图15-图19依次是实施例4中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图;
图20-图24依次是实施例5中储存1周、1个月、2个月、3个月、6个月,12个月后在稀释梯度为3的荧光图。
表2反复冻融后的滴度结果
冻融次数 |
冻融1次 |
冻融2次 |
冻融3次 |
实施例3滴度(TU/ml) |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
3×10<sup>7</sup> |
实施例4滴度(TU/ml) |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
3×10<sup>7</sup> |
实施例5滴度(TU/ml) |
7×10<sup>6</sup> |
5×10<sup>5</sup> |
3×10<sup>4</sup> |
表3不同储存时间下的滴度结果
储存时间 |
1周 |
1月 |
3月 |
6月 |
12月 |
实施例3滴度(TU/ml) |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
实施例4滴度(TU/ml) |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
4×10<sup>7</sup> |
实施例5滴度(TU/ml) |
1×10<sup>7</sup> |
7×10<sub>6</sub> |
1×10<sup>6</sup> |
4×10<sup>4</sup> |
8×10<sup>3</sup> |
从表2可以看出,实施例3、实施例4在前两次冻融的过程中,病毒的滴度没有明显变化,第三次冻融中,病毒的滴度下降10%;实施例5在第二次、第三次冻融后,病毒的滴度下降明显。
从图1-图3可以看出,实施例3在三次冻融的过程中,荧光细胞数下降趋势较为缓慢。
从图4-图6可以看出,实施例4在三次冻融的过程中,荧光细胞数下降趋势较为缓慢。
从图7-图9可以看出,实施例5在三次冻融的过程中,荧光细胞数下降趋势明显。尤其在第三次冻融(图9)的时候,荧光细胞数已经非常少,导致图片呈现暗色调。
综上所述,通过检测冻融次数的影响,加入了本发明的实施例3和实施例4的慢病毒滴度在第三次冻融时会有所下降,在临床应用中,一般情况下只会冻融一次,表明该稳定剂可以有效防止冻融对慢病毒活性的影响。
从表3可以看出,实施例3、实施例4在12个月内,病毒的滴度没有明显变化,实施例5随着时间的推移,病毒的滴度下降明显。
从图10-图14可以看出,实施例3在12个月内,荧光细胞数变化不明显。
从图15-图19可以看出,实施例4在12个月内,荧光细胞数变化不明显。
从图20-图24可以看出,实施例3随着时间的推移,荧光细胞数一直下降,至6个月(图23)、12个月(图24)时,荧光细胞数已经非常少,导致图片呈现暗色调。
综上所述,通过检测储存时间的影响,加入了本发明的实施例3和实施例4的慢病毒滴度在储存12个月后,滴度没有下降,而实施例5在12个月时,滴度下降明显。表明该稳定剂可以有效地保护慢病毒在储存过程中的稳定性。
总结:经验证,使用本发明的慢病毒在-80℃储存6个月后滴度没有任何下降,冻融一次后滴度没有明显下降,冻融三次后滴度损失仅10%,符合慢病毒的生产、运输和使用过程中的储存要求。本发明使用的冻存液组分均为GMP级别的原料,可满足临床应用要求,成分简单,使用步骤少,不需要使用额外的仪器设备,容易进行质量控制。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。