CN113133995B - 抑制剂cni-1493在猪繁殖与呼吸综合征中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请属于动物疾病预控技术领域，具体涉及抑制剂CNI‑1493在猪繁殖与呼吸综合征中应用专利申请事宜。作为eIF5A羟脯氨酸修饰的特异性抑制剂CNI‑1493，将其处理细胞后，用于抑制PRRSV在细胞内的增殖；所述细胞为真核生物细胞。本申请中，发明以MARC‑145细胞为例，在利用eIF5A羟脯氨酸修饰特异性抑制剂CNI‑1493处理细胞后接种PRRSV，通过检测PRRSV转录及蛋白水平变化情况以及PRRSV滴度的变化，初步认定抑制剂CNI‑1493针对PRRSV具有一定的抑制作用。基于这一结果，可为PRRS的防控奠定一定的技术基础，同时也为其他抗PRRSV药物的筛选提供新的思路和借鉴。

Description

抑制剂CNI-1493在猪繁殖与呼吸综合征中的应用
技术领域
本申请属于动物疾病预控技术领域，具体涉及抑制剂CNI-1493在猪繁殖与呼吸综合征中应用专利申请事宜。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive andRespiratory Syndrome Virus， PRRSV）引起的一种以母猪流产和各年龄段猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病。1987年该病首先在北美发现，此后在世界范围内广泛传播，给养猪业带来巨大损失。1995年我国首次报道PRRS以来，该病在国内长期流行，危害巨大，是影响我国养猪业的重大传染病之一。PRRSV属于套式病毒目（Nidovirales），动脉炎病毒科（Arteriviridae），动脉炎病毒属（Arteriviridae），单股正链RNA病毒，基因组全长为15.4kb。病毒粒子呈球型，直径为55～60纳米。病毒有2个基因型，即PRRSV-1型和PRRSV-2型，我国流行的毒株主要为PRRSV-2型，PRRSV-1零星散发。
PRRS存在以下特征导致防控困难：一是存在持续性感染；二是亚临床感染及偶然的疫情大爆发；三是病毒高度变异；四是抗体不能产生有效的免疫保护。针对PRRSV的防控，现有技术多是从猪场环境消毒、提高生猪免疫力等综合性手段来进行。针对性的疫苗注射虽然可以提高生猪对PRRSV的抵抗力，但由于PRRSV变异较快，基因型、亚基因型多，因此使得疫苗的实际防控效果不够理想。也因此，针对性开发相关防控治疗用药仍然是十分紧迫的科研任务。
真核生物翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factors，eIFs）是一类在真核生物蛋白翻译过程中发挥重要作用的蛋白家族，目前已发现21个成员。大量研究表明，eIFs与多种病毒存在直接或间接的相互作用。病毒可以通过调控eIFs表达及修饰，抑制核糖体对宿主mRNA招募或影响翻译起始复合体活性等方式，创造有利于自身复制的环境。由此，基于真核生物翻译起始因子功能角度，开发相关病毒复制抑制药剂，可为PRRS的防控提供一定的技术指导。
发明内容
通过对抑制剂CNI-1493在PRRSV防控中的研究，本申请目的在于提供一种防控PRRSV的新思路，同时也为相关药物开发奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
抑制剂CNI-1493在猪繁殖与呼吸综合征中应用，作为eIF5A羟脯氨酸修饰的特异性抑制剂CNI-1493，将其处理细胞后，可以抑制PRRSV在细胞内的增殖；
所述细胞为真核生物细胞，具体例如为MARC-145细胞；
具体处理细胞时，以MARC-145细胞为例，抑制剂CNI-1493的用量为：0.1~100 μM，优选为0.1~10 μM；
所述抑制PRRSV在细胞内的增殖，通过采用Real-time PCR技术对PRRSV-N基因转录水平的表达情况进行检测判定，具体检测判定时，
针对PRRSV-N的引物序列设计如下：
F：5’-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3’，
R：5’-GCAAACTAAACTCCACAGTGTAA-3’。
猪繁殖与呼吸综合征防治用药剂组合物，其中有效成分为抑制剂CNI-1493，其余为可接受的药用载体。
已有研究表明，eIF5A与病毒复制密切相关。其中，艾滋病毒（HumanImmunodeficiency Virus，HIV）辅助因子Rev蛋白能够持续的穿梭于宿主细胞的细胞核质之间，介导了未剪接和未完全剪接的病毒mRNA的核质运输，这个过程依赖于Rev蛋白与eIF5A的结合才能实现，而eIF5A功能缺失突变体阻断了Rev蛋白的核输出和HIV复制。eIF5A是目前唯一已知的具有羟脯氨酸修饰的蛋白，而羟脯氨酸残基也是eIF5A发挥生物学功能的重要基团，在病毒复制过程中发挥了重要作用。实验表明，在使用羟脯氨酸抑制剂处理细胞后可导致HIV不能复制。这些结果提示了eIF5A羟脯氨酸修饰可能是新型抗病毒药物靶标。
由于eIF5A羟脯氨酸修饰包含严格的赖氨酸聚合酶（Deoxyhypusine synthase，DHPS）和赖氨酸羟化酶（Deoxyhypusine hydroxylase，DOHH）两个酶催化步骤。研究表明，化合物CNI-1493能够抑制DHPS活性，从而抑制eIF5A羟脯氨酸修饰的产生。同时，现有实验证明CNI-1493能够体外抑制HIV复制，且并未显示出任何毒副作用。由于PRRSV与HIV同为RNA病毒，因此，CNI-1493对PRRSV的复制是否同样具有类似影响，显然有进一步实验探索意义。
本申请中，发明以MARC-145细胞为例，在利用eIF5A羟脯氨酸修饰特异性抑制剂CNI-1493处理细胞后接种PRRSV，通过检测PRRSV转录及蛋白水平的变化情况以及PRRSV滴度的变化，初步认定抑制剂CNI-1493针对PRRSV具有一定的抑制作用。基于这一结果，可为PRRS的防控奠定一定的技术基础，同时也为其他抗PRRSV药物筛选提供了一种新的思路和借鉴。
附图说明
图1为不同浓度CNI-1493抑制剂对细胞活性的影响；
图2为 CNI-1493处理细胞对PRRSV滴度的影响；
图3为间接免疫荧光技术（IFA）检测CNI-1493处理细胞对PRRSV复制的影响；
图4为Real-time PCR验证用CNI-1493处理细胞对PRRSV复制的影响；
图5 为Western Blot验证CNI-1493处理细胞对PRRSV复制的影响。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请技术方案做进一步解释说明。在介绍具体实施例前，为便于本领域技术人员详细了解本申请的相关研发情况，就下述实施例中所涉及的部分实验材料、检测方法等背景性实验情况简介如下。
生物材料：
PRRSV 高致病性毒株HN07-1（GeneBank登陆号为：KX766378.1）由河南农业科学院动物免疫学重点实验室分离鉴定并惠赠；
PRRSV 经典毒株BJ-4（GenBank登录号：AF331831.1）由中国农业大学杨汉春教授惠赠；
MARC-145细胞（猴肾上皮样细胞）是一种常用实验细胞，可从公开渠道获得；
实验过程中，相关引物合成及测序工作由生物工程（上海）股份有限公司提供和完成。
主要实验试剂：
真核生物翻译起始因子5A (eukaryotic initiation factor 5A, eIF5A）羟脯氨酸修饰特异性抑制剂CNI-1493购自MCE公司；
DMEM培养基、EDTA-胰蛋白酶、DEPC水、尿素、Tris-base、RIPA裂解液等为索莱宝生物科技有限公司产品；
胎牛血清为GIBCO公司产品；
DAPI为SIGMA公司产品；
TRIZOL试剂为Invitrogen公司产品；
反转录试剂盒为TAKARA公司产品；
荧光定量用试剂盒为ROCHE公司产品；
PVDF膜为Millipore公司产品；
Cell Proliferation Assay检测试剂盒为Promega公司产品；
抗PRRSV N蛋白的抗体，参考现有技术常规制备即可。
实施例1
如前提及所述，由于PRRSV与HIV同为RNA病毒，因此，对于HIV具有抑制作用的CNI-1493抑制剂，对于PRRSV的复制是否同样具有类似影响，发明人认为有进一步研究的价值。因此，发明人进行了相关实验验证，下面就相关实验过程及结果简要介绍说明如下。
（一）预备病毒
将PRRSV（HN07-1株、BJ-4株）按照1:1000体积比接种已经长满单层的MARC-145细胞，加入血清含量为3%的DMEM培养基，置于CO2 含量为5%的37 ℃细胞培养箱中；
当80%以上的细胞发生病变时，取出细胞培养瓶，置于—80 ℃，待完全冷冻后再取出，放置于室温融化，反复冻融多次，使细胞完全破碎，病毒充分释放；使用12000 rpm离心10 min，上清用0.22 μm微孔滤膜过滤后，所收获即为病毒，500 μl/管进行分装，保存于—80℃备用。
（二）抑制剂处理及病毒感染
在96孔细胞板中培养MARC-145细胞，当其长满底面积80%以上时候，分别将0.1 μM、1 μM、10 μM、100 μM的CNI-1493抑制剂加入板孔中，每个浓度8个重复，并以加入培养基的板孔作为对照。加入抑制剂CNI-1493后，将细胞板放入CO2培养箱继续培养30 min后取出。使用分光光度计测定波长490 nm处的吸光值。
结果如图1所示，与对照组相比10 μM CNI-1493是对细胞生长状态影响最小时的最大剂量，因此选用此浓度进行后续实验。
（三）相关实验结果
基于上述实验结果，对抑制剂处理后细胞感染PRRSV的情况进行进一步的评价和分析。具体结果介绍如下。
（1）病毒滴度变化情况
采用组织半数感染（TCID50）方法测定细胞接种病毒后的变化情况，具体操作参考如下：
（a）先将长满单层MARC-145细胞的培养液用PBS洗涤3次，再用胰蛋白酶消化3min，加入含有10%胎牛血清的DMEM培养液终止消化，反复吹打，使其细胞单个分散；
后用排枪将细胞均匀加入96孔板中，次日观察细胞变化，若细胞在板孔中达到底面积80%时，即可进行后续实验；
（b）使用10 μM的CNI-1493抑制剂加入96孔板，并以加入培养基的96孔板作为对照，随后将细胞板放入CO2培养箱继续培养30 min后取出，弃去培养液；
（c）以未感染细胞作为对照，将病毒调整为10-1至10-10共10个稀释梯度，按照100 μL/孔分别接种于长满单层MARC-145细胞中，每个稀释梯度接种8孔，并留8个空白孔作为对照，于37 ℃、5% CO2 培养箱中培养5天；
记录各孔细胞病变情况，出现病变即为感染，并及时记录感染结果，重复3次；
根据Reed-Muench法计算TCID50结果。
CNI-1493处理细胞30 min后接种HN07-1，36 hpi收获病毒测得的TCID50值为显著低于对照组；CN-1493处理细胞30 min后接种BJ-4，36 hpi收获病毒测得的TCID50值显著低于对照组。
具体统计结果如图2所示。可以看出，相关经统计学分析差异显著。也即，无论PRRSV的致病力高低，TCID50实验证实CNI-1493处理细胞组的PRRSV滴度均显著降低。
（2）IFA检测病毒增殖情况
以PRRSV HN07-1株处理细胞作为阳性对照，具体而言：
CNI-1493处理MARC-145细胞30 min后，用MOI=0.1的PRRSV HN07-1株感染细胞，培养基使用的是含血清含量为3%的DMEM培养基；同时设置未感染的板孔作为空白对照；分别在12 hpi，24 hpi弃去上清。
随后，用PBS轻轻洗涤细胞，用预冷的甲醇固定细胞样品30 min，用PBST配制的5%脱脂奶37 ℃封闭1 h，再用抗PRRSV-N蛋白单抗37 ℃孵育细胞1 h，PBST洗涤轻轻洗涤细胞3遍，用FITC标记羊抗鼠二抗37 ℃避光孵育1 h后检测细胞的感染情况。
荧光图片用激光共聚焦（Olympus FLUOVEIW IX81）进行拍摄，结果如图3所示。
可以看出：IFA证实与未加抑制剂组相比，CNI-1493处理细胞后再接种HN07-1，CNI-1493处理组荧光信号显著减弱，说明PRRSV复制受到显著抑制。
（3）实时荧光定量PCR检测PRRSV-N基因的表达情况
采用Real-time PCR技术，对PRRSV N基因表达情况进行检测判定，具体实验操作参考如下。
（a）提取RNA
以未感染为对照，对病毒感染6 hpi、12 hpi、24 hpi的MARC-145细胞，分别用PBS洗涤细胞3遍。用TRIzol处理PRRSV感染后的MARC-145细胞：6孔板每孔加入1 ml TRIzol，用枪反复吹打细胞使其完全解离；
每500 μl TRIzol（含细胞样品）加入100 μl氯仿，充分震荡混匀使其无分相，室温下放置5 min；
4℃、12000 g离心15 min，转移上清约200 μl至另一个DEPC水处理过的EP管，注意不要吸到中间层；
上清中加入200 μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，放置于—20 ℃数小时以沉淀核酸；
4 ℃、12000 g离心15 min，小心移除上清；
加入DEPC水配制的75%的酒精，8000 g离心5 min，小心移除上清，可重复操作一遍，将EP管倒置沥干酒精；
每管中加入30 μl DEPC水，55 ℃溶解核酸10 min，用Nanodrop仪器测定每管中的核酸浓度。
（b）反转录成cDNA
使用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，具体步骤如下：
每管中含5×Mix 4 μl，RNA 1 μg，使用DEPC水定容至20 μl；
在37 ℃恒温水浴锅中放置20 min，85 ℃放置5秒钟以终止反应，即得cDNA。
（c）Real-time PCR反应
以β-Actin为内参基因，设计PCR扩增用引物如下：
PRRSV-N（序列如SEQ ID No.1~2所示）
F：5’-AAACCAGTCCAGAGGCAAGG-3’，
R：5’-GCAAACTAAACTCCACAGTGTAA-3’；
β-Actin
F：5’-TGCGGGACATCAAGGAGAA-3’，
R：5’-TCGTTGCCGATGGTGATG-3’。
使用ABI 7500 fast荧光定量检测仪，以上述所制备cDNA为模板，利用上述引物进行扩增。实验重复三次，数据用绝对定量（SYBR Green染料法）分析。
用CNI-1493处理细胞30min后，接种PRRSV HN07-1，分别于6hpi，12hpi，24hpi收获细胞样品。用Real-time PCR验证CNI-1493处理细胞对PRRSV复制的影响。结果发现，在24hpi HN07-1的复制受到显著抑制，相关经统计学分析差异显著。（图4）。
（4）Western Blot 检测
用CNI-1493处理细胞30 min后，接种PRRSV HN07-1株，分别于12 hpi，24 hpi收获细胞，同时以未感染的细胞为对照。分别用PBS洗涤细胞3遍后，用EDTA-Tripsin消化并收获细胞；加入RIPA冰上裂解30 min，再加入5×Loading Buffer，沸水煮5~10 min后离心进行SDS-PAGE，整个电泳过程使用80 V电压；
之后，蛋白被电转至0.45 μm PVDF膜上，5%脱脂奶室温下封闭2 h，用抗PRRSV-N蛋白单抗以及β-Actin蛋白单抗在4℃下孵育1 h，用PBST洗涤三次，然后用HRP标记的山羊抗兔IgG抗体孵育1 h，PBST洗膜三次，用ECL超敏发光液进行检测。
具体结果如图5所示。可以看出，Western Blot检测表明，CNI-1493抑制剂处理组的PRRSV-N蛋白显著低于对照组，说明CNI-1493能抑制PRRSV复制。
序列表
<110> 河南牧业经济学院
<120> 抑制剂CNI-1493在猪繁殖与呼吸综合征中的应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工设计(Artificial design)
<400> 1
aaaccagtcc agaggcaagg 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
gcaaactaaa ctccacagtg taa 23

Claims (1)

1.抑制剂CNI-1493在制备猪繁殖与呼吸综合征防治药剂中的应用，其特征在于，CNI-1493作为eIF5A羟脯氨酸修饰的特异性抑制剂，用于抑制PRRSV在细胞内的增殖。
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