CN112080524A - 一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液，包括以下体积分数的组分：含NaCl的Tris‑HCl缓冲溶液70‑93％，5‑20％的甘油，1‑6％的CD‑Lipid浓缩液，1‑8％的人血清白蛋白(HSA)溶液；其中，所述含NaCl的Tris‑HCL缓冲溶液中，Tris‑HCl的摩尔浓度为0.8‑20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08‑0.15M；所述含NaCl的Tris‑HCl缓冲溶液的pH值为7.0‑8.0。该冻存液能在较低温下长期保存慢病毒载体而不影响其滴度，还能在使用过程中反复冻融以及在较长时间放置于室温下，仍然能够最大程度的保持慢病毒载体滴度。本发明还提供了冻存液的制备方法和应用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种慢病毒载体冻存保护液及其制备方法和应用。
背景技术
慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的基因治疗效果，在国外已经开展了广泛的临床研究，例如利用慢病毒载体制备CAR-T进行肿瘤免疫治疗，因此具有广阔的应用前景。
由于慢病毒含有类脂包膜，因此慢病毒载体的稳定性较低、容易失活。为了维持病毒载体结构的完整性，维持其生物滴度，慢病毒载体一般配制成液体于超低温(例如-80℃)下保存，或在低温冷冻条件下运输，并在使用前解冻。
慢病毒载体生物滴度的丧失多发生在保存阶段。慢病毒载体低温下保存，其主要挑战就是溶液降低到冰点过程中，以及在超低温保存阶段对对慢病毒结构性和功能性成分的破坏。另外，超低温保存的时间过长或反复冻融，都会导致慢病毒载体生物滴度(病毒滴度)大幅降低，从而限制了它的正常使用。
通常通过添加冻存保护剂来保存慢病毒的滴度，例如牛血清或培养基，但在培养基中冻存5个月的慢病毒的滴度急剧下降；但是牛血清保存的慢病毒，并不利于慢病毒的临床应用。也有针对慢病毒设计的冻干制剂配方，这类试剂虽能有效保存病毒载体的滴度，但试剂的成份复杂，制备较繁琐，并不利于慢病毒的临床应用，比如用于CAR-T制备。
因此亟需一种成分简单、能在较低温下长期保存慢病毒载体且不影响其滴度的冻存保护液。
发明内容
本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液及其制备方法，它能在较低温下长期保存慢病毒载体，维持其结构的完整性，不影响其滴度，还能在使用过程中反复冻融以及较长时间放置于室温，仍然能够保持较高的滴度。
本发明提供了一种慢病毒载体冻存保护液，包括以下体积分数的组分：70-93％含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，5-20％的甘油，1-6％的CD-Lipid浓缩液，1-8％的人血清白蛋白(HSA)溶液；
进一步地，所述含NaCl的Tris-HCL缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.88-10mM，NaCl的摩尔浓度为0.088-0.1M。
进一步地，所述含NaCl的Tris-HCL缓冲溶液中，Tris-HCL的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M。
进一步地，所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0
进一步第，所述5-20％的甘油。进一步优选为20％。
进一步地，所述CD-Lipid浓缩液的体积分数为1-5％。进一步优选为1％。
进一步第，所述人血清白蛋白(HSA)溶液的质量浓度为1-5％。进一步优选为1％。
本发明中，所述CD-Lipid浓缩液为化学成分确定的脂质物质CD-Lipid(Chemically Defined Lipid Concentrate)浓缩的脂质乳液，具体包括以下各成分：花生四烯酸(Arachidonic Acid)：2.0mg/L，胆固醇(Cholesterol)：220.0mg/L，DL-α-生育酚乙酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)7.0mg/L，亚油酸(Linoleic Acid)：10.0mg/L，亚麻酸(Linolenic Acid)：10.0mg/L，十四烷酸(Myristic Acid)：10.0mg/L，油酸(OleicAcid)：10.0mg/L，棕榈酸(Palmitic Acid)：10.0mg/L，十八酸(Stearic Acid，又称硬脂酸)：10.0mg/L，吐温-80：2200.0mg/L，普朗尼克F-68(Pluronic F-68)：90.0g/L。
在本发明一具体实施方式中，所述CD-Lipid浓缩液可购买自Gibco公司。
本发明的所述慢病毒载体冻存保护液中，在Tris-HCl缓冲溶液中添加NaCl，得到含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液具有合适的稳定离子强度，以及加入的甘油，作为后续配制所述慢病毒载体冻存保护液成分，可以提高所述慢病毒载体冻存保护液的稳定性，并维持很好的渗透压，维持慢病毒载体等渗，有利于长期保持病毒载体的结构完整性，避免结构性和功能性成分被物理性破坏。
本发明在含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中加入成份确定的脂质物质CD-Lipid、人血清白蛋白得到所述慢病毒载体冻存保护液。其中，人血清白蛋白能有效避免蛋白质变性，能亲和慢病毒载体的包膜糖蛋白，保护病毒外壳蛋白，防止其失活。CD-Lipid能对慢病毒载体的包膜蛋白上的氨基酸残基形成保护层，在一定程度上提高慢病毒载体的稳定性。此外，人血清白蛋白、CD-Lipid等大分子物质，在温度下降的过程中，它们形成了水化膜，降低冰晶形成，避免了慢病毒因温度下降时，冰晶的形成造成慢病毒结构的物理损伤(尤其是包膜蛋白和脂双层)，从而有利于长期保持病毒载体的结构完整性，保持慢病毒载体的滴度。
本发明第一方面提供的慢病毒载体冻存保护液的配比合理，成分简单、组成明确，加入所述冻存保护液的慢病毒能在-80℃的超低温条件下，稳定保存8-12个月，其滴度能维持其最大滴度的85％；在4℃下稳定保存1-2个月，滴度维持在其最大滴度的65％左右。本发明冻存液中所有组分的构成明确，可以工业化生产，原材料价格便宜、易获取，具有低成本优势。
附图说明
图1为不同冻存保护液在-80℃条件下对CD19CAR慢病毒载体进行保存不同时间后，对其滴度的影响；
图2为不同冻存保护液中，冻融次数对CD19CAR慢病毒载体滴度影响。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
将NaCl加入到Tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为78％、20％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例2：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为83％、15％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例3：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为88％、10％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例4：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为93％、5％、1％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例5：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为74％、20％、5％和1％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例6：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为74％、20％、1％和5％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
实施例7：
一种慢病毒载体冻存保护液的制备方法，包括以下步骤：
按实施例1的方法配制含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0；
将上述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液与甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白(HSA)溶液分别按照体积分数为70％、20％、5％和5％的比例进行混合，制得慢病毒载体冻存保护液。
为突出本发明的有益效果，设置以下对比实施例：
对比例1：
一种冻存液，该冻存液为含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液(与实施例1中的原料相同)，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0。
对比例2：
一种冻存液，该冻存液为含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.3M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为8.0。
对比例3
一种冻存液，包括以下体积分数的各组分：99％的含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液和1％的人血白蛋白(HSA)溶液，其中，含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液这一原料与实施例1中相同，即，pH值为8.0，Tris-HCl、NaCl在所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液中的摩尔浓度分别为10mM、0.1M。
对比例4：
一种冻存液，该冻存液为市售的X-VIVO培养基(Lonza，货号04-418Q)。
对比例5：
一种冻存液，该冻存液为含20％FBS的X-VIVO培养基(Lonza，货号04-418Q)。
制备实施例CD19CAR慢病毒载体的制备
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)由识别B细胞特异性抗原CD19的单链抗体(scFv)、铰链区、跨膜区、胞内信号区组成，携带CAR基因的慢病毒载体，感染人T细胞，使T细胞表达CAR(CAR-T)，CAR-T能特异性地识别并杀伤表达B细胞特异性抗原CD19的白血病细胞和淋巴细胞。CD19CAR慢病毒的包装采用4质粒系统。
具体地，CD19CAR的慢病毒载体的制备过程如下：
1、包装CD19CAR慢病毒
1)转染前一天，取4瓶T75培养的293T细胞，PBS洗一次后，加入胰酶消化细胞，细胞分散后，每瓶加入约5ml的DMEM完全培养基(10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素)，计数。
2)取12个T150细胞培瓶，每瓶接入2×107个293T细胞，置于37℃，5％CO2培养箱中培养约24h，此时细胞的汇合率约为80％-90％。
3)第二天，转染前30～60min，弃去原培养液，换上新配制的的DMEM培养液(10％FBS，1％HEPES，不含双抗)。
4)磷酸钙法转染试剂盒(碧云天)：在50ml离心管中加入18ml CaCl2溶液，分别加入如下量的质粒：336ug pRSV-rev，336ug pGAG-Pol，132ug pVSVG，276ug pELNS-CD19BBζ，充分混匀；
5)向离心管中加入18ml BBS溶液，边加边混匀，室温孵育20min；
6)向每个T150培养瓶中液逐滴加入3ml质粒-转染混合液，边加边混匀。将细胞置于37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
7)6～8小时后弃去转染培养液，换新鲜DMEM完全培养基，置于37℃，5％CO2培养箱。
8)转染48h后，吸出含有病毒颗粒的培养液，用0.45μm的滤器过滤后，置于4℃保存。
9)在细胞培养皿中再加入20ml预热DMEM完全培养基，继续培养24h，收集上清用0.45μm滤器过滤，收集病毒上清。
2、CAR慢病毒载体的浓缩
1)将0.45μm滤器过滤后的病毒上清样品分装到离心管中；
2)盖上金属盖，将离心管连同金属盖一起配平，用1XPBS调整使重量偏差在0.02g范围内；
3)将配平的离心管对称放置于超速离心机中。设置离心转速50,000g，20℃离心2小时；
4)离心结束后，小心将离心管从转子中拿出，可以看到在离心管底有一小团沉淀，用Marker笔在外管壁上做标记，倒掉上清。将离心管倒扣在预先铺好的纸巾上，使残余液体流掉。可以用移液枪将挂在壁上的液滴吸走；
5)向每个离心管中分别加入400μl的例1-7及对比例1-5的冻存液，用移液器吹打使沉淀溶解，尽量减少泡沫的产生；将病毒分成40μl一管，，对于采用同一冻存液的，随意取一支样品进行滴度检测，其他剩余样品于-80℃储存。
3、滴度测定
以下所述的检测方法适用于检测冻存前的慢病毒载体，以及冻存30、60、180、360天复苏的病毒载体，及反复冻融的病毒载体。
1)取24孔板接种293T细胞。每孔细胞为5×104个，所加培养基体积为500ul,不同种类的细胞生长速度有所差异，进行病毒感染时的细胞融合率为40％-60％；
2)准备3个无菌EP管，在每个管中加入90ul的新鲜完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)接种细胞24小时后，取两个孔的细胞进行计数，确定感染时细胞的实际数目，记为N；
3)取待测定的病毒原液10ul加入到第一个管中，轻轻混匀后，取10ul加入到第二个管中，然后依次操作直到最后一管；
4)每孔加入10ul不同稀释倍数的慢病毒，感染24小时后，除去培养上清，更换为500μl完全培养基(高糖DMEM+10％FBS)，5％CO2继续培养48小时；
5)72小时后，用胰酶消化后，用500ul PBS重悬细胞，并离心(1500rpm，5min)；
6)弃上清，100ul PBS重悬细胞，并向加入5ul抗CD19scFv抗体(CAR检测抗体)，4℃放置30min；
7)加入500ul PBS，并离心(1500rpm，5min)；
8)加入500ul PBS，流式细胞仪测定表达CAR的阳性率。取阳性率在1-20％的病毒稀释倍数，计算病毒滴度。
按照以下公式计算病毒滴度：
浓缩后病毒滴度为＝{(测定的阳性细胞百分比×感染细胞时的细胞总数)/接种病毒体积}×稀释倍数
举例来说，感染病毒时293T细胞数为5.5×104，每孔加入10μL稀释100倍的慢病毒，流式检测到带荧光的细胞数为5.3％，则该慢病毒的滴度为：{(7.3％×6.5×104/0.01ml)}×102＝4.7×107。
应用实施例：
以下探讨本发明实施例提供的慢病毒载体冻存保护液在慢病毒载体的冻存和/或复苏中的应用，本应用实施例采用CD19CAR慢病毒载体作为研究对象，当然并不限于使用该种病毒载体。
具体地，所述应用包括：
用本发明实施例1-7提供的慢病毒载体冻存保护液(分别记作冻存液1-7)，分别重悬浓缩后的CD19CAR慢病毒，得到CD19CAR慢病毒重悬液，同时以对比例1-5的溶液(分别记作对照1-5)作为对照。
1、-80℃条件下，不同冻存保护液对CD19CAR慢病毒载体保存不同时间后，对其滴度的影响
将重悬在不同冻存液中慢病毒载体，检测冻存前的慢病毒滴度，即D0(冻存当日)；之后分别于D60，D180，D360从-80℃取出慢病毒，置于冰上待其完全融化。检测不同冻存时间的慢病毒滴度，结果如图1所示。
2、反复冻融对CD19CAR慢病毒载体滴度的影响
将不同冻存液中的慢病毒载体样品在冻存前立即进行滴度检测，即得到冻融前样品的滴度；
将各组样品放入液氮中速冻，冻10分钟后取出，置于冰上待其完全溶解，记为冻融1次。随后又立即放入液氮中速冻，冻10分钟后取出，随即置于冰上待其完全溶解，记为冻融2次；依次循环，直至冻融5次、10次。将冻融前的样品、冻融1次、冻融5次和冻融10次的样品进行滴度检测，结果如图2所示。
图1为不同冻存时间，不同冻存液保存的慢病毒滴度如下表1所示：
表1不同冻存液对慢病毒滴度的影响
图2为不同冻存液保存的慢病毒，在不同冻融次数下的慢病毒滴度如下表2所示：
表2冻融次数对慢病毒滴度的影响
图1及表1可知，CD19CAR慢病毒保存在本发明实施例3提供的冻存液3中，在-80℃条件下即使在冻存360天后，其有效滴度滴度仍能达到冻存时的90％，远高于其他实验组中的病毒滴度滴度(也高于FBS的)，而且在整个冻存过程中，用FBS作为冻存液，病毒滴度变化较平缓。冻存效果其次较好的依次是保存剂7，保存剂2，保存剂5和保存剂6。整体来说，保存剂1-7均比对比例1-4的效果好。
如图2及表2所示，在采用保存剂1-4的病毒样品经反复冻融后(图2)，1次冻融后，滴度降到冻融前的80％-85％，5次冻融后降为冻融前的30％-47％，10次冻融后，滴度冻存前的10％左右，与对照组1-4相比，这说明了本发明提供的慢病毒载体冻存保护液极大地提高了CD19CAR慢病毒在超低温条件下的保存时间，且对其滴度的影响不大，并对反复冻融的破坏性条件表现出一定的保护性。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。
Claims (9)
1.一种慢病毒载体冻存液，其特征在于，包括以下体积分数的组分：含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液70-93％，5-20％的甘油，1-6％的CD-Lipid浓缩液，1-8％的人血清白蛋白(HSA)溶液；其中，所述含NaCl的Tris-HCL缓冲溶液中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0。
2.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其特征在于，所述慢病毒载体冻存液中，所述CD-Lipid浓缩液的体积分数为1-6％。
3.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其特征在于，所述含NaCl的Tris-HCL缓冲溶液中，Tris-HCL的摩尔浓度为10mM，NaCl的摩尔浓度为0.1M。
4.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其特征在于，所述人血清白蛋白(HSA)溶液中含有质量浓度为25％的人血白蛋白。
5.如权利要求1所述的慢病毒载体冻存液，其特征在于，所述CD-Lipid浓缩液包括以下各组分：花生四烯酸：2.0mg/L，胆固醇：220.0mg/L，DL-α-生育酚乙酸酯7.0mg/L，亚油酸：10.0mg/L，亚麻酸：10.0mg/L，十四烷酸：10.0mg/L，油酸：10.0mg/L，棕榈酸：10.0mg/L，十八酸：10.0mg/L，吐温-80：2200.0mg/L，普朗尼克F-68：90.0g/L。
6.一种慢病毒载体冻存液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将NaCl加入到Tris-HCl缓冲溶液中，得到含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液，其中，Tris-HCl的摩尔浓度为0.8-20mM，NaCl的摩尔浓度为0.08-0.15M；所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液的pH值为7.0-8.0；将所述含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液、甘油、CD-Lipid浓缩液和人血白蛋白溶液分别按照体积分数为70-93％、5-20％、1-6％和1-8％进行混合，制得慢病毒载体冻存液。
7.一种如权利要求1-5任一项所述的慢病毒载体冻存液在慢病毒载体冻存和/或复苏中的应用，其特征在于，包括：取上述慢病毒载体冻存液；向所述慢病毒载体中加入上述慢病毒载体冻存液，重悬后，得到慢病毒重悬液；冻存所述慢病毒重悬液，得到冻存的慢病毒载体。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，冻存结束后，将所述冻存后的慢病毒载体进行复苏，所述复苏的方法包括：将冻存后的慢病毒载体冰上待其溶解，得到复苏后的慢病毒载体。
9.一种慢病毒载体制剂，其特征在于，包括慢病毒载体和如权利要求1-5任一项所述的慢病毒载体冻存。
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