CN116479046A - Dock8基因在调控htlv-1病毒感染中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及DOCK8基因在调控HTLV‑1病毒感染中的用途。所述用途具体为降低DOCK8基因表达水平的物质在制备体外促进HTLV‑1病毒感染的产品中的用途，DOCK8基因或其表达促进剂在制备用于抑制HTLV‑1病毒感染的产品中的应用，以及DOCK8基因或其表达促进剂在制备预防T淋巴细胞白血病的药物中的应用。本发明实验结果证明敲除DOCK8基因可以促进HTLV‑1病毒的感染与复制，提示过表达DOCK8基因可有效抑制HTLV‑1病毒感染，可为急性成人T淋巴细胞白血病(ATL)的靶向治疗奠定基础。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，DOCK8基因在调控HTLV-1病毒感染中的用途。
背景技术
人T淋巴细胞白血病1型病毒(human T-cell leukemia virus type 1,HTLV-1)与HIV-1相似，是一种与人类多种疾病密切相关的逆转录病毒，可以通过临床输血、毒品注射、性接触及母婴等途径传播。HTLV-1的潜伏期较长，感染后2％～5％的患者可发展为成人T淋巴细胞白血病(adult T-cellleukemia,ATL)。ATL起病急进展快、预后差、死亡率高。因此，有必要开展靶向精准治疗的必要。
近年来国内外多聚焦于HTLV-1病毒感染的流行病调查，其长期潜伏和致病的分子机制目前尚不清楚。发明人前期通过基因敲入技术，在Jurkat细胞(HTLV-1-CD4+T细胞，白血病细胞，悬浮细胞)上打上标签(鼠H-2Kk)，构建带标签的JurkatKI细胞模型(简称为JK40，图1)，通过细胞共培养技术，使用MT4细胞(HTLV-1+CD4+T细胞)与JurkatKI细胞(HTLV-1-CD4+T细胞)共培养，促使JurkatKI细胞带上HTLV-1病毒，并通过磁性微球分选技术分离两种悬浮细胞，构建HTLV-1+JK40细胞模型(图2)，通过RNA测序技术，进行HTLV-1+JK40细胞、JK40细胞测序，并进行结果分析，筛选出一种细胞差异性表达的分子DOCK8(图3)。为进一步探讨DOCK8对HTLV-1病毒复制的影响，本发明通过敲除JK40细胞中的DOCK8，观察病毒mRNA、蛋白和细胞因子的表达变化，以期深入挖掘DOCK8在HTLV-1感染发生发展过程中的作用和潜在机制。
发明内容
本发明的目的在于探讨DOCK8基因影响HTLV-1感染及致病的分子机制，为ATL患者临床诊治提供新的分子靶点。
第一方面，本发明提供降低DOCK8基因表达水平的物质在制备体外促进HTLV-1病毒感染的产品中的用途，所述降低DOCK8基因表达水平的物质为针对白血病细胞DOCK8基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂，实施慢病毒感染或基因敲除的sgRNA，和针对DOCK8蛋白特异的抗体。
进一步的，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，核苷酸序列依次如SEQ IDNO.1-3所示。
第二方面，本发明提供所述DOCK8基因或其表达促进剂在制备用于抑制HTLV-1病毒感染的产品中的应用。
第三方面，本发明提供所述DOCK8基因或其表达促进剂在制备预防和/或治疗T淋巴细胞白血病的药物中的应用。。
进一步的，所述T淋巴细胞白血病是由HTLV-1病毒感染所致。
本发明的有益效果：
本发明首次发现敲除DOCK8基因可以促进HTLV-1病毒的感染与复制，提示过表达DOCK8基因可有效抑制HTLV-1病毒感染，可为急性成人T淋巴细胞白血病(ATL)的靶向治疗奠定基础。
附图说明
图1为Jurkat细胞敲入标签的示意图。
图2为构建HTLV-1+JK40细胞模型的示意图。
图3为RNA测序技术找差异性表达的分子的示意图。
图4为DOCK8基因及打靶位点信息。
图5为DOCK8基因敲除单克隆细胞株筛选结果。
图6为DOCK8基因敲除对HLTV-1病毒表达的GAG、5UTR、TAX和P19水平的影响。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不应理解为本发明的限制。如未特殊说明，下述实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：设计合成用于DOCK8基因敲除的sgRNA
根据NCBI Genbank上DOCK8的基因序列，结合CRISPR/Cas9基因编辑原理，设计gRNA序列sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，经上海百力格生物技术有限公司生产交付，DOCK8基因及打靶位点如图4所示。
sgRNA1：CCCTTCGCAGGACAACCACC TGG(SEQ ID NO.1)。
sgRNA2：TTCTGATCCAGCACGCGGAT GGG(SEQ ID NO.2)。
sgRNA3：GTCTGGCCAGCGATGACCAT GGG(SEQ ID NO.3)。
采用本发明上述三条sgRNA能够精确指导Cas9蛋白靶向切割DOCK8基因。
实施例2：用于基因打靶sgRNA载体的构建
1.构建基因打靶引物DNA准备工作：
1)引物的设计和准备：针对sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3设计打靶引物(表1)。轻离每只1OD引物后，使用无菌水(Ultra Pure Distilled Water,ddH2O)，将引物稀释成浓度为：100μmol/L。
表1打靶引物序列信息
2)试剂盒准备：在保持4℃情况下准备所需T4 Polynucleotide Kinase Kits，解冻后需要预先振荡混匀以及使用小离心机轻离收集。
2.磷酸化配对引物以及退火结合引物：
1)配对引物磷酸化：分别磷酸化合成配对引物，使表1中的引物末端呈粘性末端，其引物磷酸化反应配制体系如下表(表2)：
表2配对引物磷酸化体系
2)失活磷酸化酶：将孵育产物转移至将该反应体系所示试剂充分混匀，置于37℃PCR仪40分钟后调为95℃，5分钟。
3)配对引物退火：取出反应产物，加入0.5μl T4 PNK，继续在PCR仪器上运行95℃向25℃逐步降温，降温速度为5℃/min程序。
4)配对引物保存：退火完成后即可将产物放置于4℃或者-20℃进行保存。
3.扩增用于构建基因编辑的表达载体：
1)纯化空载体质粒：得到质粒pX458-DsRed2后，准备相应质粒抗性普通琼脂培养皿，将约10μl菌液使用平板分区划线法方法划线，标记后将培养板置于37℃培养箱培养约14小时，繁育至菌落清晰可见饱满，平板表面无卫星菌落即可。
2)扩增空载体质粒：无菌环境中，使用接种环挑取某一完整菌落置于带有相应质粒抗性琼脂培养基培养管中，在37℃摇床上培养，约14小时。
3)质粒保存：次日，菌液浑浊证明培养成功，将菌液加入甘油管中-80℃保存，或直接使用。
4.提取用于构建基因编辑的表达载体：
1)通过TIANGEN Endo Free Mini Plasmid Kits提取质粒。
2)菌液转入15ml管，离心8,000rpm/min，1分钟，弃上清。
3)加入P1 500μl震荡，吹打混匀，将其转移至新的2ml EP管中。
4)加入P2 500μl立即上下倒置摇晃至液体变清，时间不要超过5分钟。
5)加入500μl P4Buffer立即剧烈混匀10秒，静放10分钟。
6)于CP4柱加入500μl BL平衡液，离心13,000rpm/min，1分钟，弃下清。
7)离心13,000rpm/min，15分钟。
8)将液体移入新的2ml EP管中，分次放入滤过柱(每次650μl)，离心13,000rpm/min，3分钟。
9)根据过滤液体量计算0.3倍异丙醇，两者混匀后，按批次转入收集柱，离心13,000rpm/min，1分钟，弃残余液体。
10)加入500μl去蛋白溶液PD，离心13,000rpm/min，1分钟，弃下清。
11)加入PW清洗液600μl，静置3分钟，离心13,000rpm/min，1分钟，弃下清。
12)重复一次并吸干废液。
13)空离13,500rpm/min，2分钟。
14)将CP4柱置于1.5ml离心管(Eppendorf)，开盖5分钟，晾干。
15)向膜中央悬空滴加30μl ddH2O，静置等待3分钟。
16)离心13,500rpm/min，2分钟。
17)重新倒挂后，离心13,500rpm/min，2分钟。
18)使用DNA浓度检测仪，选择DNA双链检测程序，对回收质粒进行质量检测，确定其纯度参数260/280和260/230在正常范围内，并且保证质粒浓度大于1,000ng/μl。将质粒保存至-20℃保存待用。
5.线性化进行基因编辑质粒pX458-DsRed2载体：
1)酶切质粒体系：根据质粒特性，选用BbsI酶将载体pX458-DsRed2质粒酶切线性化，酶切反应体系如下表(表3)：
表3质粒线性化酶切反应体系
2)试剂混匀后留在37℃恒温箱孵育4小时。
酶切进行尾声，制备0.8％核酸电泳用含EB替代核酸染料琼脂糖胶1/4板，厚度为1cm左右。
3)检测酶切效率：混合完成线性化酶切反应体系，加样枪量出1μl反应体系于1.5ml离心管中，向该管中加入5μl 1x Loading Buffer，两者混合后匀速加入浸入核酸工作液胶孔中。
4)同样步骤取1μl未经酶线性化处理，浓度为30ng/μl原始环状质粒于1.5ml离心管中，向内加入5μl 1x Loading Buffer，两者混匀后匀速加入浸入核酸电泳液胶孔中，紧挨步骤4样品。
5)在以上两孔左侧加入3μl DL15000 Plus DNA Marker，进行电泳，90V，30分钟。
6)核酸电泳结束后，将核酸胶表面残余液体用一次性吸水纸擦干后转移至凝胶成像分析仪中成像，观察未线性酶切处理质粒PCR产物为2-3条显色带，线性化酶切质粒PCR产物是否仅为一条核酸显色带，并且与DNA maker对比后是否为正常大小。
7)确定线性化酶切完全成功后，即可停止在37℃恒温培养箱孵育，将样品拿出轻离后进行回收。
6.回收已线性化进行基因编辑质粒pX458-DsRed2载体：
1)使用TIANGEN universal DNA purification kits回收线性化酶切产物原液。
2)预洗吸附柱：将下层废液管承接吸附柱，向其中加入500ul Balance液。离心13,000rpm/min，2分钟，去除残余液体，将下层废液管重新承接DNA吸附柱。
3)向该酶切体系液中加入与线性化酶切反应液等体积Buffer C，使用移液器混匀。
4)将3所得加到DNA柱中，静置等待2分钟，离心13,000rpm/min，2分钟，倒去液体，下层废液收集管承接吸附柱。
5)向柱子里加600ul清洗液，离心13,000rpm/min，2分钟，倒掉液体，下层液体管承接DNA柱。
6)重复步骤5。
7)进行空离13,000rpm/min，3分钟，倒掉液体，下层废液管承接吸附DNA柱。开盖静置5分钟，室温晾干，准备1.5ml离心管(标记该质粒名称简写即pX458-DsRed2)。
8)将CB2放入1.5ml离心管，加ddH2O至膜中心处，闭盖静置2分钟，离心12,000rpm/min，2分钟。
9)重复步骤8可提高回收效率。
10)使用DNA浓度检测仪，选择DNA双链检测程序，对回收质粒进行质量检测，确定其260/280和260/230在正常范围内，并且保证质粒浓度大于1,000ng/μl。将质粒保存至-20℃保存待用。
7.酶连黏性末端双链DNA和pX458-DsRed2载体：
1)构建酶联体系：通过T4连接酶，将已磷酸化退火合成的黏性末端双链DNA与线性化酶切后pX458-DsRed2载体进行酶连反应。其具体DNA引物片段与载体质粒量的对应关系根据其片段长度，酶联能力强弱有关，本次酶联体系如下表(表4)：
表4酶联反应体系
2)酶联：将该反应试剂混合后放于21℃PCR仪恒温无光结合4小时，后可将酶联产物留存于4℃存放或进行下一步。
8.转化酶联产物：
1)将得到酶联后产物由PCR仪转入冰盒，防止降解。
2)超净台取干净灭菌1.5ml离心管备用，取对应抗性的普通琼脂培养皿放37℃恒温培养箱，预热摇床37℃，预热水浴锅42℃。
3)将感受态细胞由冻存状态取出，冰盒轻弹外包装，固体变为液体后，分装至1.5ml离心管。
4)将酶联终产物分别加到对应1.5ml EP管里，冰上孵育等待35分钟。
5)转至水浴锅浮漂中，计时1分钟30秒后放回冰盒。
6)每管混合物加850ul LB培养基，封口膜缠绕密封管口，在37℃摇床孵育150rpm/min，50分钟。
7)准备玻璃烧灯，烧杯，三角涂布杆，适量75％酒精倒烧杯备用。
8)离心混合物，2,500rpm/min，5分钟。
9)以下步骤于酒精灯有效无菌范围内进行，弃去600ul上清，移液器混匀剩余液体和感受态，取100ul加到培养皿固体中间区域，使用灭菌三角棒待稍凉后涂布。
10)待平板自然干燥，放于37℃恒温箱中13小时。
9.验证酶联结果并保存正确质粒：
1)设计正确酶联结果DNA序列文件：首先，通过使用SnapGene软件，针对载体pX458-DsRed2做BbsI(NEB)酶切。其次，通过与相应具有黏性末端DNA引物片段做技术性酶联，得到完全正确sgRNA载体序列。
2)筛选正确酶联产物：将涂布培养得到培养皿置于酒精灯无菌范围内，接种针挑取若干单个菌落分别放入AMP抗性液体培养基中，37℃摇床培养14小时后收集至1.5ml离心管中，一份采用甘油管保存于-80℃冰箱，一份封口膜密封缠有冰袋保温送样至测序公司，进行基因测序工作，得到碱基序列。
3)比对测序结果与构建成功载体序列：选择某一菌种进行培养，待其细菌浓度适宜，再次保种后提取质粒，对质粒质量检测，确保其260/280和260/230值在正常范围内，并且保证质粒浓度大于1,000ng/μl。将质粒保存至-20℃保存待用。
实施例3：获得DOCK8基因敲除单克隆细胞系
1.JK40细胞准备：
1)细胞来源：在Jurkat细胞(HTLV-1-CD4+T细胞，白血病细胞，悬浮细胞)上打上标签(鼠H-2Kk)，构建得到的带标签的JurkatKI细胞模型(简称为JK40)。
2)细胞培养：生物安全柜每周进行紫外线照射5次，每次30分钟，执行过程新风过滤系统开启，确保正常工作。细胞传代处理按照ATCC推荐方式，在无菌生物安全柜中进行，培养细胞DMEM基础培养基，搭配胎牛血清使用，胎牛血清比例为10％。
3)制作冻存液：其比例为基础培养基DMEM、灭活血清FBS和DMSO为5:4:1。每个细胞冻存管为500μl细胞冻存液可冻存1到2million数量级细胞。所冻细胞消化收集离心后，加入细胞冻存液使细胞处于悬浮状态，移液枪转移至细胞冻存管，按照温度梯度冻存原则，将含有冻存液细胞冻存管转移至冰盒，待细胞处理完毕，冻存管放置冻存盒中。按照4℃降温变凉，再-80℃大于24小时处理，最后留存至液氮罐中可延长储存时间。实验所用冻存盒可实现每分钟降低1℃功能。复苏时按照快速解冻原则，首先准备37℃水浴锅和对应含有完全培养基离心管，然后将冻存管从液氮罐取出，使用冰盒转运，手持冻存管接触37℃水浴升温并且晃动冻存管加速细胞团块解冻。解冻后将含有冻存液和细胞转移至准备好管子里进行离心1,250rpm/min，5分钟后弃去液体，得到细胞团块，加入完全培养基，使用移液器使细胞处于单个悬浮状态，细胞计数仪技术后按照ATCC建议密度进行细胞培养和传代。
4)细胞传代收集工作：细胞生长至每孔约80％，将完全培养基弃去，使用无菌1xPBS缓冲液对细胞表面残存血清培养基进行清洗后弃去，用胰酶对细胞进行消化处理，传代参考ATCC推荐密度培养直至足够数量收集进行转染处理。
2.脂质体转染敲除DOCK8基因：
1)准备足量JK40细胞以及重组质粒，使用Lipofectamine3000进行脂质体转染。
2)转染24小时，使用荧光显微镜检查转染效率，根据GFP，即绿色荧光蛋白多寡进行转染效率判断。
3)转染后细胞2天生长至80％，胰酶消化细胞收割后常温离心1,250rpm/min，5分钟，弃去上液。加入500μl培养基，使用移液器移至无菌可密闭流式管。
3.流式细胞仪得到质粒转入细胞：
1)准备所用两个96孔细胞生长板，每孔放入150μl新鲜培养基。
2)使用Aria流式细胞仪，矫正鞘液液流，电压以及96孔板孔位。
3)选中绿色荧光蛋白阳性，即APC通道阳性单细胞转移至96孔细胞培养板中，每孔培养一个细胞，即单克隆。96孔细胞生长板细胞生长约两星期后，转移至48孔细胞繁育板中扩大生长。
4.提取单基因敲除细胞系基因组DNA：
1)收集细胞：将细胞消化收集后，离心1,250rpm/min，5分钟收集细胞清洗，弃上液收集沉淀至1.5ml管底。
2)裂解细胞：每管加入200μl Lysis Buffer和1μl蛋白酶K(Protein K,PK)，吹打细胞混匀后放入56℃金属洗浴(block)600rpm/min，消化裂解细胞2-3小时。
3)析出DNA：每管加入6μl NaCl和400μl无水乙醇进行DNA析出，密闭离心管振荡，可见絮状沉淀，4℃离心13,000rpm/min，30分钟，弃上清。
4)洗涤DNA：每管放入600μl 70％酒精，密闭管口，手持离心管振荡数次，4℃离心13,000rpm/min，5分钟，弃上液。重复一次。
5)收集DNA：倒置打开离心管盖于吸水纸上室温蒸发去除水分后，每管加100μlddH2O于55℃烘箱溶解基因组DNA，30-60分钟后取出于-20℃保存。
5.PCR验证DOCK8基因敲除结果：
1)设计验证PCR引物：通过SnapGene软件查看并且使用引物生成器设计2条检测引物序列，设计要求检测引物扩增产物要求为300-700bp，经生物合成公司生产交付。
oEX159：TTCTGGTCTGAAACGCTGGATAA(SEQ ID NO.10所示)。
oEX1 60：TCCCTTGAGCACACATCATCAG(SEQ ID NO.11所示)。
2)检测引物退火温度测试PCR：通过设定温度梯度，根据扩增产物确定延伸，使用野生型RAW264.7细胞基因组DNA作为PCR中DNA模板，设定30个循环，得到PCR产物，根据核酸胶结果得到最适退火温度。
3)PCR检测DOCK8基因敲除结果：经以上步骤得到最适退火温度后，将提出培养单克隆细胞基因组DNA和JK40KO细胞(敲除空载体)基因组DNA作为PCR中DNA模板，运行程序得到相应PCR产物，通过核酸胶比较各单克隆条带与野生条带的差距即PCR产物大小差异，确定DOCK8基因敲除结果。
结果如图5所示，筛选出DOCK8基因敲除单克隆细胞株:No.1，2,5，6,9,10,11,13，15，17，19，挑选出表型最强的单克隆DOCK8-/-JK40细胞No.6,9,10,13,17进行后续实验。
实施例4：敲除DOCK8基因对HTLV-1病毒感染的影响
1.JK40KO-DOCK8细胞、JK40KO细胞(敲除空载体)均同步与MT4细胞共培养2到3天后，裂解细胞得到RNA，使用反转录试剂盒K1622反转录为cDNA。
2.通过RT-qPCR技术检测HTLV-1病毒表达的相关分子(GAG、5UTR、TAX和P19)的水平。
结果如图6所示，敲除DOCK8基因的JK40细胞中HLTV-1病毒表达的GAG、5UTR、TAX和P19的mRNA水平显著高于JK40KO细胞(对照)，表明敲除DOCK8基因能提高HTLV-1病毒的感染效率，提示过表达DOCK8基因可有效抑制HTLV-1病毒感染，可为急性成人T淋巴细胞白血病(ATL)的靶向治疗奠定基础。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (5)
1.降低DOCK8基因表达水平的物质在制备体外促进HTLV-1病毒感染的产品中的用途，其特征在于，所述降低DOCK8基因表达水平的物质为针对白血病细胞DOCK8基因的RNA干扰分子或反义寡核苷酸、小分子抑制剂，实施慢病毒感染或基因敲除的sgRNA，和针对DOCK8蛋白特异的抗体。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述sgRNA包括sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1-3所示。
3.DOCK8基因或其表达促进剂在制备用于抑制HTLV-1病毒感染的产品中的应用。
4.DOCK8基因或其表达促进剂在制备预防和/或治疗T淋巴细胞白血病的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述T淋巴细胞白血病是由HTLV-1病毒感染所致。
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