CN116590341A - 一种腺病毒-PiggyBac系统及其制备方法和应用 - Google Patents

一种腺病毒-PiggyBac系统及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种腺病毒‑PiggyBac系统及其制备方法和应用。该腺病毒‑PiggyBac系统由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，其中PiggyBac穿梭载体腺病毒是通过将PiggyBac穿梭载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得，PBase转座酶载体腺病毒是通过将PBase转座酶载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得。该腺病毒‑PiggyBac系统结合了PiggyBac系统实现大基因稳转和腺病毒广泛的感染特性两个方面的优点，可适用于大基因稳转及腺病毒长时程表达，显著地增大了稳转细胞系的应用范围。

Description

一种腺病毒-PiggyBac系统及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因转染载体技术领域，具体涉及一种新的用于大基因稳转及腺病毒长时程表达的腺病毒-PiggyBac系统及其制备方法和应用。
背景技术
目前稳转细胞系的构建有两种方式，一种是通过慢病毒，一种是通过PiggyBac系统，但是这两种方式都有其不足。例如，对于慢病毒系统，除了筛选标记外，包装的最大容量只能4kbp，而且慢病毒对一些细胞的感染性比较低。PiggyBac系统虽然可以实现较大的目的基因的稳转，但是都是质粒形式。在研究一些质粒难以转染的细胞时，就很难通过PiggyBac系统实现细胞的稳转，更无法实现体内的大基因稳转。
腺病毒作为基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作，具有转导效率高（体外实验可接近100%），宿主范围广，不受靶细胞是否为分裂细胞所限的优势，且容易制得高滴度病毒载体（经纯化、浓缩后可达10E12-13vp/mL）。但是，由于其是不整合到宿主细胞基因组的，因此无法实现目的基因的长时程表达。
因此，亟需开发一种可以实现用于大基因稳转及腺病毒长时程表达的新系统。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提出了一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的腺病毒-PiggyBac系统及其制备方法和应用。
本发明的一个目的在于提供一种适用于大基因稳转及腺病毒长时程表达的腺病毒-PiggyBac系统。
本发明的另一个目的在于提供一种腺病毒-PiggyBac系统的制备方法。
根据本发明的一方面，提供了一种腺病毒-PiggyBac系统，由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，其中所述PiggyBac穿梭载体腺病毒是通过将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得，所述PBase转座酶载体腺病毒是通过将所述PBase转座酶载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得。
可选地，所述PiggyBac穿梭载体为pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
可选地，所述PBase转座酶载体为pADM-CMV-PBase，其中PBase的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
根据本发明的另一方面，还提供了一种腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，所述腺病毒-PiggyBac系统由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，所述制备方法包括：
构建PiggyBac穿梭载体和PBase转座酶载体；
分别将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒和所述PBase转座酶载体腺病毒。
可选地，所述PBase转座酶载体为pADM-CMV-PBase，构建所述PBase转座酶载体的步骤包括：
将pUC57-PBase和载体pADM-CMV-C-FH在SfaAI/MluI双酶切体系下进行酶切，得到目的基因片段和载体片段，其中，pUC57-Pbase是通过将PBase全基因合成至克隆载体而合成，所述PBase的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
将所述目的基因片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到所述PBase转座酶载体。
可选地，所述PiggyBac穿梭载体为pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro，构建所述PiggyBac穿梭载体的步骤包括：
步骤（2.1）：向载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP中装入Puro序列，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro；
步骤（2.2）：改造pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro的3’ITR处酶切位点，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.3）：向pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I中装入GFP，得到pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.4）：向pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入5’SB序列，得到pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.5）：向pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入3’SB序列，得到pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
可选地，所述步骤（2.1）具体包括：利用引物Puro-EcoRI-F（其核苷酸序列如SEQID NO：2所示）、引物Puro-SalI-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）和模板质粒pLent-EF1a-FH-CMV-Puro进行PCR反应，分离纯化得到PCR Puro片段；将所述PCR Puro片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP在EcoRI/ SalI双酶切体系下进行酶切，得到目的Puro片段和载体片段；将所述目的Puro片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro；
所述步骤（2.2）具体包括：以pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro为模板，利用引物3ITR-SalI-F（其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）、3ITR-F（其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示）、3ITR-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）和3ITR-DrdI-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示）进行PCR反应，分离纯化得到PCR 3ITR片段；将所述PCR 3ITR片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro在SalI/ DrdI双酶切体系下进行酶切，得到目的3ITR片段和载体片段；将所述目的3ITR片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.3）具体包括：将片段pAV-CMV-GFP和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I在SfaAI/MluI双酶切体系下进行酶切，得到目的GFP片段和载体片段；将所述目的GFP片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.4）具体包括：将引物SB5-F1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示）、SB5-F2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示）、SB5-F3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示）、SB5-F4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示）、SB5-F5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示）、SB5-R1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示）、SB5-R2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示）、SB5-R3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示）、SB5-R4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示）和SB5-R5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示）在多核苷酸激酶存在条件下进行退火反应；将载体pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I用BcuI进行酶切得到载体片段；将退火产物和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.5）具体包括：将引物SB3-F1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示）、SB3-F2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示）、SB3-F3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示）、SB3-F4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示）、SB3-F5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示）、SB3-R1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示）、SB3-R2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示）、SB3-R3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示）、SB3-R4（其核苷酸序列如SEQ IDNO：26所示）、SB3-R5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示）和SB3-R6（其核苷酸序列如SEQID NO：28所示）在多核苷酸激酶存在条件下进行退火反应；将载体pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I用Eco72I进行酶切得到载体片段；将退火产物和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
进一步地，前述的连接操作具体可包括：将相应的目的片段和载体片段通过T4DNA连接酶进行连接得到连接产物。更具体地，在构建PBase转座酶载体的步骤中，被连接的目的片段和载体片段分别为pUC57-PBase和载体pADM-CMV-C-FH被双酶切后的目的基因片段和载体片段。在构建PiggyBac穿梭载体的步骤（2.1）中，被连接的目的片段和载体片段分别为目的Puro片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP被酶切后的载体片段。在步骤（2.2）中，被连接的目的片段和载体片段分别为目的3ITR片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro被酶切后的载体片段。在步骤（2.3）中，被连接的目的片段和载体片段分别为目的GFP片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段。在步骤（2.4）中，被连接的目的片段和载体片段分别为SB5引物序列的退火产物和载体pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段。在步骤（2.5）中，被连接的目的片段和载体片段分别为SB3引物序列的退火产物和载体pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段。
前述的转化操作具体可包括：利用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化的细胞涂布于相应抗性的LB平板上进行筛选。
可选地，所述分别将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒和所述PBase转座酶载体腺病毒的步骤包括：
将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述辅助质粒转染293A细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒；
将所述PBase转座酶载体的质粒和所述辅助质粒转染293A细胞，得到所述PBase转座酶载体腺病毒，其中，所述辅助质粒为腺病毒骨架质粒AD5/F35。
根据本发明的又一方面，还提供了前述任一项的腺病毒-PiggyBac系统或根据前述任一项的制备方法制备的腺病毒-PiggyBac系统在基因稳转或腺病毒长时程表达中的应用。
可选地，在基因稳转的应用中，稳转的基因的大小大于4kbp。
本发明的有益效果在于：
本发明的腺病毒-PiggyBac系统结合了PiggyBac系统实现大基因稳转和腺病毒广泛的感染特性两个方面的优点，可适用于大基因稳转及腺病毒表达（特别是腺病毒长时程表达），显著地增大了稳转细胞系的应用范围。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1是实施例2中对比例1和对比例2感染A549细胞的荧光显微镜观察结果；
图2是实施例2中对比例1和对比例2感染A549细胞的白光显微镜观察结果；
图3是实施例2中对比例1和对比例2感染A549细胞并用嘌呤霉素筛选后的荧光显微镜观察结果；
图4是实施例2中对比例1和对比例2感染A549细胞并用嘌呤霉素筛选后的白光显微镜观察结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1：腺病毒-PiggyBac系统的制备
腺病毒-PiggyBac系统由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，其制备思路为：首先，分别构建PiggyBac穿梭载体和PBase转座酶载体；然后，分别将所构建的PiggyBac穿梭载体的质粒和PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒。
具体步骤如下：
一、构建转座酶载体与PiggyBac穿梭载体
1. 构建转座酶载体：pADM-CMV-PBase
1.1 基因合成
将下文的PBase序列通过全基因合成至克隆载体，从而合成pUC57-Pbase（合成的pUC57-Pbase来源于南京金斯瑞生物科技公司）。
PBase序列（SEQ ID NO：1）：
GCGATCGCCACCATGGGCTCTAGCCTGGACGACGAGCACATCCTGAGCGCCCTGCTGCAGAGCGACGACGAACTGGTGGGCGAGGACAGCGACAGCGAGGTCAGCGACCACGTGTCCGAGGACGACGTGCAGTCCGACACCGAGGAAGCCTTCATCGACGAGGTGCACGAAGTGCAGCCTACCAGCAGCGGCTCCGAGATCCTGGACGAGCAGAACGTGATCGAGCAGCCTGGCAGCTCCCTGGCCAGCAACAGAATCCTGACCCTGCCCCAGAGAACCATCAGAGGCAAGAACAAGCACTGCTGGTCCACCTCCAAGAGCACCAGGCGGAGCAGAGTGTCCGCCCTGAACATCGTGCGGAGCCAGAGGGGCCCCACCAGAATGTGCAGAAACATCTACGACCCCCTGCTGTGCTTCAAGCTGTTCTTCACCGACGAGATCATCAGCGAGATCGTGAAGTGGACCAACGCCGAGATCAGCCTGAAGAGGCGGGAGAGCATGACCAGCGCCACCTTCAGAGACACCAACGAGGACGAGATCTACGCCTTCTTCGGCATCCTGGTGATGACCGCCGTGAGAAAGGACAACCACATGAGCACCGACGACCTGTTCGACAGATCCCTGAGCATGGTGTACGTGTCCGTGATGAGCAGAGACAGATTCGACTTCCTGATCAGATGCCTGAGAATGGACGACAAGAGCATCAGACCCACCCTGCGGGAGAACGACGTGTTCACCCCCGTGCGGAAGATCTGGGACCTGTTCATCCACCAGTGCATCCAGAACTACACCCCTGGCGCCCACCTGACCATCGATGAGCAGCTGCTGGGCTTCAGAGGCAGATGCCCCTTCAGAGTGTACATCCCCAACAAGCCCAGCAAGTACGGCATCAAGATCCTGATGATGTGCGACAGCGGCACCAAGTACATGATCAACGGCATGCCCTACCTGGGCAGAGGCACCCAGACAAACGGCGTGCCCCTGGGCGAGTACTACGTGAAAGAACTGAGCAAGCCTGTGCATGGCAGCTGCAGGAACATCACCTGCGACAACTGGTTCACCAGCATCCCCCTGGCCAAGAACCTGCTGCAGGAACCCTACAAGCTGACCATCGTGGGCACCGTGCGGAGCAACAAGCGGGAGATCCCAGAGGTGCTGAAGAACAGCAGATCCAGACCTGTGGGAACAAGCATGTTCTGCTTCGACGGCCCCCTGACCCTGGTGTCCTACAAGCCCAAGCCCGCCAAGATGGTGTACCTGCTGTCCAGCTGCGACGAGGACGCCAGCATCAACGAGAGCACCGGCAAGCCCCAGATGGTGATGTACTACAACCAGACCAAGGGCGGCGTGGACACCCTGGACCAGATGTGCAGCGTGATGACCTGCAGCAGAAAGACCAACAGATGGCCCATGGCCCTGCTGTACGGCATGATCAATATCGCCTGCATCAACAGCTTCATCATCTACAGCCACAACGTGTCCAGCAAGGGCGAGAAGGTGCAGAGCCGGAAGAAATTCATGCGGAACCTGTACATGAGCCTGACCTCCAGCTTCATGAGAAAGAGACTGGAAGCCCCCACCCTGAAGAGATACCTGCGGGACAACATCAGCAACATCCTGCCCAAGGAAGTGCCAGGAACAAGCGACGACAGCACCGAGGAACCCGTGATGAAGAAGAGGACCTACTGCACCTACTGTCCCAGCAAGATCAGAAGAAAGGCCAACGCCAGCTGCAAGAAATGCAAAAAAGTGATCTGCCGGGAGCACAACATCGACATGTGCCAGAGCTGTTTCTGAACGCGT
1.2酶切
（1）将合成得到的pUC57-PBase和载体pADM-CMV-C-FH进行酶切，酶切体系如下表1所示：
表1 合成基因和载体酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-CMV-C-FH在反应1.8h时，加入FAST AP1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的基因片段和载体片段。
1.3连接
将回收的目的基因片段与经过同样双酶切得到的载体片段连接，连接体系如下表2所示：
表2 连接体系
将连接体系中的物质混匀后微离心，22°C连接1h，得到连接产物。
1.4转化
利用连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将转化的细胞涂布于相应抗性的LB平板上进行筛选，具体操作如下：
（1）从-80℃取出提前制备好的DH5a感受态细胞置于冰浴中。
（2）待DH5a感受态细胞融化后，取5μl连接产物加入20μl DH5a感受态细胞中，充分混匀，冰浴中静置15分钟。
（3）将离心管放入42℃水浴锅中40秒（期间不要摇动离心管），然后快速移至冰浴中，静置2分钟。
（4）向离心管中加入200μl的无菌的LB培养基（不加抗生素），混匀后置于摇床中于37℃，220rpm振摇1小时。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。
（5）涂布到相应抗性的固体培养基平皿中。
（6）37℃培养箱中培养过夜。
1.5质粒小提
使用试剂盒对筛选出的细胞进行质粒小提。
1.6鉴定
挑取1.5步骤中单菌落培养后提取的质粒，用SfaAI/MluI双酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到PBase转座酶载体pADM-CMV-PBase。
2. 构建PiggyBac穿梭载体：pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro
2.1 向载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP中装入Puro序列
2.1.1引物设计
设计下表3中所示的PCR引物序列：
表3 PCR引物序列
合成引物后先瞬时离心，向引物干粉中加入H2O，H2O的μl数为引物干粉的nmol数*10，稀释成100μM的母液，再转入1.5ml离心管，稀释10倍成为PCR引物工作液。
2.1.2 PCR
PCR体系如下表4所示：
表4 PCR体系（单位：μl）
PCR体系中的引物和模板对应如下表5所示：
表5 PCR引物和模板
PCR反应程序如下表6所示：
表6 PCR反应程序
PCR反应结束后，将得到的PCR产物取2μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，若目的条带大小正确，利用PCR纯化回收试剂盒回收目的片段（即PCR Puro片段）。
2.1.3酶切
（1）将PCR Puro片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP进行酶切，酶切体系如下表7所示：
表7 酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP在反应1.8h时，加入FAST AP 1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段（即目的Puro片段和载体片段）。
2.1.4连接
此连接步骤与前文1.3的连接步骤基本相同，不同之处仅在于被连接的片段为目的Puro片段和pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP被酶切后的载体片段。
2.1.5转化
此转化步骤与前文1.4的转化步骤相同。
2.1.6质粒小提
此提取步骤与前文1.5的提取步骤相同。
2.1.7鉴定
挑取2.1.6步骤中单菌落培养后提取的质粒，用EcoRI/SalI双酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro。
2.2改造pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro的3’ITR处酶切位点
2.2.1引物设计
设计下表8中所示的引物序列：
表8 引物序列
合成引物后先瞬时离心，向引物干粉中加入H2O，H2O的μl数为引物干粉的nmol数*10，稀释成100μM的母液，再转入1.5ml离心管，稀释10倍成为PCR引物工作液。
2.2.2 PCR
PCR体系如下表9所示：
表9 PCR体系（单位：μl）
PCR体系中的引物和模板对应如下表10所示：
表10 PCR引物和模板
PCR反应程序如下表11所示：
表11 PCR反应程序
PCR反应结束后，将第一轮得到的20μl PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，若目的条带大小正确，使用胶回收试剂盒回收目的片段（即PCR 3ITR片段）。
将第二轮得到的PCR产物取2μl用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离检测，若目的条带大小正确，使用纯化回收试剂盒回收目的片段（即PCR 3ITR片段）。
2.2.3酶切
（1）将PCR 3ITR片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro进行酶切，酶切体系如下表12所示：
表12 酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro在反应1.8h时，加入FAST AP 1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段（即目的3ITR片段和载体片段）。
2.2.4连接
此连接步骤与前文1.3的连接步骤基本相同，不同之处仅在于被连接的片段为目的3ITR片段和pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro被酶切后的载体片段。
2.2.5转化
此转化步骤与前文1.4的转化步骤相同。
2.2.6质粒小提
此提取步骤与前文1.5的提取步骤相同。
2.2.7鉴定
挑取2.26步骤中单菌落培养后提取的质粒，用SalI/DrdI双酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I。
2.3向pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I中装入GFP
2.3.1酶切
（1）将片段pAV-CMV-GFP和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I进行酶切，酶切体系如下表13所示：
表13 酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I在反应1.8h时，加入FAST AP 1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段（即目的GFP片段和载体片段）。
2.3.2连接
此连接步骤与前文1.3的连接步骤基本相同，不同之处仅在于被连接的片段为目的GFP片段和pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段。
2.3.3转化
此转化步骤与前文1.4的转化步骤相同。
2.3.4质粒小提
此提取步骤与前文1.5的提取步骤相同。
2.3.5鉴定
挑取步骤2.3.4中单菌落培养后提取的质粒，用SfaAI/MluI双酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I。
2.4向pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入5’SB序列
2.4.1引物设计
设计下表14中所示的SB5引物序列：
表14 SB5引物序列
将合成的引物先瞬时离心，向引物干粉中加入H2O，H2O的μl数为引物干粉的nmol数*10，稀释成100μM的母液用于退火。
2.4.2退火反应
退火反应体系如下表15所示：
表15 退火反应体系
退火程序为：98°C 30min → 0.1°C/s降温到25°C，25°C 20min → 4°C ∞。
2.4.3酶切
（1）将载体pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I进行酶切，酶切体系如下表16所示：
表16 酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I在反应1.8h时，加入FAST AP 1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段（即pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段）。
2.4.4连接
此连接步骤与前文1.3的连接步骤基本相同，不同之处仅在于被连接的片段为SB5引物的退火产物和pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I被酶切后的载体片段。
2.4.5转化
此转化步骤与前文1.4的转化步骤相同。
2.4.6质粒小提
此提取步骤与前文1.5的提取步骤相同。
2.4.7鉴定
挑取2.4.6步骤中单菌落培养后提取的质粒，用BcuI单酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I。
2.5向pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入3’SB序列
2.5.1引物设计
设计下表17中所示的SB3引物序列：
表17 SB3引物序列
合成引物后先瞬时离心，向引物干粉中加入H2O，H2O的μl数为引物干粉的nmol数*10，稀释成100μM的母液，再转入1.5ml离心管，稀释10倍成为退火工作液。
2.5.2退火反应
退火反应体系如下表18所示：
表18 退火反应体系
退火程序为：98°C 30min → 0.1°C/s降温到25°C，25°C 20min → 4°C ∞。
2.5.3酶切
（1）将载体pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I进行酶切，酶切体系如下表19所示：
表19 酶切体系
（2）加样混匀后置于37℃酶切2h（载体pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro -Eco72I在反应1.8h时，加入FAST AP 1μl），反应结束后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测酶切目的条带大小，并用胶回收试剂盒回收目的片段（即pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro -Eco72I被酶切后的载体片段）。
2.5.4连接
此连接步骤与前文1.3的连接步骤基本相同，不同之处仅在于被连接的片段为SB3引物的退火产物和pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro -Eco72I被酶切后的载体片段。
2.5.5转化
此转化步骤与前文1.4的转化步骤相同。
2.5.6质粒小提
此提取步骤与前文1.5的提取步骤相同。
2.5.7鉴定
挑取2.5.6步骤中单菌落培养后提取的质粒，用SalI/Eco72I双酶切进行酶切鉴定阳性克隆，并经测序验证，得到pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
二、制备PiggyBac穿梭载体腺病毒和转座酶载体腺病毒
通过分别将所构建的PiggyBac穿梭载体的质粒和PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒。
具体地，将PiggyBac穿梭载体的质粒和辅助质粒转染293A细胞，得到PiggyBac穿梭载体腺病毒；并将PBase转座酶载体的质粒和辅助质粒转染293A细胞，得到PBase转座酶载体腺病毒，其中，辅助质粒为腺病毒骨架质粒AD5/F35。
下面以转座酶载体腺病毒的制备为例对转座酶载体腺病毒的制备步骤进行具体说明。
1. 转染：将293A细胞接种于6孔板中培养过夜，以PEI（聚醚酰亚胺）为转染试剂，将转座酶载体质粒和辅助质粒加入到293A细胞培养皿中进行转染，将培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中培养。具体的操作步骤如下：
1.1 向灭菌EP管加入500μl不含血清DMEM培养基和9μl PEI配成混合物（Mix），静置5min以上。
1.2 静置后，依次加入2.5μg转座酶载体质粒和2.5μg辅助质粒（即腺病毒骨架质粒AD5/F35），涡旋振荡混匀，其中，PEI:质粒=3:1。
1.3 涡旋瞬离，静置30min以上。
1.4 静置期间铺6孔板293A细胞，细胞数约0.3-0.5×106个/孔。可替代地，也可以提前铺6孔板293A细胞。
1.5 将静置后的混合液逐滴加入6孔板细胞中，十字混匀后置于CO2培养箱中培养。
2. 扩增并收毒：将出现CPE（细胞病变效应）的六孔板中的细胞转入10cm盘中，待10cm盘出现CPE效应后，收毒并转入15ml离心管中，离心。具体的操作步骤如下：
2.1扩增二代病毒
2.1.1 转染后的6孔板细胞随时观察，大约培养2周左右293A细胞出现明显的CPE（CPE程度应为细胞变大、变圆，80%以上的细胞从壁上脱落并漂起来出现聚集和空隙）。将6孔板中细胞培养液连同吹起的细胞一起转入到10cm培养皿中（293A细胞汇合度为80%以上），摇匀后置于CO2培养箱中培养，2-3天后收毒。
2.1.2 收集具有CPE效应（CPE程度应为细胞变大、变圆，80%以上的细胞从壁上脱落并漂起来出现聚集和空隙）的10cm盘中的细胞培养液连同吹起的细胞，用电动移液枪移至15ml离心管中，并做好相应的标记。
2.2收粗毒
2.2.1 将15ml离心管在3500 rpm下离心7min。
2.2.2离心后倒掉上清，沉淀用1ml的1x A195回溶，然后吸到1.5ml EP管中，并对照离心管上面的标记做好相应标记。
2.2.3将准备好的EP管置于-80℃冰箱或干冰水浴锅或者干式恒温器，设置温度为37.0℃，以此反复冻融四次。
2.2.4冻融完成后，12000rpm离心10min。
2.2.5将上清移到二维码管中，吸取每个二维码管内的病毒30μl存到96孔板中，留作滴度检测和特异性检测用。
2.2.6将二维码管盖好盖子，然后存放于-80℃的冰箱中。二维码管与病毒库96孔板孔号对应做好记录。
2.3大量扩增及收毒
2.3.1将收集起来的病毒平均滴加到10-20个10cm盘中（加的病毒量需根据二代病毒活性和滴度而定），十字混匀后，置于CO2培养箱中培养，2-3天后收毒。
2.3.2用电动移液枪收集具有CPE效应的10-20个10cm盘中的细胞至50ml离心管中，并做好相应的标记。
2.3.3 在3500 rpm下离心7min。
2.3.4 将病毒上清倒入提前配制好的加入了NaCl和PEG8000的50ml离心管中（NaCl用量: 2.33g/100ml；PEG8000用量: 8.5g/100ml）后摇匀，放置于4℃冰箱，30min后再次摇匀，以此摇匀2-3次后，4℃直立放置过夜。
3. 纯化前的处理
3.1病毒上清处理
3.1.1 将4℃放置过夜的上清进行离心，在3500rpm、4℃下离心30min。
3.1.2离心后弃掉上清，用4ml PBS+0.001%PF68将沉淀重悬，最终收集到50ml管中。
3.2细胞沉淀处理
3.2.1重悬
3.2.1.1细胞沉淀用4ml PBS+0.001%PF68重悬，混匀。
3.2.1.2加入1ml 5mol/L NaCl（用于裂解细胞核）至终浓度为1mol/L。
3.2.2超声破碎细胞
3.2.2.1将超声探头依次经灭菌水配置的10％84消毒液、75％酒精及灭菌水进行超声清洗。
3.2.2.2将重悬后的细胞碎片超声破碎3-4次（AMPL值为30%，30s/次，每次间隔20-30s），至液体不粘稠。
3.2.2.3超声后，在3500rpm、4℃下离心30min。
3.2.2.4离心后弃去沉淀，将细胞沉淀重悬后的样品与处理好的上清病毒混合。
4. 纯化与浓缩
4.1纯化：碘克沙醇密度梯度离心。
（1）先用灭菌水配制w/v为60%的碘克沙醇，并用0.2μm的滤膜过滤，再按照一定的比例分别配置15%、25%、40% w/v浓度的碘克沙醇。
（2）取一个超离管，用长针管缓慢地逐层加入不同浓度的碘克沙醇。先加入15%层9ml，再加入25%层6ml，其次加入40%层5ml，最后加入60%层4.2ml。
（3）用电动移液枪将处理好的病毒液10-11ml加入到最上层。
（4）超高速离心：超离管配平，误差控制在0.01g以内。设置参数：48000rpm，2.5h，4℃，ROTOR: VTi 50。
4.2浓缩
（1）滴毒：
离心后，将超离管底用针头刺破，弃掉前3ml，收集第4ml到9ml的溶液至15ml离心管中。
（2）浓缩：
提前用0.001% F68/PBS 润湿0.20μm滤膜和超滤管。将收集的6ml液体用PBS+0.001%PF68稀释至体积15ml，混匀。一次性注射器吸取病毒液后，换上0.20μm滤膜过滤到超滤管中，3500g离心40min。将离下去的液体弃掉，再在超滤管中加入PBS+PF68至体积15ml，混匀后再次离心。
前述的转座酶载体腺病毒的制备步骤同样可用于PiggyBac穿梭载体腺病毒的制备，只需将转染步骤中用到的转座酶载体质粒替换为PiggyBac穿梭载体质粒即可。
实施例2
为了评估本发明的腺病毒-PiggyBac系统的基因稳转应用效果，设置对比例与本发明的腺病毒-PiggyBac系统进行对比。
以本发明的腺病毒-PiggyBac系统（由实施例1制备的PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成）为对比例1，以由PiggyBac穿梭载体腺病毒ADV-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro和ADV-CMV-FH组成的系统为对比例2，通过分别以对比例1和对比例2的系统感染A549细胞来观察基因稳转的效果。
以对比例1为例，具体的感染和观察操作如下。
1.取1皿生长对数期的A549细胞，吸去培养基，用PBS清洗一次，加入1mL胰蛋白酶消化细胞，待细胞轻微脱落后，加入5mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移到15mL离心管中，1000rpm离心5min，取得细胞沉淀用3mL完全培养基重悬。
2.将细胞悬液用PBS稀释20倍，然后用血球计数板进行计数。
3.将细胞按照每孔50万的细胞量种于6孔板中，细胞放于37℃，5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养6-8h。
4.取PiggyBac穿梭载体腺病毒和转座酶载体腺病毒，按照MOI（感染复数）=20计算所需病毒量，按照两种病毒1：1的比例加入到6孔板的一个孔中，同时每孔加入终浓度为1ng/mLADV-HR。
5.继续培养48h后进行拍照观察。荧光显微镜拍照观察结果如图1中（a）所示，白光显微镜拍照观察结果如图2中（a）所示。
6.在6孔板的每孔中加入终浓度为4ng/mL的嘌呤霉素，继续筛选48h。
7.待细胞长满后进行传代处理，同时继续加入终浓度为4ng/mL嘌呤霉素的培养基维持培养2周后进行拍照观察。荧光显微镜拍照观察结果如图3中（a）所示，白光显微镜拍照观察结果如图4中（a）所示。
按照前述1至7的步骤，利用对比例2的系统进行同样的操作。其中，步骤5中培养48和后的荧光显微镜拍照观察结果如图1中（b）所示，白光显微镜拍照观察结果如图2中（b）所示。步骤7中经过嘌呤霉素筛选后继续培养2周后的荧光显微镜拍照观察结果如图3中（b）所示，白光显微镜拍照观察结果如图4中（b）所示。
从图1至图4的观察结果可以看出，在感染48小时后，再加嘌呤霉素继续培养2周后，对比例1（即本发明的ADV-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro + ADV-CMV-Pbase系统）组的细胞稳转扩增，得到稳转细胞克隆；而对比例2（即ADV-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro+ ADV-CMV-FH系统）组的细胞全部凋亡，没有形成稳转细胞系。
实验结果数据表明，本发明的腺病毒-PiggyBac系统可以实现目的基因的稳转，是有效的稳转系统。
在此处所提供的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
至此，本领域技术人员应认识到，虽然本文已详尽示出和描述了本发明的多个示例性实施例，但是，在不脱离本发明精神和范围的情况下，仍可根据本发明公开的内容直接确定或推导出符合本发明原理的许多其他变型或修改。因此，本发明的范围应被理解和认定为覆盖了所有这些其他变型或修改。

Claims (10)

1.一种腺病毒-PiggyBac系统，其特征在于，由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，其中所述PiggyBac穿梭载体腺病毒是通过将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得，所述PBase转座酶载体腺病毒是通过将所述PBase转座酶载体的质粒和辅助质粒转染宿主细胞制得。
2.根据权利要求1所述的腺病毒-PiggyBac系统，其特征在于，所述PiggyBac穿梭载体为pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
3. 根据权利要求1或2所述的腺病毒-PiggyBac系统，其特征在于，所述PBase转座酶载体为pADM-CMV-PBase，其中PBase的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.一种腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，其特征在于，所述腺病毒-PiggyBac系统由PiggyBac穿梭载体腺病毒和PBase转座酶载体腺病毒组成，所述制备方法包括：
构建PiggyBac穿梭载体和PBase转座酶载体；
分别将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒和所述PBase转座酶载体腺病毒。
5.根据权利要求4所述的腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，其特征在于，所述PBase转座酶载体为pADM-CMV-PBase，构建所述PBase转座酶载体的步骤包括：
将pUC57-PBase和载体pADM-CMV-C-FH在SfaAI/MluI双酶切体系下进行酶切，得到目的基因片段和载体片段，其中，pUC57-Pbase是通过将PBase全基因合成至克隆载体而合成，所述PBase的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
将所述目的基因片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到所述PBase转座酶载体。
6.根据权利要求4所述的腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，其特征在于，所述PiggyBac穿梭载体为pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro，构建所述PiggyBac穿梭载体的步骤包括：
步骤（2.1）：向载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP中装入Puro序列，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro；
步骤（2.2）：改造pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro的3’ITR处酶切位点，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.3）：向pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I中装入GFP，得到pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.4）：向pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入5’SB序列，得到pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
步骤（2.5）：向pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I中装入3’SB序列，得到pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
7.根据权利要求6所述的腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，其特征在于，
所述步骤（2.1）具体包括：利用引物Puro-EcoRI-F（其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示）、引物Puro-SalI-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）和模板质粒pLent-EF1a-FH-CMV-Puro进行PCR反应，分离纯化得到PCR Puro片段；将所述PCR Puro片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-copGFP在EcoRI/ SalI双酶切体系下进行酶切，得到目的Puro片段和载体片段；将所述目的Puro片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro；
所述步骤（2.2）具体包括：以pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro为模板，利用引物3ITR-SalI-F（其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）、3ITR-F（其核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示）、3ITR-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示）和3ITR-DrdI-R（其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示）进行PCR反应，分离纯化得到PCR 3ITR片段；将所述PCR 3ITR片段和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro在SalI/ DrdI双酶切体系下进行酶切，得到目的3ITR片段和载体片段；将所述目的3ITR片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.3）具体包括：将片段pAV-CMV-GFP和载体pADM-CMV-C-FH-mCMV-Puro-Eco72I在SfaAI/MluI双酶切体系下进行酶切，得到目的GFP片段和载体片段；将所述目的GFP片段和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.4）具体包括：将引物SB5-F1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示）、SB5-F2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示）、SB5-F3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示）、SB5-F4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示）、SB5-F5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示）、SB5-R1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示）、SB5-R2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示）、SB5-R3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示）、SB5-R4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示）和SB5-R5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示）在多核苷酸激酶存在条件下进行退火反应；将载体pADM-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I用BcuI进行酶切得到载体片段；将退火产物和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I；
所述步骤（2.5）具体包括：将引物SB3-F1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示）、SB3-F2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示）、SB3-F3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示）、SB3-F4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示）、SB3-F5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示）、SB3-R1（其核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示）、SB3-R2（其核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示）、SB3-R3（其核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示）、SB3-R4（其核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示）、SB3-R5（其核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示）和SB3-R6（其核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示）在多核苷酸激酶存在条件下进行退火反应；将载体pADM-SB5-CMV-GFP-mCMV-Puro-Eco72I用Eco72I进行酶切得到载体片段；将退火产物和所述载体片段通过连接、转化和质粒小提操作，得到pADM-PB-CMV-GFP-mCMV-Puro。
8.根据权利要求4-7中任一项所述的腺病毒-PiggyBac系统的制备方法，其特征在于，所述分别将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述PBase转座酶载体的质粒与辅助质粒转染宿主细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒和所述PBase转座酶载体腺病毒的步骤包括：
将所述PiggyBac穿梭载体的质粒和所述辅助质粒转染293A细胞，得到所述PiggyBac穿梭载体腺病毒；
将所述PBase转座酶载体的质粒和所述辅助质粒转染293A细胞，得到所述PBase转座酶载体腺病毒，其中，所述辅助质粒为腺病毒骨架质粒AD5/F35。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的腺病毒-PiggyBac系统或根据权利要求4-8中任一项所述的制备方法制备的腺病毒-PiggyBac系统在基因稳转或腺病毒长时程表达中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，稳转的基因的大小大于4kbp。
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