CN107312799B - 慢病毒载体冻存保护液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液，包括以下体积分数的组分：含NaCl的tris‑HCl缓冲溶液88‑97％，B27无血清添加剂1‑10％，CD‑Lipid浓缩液1‑6％，人血清白蛋白(HSA)溶液1‑8％；其中，所述含NaCl的tris‑HCL缓冲溶液中，tris‑HCl的摩尔浓度为0.8‑20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08‑0.15M；所述含NaCl的tris‑HCl缓冲溶液的pH值为7.0‑8.0。该冻存保护液能在较低温下长期保存慢病毒载体而不影响其活性，还能在使用过程中反复冻融以及在较长时间暴露于有机体体温或室温后，仍然能够保持符合使用要求的慢病毒载体活性。本发明还提供了冻存保护液的制备方法和应用。

Description

慢病毒载体冻存保护液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒载体冻存保护液及其制备方法和应用。

背景技术

随着基因治疗技术的发展，在治疗人类疾病方面病毒载体得到了越来越多的应用。其中，慢病毒载体是常用的病毒载体，它是在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效地将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正RNA，其基因组进入细胞后，在细胞浆中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白。与其他病毒载体相比，慢病毒载体的基因表达作用持续且稳定，能将目的基因有效整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。因此，慢病毒已成为基因治疗和体外基因修饰的主要载体。

然而，慢病毒载体的稳定性低、容易失活，为了维持病毒载体的结构完整性必须在相对低温下维持和运送这类制剂以便维持其生物活性。慢病毒载体生物活性的丧失多发生在贮存保藏阶段。而携带目的基因的重组慢病毒载体一般制成液体制剂超低温(例如不高于-60℃)下保存，在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。而在冷冻点以下的温度保存稳定的主要挑战之一就是防止结构性和功能性成分在冷冻期间和保存阶段的物理性破坏。另外，超低温保存的时间过长在使用过程中反复冻融或者使用不当，重组慢病毒载体的生物活性(一般以病毒滴度来表示)往往会迅速大幅下降，从而限制了它的正常使用。

现有技术中通常通过体外添加冻存保护剂来保存慢病毒的活性，例如牛血清或培养基，但在培养基中冻存3个月内的慢病毒的活性急剧下降，牛血清保存的慢病毒中还存在潜在的致病因子，并造成慢病毒批间稳定性不一致。也有针对慢病毒设计的冻干制剂配方，这类试剂虽能有效保存病毒载体的活性，但试剂的成份复杂，制备较繁琐，并不利于制剂质量的控制。

因此亟需一种成分简单、能在较低温下长期保存慢病毒载体且不影响其活性的冻存保护试剂。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液及其制备方法，它能在较低温下长期保存慢病毒载体，维持其结构的完整性，不影响其活性，还能在使用过程中反复冻融以及在较长时间暴露于有机体体温或室温后，仍然能够保持符合使用要求的慢病毒载体活性。

第一方面，本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液，包括以下体积分数的组分：

88-97％的含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，1-10％的B27无血清添加剂，1-6％的CD-Lipid浓缩液，1-8％的人血清白蛋白(HSA)溶液；其中，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0。

进一步优选地，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCl的摩尔浓度为0.88-10mM，NaCl的摩尔浓度为0.088-0.1M。

进一步优选地，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCL的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M。

优选地，所述慢病毒载体冻存保护液中，所述CD-Lipid浓缩液的体积分数为1-5％。进一步优选为1％。

优选地，所述慢病毒载体冻存保护液中，所述人血清白蛋白(HSA)溶液的体积分数为1-5％。进一步优选为1％。

进一步优选地，所述慢病毒载体冻存保护液中包括以下体积分数的组分：

88-97％的含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，1-10％的B27无血清添加剂，1-5％的CD-Lipid浓缩液，1-5％的人血清白蛋白溶液；其中，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0。

本发明中，所述人血清白蛋白(HSA)溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。

本发明中，所述CD-Lipid浓缩液为化学成分确定的脂质物质CD-Lipid(Chemically Defined Lipid Concentrate)浓缩的脂质乳液，具体包括以下各成分：

花生四烯酸(Arachidonic Acid)：2.0mg/L，胆固醇(Cholesterol)：220.0mg/L，DL-α-生育酚乙酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)7.0mg/L，亚油酸(Linoleic Acid)：10.0mg/L，亚麻酸(Linolenic Acid)：10.0mg/L，十四烷酸(Myristic Acid)：10.0mg/L，油酸(Oleic Acid)：10.0mg/L，棕榈酸(Palmitic Acid)：10.0mg/L，十八酸(Stearic Acid，又称硬脂酸)：10.0mg/L，吐温-80：2200.0mg/L，普朗尼克F-68(Pluronic F-68)：90.0g/L，余量为乙醇。

在本发明一具体实施方式中，所述CD-Lipid浓缩液可购买自Gibco公司。

本发明的所述慢病毒载体冻存保护液中，在tris-HCl缓冲溶液中添加NaCl，得到含NaCl的tris-HCl缓冲溶液具有合适的稳定离子强度，采用它作为后续配制所述慢病毒载体冻存保护液成分，可以提高所述慢病毒载体冻存保护液的稳定性，并维持很好的渗透压，维持慢病毒载体等渗，有利于长期保持病毒载体的结构完整性，避免结构性和功能性成分被物理性破坏。

本发明在含NaCl的tris-HCl缓冲溶液中加入B-27无血清添加剂和成份确定的脂质物质CD-Lipid、人血清白蛋白得到所述慢病毒载体冻存保护液。其中，B-27无血清添加剂含有人体白细胞抗原HLA-B27，它能有效避免蛋白质变性，能亲和慢病毒载体的包膜糖蛋白，保护病毒外壳蛋白，防止其失活。CD-Lipid能对慢病毒载体的包膜蛋白上的氨基酸残基形成保护层，在一定程度上提高慢病毒载体的稳定性。人血清白蛋白溶液能在冻存慢病毒复苏之后提供适于慢病毒生存的营养环境，帮助慢病毒从冻存状态快速恢复。在后续将慢病毒载体回输至人体时会起到血浆容量扩充剂的作用，且不会如牛血清(FBS)等非人体成分一样引起过敏反应。此外，人血清白蛋白、B-27、CD-Lipid等大分子物质构成了成分丰富多元的营养体系，能在慢病毒冻存的过程中提供了稳定的、直接的营养供给，保证了慢病毒存活率；在温度下降的过程中，它们形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了慢病毒因温度下降时，冰晶的形成造成慢病毒结构的物理损伤(尤其是包膜蛋白和脂双层)甚至死亡，从而有利于长期保持病毒载体的结构完整性，提高慢病毒载体的复苏成活率，并保持其病毒活性。

本发明第一方面提供的慢病毒载体冻存保护液的配比合理，成分简单、组成明确，加入所述冻存保护液的慢病毒能在-80℃的超低温条件下，稳定保存6-12个月，且感染活性也能维持其最大感染活性的90％；还能在4℃下稳定保存1-3个月，活性维持在其最大感染活性的70％左右，从而保证了临床使用该慢病毒载体时的有效剂量和长效保存性。本发明冻存液中所有组分的构成明确，可以工业化生产，原材料价格便宜、易获取，具有低成本优势。

第二方面，本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

将NaCl加入到tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0；

将所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液、B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为88-97％、1-10％、1-6％和1-8％进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

优选地，在将所述慢病毒载体冻存保护液进行混合之前将各组分分别采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤。

本发明第二方面提供的慢病毒载体冻存保护液的制备方法，方法简单易操作，制备成本较低，易于产业化生产。

第三方面,本发明提供了一种如第一方面的慢病毒载体冻存保护液在慢病毒载体冻存和/或复苏中的应用，包括：

取上述慢病毒载体冻存保护液；提供慢病毒载体；

向所述慢病毒载体中加入上述慢病毒载体冻存保护液，重悬后，得到慢病毒重悬液；冻存所述慢病毒重悬液，得到冻存的慢病毒载体。

优选地，所述慢病毒重悬液中，慢病毒载体的活性滴度为1.0×10⁷TU//mL-1.0×10⁹TU/mL(转导单位/毫升)。

优选地，冻存的所述慢病毒载体为转运抗CD19分子的可变区的重组慢病毒。

在本发明的其他实施方式中，所述慢病毒载体还可为携带抗肿瘤抗原NY-ESO-1、抗间皮素Mesothline、或抗淋巴瘤抗原BCMA的重组慢病毒。

优选地，所述冻存的具体操作为：将所述慢病毒重悬液经过过滤后，分装于多个冻存管中，将多个冻存管，速冻后，保持于-80℃环境中。其中，所述速冻可以在干冰或液氮罐中进行。

进一步优选地，在冻存结束后，还包括将所述冻存后的慢病毒载体进行复苏，所述复苏的方法包括：

将冻存后的慢病毒载体置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至完全融解，得到复苏后的慢病毒载体。

复苏后的慢病毒载体可进行后续病毒活性检测实验、细胞转染实验等，也可以直接回输人体。

采用所述冻存保护液冻存后的慢病毒载体，在刚冻存时，其活性滴度为1.0×10⁷TU//mL-1.0×10⁹TU/mL。在-80℃的超低温条件下冻存12个月以后，其有效活性滴度仍能达到刚冻存时的90％；在4℃下保存1-3个月，其有效活性滴度仍能达到其最大感染活性的70％左右。所述冻存的病毒载体经1次冻融(冻存-复苏)后，滴定降到冻融前的80％-85％，经多次反复冻融后，仍具有一定的病毒活性。这说明，本发明提供的所述慢病毒载体冻存保护液极大地提高了慢病毒在低温条件下的保存时间，并对反复冻融的破坏性条件表现出一定的保护性。

与冻干保护制剂相比，所述冻存保护液对重组慢病毒的保护能力与冻干保护制剂相当，但是成分少，制备更为简单，保护液中原料来源都有商品化的临床试剂，使用时，减少了对原材料复杂的质控过程，也节约了人力和监控成本，些保护剂适应用重组慢病毒的临床研究使用，普通的实验室不需要价格昂贵的冻干设备，也能制备出临床使用的重组慢病毒制剂。

本发明第三方面提供的应用，该慢病毒载体冻存保护液能在较低温下长期保存慢病毒载体，维持其结构的完整性，不影响其活性，还能在使用过程中反复冻融以及在较长时间暴露于有机体体温或室温后，仍然能够保持符合使用要求的慢病毒载体活性。

第四方面，本发明提供了一种慢病毒载体制剂，包括慢病毒载体和第一方面所述的慢病毒载体冻存保护液。

优选地，所述慢病毒载体制剂中，所述慢病毒载体的活性滴度为1.0×10⁷个/mL-1.0×10⁹TU/mL。

所述慢病毒载体制剂可进行细胞转染实验、病毒活性检测实验等，也可以直接回输人体，而无需经过额外的处理工序，从而减少操作流程，降低污染概率。

如果以注射方式给药，本发明所述重组慢病毒载体制剂的注射用量可以为本领域常用的剂量，至多300微升、一般1-200微升、优选50-150微升；如选择视网膜下腔注射方式时，人每只眼睛一次注射剂量为50～150微升，优选100微升。其中给予人类受试者的有效量一般为2×10⁶-2×10¹⁰TU/个体。

本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。

附图说明

图1为不同冻存保护液在-80℃条件下对CAR19重组慢病毒载体进行保存不同时间后，对其活性的影响图；

图2为反复冻融次数对在不同冻存保护液中的CAR19重组慢病毒载体(即，对不同CAR19重组慢病毒制剂)活性的影响图，其中(a)为本发明实施例1-4的结果，(b)为对照组1-4的结果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

本发明中，“病毒载体”是指缺乏自我复制能力，具有将核酸分子导入宿主内部的能力的病毒颗粒。而“慢病毒载体”是指以灵长类免疫缺陷病毒来源的一种病毒载体，它包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。“重组”病毒载体是指通过基因重组技术构建的病毒载体。利用编码病毒基因组的DNA和包装细胞构建的病毒载体包含在重组病毒载体中。

本发明所述重组慢病毒载体可以进一步含有来自其它病毒的被膜蛋白。例如，作为这种蛋白质，最好是来自感染人类细胞的病毒被膜蛋白。对这种蛋白质没有特别的限定，可例举出逆转录病毒的兼嗜性病毒手皮膜蛋白等，例如可以使用来自小鼠白血病病毒(MuMLV)4070A株的被膜蛋白。另外，也可以使用来自MuMLV 10Al的被膜蛋白。另外，作为疱疹病毒科的蛋白，可以举出例如，单纯性疱疹病毒的gB、gD、gH、gp85蛋白，EB病毒的gp350、gp220蛋白等。作为嗜肝病毒科的蛋白，可以例举出B型肝炎病毒的S蛋白等。所述被膜蛋白还可为麻疹病毒糖蛋白与其他单链抗体融合后形成。

慢病毒载体的包装通常采用瞬时转染或采用细胞系包装。瞬时转染时可以用作包装细胞使用的人类细胞株，例如包括293细胞、293T细胞、293FT细胞、293LTV细胞、293EBNA细胞及其他的从293细胞分离的克隆；SW480细胞、u87MG细胞、HOS细胞、C8166细胞、MT-4细胞、Molt-4细胞、HeLa细胞、HT1080细胞、TE671细胞等。也可以采用来源于猴子的细胞株，例如，COS1细胞、COS7细胞、CV-1细胞、BMT10细胞等。而且，通常采用的磷酸钙和PEI转染试剂，还有一些转染试剂如Lipofectamine2000、FuGENE和S93fectin也被经常使用。

慢病毒的包装也采用一些慢病毒包装细胞系，如使用最普遍的Env糖蛋白、VSVG蛋白或HIV-1gag-pol蛋白所产生的稳定细胞系。

为了安全起见，大规模使用的慢病毒载体系统都是采用分割基因组的方法，即将起不同辅助功能的基因定位于不同的质粒。目前有四质粒系统(编码gag-pol基因、Rev基因、VSVG基因、SIN转移基因分别位于四个不同的质粒)、俄三质粒系统(去掉了编码Rev基因的质粒，在gag-pol质粒中gag-pol基因采用了在人细胞中偏爱性的密码子)和二质粒系统(慢病毒载体包装所必需的辅助基因位于同一个质粒上，这些辅助基因是单一的基因序列；另一个则是转基因质粒)。也有超过四质粒系统的慢病毒包装系统在使用。

本发明提及的重组慢病毒载体实质上可以进行完全纯化。纯化方法包括过滤器过滤、离子交换层析、超滤、分子筛、核酸酶消化、过滤除菌等己知的纯化/分离方法来进行。通常，在小规模制备时，也采用高速离心的方法。例如将载体悬液通过0.45μm的过滤器进行过滤后，在42500xg、4℃下进行离心90分钟，可以对载体进行沉淀和浓缩。

优选地，所述重组慢病毒载体为灵长类的重组慢病毒载体，即重组人免疫缺陷病毒载体(HIV)或重组猴免疫缺陷病毒载体(SIV)。

进一步地，所述重组慢病毒载体可为携带任何目的基因的SIV或HIV载体。

优选地，所述重组慢病毒载体携带一些单基因，例如RPE65等。这些基因的突变、缺失通常会导致一些遗传性疾病。通过慢病毒载体携带一些正确的基因感染特定的干细胞，再回输病人体内，从而达到较好的治疗效果。

以下为本发明实施例中所采用的各原料的厂家品牌与货号：

表1原料表

实施例1：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

将NaCl加入到tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为97％、1％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例2：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为96％、2％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例3：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为93％、5％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例4：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为88％、10％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例5：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为92％、2％、5％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例6：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为92％、2％、1％和5％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

实施例7：

一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：

按实施例1的方法配制含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；

将上述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液与B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为88％、2％、5％和5％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

为突出本发明的有益效果，设置以下对比实施例：

对比例1：

一种冻存液，该冻存液为含NaCl的tris-HCl缓冲溶液(与实施例1中的原料相同)，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0。

对比例2：

一种冻存液，该冻存液为含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0。

对比例3

一种冻存液，包括以下体积分数的各组分：99％的含NaCl的tris-HCl缓冲溶液和1％的人血白蛋白(HSA)溶液，其中，含NaCl的tris-HCl缓冲溶液这一原料与实施例1中相同，即，pH值为8.0，tris-HCl、NaCl在所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液中的摩尔浓度分别为10mM、0.1M。

对比例4：

一种冻存液，该冻存液为市售的X-VIVO培养基(Lonza，货号04-744Q)。

对比例5：

一种冻存液，该冻存液为市售的胎牛血清(FBS)溶液，其中，FBS的质量分数为25％。

制备实施例转运CAR CD19的慢病毒载体的制备(包括纯化)

CD19是血液系统中B细胞的特异性标志物，分布于正常人体的B淋巴细胞和前B淋巴细胞，随着B淋巴细胞分化为成熟浆细胞，CD19的表达也逐渐消失。CD19分子是免疫球蛋白超家族成员之一，通过与B细胞上的B细胞受体(BCR)的结合参与B细胞发育、细胞内信号传导等过程。嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T Cells，CAR-T)靶向性抗肿瘤细胞免疫技术是将包括识别B细胞特异性抗原CD19的单链抗体(scFv)、铰链区、跨膜区、胞内信号区(免疫受体酪氨酸活化基序ITAM)和胞内信号区共刺激分子传导结构域的嵌合抗原受体表达于慢病毒载体，并将该载体转染至自体T细胞，使修饰后的CART-19细胞具有靶向性，能特异性地识别并杀伤表达B细胞特异性抗原CD19的白血病细胞和淋巴细胞。

包装转运CAR CD19的慢病毒采用三质粒包装体系瞬转人类胎儿肾细胞293T，pmd2G质粒提供病毒包膜蛋白VSVG，pspax2质粒提供病毒组装蛋白gag-pol，pwpxld质粒重组构建携带CAR CD19的结构域(pwpxld-CAR CD19)。pwpxld-CAR CD19，是将CD19分子的单链抗体序列与T细胞共刺激信息序列重组到pwpxld质粒中的重组慢病毒转运载体。

具体地，转运CAR CD19的慢病毒载体的制备过程如下：

1、包装转运CAR CD19的慢病毒

1)将来自人类胎儿肾细胞的细胞株239T细胞按照密度为2E+08个/瓶接种到一个1720cm²多层细胞培养瓶中，在560mL的高糖DMEM培养基中进行培养24小时；

第二天开始转染，每个多层细胞培养瓶需要使用600μg的DNA，其中，转染用的质粒DNA的质量比为慢病毒转运载体(pwpxld-CAR CD19)：慢病毒包装载体(pspax2)：慢病毒外膜载体(pmd2G)＝5:3：2，即每个多层细胞培养瓶需用pwpxld-CAR 300μg，pspax2 180μg，pmd2g 120μg；并向每个多层细胞培养瓶加入1800μg的PEI转染试剂。

其中，慢病毒转运载体(pwpxld)来源于Addgne公司，货号12258，慢病毒包装载体(pspax2)来自Invitrogen公司，货号VT1444，慢病毒外膜载体(pmd2G)来自Invitrogen公司，货号VT1443；

2)制备DNA-PEI复合物：分别取20mL的无血清培养基Opti-MEM(Gibco，货号：31985-070)，加入到两支50mL离心管中，一支标记DNA，另一支标记为PEI，按上面计算的各质粒用量，加入到DNA管中，并将相应的PEI加入到PEI管中，分别混匀两管中的物质，将两管中的溶液相混合，并在室温下静置20min以形成含DNA-PEI复合物的溶液。

3)将上述DNA-PEI复合物溶液滴加到560mL无血清Opti-DMEM培养基中，混匀；

去除培养瓶中的生长培养基，替换成已加入DNA-PEI复合物的无血清培养基，然后置于5％CO₂的细胞培养箱进行孵育转染，待转染6个小时后，注入560mL预热的含10％胎牛血清FBS和丁酸钠的高糖培养基D-MEM，放入CO2培养箱中进行培养。

4)收获病毒上清：转染后48小时，回收病毒上清液，并对其用0.45um的滤杯过滤，收获病毒载体样品溶液，并在4℃下保存。

2、CAR CD19慢病毒纯化

1)在37℃下采用Benzonase(核酸酶)处理过滤后的病毒上清0.5小时，其中Benzonase的用量为0.5U/mL；

2)切向流将上清液浓缩成100倍；

3)采用离子层析柱(PALL，MustangQ柱，货号XT5MSTGQPM6)来纯化浓缩过的上清，采用含10mM的Tris-HCl,0.8M的NaCl的混合溶液进行洗脱，收集洗脱液，得到洗脱后的病毒液；

4)将经离子层析洗脱后的病毒液浓缩成5-10倍体积，分别置换到5mL实施例1-7及对比例1-5的冻存液中，然后进行分装，无菌分装后，对于采用同一冻存液的来说，随意取一小部分样品进行滴度检测，其他剩余样品用碎干冰速冻后储存在-80℃。

本发明中病毒滴度的测定

以下所述的检测方法适用于检测冻存前的病毒载体活性，以及冻存30、60、180、360天复苏的病毒载体活性，及反复冻融的病毒载体活性。

1)第一天上午将人肉瘤细胞HT1080接种到12孔细胞板，每孔加入0.5mL的含10％胎牛血清(FBS)的D-MEM培养基，确保每个孔接种1E+05个细胞，将细胞板板放于培养箱中，培养2小时，向每孔中加入0.1μL的上述病毒样品溶液，每孔补加0.5μL、8mg/mL的polybrene(聚凝胺，基因转染增强剂)，放置于培养箱中过夜培养；

2)第二天吸净加入有病毒样品的孔内的上清液，替换成1mL的含10％胎牛血清(FBS)的D-MEM培养基，继续培养24小时；

3)第三天上午消化细胞，取一半的细胞做染色，具体操作为：采用流式缓冲液(D-PBS+3％FBS，D-PBS为杜氏磷酸盐缓冲液)来清洗细胞一遍，然后将细胞重悬到100μL的预冷的流式液(D-PBS+3％FBS)中，再加入4μL的羊抗鼠IgG Fab片段的荧光抗体(goat Anti-Mouse IgG(Fab specific)-FITC)，在4℃冰箱孵育30min后，采用室温放置的D-PBS漂洗三遍，上机检测FITC阳性比例的细胞(即，具有FITC荧光颜色的细胞)，按照以下公式计算病毒滴度：

计算滴度的公式为：病毒液滴度(TU/mL)＝接种的细胞数×(阳性比例细胞的百分数/100)/加入病毒的量(mL)。

举例来说，若每孔接种的HT1080细胞数为1E+05个，每孔加入10μL的病毒原液时，流式检测到带荧光的细胞数为80％，则滴度为：1E+05接种的细胞数*80％阳性比例细胞/100/(10μL/1000)mL＝8E+06TU/mL。

应用实施例：

以下探讨本发明实施例提供的慢病毒载体冻存保护液在慢病毒载体的冻存和/或复苏中的应用，本应用实施例采用上述方法提供纯化的转运CAR19的慢病毒载体作为研究对象，当然并不限于使用该种病毒载体。

具体地，所述应用包括：

按上述方法提供纯化的转运CAR19的慢病毒载体，之后将CAR19慢病毒分别置换到本发明实施例1-7提供的慢病毒载体冻存保护液(分别记作保存剂1-7)中，重悬得到CAR19慢病毒重悬液，同时以对比例1-5的溶液(分别记作对照1-5)作为对照。

1、不同冻存保护液在-80℃条件下对CAR19重组慢病毒载体保存不同时间后，对其活性的影响

将重悬在不同冻存液中的重组慢病毒载体经过滤、分装后，检测冻存前的病毒样品的滴度，并将同一实验组剩余的病毒样品用碎干冰速冻后，在-80℃下分别保存0d(即冻存当日)，60d，180d，360d，之后从-80℃取出，立即放入37℃水浴锅中，迅速晃动直至完全解冻，得到复苏后的慢病毒载体。解冻后随即放于冰上进行活性滴度检测，结果如图1所示。

2、反复冻融对CAR19重组慢病毒制剂载体活性的影响

将重悬在不同冻存液中的重组慢病毒载体样品在冻存前立即进行滴度检测，即得到冻融前样品的滴度；

将各组样品放入液氮中速冻，冻10分钟后取出，随即放入37℃水浴锅中，时时晃动，直至观察到各组中的不同溶液完全解冻后，立即取出，记为冻融1次。随后又立即放入液氮中速冻，冻10分钟后取出，随即放入37℃水浴锅中，时时晃动，观察到各组中的不同溶液完全解冻后，立即取出，记为冻融2次。依次循环，直至冻融5次、8次。将冻融前的样品、冻融5次的样品和冻融8次的样品进行滴度检测，结果如图2所示。

其中，图1中在不同时间点下采用各试剂的病毒滴度如下表1所示：

其中，图2中采用各试剂的病毒在不同冻融次数下表2所示的滴度如下：

从图1及表1中可以看出，CAR19慢病毒保存在本发明实施例3提供的保存剂3中，在-80℃条件下即使在冻存360天后，其有效活性滴度仍能达到冻存时的90％，远高于其他实验组中的病毒活性滴度(也高于FBS的)，而且在整个冻存过程中，相对于采用FBS作为冻存液来说，病毒在其中的活性滴度变化较平缓。冻存效果其次较好的依次是保存剂7，保存剂2，保存剂5和保存剂6。整体来说，保存剂1-7均比对比例1-4的效果好。

如图2及表2所示，在采用保存剂1-4的病毒样品经反复冻融后(图2)，1次冻融后，活性滴度降到冻融前的80％-85％，5次冻融后降为冻融前的30％-47％，8次冻融后，活性滴度为10％左右，与对照组1-4相比，这说明了本发明提供的慢病毒载体冻存保护液极大地提高了CAR19慢病毒在超低温条件下的保存时间，且对其活性的影响不大，并对反复冻融的破坏性条件表现出一定的保护性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种慢病毒载体冻存保护液，其特征在于，包括以下体积分数的组分：

88-97％的含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，1-10％的B27无血清添加剂，1-6％的CD-Lipid浓缩液，1-8％的人血清白蛋白溶液；其中，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0。

2.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存保护液，其特征在于，所述慢病毒载体冻存保护液中，所述CD-Lipid浓缩液的体积分数为1-5％。

3.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存保护液，其特征在于，所述含NaCl的tris-HCL缓冲溶液中，tris-HCL的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M。

4.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存保护液，其特征在于，所述人血清白蛋白(HSA)溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。

5.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存保护液，其特征在于，所述CD-Lipid浓缩液包括以下各组分：

花生四烯酸：2.0mg/L，胆固醇：220.0mg/L，DL-α-生育酚乙酸酯7.0mg/L，亚油酸：10.0mg/L，亚麻酸：10.0mg/L，十四烷酸：10.0mg/L，油酸：10.0mg/L，棕榈酸：10.0mg/L，十八酸：10.0mg/L，吐温-80：2200.0mg/L，普朗尼克F-68：90.0g/L，余量为乙醇。

6.一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将NaCl加入到tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl的tris-HCl缓冲溶液，其中，tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0；

将所述含NaCl的tris-HCl缓冲溶液、B27无血清添加剂、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为88-97％、1-10％、1-6％和1-8％进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。

7.一种如权利要求1-5任一项所述的慢病毒载体冻存保护液在慢病毒载体冻存和/或复苏中的应用，其特征在于，包括：

取上述慢病毒载体冻存保护液；提供慢病毒载体；

向所述慢病毒载体中加入上述慢病毒载体冻存保护液，重悬后，得到慢病毒重悬液；冻存所述慢病毒重悬液，得到冻存的慢病毒载体。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述慢病毒重悬液中，慢病毒载体的活性滴度为1.0×10⁷TU//mL-1.0×10⁹TU/mL。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，冻存结束后，将所述冻存后的慢病毒载体进行复苏，所述复苏的方法包括：

将冻存后的慢病毒载体置于37℃水浴锅中，迅速晃动直至完全融解，得到复苏后的慢病毒载体。

10.一种慢病毒载体制剂，其特征在于，包括慢病毒载体和如权利要求1-5任一项所述的慢病毒载体冻存保护液。

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