CN112048477A - Ebv病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法：(1)将鼻咽部粘膜组织用Dispase Ⅱ消化；打成单个细胞，离心去除上清，得细胞沉淀；(2)细胞沉淀用上皮细胞培养基悬浮，培养；(3)消化成单细胞，种在24孔支持膜上方小室中，培养至长满支持膜；(4)将支持膜上方的培养液完全去除；继续培养2～3周；(5)当观察到大面积纤毛摆动时，加入Akata细胞进行细胞‑细胞接触介导的EBV感染；感染成功，即得EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型。本发明的建立方法，取材部位是鼻咽部粘膜组织，经气液界面培养，鼻咽部上皮细胞可分化成完全极化的假复层呼吸道上皮组织，由基底层细胞、分泌型杯状细胞和摆动纤毛细胞构成，完全模拟鼻咽部上皮组织。
Description
技术领域
本发明涉及一种EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法。
背景技术
EBV病毒的全称为Epstein-Barr virus，是由Epstein和Barr于1964年首次成功地使用Burkitt非洲儿童的淋巴瘤细胞，通过体外悬浮培养而建立的病毒株。EBV在人群中具有普遍感染性，在全球范围内，血清学表明有90％以上的人被EBV感染过。EBV主要通过唾液和血液传播和传染。感染多发生在幼儿时期，一般不伴随或只伴随较弱的临床症状。EBV的感染能够诱导多种恶性肿瘤的产生，包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌和胃癌等。目前还没有有效治疗EBV感染的药物，对因EBV感染而引起的致癌，目前还得不到有效地防治或治疗。为了治疗EBV相关疾病，必须更深入地研究EBV，有必要建立一种便于研究EBV感染上皮细胞的体外模型，探讨鼻咽癌发病机制。
血清学研究表明，超过95％的成人感染并携带EB病毒。EB病毒感染的靶细胞包括B淋巴细胞和上皮细胞。EB病毒是有史以来第一个发现的人类致癌病毒。EB病毒感染所引起的疾病具有地域性差异：例如传染性单核细胞增多症主要发生在欧洲和北美，通常影响青少年或年轻人；在赤道非洲，EBV感染引起伯基特淋巴瘤；在中国台湾、中国南部和东南亚，EB病毒感染可导致鼻咽癌。
EB病毒感染的靶细胞包括B淋巴细胞和上皮细胞。EB病毒感染外周血里的B淋巴细胞，很容易建立B淋巴细胞系，并作为体外研究淋巴瘤的重要模型。然而，由于EB病毒非常难感染上皮细胞，使得感染模型缺乏，严重阻碍了EB病毒感染在引起鼻咽部上皮癌变为鼻咽癌的机制研究。过去虽然人们建立了各种上皮体外感染模型，但都不是生理性相关，比如传统单层贴壁培养来自于口腔和扁桃体上皮细胞，因为细胞是单层非极化，不能模仿呼吸道上皮的多层结构。另外也有人用来自口腔的上皮细胞或EBV阴性的鼻咽癌永生细胞系经气液界面培养，形成不完全极化的呼吸道假复层结构。
有关EBV上皮细胞体外感染模型目前尚未有专利报道，现有报道都是非专利文献文章，如：【Pegtel,D.M.；Middeldorp,J.；Thorley-Lawson,D.A.Epstein-Barr virusinfection in ex vivo tonsil epithelial cell cultures of asymptomaticcarriers.J Virol.2004,78,12613–12624.doi:10.1128/JVI.78.22.12613-12624.2004.】、【Heawchaiyaphum,C.；Iizasa,H.；Ekalaksananan,T.；Burassakarn,A.；Kiyono,T.；Kanehiro,Y.；Yoshiyama,H.；Pientong C.Epstein-Barr virus infection oforal squamous cells.Microorganisms2020,8:pii:E419.doi:10.3390/microorganisms8030419.】、【Li,Q.；Young,L.S.；Niedobitek,G.；Dawson,C.W.；Birkenback,M.；Wang,F.；Rickinson,A.B.Epstein–Barr virus infection andreplication in a human epithelial cell system.Nature 1992,365,347–350.doi:10.1038/356347a0】、【Tugizov,S.M.；Berline,J.W.；Palefsky,J.M.Epstein-Barr virusinfection of polarized tongue and nasopharyngeal epithelial cells.NatMed.2003,9,307–314.doi:10.1038/nm830.】、【Caves,E.A.；Cook,S.A.；Lee,N.；Stoltz,D.；Watkins,S.；Shair,K.H.Y.Air-liquid interface method to study Epstein-Barrvirus pathogenesis in nasopharyngeal epithelial cells.mSphere 2018,3,pii:e00152-18.doi:10.1128/mSphere.00152-18.】、【Temple,R.M.；Zhu,J.；Budgeon,L.；Christensen,N.D.；Meyers,C.；Sample,C.E.Efficient replication of Epstein-Barrvirus in stratified epithelium in vitro.Proc Natl Acad Sci U.S.A.2014,111,16544–16549.doi:10.1073/pnas.1400818111.】。但这些培养系统均缺乏纤毛及分泌表型的分化。
发明内容
针对上述现有技术，针对现有EBV病毒感染上皮细胞效率低，不能有效复制的限制因素，本发明提供了一种EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法——利用鼻腔基底层干细胞分化而来的假复层呼吸道上皮构建病毒体外感染模型。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，包括以下步骤：
(1)将鼻咽囊肿患者手术切除的鼻咽部粘膜组织置于PBS缓冲液(4℃)中冲洗(手术切除后立即放入)，去除表面黏液，剥离除去粘膜下组织；4℃下用DispaseⅡ(分散酶Ⅱ)(购自Sigma公司，使用浓度为10mg/ml)消化8～12h；用含10％FBS的DMEM培养液终止消化，用加样枪缓慢机械打成单个细胞，离心去除上清，得细胞沉淀；
(2)上述离心后得到的细胞沉淀，用上皮细胞培养基悬浮，加入胎牛血清(加入量为培养基的0.02％，体积百分数)，培养(在6孔板里培养至铺满80％)；
所述培养的培养条件为：37℃、5％CO2、95％空气；
(3)上述培养的上皮细胞，用胰酶(使用浓度为0.05％，重量百分数)消化成单细胞，悬浮于B-ALITM生长培养基(可购自Lonza,Walkersville,MD)中，细胞密度为1×106/ml；种在24孔支持膜上方小室中(24-well Transwell inserts，0.4μm pore size，Corning，NY)，加400μl B-ALITM生长培养基于支持膜下方小室，培养至长满支持膜(大约3天)；
所述培养的培养条件为：37℃、5％CO2、95％空气；
(4)将支持膜上方的培养液完全去除，使上方暴露于空气，细胞生长所需的营养成分由支持膜下方的B-ALITM生长培养基供给，即气液体界面(Air-liquid in-terface，ALI)培养；每隔一天换液一次；继续培养2～3周；
(5)上述培养2～3周后，倒置显微镜20倍镜头下观察，当观察到大面积纤毛摆动时，加入Akata细胞(现有技术中已有的细胞产品，可常规市场购买得到)进行细胞-细胞接触介导的EBV感染；感染成功，即得EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型。
本发明的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，具有以下优点或有益效果：首先，取材部位是鼻咽部粘膜组织，该部位位于呼吸道上皮和鳞状上皮的交界处，上皮下富含丰富的淋巴组织，是鼻咽癌的发病部位，而且亚洲的鼻咽癌是未分化癌，100％和EBV感染相关。其次，经气液界面培养，鼻咽部上皮细胞可分化成完全极化的假复层呼吸道上皮组织，由基底层细胞、分泌型杯状细胞和摆动纤毛细胞构成，完全模拟鼻咽部上皮组织。本发明的模型的建立方法，还可以扩展应用到其他呼吸道病毒模型的建立，例如流感病毒、鼻病毒、肺病毒和SARS-CoV-2病毒。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：本发明的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的构建方法的技术路线示意图。
图2：EBV感染假复层呼吸道上皮示意图(目镜10×，物镜40×)，其中，A、基底层细胞；B、杯状分泌细胞；C、纤毛细胞；红色是用细胞类型特异性抗体染色确定细胞类型，绿色的亮点是病毒EBBERRNA探针杂交信号位于细胞核里。
图3：鼻咽部上皮细胞(单层培养)，加入Akata细胞，通过细胞-细胞接触介导EBV感染，由于EBV病毒DNA是被绿色荧光蛋白(GFP)标记的，所以感染成功细胞发出绿色荧光。i)是光镜和绿色荧光通道合在一起图像，显示了感染和位感染细胞的形态；ii)是蓝色(细胞核染料DAPI)和绿色荧光通道合在一起通道，根据此图统计总细胞数(蓝色)，有多少感染(绿色)，n＝3重复，计算出感染效率为0.26％。
图4：选取有代表性的切片(n＝3)，统计蓝色细胞核给出总细胞数，统计带绿色光点的细胞核给出被感染的细胞数，或者和前者的比值计算出感染效率。基底层细胞感染比率为25.％，基底层以上细胞层感染比率为65％，均比单层细胞感染效率高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的构建
步骤如下(技术路线如图1所示)：
(1)将鼻咽囊肿患者手术切除的鼻咽部粘膜组织置于PBS缓冲液(4℃)中冲洗(手术切除后立即放入)，去除表面黏液，剥离除去粘膜下组织；4℃下用DispaseⅡ(分散酶Ⅱ)(购自Sigma公司，使用浓度为10mg/ml)消化8～12h；用含10％FBS的DMEM培养液终止消化，用加样枪缓慢机械打成单个细胞，离心去除上清，得细胞沉淀；
(2)上述离心后得到的细胞沉淀，用FG培养基悬浮，加入胎牛血清(加入量为FG培养基的0.02％，体积百分数)，在6孔板里培养(37℃、5％CO2、95％空气)至铺满80％；
所述FG培养基是由基础上皮细胞培养基(购自瑞士的CELLnTEC公司)和DMEM培养基按3:1(体积比)的比例混合而成的；
(3)上述培养的上皮细胞，用胰酶(使用浓度为0.05％，重量百分数)消化成单细胞，悬浮于B-ALITM生长培养基(购自Lonza,Walkersville,MD)中，细胞密度为1×106/ml；种在24孔支持膜上方小室中(24-well Transwell inserts，0.4μm pore size，Corning，NY)，加400μl B-ALITM生长培养基于支持膜下方小室，培养(37℃、5％CO2、95％空气)至长满支持膜(大约3天)；
(4)将支持膜上方的培养液完全去除，使上方暴露于空气，细胞生长所需的营养成分由支持膜下方的B-ALITM生长培养基供给，即气液体界面(Air-liquid in-terface，ALI)培养；每隔一天换液一次；继续培养2～3周；
(5)上述培养3周后，倒置显微镜20倍镜头下观察，观察到大面积纤毛摆动，加入Akata细胞进行细胞-细胞接触介导的EBV感染；
(6)感染后第5天，4％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用EBV特异性EBER RNA探针进行核酸杂交以检测EBV的感染效率和细胞内分布，结果如图2所示，由图可知，多层结构有基底层细胞(p63+，红色)，杯状分泌细胞(MUC5AC，红色)(图中红色是不同细胞类型特异性抗体，箭头所指是EBV病毒RNA探针杂交信号显示感染)，EBER RNA探针原位检测到EBV病毒可以感染三种细胞，信号更多位于基底层之上的几层细胞。感染效率显著高于单层细胞感染并且体现了呼吸道上皮细胞构成的多样性(图3和图4)。本实施例成功构建了完全模拟呼吸道上皮的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型。
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
Claims (10)
1.一种EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将鼻咽部粘膜组织置于PBS缓冲液中冲洗，去除表面黏液，剥离除去粘膜下组织；用DispaseⅡ消化；终止消化，打成单个细胞，离心去除上清，得细胞沉淀；
(2)上述离心后得到的细胞沉淀，用上皮细胞培养基悬浮，加入胎牛血清，培养；
(3)上述培养的上皮细胞，用胰酶消化成单细胞，悬浮于B-ALITM生长培养基中；种在24孔支持膜上方小室中，加B-ALITM生长培养基于支持膜下方小室，培养至长满支持膜；
(4)将支持膜上方的培养液完全去除，使上方暴露于空气，继续培养2～3周；
(5)上述培养2～3周后，显微镜观察，当观察到大面积纤毛摆动时，加入Akata细胞进行细胞-细胞接触介导的EBV感染；感染成功，即得EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型。
2.根据权利要求1所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，DispaseⅡ的使用浓度为10mg/ml，消化温度为4℃，时间为8～12h。
3.根据权利要求1或2所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(1)中，用含10％FBS的DMEM培养液终止消化。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，胎牛血清的加入量为培养基的0.02％。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)中，所述培养的培养条件为：37℃、5％CO2、95％空气。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(2)中，培养是在6孔板里培养，培养至铺满80％。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(3)中，悬浮于B-ALITM生长培养基中的细胞密度为1×106/ml。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：所述步骤(3)中，培养至长满支持膜的时间为3天。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法，其特征在于：还包括以下步骤：(6)感染后第5天，4％福尔马林固定，石蜡包埋，切片，用EBV特异性EBER RNA探针进行核酸杂交以检测EBV的感染效率和细胞内分布。
10.利用权利要求1～9中任一项所述的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型的建立方法构建得到的EBV病毒感染人工呼吸道上皮模型。
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