CN115820693A - 一种稳定表达冠状病毒3cl蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用，属于生物技术领域。以人类免疫缺陷病毒‑1来源的慢病毒载体为骨架，将冠状病毒3CL蛋白酶基因片段克隆至慢病毒载体骨架中，构建冠状病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒；其中，重组质粒包括调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因。使用该慢病毒体系感染宿主细胞株，筛选鉴定得到安全性高、无人群传染能力、在低生物安全防护等级实验室即可测定冠状病毒3CL蛋白酶抑制或降解活性的细胞模型。通过目的蛋白或报告蛋白的荧光或发光信号反映外源性刺激效果，操作简便，可大幅提升科研效率，实现高通量筛选，加快新冠肺炎有效药物和疫苗研发进程。

Description

一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及 构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是由新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)引起的发热性呼吸系统疾病。SARS-CoV-2属于β属冠状病毒，冠状病毒的基因组为线性单股正链的RNA病毒，是自然界广泛存在的一大类病毒。目前已知可以感染人的冠状病毒有7种，均为β属冠状病毒，分别为：HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-COV-2。其中SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-COV-2传染性强，可能导致人类严重呼吸道疾病，给人类健康带来巨大威胁。

3CL蛋白酶(3chymotrypsin-like protease,3CL^pro)也称为主要蛋白酶(M^pro)，能够特异性地识别非结构蛋白NSP4-NSP16的11个切割位点并进行切割，从而释放出冠状病毒其它的非结构蛋白，在子代病毒的复制和转录过程中起到极其关键的作用。氨基酸序列比对显示，SARS-CoV-2和SARS-CoV、MERS-CoV之间3CL蛋白酶的相似性超过90％，具有高度的结构相似性和保守性。因此，3CL蛋白酶可以作为开发抑制多种冠状病毒感染复制转录药物的同源靶标，以预防SARS-CoV-2病毒可能在未来出现的任何突变形式或应对其他冠状病毒的威胁。

但是，目前冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物筛选细胞水平的实验方法需通过病毒毒株感染体外培养的动物细胞来进行，此方法应在生物安全防护三级实验室(P3)进行且安全风险较高，不利于高通量筛选。因此构建快速、准确且安全系数高，在低生物安全防护等级实验室(P2)即可应用的冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物筛选工具具有重要意义。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用，构建快速、准确且安全系数高，在低生物安全防护等级实验室(P2)即可应用的冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物筛选工具。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和辅助包装质粒；

其中，所述冠状病毒3CL蛋白酶基因为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV或变异株的3CL蛋白酶基因。

优选地，含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒与辅助包装质粒的质量比为4:5。

优选地，所述辅助包装质粒为调控外源基因表达的慢病毒蛋白表达质粒、实现组织或细胞特异性表达的慢病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒或提供病毒包装所需包装蛋白的质粒。

优选地，所述含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒包括人类免疫缺陷病毒-1来源的慢病毒载体骨架、含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的目的基因片段、调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因。

优选地，冠状病毒3CL蛋白酶基因的序列如SEQ.ID.5所示。

优选地，所述标签蛋白为His、GST、HA、c-Myc和Flag标签中的一种或两种；所述报告基因为绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因和荧光素酶基因中的一种或两种；所述药物筛选基因为Puro、Hygro、Neo或Bsd。

优选地，所述慢病毒载体为GV492载体。

本发明还公开了上述一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系、细胞模型及构建方法和应用，以携带有调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因的慢病毒载体质粒为骨架，经酶切后获得线性化载体，将扩增得到的冠状病毒3CL蛋白酶基因片段插入线性化载体的酶切位点之间，得到含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒；再将含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和病毒辅助包装质粒以质量比为4:5进行包装、转染、扩增，得到用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系；

其中，所述酶切位点为BamHI/AgeI。

优选地，包装、转染、扩增的具体步骤为：大肠杆菌菌株扩增获取含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和辅助包装质粒，通过质粒提取获得高浓度、高纯度、无内毒素的质粒；将质粒滴加至动物细胞培养液中，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养6～10h后换入新鲜培养基，继续培养48～72h，裂解细胞收集慢病毒体系原液，得到用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系。

本发明还公开了上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系在制备稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型、动物模型及抗冠状病毒感染化学药物、生物制剂及基因疗法研发中的应用。

本发明还公开了一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型，其特征在于，将上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系通过转导表达外源性冠状病毒3CL蛋白酶的动物细胞得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型。

本发明还公开了上述一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的构建方法，将上述一种用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系感染动物细胞，经qPCR检测、抗性筛选、细胞扩培、标签蛋白表达检测，获得稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的单克隆细胞株。

优选地，感染过程中病毒接种的MOI为20～40，抗性药物的使用浓度为2.0～10.0μg/mL。

本发明还公开了上述一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型在新药研发、药物筛选、生物制剂制备、基因治疗方案研究及动物模型建立中的应用。

优选地，药物筛选过程中，将冠状病毒3CL蛋白酶稳转细胞株接种至培养容器中，加入候选药物作用，经处理后检测荧光信号或发光信号，通过荧光强度或发光值表征冠状病毒3CL蛋白酶表达值的变化，绘制候选药物的剂量效应曲线，从而筛选出对3CL蛋白酶表达及活性具有调控作用的药物并确定其效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，首先，慢病毒体系宿主广泛，对于分裂和非分裂细胞均具有感染能力，能较大程度提高目的基因在较难转染细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞中的转导效率；其次，慢病毒体系携带的冠状病毒3CL蛋白酶基因组可整合到转染细胞的基因组，使转染细胞长时间稳定表达外源基因，不随细胞分裂传代而丢失；最后，慢病毒体系免疫原性低，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验。构建的慢病毒体系经修饰不携带致病基因、安全性高，不会感染人体或在人群传播，因而能够作为低生物安全防护等级实验室(P2)中冠状病毒3CL蛋白酶靶向药物的筛选工具。

进一步地，采用荧光蛋白或发光蛋白的表达信号强度反映外源性刺激效果，如通过荧光强度/发光值反应药物抑制/降解目标蛋白的效果，使结果可视化，方便检测。

本发明提供的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型，利用上述慢病毒体系构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型，细胞模型采用病毒法制备，相比传统化学转染方法周期短，且获得的活性细胞株响应强度高，操作简便，无需繁琐步骤，检测成本低且在低生物安全防护等级实验室(P2)即可完成相应工作，可大幅提升科研效率，实现高通量筛选；可以加快新冠肺炎有效药物和疫苗的研发进程提供有力工具，为新冠肺炎治疗药物的开发奠定基础，此外，细胞模型的建立方法可以推广到其他领域，助力药物研发。

附图说明

图1为本发明的构建新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒的载体质粒GV492图谱；

图2为本发明的GV492载体酶切产物凝胶电泳图；其中，1：Marker；2：GV492载体酶切产物；3：未经酶切GV492载体；

图3为本发明的新冠病毒3CL蛋白酶基因PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，1：Marker；2：PCR产物；

图4为本发明的单克隆细胞的形态及PCR鉴定凝胶电泳图；其中，1：阴性对照(ddH₂O)；2：阴性对照(空载对照组)；3：阳性对照(GAPDH)；4：Marker；5-12：1-8号转化子；

图5为本发明的病毒包装辅助质粒pHelper 1.0载体图谱；

图6为本发明的病毒包装辅助质粒pHelper 2.0载体图谱。；

图7为本发明的稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒滴度检测流程图；

图8为本发明的荧光法检测稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒滴度结果图；其中，A为病毒原液0.1μL组亮场图像(×200)，B为病毒原液1.0μL组亮场图像(×200)，C为病毒原液10μL组亮场图像(×200)，D为病毒原液0.1μL组荧光图像(×200)，E为病毒原液1.0μL组荧光图像(×200)，F为病毒原液10μL组荧光图像(×200)；

图9为本发明的HEK-293细胞感染稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒效果图；其中，A为实验组亮场图像(×100)，B为阴性对照组亮场图像(×100)，C为实验组亮场图像(×200)，D为阴性对照组亮场图像(×200)，E为实验组荧光图像(×100)，F为阴性对照组荧光图像(×100)，G为实验组荧光图像(×200)，H为阴性对照组荧光图像(×200)；

图10为本发明的HEK-293细胞感染稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒后qPCR检测结果图；

图11为本发明的新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株荧光检测图；其中，A为实验组亮场图像(×100)，B为实验组荧光图像(×100)，C为实验组亮场图像(×200)，D为实验组荧光图像(×200)，E为阴性对照组亮场图像(×100)，F为阴性对照组荧光图像(×100)，G为阴性对照组亮场图像(×200)，H为阴性对照组荧光图像(×200)，I为未感染对照组亮场图像(×100)，J为未感染对照组荧光图像(×100)，K为未感染对照组亮场图像(×200)，L为未感染对照组荧光图像(×200)；

图12为本发明的新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株传代后荧光检测图；其中，A为实验组亮场图像(×100)，B为阴性对照组亮场图像(×100)，C为实验组亮场图像(×200)，D为阴性对照组亮场图像(×200)，E为实验组荧光图像(×100)，F为阴性对照组荧光图像(×100)，G为实验组荧光图像(×200)，H为阴性对照组荧光图像(×200)；

图13为本发明的Western blot检测Flag标签蛋白表达水平结果图；

图14为本发明的稳转细胞株对3CL蛋白酶抑制剂PF-07321332的量效曲线关系图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明提供的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和辅助包装质粒；含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒，包含冠状病毒3CL蛋白酶基因片段、调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因；辅助包装质粒为可调控外源基因表达的慢病毒蛋白表达质粒、可实现组织或细胞特异性表达的慢病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒和提供病毒包装所需包装蛋白的质粒；

其中，所述标签蛋白包括但不限于His、GST、HA、c-Myc、Flag标签或任何组合的双标签蛋白，所述报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、荧光素酶基因或任何组合的双报告基因；所述药物筛选基因包括但不限于Puro、Hygro、Neo或Bsd；所述冠状病毒3CL蛋白酶基因为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV或变异株的3CL蛋白酶基因。

下面以含有冠状病毒3CL蛋白酶基因、元件序列为Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin的GV492载体的重组质粒、病毒包装辅助质粒pHelper 1.0载体和pHelper2.0载体包装得到的慢病毒体系进行详述。

1.构建新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒

利用限制性内切酶消化获得线性化载体，PCR扩增制备新冠病毒3CL蛋白酶基因片段，以线性化载体和目的基因扩增产物配制反应体系，进行重组反应，实现线性化载体和目的基因片段的体外环化。重组产物进行转化，挑取平板上的单克隆进行PCR鉴定，对阳性克隆进行测序及结果分析。具体步骤如下：

1)酶切体系的构建

商业化的GV492载体(质粒图谱参见图1，BamHI/AgeI酶切)购自上海吉凯基因化学技术有限公司，该GV492载体的元件序列为Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin。如表1构建酶切体系，按顺序依次加入试剂后用移液枪吹打混匀，短暂离心，置于37℃反应3h。对GV492载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳(图2)，回收目的条带。

表1酶切反应体系

试剂	体积(μL)
		ddH<sub>2</sub>0	42
lO×CutSmartBuffer2	5
		纯化的GV492载体质粒DNA(lμg/μL)	2
Age I(10U/μL)	1

2)目的基因片段的获取

设计引物，引物序列如表2所示：

表2扩增引物序列

ID	序列	序号
			NSP5-p1	aggtcgactctagaggatcccgccaccatgagtggttttagaaaaatg	SEQ.ID.NO.1
NSP5-p2	tccttgtagtccataccttggaaagtaacacctgagcattg	SEQ.ID.NO.2

扩增引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR获得目的基因。

如表3配置PCR反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行反应。按照表3反应条件进行冠状病毒3CL蛋白酶基因PCR扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(图3)，回收目的条带。

表3PCR反应体系及反应条件

3)PCR产物与载体进行交换

如表4配制PCR产物与酶切后的GV492载体的反应体系，混匀离心，于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化。在该体系中，加入的线性化GV492载体DNA和纯化的PCR产物的最适摩尔比为1：2。

表4PCR产物与载体的反应体系

反应体系	阳性对照(μL)	自连对照(μL)	实验组(μL)
				ddH<sub>2</sub>O	2.5	4.5	3.5
5×CE II Buffer	2	2	2
				酶切后的GV492载体DNA	2.5	2.5	2.5
纯化后的PCR产物片段	2	0	1
				Exnase<sup>TM</sup> II	1	1	1

4)转化

将10μL交换反应产物加入到100μL感受态细胞中，混匀后在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有Puromycin(Clontech)的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。

5)菌落PCR鉴定

如表5配制反应体系，震荡混匀、离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。

表5PCR鉴定引物序列、反应体系及反应条件

对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，观察鉴定结果(图4)。其中：空白对照以ddH₂O为模板，结果显示鉴定体系不存在污染；阴性对照为未插入新冠病毒3CL蛋白酶基因的空载体，结果显示扩增过程中无假阳性现象；阳性对照以含有GAPDH基因的DNA为模板，结果显示工作体系正常。经鉴定阴性转化子PCR产物大小为185bp，阳性转化子PCR产物大小为1106bp。

6)测序

将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含Puromycin的LB液体培养基中，37℃培养16h，取适量菌液进行测序。对测序结果与目的基因序列进行比对分析，比对结果如表6，说明菌液测序结果与目的基因序列(即冠状病毒3CL蛋白酶基因序列)完全一致。

表6测序结果

2.新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒的慢病毒包装

使用质粒抽提试剂盒(Qiagen)将重组新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒及商品化的病毒包装辅助质粒pHelper 1.0载体(图5，上海吉凯基因化学技术有限公司)和pHelper 2.0载体(图6，上海吉凯基因化学技术有限公司)进行质粒提取，获得高浓度高纯度无内毒素的质粒。包装过程中用到的慢病毒包装细胞为HEK-293T细胞，经培养生长增殖形成单层细胞；用于扩增慢病毒载体和辅助包装质粒的菌株为大肠杆菌菌株DH5α。具体包装步骤如下：

在转染前24h，使用胰蛋白酶(生工生物工程(上海)股份有限公司)消化对数生长期的HEK-293T细胞，以含10％血清(上海微科生化试剂有限公司)的培养基调整细胞密度约5×10⁶细胞/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养24h，待细胞密度达80％时可用于转染。转染前2h更换无血清培养基，后将DNA溶液(重组新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒表达质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg)加入离心管中，在室温下孵育15min后缓慢滴加至HEK-293T细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养。培养6h后弃去含有转染混和物的培养基，加入10mL的PBS液洗涤，弃去后加入含10％血清的细胞培养基20mL，于37℃、含5％CO₂培养箱内继续培养72h。

根据细胞状态，收集转染后的细胞上清液于4℃，4000rpm离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm过滤器过滤上清液于超速离心管中，将带有病毒上清液的超速离心管在4℃下，以25000rpm离心2h。离心结束后弃去上清，加入PBS重悬。经充分溶解后，10000rpm高速离心5min，取上清液，即得慢病毒体系原液。

3.稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶慢病毒的质量检测

采用下述方法对制得的慢病毒体系原液进行质量检测方法：

1)物理指标检测

通过肉眼判断，上述慢病毒体系呈澄清液体状。用移液器缓慢吸取50μL上清液体，无明显粘稠感或吸液滞后现象。

2)无菌检测

将慢病毒体系上清液加入到HEK-293T细胞中，培养24h后镜检，发现无细菌及真菌污染情况，细胞间隙无明显颗粒存在，培养基澄清透明。

3)滴度检测

上述慢病毒体系为荧光标记的慢病毒，通过荧光法根据GFP表达情况测定上述慢病毒体系滴度。测定前一天，使用HEK-293T贴壁细胞铺板，96孔板中每孔4×10⁴个细胞，体积为100μL。在3个无菌EP管中分别加入90μL无血清培养基(DMEM，BiologicalIndustries)。如图7所示，取待测病毒原液10μL加入到第一个管(记为1E+1μL)中，混匀后，取10μL加入到第二个管(记为1E+0μL)中，继续相同的操作，第三个管记为1E-1μL。选取所需细胞孔，弃去90μL细胞培养基，加入90μL稀释好的慢病毒溶液，培养箱培养24h后，加入完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％PS)100μL。培养72h后，观察GFP荧光表达情况，根据病毒滴度＝荧光细胞数/病毒原液量，测量慢病毒体系的滴度，经测定上述慢病毒体系滴度为4E+8TU/mL(图8)。

4.新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株的构建

使用上述慢病毒体系感染HEK-293细胞，并经qPCR检测、抗性筛选、细胞扩培、标签蛋白表达检测等步骤获得混合克隆稳定细胞株。具体步骤如下：

1)HEK-293细胞准备

从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中。解冻后1300rpm离心3min，移至生物安全柜；吸去冻存液，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种至含有5mL完全培养基的培养皿中，混匀后置于37℃、5％CO₂浓度培养箱中培养；24h后更换一次培养液继续培养，待细胞融合度达80％左右传代培养，保持细胞良好的生长状态。

2)HEK-293细胞感染慢病毒

处于对数生长期的细胞用胰酶(GIBCO)消化，离心去上清，加入至1mL新鲜培养基中重悬。取20μL细胞悬液于6孔板中计数铺板，复孔1×10⁵个，再加入2mL DMEM培养基。将铺好的板放入培养箱等待贴壁，隔天观察细胞贴壁状态，状态良好则感染目的病毒。

将板中培养基换成1mL的含Polybrene(上海碧云天生物技术有限公司)的Opti-MEM减血清培养基(Thermo Fisher)。对HEK-293细胞进行感染(MOI＝20)，上述慢病毒体系的加入量为5μL，设置阴性对照组(不含目的基因)及未感染对照组(空细胞)。感染完成后将6孔板放回培养箱，16h后将带有病毒的培养基更换成新鲜的DMEM培养基。感染72h后，将感染好的板置于荧光显微镜下观察，细胞状态良好，未出现大量死亡现象，阳性感染效率为95％(图9)。

进行qPCR检测，内参基因(上海吉凯基因化学技术有限公司)和目的基因的引物信息见表7。使用Trizol试剂盒(上海普飞公司)进行总RNA抽取，反转录获得cDNA，进行Real-time PCR检测，通过2^-ΔΔCt法进行数据分析，目的基因在阴性对照组中表达非常低，表达丰度为1.001，而实验组目的基因的表达丰度为30923.031(图10)。与阴性对照组相比，实验组的表达丰度是阴性对照组的30923倍。

表7内参基因和目的基因的引物信息

名称	上游引物序列	扩增片段长度(bp)	序号
				内参基因上游引物	gcgtgacattaaggagaagc	236	SEQ.ID.NO.6
内参基因下游引物	ccacgtcacacttcatgatgg	236	SEQ.ID.NO.7
				目的基因上游引物	gttcgcattcaaccaggac	216	SEQ.ID.NO.8
目的基因下游引物	tgtgccagcatgaactcc	216	SEQ.ID.NO.9

3)新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株的构建

根据PCR结果，进行新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株的构建。使用上述慢病毒体系感染HEK-293细胞，感染16h后换液。感染72h后，荧光显微镜下观察，荧光未达到100％，加入2μg/mL的Puromycin进行筛选。同时设置阴性对照组(不含目的基因)和未感染对照组(空细胞)，加入同浓度的Puromycin。细胞筛选48h后，镜下观察，实验组荧光已达到100％，未感染对照组已全部死亡(图11)。

4)稳转细胞株的传代与扩增

将感染后的HEK-293细胞6孔板从培养箱中拿出放在操作台上，吸去上清，向孔板中加入PBS进行清洗。加入0.25％EDTA，每孔0.5mL，放入培养箱中孵育3min。取出6孔板，放入生物安全柜，向每孔中加入含10％FBS的培养基，终止消化。吸出含有细胞的上清液，转移至EP管中，300rpm离心3min。取出EP管，弃上清，再加入DMEM培养基1mL重悬。将重悬后的细胞悬液转移至含有10mL培养基的培养皿中。将培养皿放入培养箱中培养72h后，荧光显微镜下观察，慢病毒体系感染后的传代细胞生长状况良好，荧光效率达到100％，与阴性对照组无显著差别(图12)。

采用蛋白免疫印迹检测Flag标签蛋白的表达水平，使用RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，BCA Protein Assay Kit(上海碧云天生物技术有限公司)进行蛋白定量，经12.5％SDS-PAGE凝胶分离，后使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。4℃下用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)封闭PVDF膜过夜。用封闭液稀释一抗(anti-flag：37kDa，Sigma；anti-β-actin：42kDa，Santa Cruz)，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h，并用TBST洗膜4次，每次8min。用封闭液稀释二抗(anti-mouse IgG：CST)，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST洗膜4次，每次8min。最后进行ECL发光成像，结果显示，在实验组中检测到Flag条带(图13)。

5.建立新冠病毒3CL蛋白酶抑制剂PF-07321332的量效曲线关系

应用稳定表达新冠病毒3CL蛋白酶的慢病毒，建立在低生物安全防护等级实验室(P2)进行细胞水平靶向药物筛选实验的方法。具体步骤如下：

使用步骤4中的活性稳转细胞株(HEK-293)贴壁细胞铺板，96孔板中每孔4×10⁴个细胞，体积为100μL。置于CO₂培养箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。制备新冠病毒3CL蛋白酶抑制剂PF-07321332标准品溶液，设置稀释浓度梯度(初始终浓度为10μM，十倍倍比稀释5个浓度)，将配置好的梯度浓度的标准品溶液加入到96孔板中(10μL/孔)，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下静置培养过夜。小心吸去上清收集细胞，加入100μL PBS缓冲液(1×，pH值7.2)洗涤2次，后用1％triton X-100(Sigma)处理细胞15分钟，加入100μLPBS缓冲液(1×，pH值7.2)洗涤2次，收集细胞10⁵个。用5％的BSA封闭液对样品封闭1h，后使用封闭液稀释一抗(Anti-SARS-CoV-2 3CL^pro：30-35kDa，AssayGenie)与细胞在室温下孵育1h，加入100μL PBS缓冲液(1×，pH值7.2)洗涤2次。后使用封闭液稀释荧光二抗(anti-rabbit IgG：CST)与细胞在室温下孵育1h，通过流式细胞术标记新冠病毒3CL蛋白酶的表达，计算平均荧光强度(MFI)值。抑制率(％)＝1-[(MFI_样品组-MFI_背景)/(MFI_对照组-MFI_背景)]×100％。以药物浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标，利用统计软件Graphpad Prism拟合实验数据，得到候选药物的剂量效应曲线。如图14所示，本发明构建的新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株在3CL蛋白酶抑制剂PF-07321332刺激下呈现浓度依赖的抑制作用，说明药物浓度与目的蛋白的平均荧光强度值存在明显的相关性，发明构建的新冠病毒3CL蛋白酶稳转细胞株可用于药物的筛选及活性测定。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，其特征在于，包括含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和辅助包装质粒；

其中，所述冠状病毒3CL蛋白酶基因为SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS-CoV、HCoV或变异株的3CL蛋白酶基因。

2.根据权利要求1所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，其特征在于，含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒与辅助包装质粒的质量比为4:5。

3.根据权利要求1所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，其特征在于，所述辅助包装质粒为调控外源基因表达的慢病毒蛋白表达质粒、实现组织或细胞特异性表达的慢病毒蛋白表达质粒、提供病毒包装所需包膜蛋白的质粒或提供病毒包装所需包装蛋白的质粒。

4.根据权利要求1所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，其特征在于，所述含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒包括人类免疫缺陷病毒-1来源的慢病毒载体骨架、含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的目的基因片段、调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因。

5.根据权利要求1所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系，其特征在于，冠状病毒3CL蛋白酶基因的序列如SEQ.ID.5所示。

6.权利要求1～5任意一项所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系的构建方法，其特征在于，以携带有调控元件、标签蛋白基因、报告基因和药物筛选基因的慢病毒载体质粒为骨架，经酶切后获得线性化载体，将扩增得到的冠状病毒3CL蛋白酶基因片段插入线性化载体的酶切位点之间，得到含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒；再将含有冠状病毒3CL蛋白酶基因的重组质粒和病毒辅助包装质粒以质量比为4:5进行包装、转染、扩增，得到用于构建稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的慢病毒体系；

其中，所述酶切位点为BamHI/AgeI。

7.权利要求1～5任意一项所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系在制备稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型、动物模型及抗冠状病毒感染化学药物、生物制剂及基因疗法研发中的应用。

8.一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型，其特征在于，将权利要求1～5任意一项所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系通过转导表达外源性冠状病毒3CL蛋白酶的动物细胞得到稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型。

9.权利要求8所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型的构建方法，其特征在于，将权利要求1～5任意一项所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的慢病毒体系感染动物细胞，经qPCR检测、抗性筛选、细胞扩培、标签蛋白表达检测，获得稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的单克隆细胞株。

10.权利要求9所述的一种稳定表达冠状病毒3CL蛋白酶的细胞模型在新药研发、药物筛选、生物制剂制备、基因治疗方案研究及动物模型建立中的应用。

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