CN112189658A

CN112189658A - 慢病毒载体冻存液及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN112189658A
Application number: CN202011268914.8A
Authority: CN
Inventors: 孙秀莲
Original assignee: Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yiming Suzhou Cell Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2020-11-13
Filing date: 2020-11-13
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明提供了一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：羟乙基淀粉注射液0.5％‑10％；人血清白蛋白溶液0.5％‑10％；无血清培养基70％‑95％；DMSO 4％‑10％。本发明的冻存液可以长期、稳定地保存慢病毒载体，在保存过程中慢病毒载体的生物学活性可以得到很好的维持和保护。本发明还提供了冻存液的制备方法和应用。

Description

慢病毒载体冻存液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及慢病毒载体技术领域，特别是涉及一种慢病毒载体冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

慢病毒载体是常用的病毒载体，是CAR-T细胞工程的主要传递载体。然而，由于慢病毒本身的生物学特性导致其生物活性不稳定，因此在载体制备及保存过程中需要严格控制操作方法，以维持载体的结构完整性及生物学活性。与细胞类似，慢病毒载体需要在超低温环境中保存及运输，使用前进行解冻。冻存时间过长或者反复冻融都会使慢病毒载体的生物学活性迅速下降，使其降低甚至失去感染细胞的能力，不能完成目的基因的整合及表达。因此慢病毒载体冻存时一般需要加入保护剂，防止冷冻过程中冰晶等对病毒载体结构造成伤害。

目前常用的保护剂一般是胎牛血清、培养基等。胎牛血清作为一种动物来源的物料，可能存在潜在的致病因子，而CAR-T细胞的制备过程中严格控制动物来源成分物料；而在培养基中冻存慢病毒载体，冻存时间较短，一般3个月左右其活性快速降低，不能满足慢病毒载体大规模生产保存要求。

因此，需要一种改进的慢病毒载体冻存液，能够在超低温环境下长期稳定地保存慢病毒载体并维持其生物学活性。

发明内容

本发明的目的是要提供一种能在超低温环境下长期保存慢病毒载体且不影响其活性的冻存液。

特别地，本发明提供了一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

可选地，慢病毒载体冻存液包括以下体积分数的各组分：

可选地，羟乙基淀粉注射液为羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠的灭菌水溶液。

可选地，人血清白蛋白溶液中含有质量浓度为20％的人血白蛋白。

可选地，无血清培养基选自无血清DMEM基础培养基、无血清DMEM/F12培养基、无血清X-VIVO15培养基。

本发明还提供一种前述的慢病毒载体冻存液的制备方法，包括步骤：

1)按照体积分数配比向无菌容器内加入羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清培养基，混合均匀，得到混合物；

2)混合物与DMSO分开存放，使用时将混合物与DMSO混合。

可选地，羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清培养基在室温条件下混合。

本发明还提供一种前述的慢病毒载体冻存液的应用，其中冻存液用于慢病毒载体的保存。

可选地，慢病毒载体冻存液的应用包括：

将羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清培养基在室温条件下混合均匀，得到混合物；

向慢病毒载体中加入混合物，进行回溶；

回溶后，向其中加入DMSO，冻存。

本发明的慢病毒载体冻存液的优点在于：

1)可以长期、稳定地保存慢病毒载体，在保存过程中慢病毒载体的生物学活性可以得到很好的维持和保护；还可以在使用过程中反复冻融；

2)成分简单，构成明确，易获取，成本低，可以实现工业化生产应用；

3)应用步骤简单，操作方便。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下文中采用非限定性实施例作进一步说明。

实施例1

一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

其中，羟乙基淀粉注射液为羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠的灭菌水溶液，每500mL含羟乙基淀粉130/0.4 30g、氯化钠4.5g，其中含羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠均应为标示量的95.0％-105.0％。人血清白蛋白溶液中含有质量浓度为20％的人血白蛋白，辅料为辛酸钠、氯化钠、灭菌注射用水，规格可以为10g(20％，50mL)*1瓶。

实施例1的慢病毒载体冻存液的制备方法，包括步骤：

1)按照前述的各组分配比向无菌容器内加入羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清X-VIVO15培养基，在室温条件下混合均匀，得到混合物；

2)步骤1)得到的混合物与DMSO分开存放，使用时将混合物与DMSO混合。

步骤1)中，羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清X-VIVO15培养基的加入顺序不限。

实施例1的慢病毒载体冻存液可以用于慢病毒载体的保存，包括步骤：

将羟乙基淀粉注射液、人血清白蛋白溶液、无血清X-VIVO15培养基在室温条件下混合均匀，得到混合物；

向慢病毒载体中加入混合物，进行回溶；

回溶后，向其中加入DMSO，冻存。

通常是向超速离心纯化后的慢病毒载体沉淀中加入混合物来进行回溶。

对比例1

一种冻存液，是PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)，为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的无钙镁离子的PBS缓冲，型号PB2004Y。

对比例2

一种冻存液，是淋巴细胞培养基，为LONZA公司的X-VIVO15，货号04-418Q。

下面以实施例1的慢病毒载体冻存液、对比例1的冻存液、对比例2的冻存液为例，对冻存液的应用过程及效果进行示例性详述。

冻存液的应用过程具体包括以下步骤：

(1)将293T细胞按照接种密度0.8-1.2×10⁷个/皿接种于100mm培养皿中培养过夜，以聚乙烯亚胺(PEI)为转染试剂，将GFP质粒(pLent-mir-GFP-puro)、psPAX2质粒及pMD2.G质粒加入到前述的培养皿中进行转染，将培养皿置于37℃、5％CO₂培养箱中转染70h，得到GFP慢病毒载体悬液。

其中，293T细胞的培养基为DMEM完全培养基(在DMEM基础培养基500mL中加入胎牛血清55mL，混匀)，培养过夜的时间一般为16-24h。前述的质粒均为济南宜明医疗科技有限公司生产制品。可以根据实验要求选择具体的转染时间，在转染时间24-72h内收获的慢病毒载体均可以使用本发明的冻存液冻存。

每100mm培养皿中质粒的加入量为GFP：psPAX2：pMD2.G＝10μg：6μg：3μg；PEI溶液的浓度为1μg/μL，用量为质粒总量的3-4倍。以转染3个100mm培养皿为例，转染具体过程包括：首先，计算出质粒用量：转染3个100mm培养皿，各质粒的用量为GFP：psPAX2：pMD2.G＝30μg：18μg：9μg；然后，取无菌离心管1支，加入无血清DMEM基础培养基2.8mL，再加入前述的三种质粒，混匀，室温孵育5min，再向该离心管中滴加200μL PEI溶液，混匀，孵育30min，得到质粒PEI混合物；最后，按照1mL/皿将孵育好的前述的质粒PEI混合物加入到培养皿中进行转染。

(2)本次共转染9皿293T细胞，将转染完成的GFP慢病毒载体悬液平均分成3份，加入到超速离心管中，25000g，4℃，离心2h以超速离心纯化GFP慢病毒载体。

(3)超速离心结束，弃掉各组的上清液，得到三组GFP慢病毒载体沉淀，标记为1号、2号、3号，分别向1号、2号、3号GFP慢病毒载体沉淀中加入450μL实施例1的混合物、500μL对比例1的冻存液、500μL对比例2的冻存液，在2-8℃过夜进行GFP慢病毒载体回溶，在过夜回溶后的1号中加入50μL DMSO，得到回溶后的三种GFP慢病毒载体重悬液。其中，回溶过夜的时间一般为12-24h。

(4)将回溶后的三种GFP慢病毒载体重悬液按照100μL/管分别转移至1mL冻存管中，每种各4管，冻存于-80±5℃超低温冰箱中，得到三种GFP慢病毒载体制剂。

(5)分别在冻存24h、1个月、3个月、6个月后，将每种GFP慢病毒载体制剂分别取1管进行滴度检测。

采用有限稀释法进行滴度检测，包括以下步骤：

首先，提前4-6h按照1×10⁴个细胞/孔的量接种293T细胞至96孔细胞培养板中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养，孔内采用的培养基为DMEM完全培养基；

取8支1.5mL无菌离心管，编号1号-8号，每个管内先加入108μL无血清DMEM基础培养基；

在1号管内加入12μL解冻后的慢病毒载体制剂，混匀，其中解冻条件为室温解冻；吸取1号管中的混合液12μL加入到2号管中，混匀；再吸取2号管中的混合液12μL加入到3号管中，混匀；按照顺序依次稀释至8号管，得到8个不同稀释程度的混合液。

其次，取出准备好的接有293T细胞的96孔细胞培养板，吸弃孔内的培养基，按照顺序依次向孔内加入1号-8号管的混合液100μL/孔，并做好标记，例如，A1孔内加入1号管内的稀释10倍的混合液，A2孔内加入2号管内的稀释100倍的混合液，依次类推，A8孔内加入8号管内的稀释10⁸倍的混合液，再将96孔细胞培养板放入37℃、5％CO₂培养箱中培养72h。

最后，取出96孔细胞培养板，在荧光显微镜下查看每孔带有荧光的细胞数，记录各孔的荧光细胞数量，计算出滴度。计数统计方式及计算公式如下表1所示。

表1滴度计数统计方式及计算公式

将计算得到的8个滴度值平均后得到实际滴度数据。

在不同时间点下采用三种冻存液的滴度如下表2中所示：

表2不同时间点下采用三种冻存液的滴度数据

从表2的滴度检测结果可以看出，实施例1的冻存液可以长期、稳定地保存慢病毒载体，在保存过程中，慢病毒载体的生物学活性(滴度)可以得到很好的维持和保护。同时，实施例1的冻存液中成分无动物源成分，可以在CAR-T细胞培养过程中直接使用。对比例1的冻存液虽然成分单一，但是无论在短期冻存还是长期冻存中都不能维持慢病毒载体的生物学活性，不适于用做慢病毒载体的冻存液。对比例2的冻存液在慢病毒载体短期冻存时可以较好地保持载体的生物学活性，但是随着冻存时间增长，载体的滴度快速下降，不适宜慢病毒载体的长期冻存。可见，本发明得到了一种能够长期稳定有效冻存慢病毒载体的冻存液。

可以理解，本发明提供的冻存液是冻存慢病毒载体，对包装慢病毒载体的细胞株、培养基及转染试剂没有特殊要求。前述步骤(1)中的转染用细胞株、培养基、转染试剂均可以替换。例如，细胞株可以更换为悬浮细胞系，培养基相应地更换为悬浮细胞用培养基，转染试剂可以更换为常规的商业化转染试剂，如赛默飞世尔公司的Lipofectamine 3000试剂、Lipofectamine 2000试剂等。所用的三个质粒系统也可以更换为四质粒系统进行慢病毒载体包装。

实施例2

一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

实施例2的慢病毒载体冻存液的制备方法和应用与实施例1类似。

实施例3

一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

实施例3的慢病毒载体冻存液的制备方法和应用与实施例1类似。

实施例4

一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

实施例4的慢病毒载体冻存液的制备方法和应用与实施例1类似。

下面以实施例2和实施例3的慢病毒载体冻存液为例，分析反复冻融对慢病毒载体活性的影响。

反复冻融实验包括以下步骤：

(1)以四质粒系统包装某慢病毒载体为例，慢病毒载体标记为AK30慢病毒载体，每100mm培养皿中，质粒用量为AK30：MDL：Rev：VSVG＝7.5μg：5μg：5μg：2.5μg；PEI用量为四个质粒总量的3-4倍。共转染6个100mm皿，每3个皿为1组，共2组。质粒均为济南宜明医疗科技有限公司生产制品。四质粒系统包装的慢病毒载体收获纯化方式与实施例1中三质粒系统包装慢病毒载体的收获纯化方式相同，得到两组AK30慢病毒载体沉淀。

(2)将第一组的AK30慢病毒载体沉淀用实施例2的冻存液(无DMSO)475μL回溶24h，再滴加25μL DMSO，得到一组AK30慢病毒载体重悬液；

将第二组的AK30慢病毒载体沉淀用实施例3的冻存液(无DMSO)460μL回溶24h，再滴加40μL DMSO，得到一组AK30慢病毒载体重悬液；

每组AK30慢病毒载体重悬液均按照100μL/支，各分装4支，作为AK30慢病毒载体制剂进行反复冻融实验，其中1支用于未冻融滴度检测，1支用于反复冻融5次进行滴度检测，1支用于反复冻融10次进行滴度检测。

其中，冻融的过程为：-80℃冰箱冻存30min，取出，室温解冻(一般10min即可)，再转入-80℃冰箱冻存30min，再取出室温解冻，重复前述步骤至所需冻融次数，取样检测滴度。

因该慢病毒载体不带有荧光，故使用QPCR方法进行滴度检测，包括以下步骤：

首先，感染前4-6h在24孔细胞培养板中按照2.5E+05个细胞/孔的量接种HEK 293细胞，培养基为DMEM完全培养基。

梯度稀释慢病毒载体：取3个无菌1.5mL离心管，编号1号-3号，分别向1号-3号管中加入588μL、540μL、540μL无血清DMEM基础培养基；之后，在1号管中加入12μL前述解冻后的AK30慢病毒载体制剂，混匀，得到稀释10倍的混合液；吸取1号管中的混合液60μL至2号管中，混匀，得到稀释100倍的混合液；吸取2号管中的混合液60μL至3号管中，混匀，得到稀释1000倍的混合液。

其次，将24孔细胞培养板中的培养基吸弃，分别吸取1号-3号管中的混合液500μL按照顺序加至接种好细胞的24孔细胞培养板中(这样每个孔中所含的病毒体积分别为10μL、1.0μL、0.1μL)，做好标记，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

最后，收集细胞，提取基因组DNA；以内参Actin质粒和目的HIV质粒作为标准品原液，做梯度稀释。并准备PCR体系，按照常规加入TB Green Premix Ex Taq酶、引物、超纯水、DNA模板，加入到96孔细胞培养板中，放入QPCR仪，运行既定程序。使用QPCR结果中的HIV拷贝数结果除以Actin拷贝数结果，即为所需要的感染效率，使用感染效率乘以感染时的细胞数量即为当前梯度加入的慢病毒载体体积的滴度，结果除以当前梯度加入病毒体积(mL)，结果乘以2，即为慢病毒载体的滴度，取所有梯度的平均值即为所需滴度结果。

在不同冻融次数下采用两种冻存液的滴度如下表3中所示：

表3不同冻融次数下采用两种冻存液的滴度数据

从表3的滴度检测结果可以看出，在采用实施例2或实施例3的冻存液冻存的慢病毒载体经过反复冻融后滴度变化不大，没有出现急速地降低，说明本发明的冻存液可以很好地保护慢病毒载体的活性，为慢病毒载体应用过程中可能会出现反复冻融使用提供了保障。

实施例5

一种慢病毒载体冻存液，与实施例1相比区别仅在于，用无血清DMEM基础培养基替代无血清X-VIVO15培养基。该实施例的慢病毒载体冻存液的应用效果与实施例1的慢病毒载体冻存液类似。

实施例6

一种慢病毒载体冻存液，与实施例1相比区别仅在于，用无血清DMEM/F12培养基替代无血清X-VIVO15培养基。无血清DMEM/F12培养基为DMEM/F121：1液体培养基。该实施例的慢病毒载体冻存液的应用效果与实施例1的慢病毒载体冻存液类似。

至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

Claims

1.一种慢病毒载体冻存液，包括以下体积分数的各组分：

2.根据权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其中，包括以下体积分数的各组分：

3.根据权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其中，

所述羟乙基淀粉注射液为羟乙基淀粉130/0.4与氯化钠的灭菌水溶液。

4.根据权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其中，

所述人血清白蛋白溶液中含有质量浓度为20％的人血白蛋白。

5.根据权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其中，

所述无血清培养基选自无血清DMEM基础培养基、无血清DMEM/F12培养基、无血清X-VIVO15培养基。

6.一种如权利要求1-5任一所述的慢病毒载体冻存液的制备方法，包括步骤：

1)按照体积分数配比向无菌容器内加入所述羟乙基淀粉注射液、所述人血清白蛋白溶液、所述无血清培养基，混合均匀，得到混合物；

2)所述混合物与所述DMSO分开存放，使用时将所述混合物与所述DMSO混合。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，

所述羟乙基淀粉注射液、所述人血清白蛋白溶液、所述无血清培养基在室温条件下混合。

8.一种如权利要求1-5任一所述的慢病毒载体冻存液的应用，其中所述冻存液用于慢病毒载体的保存。

9.根据权利要求8所述的应用，其中，包括：

将所述羟乙基淀粉注射液、所述人血清白蛋白溶液、所述无血清培养基在室温条件下混合均匀，得到混合物；

向慢病毒载体中加入所述混合物，进行回溶；

回溶后，向其中加入所述DMSO，冻存。