CN106191121A - 一种t1r2基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法 - Google Patents

一种t1r2基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种T1R2基因过表达慢病毒载体、T1R2慢病毒及其构建方法，属于分子生物学技术领域。本发明通过基因重组技术，以pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R2基因，得到T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP‑T1R2。使用慢病毒包装质粒pRSV‑Rev、pMDLg‑pRRE和pMD2.G对T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH‑CMV‑MCS‑EF1‑copGFP‑T1R2进行包装，通过转染HEK293细胞，得到T1R2慢病毒。本发明所构建的T1R2基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高，能特异、持续、高效地促进T1R2基因在宿主细胞中的稳定表达。

Description

一种T1R2基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种T1R2基因过表达慢病毒载体、T1R2慢病毒及其构建方法。
背景技术
味觉功能学研究表明，甜味主要由味觉细胞的G蛋白偶联受体(G proteincoupled receptors，GPCRs)家族所介导，即味觉受体第1家族(taste receptor family1members，T1Rs)。其中T1R2和T1R3是甜味受体，它们以T1R2+T1R3异二聚体的形式发挥作用，共同对甜味进行识别。甜味受体在结合配体后，下游G蛋白被激活，其α亚基与β、γ亚基分离，Gα亚基进入胞浆进而激活下游效应器，最终导致细胞内钙离子浓度升高。因此，通过构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。
构建共表达人T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，需要使用到带有人T1R2基因的过表达载体。现有的方法采用的是将整合有T1R2基因的质粒载体通过脂质体对宿主细胞进行转染，但是脂质体转染质粒载体的转染效率较低，要构建能稳定共表达T1R2、T1R3和Gα三种基因的细胞系成功率也较低。因此，如何提高T1R2基因过表达载体的转染效率是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种T1R2基因过表达慢病毒载体、T1R2慢病毒及其构建方法，该方法所构建的慢病毒载体，转染效率高，并能将T1R2基因整合到宿主细胞的基因组中，因此能特异、持续、高效地促进T1R2基因在宿主细胞中的稳定表达。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种T1R2基因过表达慢病毒载体，以慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R2基因，得到T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2。
本发明还提供pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：
步骤(1)，人工合成T1R2基因；
步骤(2)，以下列PCR扩增引物进行T1R2基因的PCR扩增：
所述的PCR扩增引物为：
T1R2-F：agattctagagctagcaccaccatggatggggcccagggcaaag；
T1R2-R：accctaactgacacacggatccctagtccctcctcatggtg；
步骤(3)，用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R2基因的PCR产物和慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切；
步骤(4)，用T4DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R2基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2；
其中，步骤(4)PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤(2)所采用的PCR扩增引物相同。
步骤(4)测序所用引物为：
CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；
EF13：ccaacttctcggggactgtg；
T1R2seq1：cagctgatgctgcacttc；
T1R2seq2：agctgcttgaggagatctg。
本发明另外提供一种T1R2慢病毒的构建方法，采用上述T1R2基因过表达慢病毒载体，方法是：使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G对T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2进行包装。，通过转染HEK293细胞，得到T1R2慢病毒。
本发明还要求保护上述T1R2慢病毒的构建方法构建得到的T1R2慢病毒。本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明所构建的T1R2基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％，比起现有的质粒转染法转染效率提高了1倍以上。此外由于慢病毒能将T1R2基因整合到宿主细胞的基因组中，因此使用该方法能特异、持续、高效地促进基因T1R2在宿主细胞中的稳定表达。过表达T1R2基因的细胞可用于构建共表达T1R2、T1R3和Gα基因的细胞系，可用钙流检测方法对甜味物质进行识别。
附图说明
图1是pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表达载体图谱；
图2是pRSV-Rev慢病毒包装质粒图谱；
图3是pMDLg-pRRE慢病毒包装质粒图谱；
图4是pMD2.G慢病毒包装质粒图谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
主要实验试剂及厂家：
大肠杆菌菌株DH5α(Invitrogen)
胎牛血清FBS(Invitrogen)
胰蛋白酶(Invitrogen)
DMEM完全培养基(含10％FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素)(Invitrogen)
限制性内切酶(Fermentas)
T4DNA连接酶(NEB公司)
质粒DNA提取试剂盒(Axygen公司)
制备感受态试剂盒(BIOSCIENCES)
PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)
逆转录酶MuLV(NEB)
RNase抑制剂(NEB)
SYBR Green qPCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific)
pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP、pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G，均可商购于上海比昂生物医药科技有限公司。
实施例1：T1R2基因过表达慢病毒载体构建。
1、人工合成T1R2基因，其DNA如SEQ ID NO.1所示。
2、使用PrimeSTAR高保真酶，以人工合成的T1R2基因为模板，通过如表1所示引物进行的PCR扩增：
表1
PCR反应体系与条件如表2：
表2
试剂 体积
模板 1μL
上游引物T1R2-F(10μM) 1μL
下游引物T1R2-R(10μM) 1μL
PrimeSTAR Max(2x) 10μL
ddH2O 7μL
总体积 20μL
PCR程序如表3：
表3
3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物大小是否与预期一致，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的目的片段条带，用DNA回收试剂盒回收纯化；
4、用EcoRI和BamHI限制性内切酶分别对T1R2基因的PCR产物和慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切(于37℃酶切3h)，反应体系和反应条件如表4：
表4
5、琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，切割在琼脂糖凝胶电泳胶中的T1R2基因片段条带和线性化的慢病毒载体，用胶回收试剂盒回收DNA；
6、用T4DNA连接酶于16℃水浴下，将两种酶切产物进行连接，过夜。反应如表5：
表5
试剂 体积
10X T4DNA连接酶buffer 2μL
T4DNA连接酶(400U/μL) 1μL
T1R2基因片段 10μL
线性化的慢病毒表达载体 4μL
ddH2O 3μL
总体积 20μL
7、转化感受态细胞：
从-80℃冰箱取出1管100μL DH5α感受态细胞，放冰上解冻(解冻至无冰状态)后取10μL上述步骤6中的连接产物加到感受态细胞中混匀，静置30min，42℃水浴热激1min，冰上静置2min。加LB液体培养基500μL，37℃振荡培养1小时。3000rpm离心5min，留100μl左右上清液混匀细菌后涂到LB平板上，37℃倒置培养过夜。
8、挑取数个菌落，做菌落PCR检测转化子，反应体系和条件见步骤2；
9、将菌落PCR鉴定得到的阳性克隆进行测序验证，测序引物如表6：
表6
实施例2：T1R2慢病毒包装
1、用胰蛋白酶消化对数生长期的HEK293细胞，细胞密度为5×106时；重新接种于含有25mL含10％(v/v)FBS的无抗生素DMEM培养基直径为15cm的细胞培养皿中，37℃，50mL/L CO2培养箱内培养；
2、制备慢病毒包装系统中四种质粒DNA溶液：
将以上质粒加入无菌水定容至1800μL，再加入CaCl2(2.5mol/L)溶液200μL，混匀，加入2×PBS缓冲盐溶液2000μL，室温放置20～30min；
3、当细胞密度达60％～70％时进行转染。此时将步骤2中制备的DNA溶液和磷酸钙混合液转移至步骤1得到的含单层细胞的细胞培养皿中，混匀，培养12h后弃去培养液，细胞用15mL PBS溶液冲洗，共洗3次。
4、向上述细胞培养皿中加入含100mL/L FBS的DMEM细胞培养液15mL，继续培养48h；
5、收集转染72h的HEK293细胞上清液；
6、将收集的上清液于4℃，4000g离心10min，再次收集上清液；
7、将再次收集得到的上清液以0.45μm滤器过滤；
8、将滤液于40mL超速离心管中，4℃，25000r/min离心20min，弃上清液；
9、而后以冰500ul PBS重旋病毒沉淀于4℃溶解过夜，得到慢病毒液，即T1R2慢病毒。
实施例3：细胞转染和筛选
1、在6孔细胞培养板中培养HEK293细胞，待细胞完全贴壁汇合度为40％-50％后，即可进行细胞转染；转染前，每孔细胞换成500μL新鲜的DMEM完全培养基，并且每孔加入1μL的聚凝胺(polybrene)，放置于培养箱孵育1h。
2、在上述6孔细胞培养板的2个孔中，分别加入5μL实施例2得到的T1R2慢病毒液，其中一孔细胞加10μL的空载慢病毒液(空载慢病毒液与T1R2慢病毒液的唯一区别是不含有T1R2基因，其余制备方法都相同)，另一孔做空白细胞对照，充分的摇匀后放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养
3、转染6小时后，吸走孔内的培养基，并用PBS洗两次；换成新鲜的DMEM完全培养基，放入37℃、5％(v/v)CO2、95％相对湿度的培养箱中培养。
4、感染48小时后，与对照组相比较，于荧光显微镜下观察感染效果。若观察到明显的绿色荧光，说明已转染成功。此时将得到的HEK293-T1R2细胞移至10cm细胞培养皿扩大培养。
实施例4：使用实时荧光定量PCR进行T1R2基因的表达检测。
1、HEK293-T1R2细胞总RNA提取：
1)将10cm细胞培养皿中汇合度达80％的筛选得到的HEK293-T1R2细胞用预冷PBS缓冲液洗2遍，加1ml Trizol裂解液重悬。
2)接着加入0.2ml三氯甲烷，剧烈摇动10s，室温放置3分钟。
3)4℃，12000rpm离心20min。
4)将上清水相转移至另一新的无RNA酶离心管中，并加入等体积的异丙醇，混匀，-80℃放置1h。
5)4℃，12000rpm离心10min，去上清。
6)加入1ml体积浓度为75％乙醇洗涤沉淀。
7)4℃，5000rpm离心3min，去上清，室温晾干。
8)加入40μL RNase-free水溶解RNA。
2、去基因组DNA和cDNA的合成
将RNA加入到gDNA吸附柱，室温10,000g离心1min，收集滤液即为去除基因组DNA的RNA。
cDNA合成条件：
RNA 1μg
dNTP(10mM)1μl
oligo dT(40μM)1μl
随机引物(40μM)1μl
加RNase-free水至34.5μl；
至于75℃5min，冰上5min。
向上述反应后的溶液中添加反转录试剂：
MuLV 1μl
10X buffer 4μl
RNase抑制剂0.5ul
42℃反应1h，75℃灭活酶10min，备用
3、cDNA的实时荧光定量PCR
将T1R2基因和内参基因actin的cDNA样本分别取样在荧光定量PCR仪上进行反应，每个样本设置3个平行实验。PCR反应体系为20μL，反应体系如表7：
表7
荧光定量PCR使用的引物如表8：
表8
反应条件为：
循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。
本发明所构建的T1R2基因过表达慢病毒载体对宿主细胞的转染效率高达80％～90％。
实验以actin为内参基因，采用2-△△Ct法进行分析，经所构建的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒载体转染的HEK293细胞中T1R2基因的相对表达量是未转入T1R2基因的HEK293细胞的2.88倍。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表

Claims (5)

1.一种T1R2基因过表达慢病毒载体，其特征在于以慢病毒pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP慢病毒表达载体为基础进行构建，并整合有T1R2基因，得到T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2。
2.权利要求1所述的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），人工合成T1R2基因；
步骤（2），以下列PCR扩增引物进行T1R2基因的PCR 扩增：
所述的PCR扩增引物为：
T1R2-F：agattctagagctagcaccaccatggatggggcccagggcaaag；
T1R2-R：accctaactgacacacggatccctagtccctcctcatggtg；
步骤（3），用限制性内切酶EcoRI和BamHI分别对T1R2基因的PCR 产物和慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP进行双酶切；
步骤（4），用T4 DNA连接酶将酶切的得到的线性化的T1R2基因和慢病毒载体连接，将得到的连接液转化DH5α感受态细胞，并进行PCR鉴定，对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对，比对正确的克隆即为构建成功的T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2；
其中，步骤（4）PCR鉴定采用的PCR扩增引物与步骤（2）所采用的PCR扩增引物相同。
3.根据权利要求2所述的pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，步骤（4）测序所用引物为：
CMV-F：cgcaaatgggcggtaggcgtg；
EF13：ccaacttctcggggactgtg；
T1R2seq1：cagctgatgctgcacttc；
T1R2seq2：agctgcttgaggagatctg。
4.一种T1R2慢病毒的构建方法，采用权利要求1所述的T1R2基因过表达慢病毒载体，其特征在于，使用慢病毒包装质粒pRSV-Rev、pMDLg-pRRE和pMD2.G对T1R2基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T1R2进行包装，，通过转染HEK293细胞，得到T1R2慢病毒。
5.权利要求4所述的T1R2慢病毒的构建方法构建得到的T1R2慢病毒。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019036868A1 (zh) * 2017-08-21 2019-02-28 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种b/t淋巴细胞弱化因子基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法
CN111304254A (zh) * 2020-02-20 2020-06-19 齐鲁医药学院 过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法
CN111321170A (zh) * 2020-03-13 2020-06-23 昆明医科大学 Mbp基因过表达型小胶质细胞及其制备方法和应用
CN112226463A (zh) * 2019-12-17 2021-01-15 合源生物科技(天津)有限公司 一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用
CN112522308A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 山东农业大学 拟南芥tir2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8067235B2 (en) * 2006-06-07 2011-11-29 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Optimized human T1R2 nucleic acid molecule
WO2013082522A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Duke University Expression of g-protein coupled receptors (gpcrs)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8067235B2 (en) * 2006-06-07 2011-11-29 Nutrinova Nutrition Specialties & Food Ingredients Gmbh Optimized human T1R2 nucleic acid molecule
WO2013082522A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Duke University Expression of g-protein coupled receptors (gpcrs)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
孟凡荣等: "慢病毒载体及其研究进展", 《中国肺癌杂志》 *
钟艳平等: "hTERT 重组第三代慢病毒载体的构建及其病毒包装鉴定", 《中国生物工程杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019036868A1 (zh) * 2017-08-21 2019-02-28 深圳市博奥康生物科技有限公司 一种b/t淋巴细胞弱化因子基因过表达慢病毒载体、慢病毒及其构建方法
CN112226463A (zh) * 2019-12-17 2021-01-15 合源生物科技(天津)有限公司 一种质粒组合及其在制备经修饰的免疫细胞中的应用
CN111304254A (zh) * 2020-02-20 2020-06-19 齐鲁医药学院 过表达hACE2基因的中性粒细胞制剂的制备方法
CN111321170A (zh) * 2020-03-13 2020-06-23 昆明医科大学 Mbp基因过表达型小胶质细胞及其制备方法和应用
CN112522308A (zh) * 2020-12-15 2021-03-19 山东农业大学 拟南芥tir2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用
CN112522308B (zh) * 2020-12-15 2022-04-01 山东农业大学 拟南芥tir2基因在提高植物盐胁迫抗性中的应用

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