CN114107223B - 利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用TPCK胰酶提高SARS‑CoV‑2病毒细胞培养滴度的方法，其特征在于将SARS‑CoV‑2病毒接种到细胞中，然后以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养，从而扩增SARS‑CoV‑2病毒，培养滴度得到大幅度提高，培养时间有效缩短。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法。
背景技术
冠状病毒是一类有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组27-32kb，在系统分类上属冠状病毒科(Coronaviridae)冠状病毒属(Coronavirus)，主要分为α、β、γ三个属。自然界中，冠状病毒宿主广泛，可感染多种禽类和哺乳动物。
在病毒学的发展史中，利用体外培养的动物组织、胚胎或细胞，分离培养病毒是突破性的成就，体外组织细胞培养是开展新病毒分离鉴定、致病机理研究、疫苗评价和药物研发等工作不可或缺的技术平台。据报道SARS-CoV-2可感染Vero E6和Huh-7细胞系，分离培养一代需要约4-6天的时间，培养时间长且细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)不易观察，必须借助PCR检测的方法才能确定病毒的存在。这不仅在一定程度上制约SARS-CoV-2分子生物学的研究发展，减缓了SARS-CoV-2疫苗和相关药物的研发速度，也潜在的增加了生物安全的风险。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足而提供利用TPCK胰酶提高 SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，SARS-CoV-2病毒在细胞中的培养滴度得到大幅度提高，培养时间有效缩短。
本发明为解决上述提出的问题所采用的技术方案为：
利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，将SARS-CoV-2病毒接种到细胞中，然后以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养，从而扩增SARS-CoV-2病毒，收获病毒液，即为较高滴度的SARS-CoV-2病毒液。
按上述方案，所述维持培养基中TPCK胰酶的含量在0～16μg/mL，优选在0～4μ g/mL，且不为0。
按上述方案，所述维持培养基中还包括DMEM培养液、BSA、青-链霉素。优选地，维持培养基由DMEM、BSA、青-链霉素和TPCK胰酶组成，在DMEM基础培养基中添加了青霉素100μg/mL、链霉素100μg/mL、牛血清白蛋白(BSA)2.5mg/mL、TPCK胰酶0～ 4μg/mL。
按上述方案，接种的SARS-CoV-2病毒与接种细胞的数量比值(multiplicity ofinfection，MOI)在0.01～100之间，SARS-CoV-2病毒接种到细胞中1～2小时后，以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养1～3天。优选地，SARS-CoV-2病毒接种到细胞中1～2 小时后，以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养24～72小时。
按上述方案，本发明主要采用人肝癌细胞Huh7.5和非洲绿猴肾细胞Vero E6作为接种细胞。进一步地，接种细胞为初始细胞传代浓度为3×104个/mL～5×105个/mL的人肝癌细胞或非洲绿猴肾细胞，预先培养24～48小时后，接种SARS-CoV-2病毒。
本发明还提供一种优选地利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，采用初始细胞传代浓度为3×104个/mL～5×105个/mL的人肝癌细胞或非洲绿猴肾细胞，培养24～48小时后，接种MOI＝10的SARS-CoV-2病毒，接种1-2小时后，用Hank's缓冲溶液等无菌洗液洗涤细胞，然后再以含有0～4μg/mL TPCK胰酶的维持培养基进行培养1-3 天，从而扩增SARS-CoV-2病毒来提高培养滴度。
按上述方案，所述SARS-CoV-2病毒具体采用SARS-CoV-2毒株(BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020(EPI_ISL_412981))。该毒株从2020年1月18日发病的患者身上分离得到，分子分型为B.4，氨基酸突变位点NSP2 V198I、NSP6 L37F、NSP6 V246D，是国内早期流行的新冠病毒的代表株，该毒株序列信息已上传至GISAID。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所述提高SARS-CoV-2病毒培养滴度的方法，解决了用常规病毒培养基培养SARS-CoV-2病毒在Huh7.5细胞中增殖慢的问题；减少了SARS-CoV-2病毒在Vero E6细胞中的培养时间。本发明的方法与普通的培养条件相比较，在Huh7.5细胞中培养滴度可以提高250倍，培养时间可由6天减少为3天，细胞病变效应明显。在Vero E6细胞中，培养时间由3天减少为2天，培养滴度提高2.9倍。
附图说明
图1为在Huh7.5细胞上TPCK-胰酶浓度对细胞病变效应CPE的影响。其中，2％ FBS代表常用病毒维持培养基；0～4μg/mL TPCK-胰酶代表实施例2中所用的TPCK-胰酶浓度在0～4μg/mL范围的病毒维持培养基。
图2为在Vero E6细胞上TPCK-胰酶浓度对细胞病变效应CPE的影响。其中，2％ FBS代表常用病毒维持培养基；0～2μg/mL TPCK-胰酶代表实施例3中所用的TPCK-胰酶浓度在0～2μg/mL范围的病毒维持培养基。
图3为在Huh7.5细胞上不同浓度TPCK胰酶对SARS-CoV-2病毒扩增的影响。其中，2％FBS代表常用病毒维持培养基；0～4μg/mL TPCK-胰酶代表实施例4中所用的 TPCK-胰酶浓度在0～4μg/mL范围的病毒维持培养基。
图4为在Vero E6细胞上不同浓度TPCK胰酶对SARS-CoV-2病毒扩增的影响。其中，2％FBS代表常用病毒维持培养基；0～2μg/mL TPCK-胰酶代表实施例5中所用的 TPCK-胰酶浓度在0～2μg/mL范围的病毒维持培养基。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，下面结合实施例进一步阐明本发明的内容，但本发明不仅仅局限于下面的实施例。
下述实施例中，试验毒株为BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020 (EPI_ISL_412981)；Huh7.5细胞获赠于中国疾病预防控制中心病毒病所；Vero E6细胞购至于国家实验细胞资源共享平台；TPCK-胰酶购自Sigma公司；胎牛血清(Fetal Bovine Serum，FBS)购自CLARK Bioscience公司；7.5％BSA、PBS购自杭州吉诺公司；RLT细胞裂解液购自Qiagen公司；青-链霉素(10,000μg/mL)、EDTA-胰酶、DMEM培养基均购自Gibco公司；AgPath-ID One-step RT-PCR KIT购自Life公司；检测引物和探针由上海伯杰合成。
下述实施例中，所用仪器设备：Qiagen EZ1 Adavanced XL全自动核酸提取仪；Heal force二氧化碳培养箱；Roche 480II荧光PCR仪。
下述实施例中，采用可以用于培养人肝癌细胞Huh7.5和非洲绿猴肾细胞Vero E6的培养基，添加终浓度为0～4μg/mL的TPCK-胰酶；人肝癌细胞Huh7.5中TPCK胰酶较佳的终浓度为3μg/mL，非洲绿猴肾细胞Vero E6中TPCK胰酶较佳的终浓度为0.25μg/mL；并以完全培养基和常用病毒维持培养基作为对照。各培养基配比如下：
完全培养基：DMEM培养液(市售)+10％FBS+1％青-链霉素；
常用病毒维持培养基：DMEM培养液+2％FBS+1％青-链霉素；
实施例中的病毒维持培养基：DMEM培养液+0.25％BSA+1％青-链霉素+X，X表示一定含量的TPCK-胰酶。其中，％均以在DMEM培养液中的质量分数来计。
实施例中，所使用人肝癌细胞Huh7.5或非洲绿猴肾细胞Vero E6的复苏与培养方法如下：从液氮中迅速取出细胞(即人肝癌细胞Huh7.5或非洲绿猴肾细胞Vero E6)，在37℃水浴锅中迅速融化进行细胞复苏，待细胞完全融化后，将复苏细胞加入10倍体积的完全培养基中，以300g的离心条件离心10min，除去上清液，并加入完全培养基将细胞吹打重悬均匀，加入到细胞培养瓶中，放入37℃，二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱静置培养至第2～3天时，进行细胞传代。细胞传代时，除去细胞培养瓶中的培养液，细胞用PBS润洗 2～3遍，加入EDTA-胰酶，在37℃消化细胞2-3min，至细胞从细胞瓶的塑料表面分离，加入完全培养基，用移液管轻轻吹散细胞团，细胞计数，调整细胞悬液的浓度约为每mL含105细胞，每个T-25细胞培养瓶中加6mL细胞悬液，放入37℃，二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱静置培养。
下述实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南(第三版，科学出版社，2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例4～6中，SARS-CoV-2病毒核酸检测靶标为ORF1ab区域，引物序列、PCR体系配置和PCR扩增条件如下：
检测引物与探针序列：
正向引物(F)：CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
反向引物(R)：ACGATTGTGCATCAGCTGA
荧光探针(P):5'-FAM-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQ1-3'
PCR体系配置：
PCR扩增程序：
实施例1 TPCK胰酶维持培养基对人肝癌细胞Huh7.5和非洲绿猴肾细胞Vero E6的生长影响
将Huh7.5细胞按5×105细胞/孔接种到12孔板中，培养48hr后移去完全培养基，用PBS润洗细胞2～3次，加入一定含量TPCK-胰酶维持培养基，放入37℃，二氧化碳浓度为 5％的二氧化碳培养箱培养，于72hr后观察镜检观察细胞形态，确定TPCK-胰酶浓度对 Huh7.5细胞生长的影响(如表1所示)。
将Vero E6细胞按5×105细胞/孔接种到12孔板中，培养24hr后移去完全培养基，用 PBS润洗细胞2～3次，加入一定含量TPCK-胰酶维持培养基，放入37℃，二氧化碳浓度为5％的二氧化碳培养箱培养，于72hr后观察镜检观察细胞形态，确定TPCK-胰酶浓度对VeroE6细胞生长的影响(如表1所示)。
表1 TPCK-胰酶浓度对Huh7.5细胞和Vero E6细胞生长的影响
由表1可知：未感染SARS-CoV-2病毒的人肝癌细胞Huh7.5可在TPCK-胰酶浓度低于8μg/mL的维持培养基中正常生长，细胞状态不受影响。而未感染SARS-CoV-2病毒的非洲绿猴肾细胞Vero E6细胞可在TPCK-胰酶浓度低于4μg/mL的维持培养基中正常生长，细胞状态不受影响。
实施例2在Huh7.5细胞上TPCK-胰酶浓度对CPE形成的影响
将Huh7.5细胞按5×105细胞/孔接种到12孔板中，培养48hr后移去完全培养基，用Hank's液润洗细胞2～3次，每孔加入200μL按1:100稀释(用不含TPCK胰酶的病毒维持培养基稀释)的SARS-CoV-2毒株(BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020)，接种1～2 小时后，移去病毒接种液，用Hank's液润洗细胞2次，加入一定含量TPCK-胰酶病毒维持培养基，以常用病毒维持培养基做对照，放入二氧化碳培养箱培养24hr、48hr、72hr后观察镜检观察细胞形态，确定TPCK-胰酶浓度对CPE的影响(图1)。
由图1可知：SARS-CoV-2病毒感染Huh7.5细胞后，在常用病毒维持培养基培养72小时内，无CPE出现，肉眼无法判断病毒是否增殖。而用一定含量TPCK-胰酶维持培养基培养72小时，在含1μg/mL～4μg/mL TPCK-胰酶的维持培养基中，培养48小时后就能看到 CPE的出现，随着TPCK-胰酶浓度的增高，CPE出现的数量随之增加，而且出现的空斑也随之增大，辨认明显。
实施例3在Vero E6细胞上TPCK-胰酶浓度对CPE形成的影响
将Vero E6细胞按5×105细胞/孔接种到12孔板中，培养48hr后移去完全培养基，用 Hank's液润洗细胞2～3次，每孔加入200μL按1:100用不含TPCK胰酶的病毒维持培养基稀释的SARS-CoV-2毒株(BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020)，接种1～2小时后，移去病毒接种液，用Hank's液润洗细胞2次，加入一定含量TPCK-胰酶病毒维持培养基，以常用病毒维持培养基做对照，放入二氧化碳培养箱培养24hr、48hr、72hr后观察镜检观察细胞形态，确定TPCK-胰酶浓度对CPE的影响(图2)。
由图2可知：SARS-CoV-2病毒感染Vero E6细胞后，在常用病毒维持培养基培养，在48小时就能看见细胞出现变圆漂浮现象。而用一定含量TPCK-胰酶维持培养基培养，高浓度的TPCK-胰酶在24小时就能出现明显的病变现象。在24小时，2μg/mL TPCK-胰酶的维持培养基中，感染SARS-CoV-2病毒的Vero E6细胞就出现了明显的细胞变圆、大量脱落的现象；1μg/mL TPCK-胰酶的维持培养基中，感染SARS-CoV-2病毒的Vero E6细胞也出现了空斑现象；TPCK-胰酶浓度越高，病变现象越明显。在培养48小时后，所有含TPCK-胰酶的维持培养基中，感染SARS-CoV-2病毒的Vero E6细胞都出现了明显的细胞变圆脱落现象。
实施例4在Huh7.5细胞上TPCK-胰酶浓度对病毒扩增的影响
将Huh7.5细胞按3×104细胞/孔接种到96孔板中，培养24hr后移去完全培养基，用Hank’s液润洗细胞2～3次，每孔加入100μL按1:100稀释的SARS-CoV-2毒株(BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020)，接种1～2小时后，移去病毒接种液，用Hank’s液润洗细胞2次，加入100μL一定含量TPCK-胰酶维持培养基(以常用病毒维持培养基做对照)，放入二氧化碳培养箱培养，24hr、48hr、72hr后用100μL RLT细胞裂解液裂解细胞，用核酸提取仪提取总RNA后进行定量PCR检测，确定在不同TPCK-胰酶浓度培养条件下，病毒的 Ct值和管家基因GAPDH的Ct值(表2)；并以含2％FBS常规病毒培养基的病毒Ct值为参照，计算病毒在不同TPCK-胰酶浓度的维持培养基中基的扩增效率(表3)。
表2不同浓度TPCK胰酶、不同培养时间下SARS-CoV-2病毒扩增Ct值
表3不同浓度TPCK胰酶对SARS-CoV-2病毒扩增的影响
由表2-3可知：经过72hr培养，SARS-CoV-2病毒能在常规病毒培养基和含有TPCK-胰酶维持培养基的Huh7.5细胞中增殖。在常规病毒培养基中，SARS-CoV-2病毒在72小时后才开始缓慢增殖，而在含有一定TPCK-胰酶维持培养基中，病毒的扩增倍数呈现TPCK-胰酶浓度依赖效应。在不含胰酶的维持培养基中，病毒不能增殖；在0.5μg/mL的TPCK-胰酶维持培养基中，病毒在72小时后才开始缓慢增殖；而在1～4μg/mL的TPCK-胰酶维持培养基中，病毒在24小时后就开始了增殖，随着时间的增加，病毒量逐渐增多；随着TPCK-胰酶浓度的提高，病毒滴度也相应提高。在3μg/mL的TPCK-胰酶维持培养基中，经过72小时培养，病毒滴度达到最高，相比于同时期的常规病毒培养基而言，病毒扩增效率提高了 250.3倍。
实施例5在Vero E6细胞上TPCK-胰酶浓度对病毒扩增的影响
将Vero E6细胞按3×104细胞/孔接种到96孔板中，培养24hr后移去完全培养基，用 Hank’s液润洗细胞2～3次，每孔加入100μL按1:100稀释的SARS-CoV-2毒株(BetaCoV/Wuhan/HBCDC-HB-05/2020)，接种1～2小时后，移去病毒接种液，用Hank’s液润洗细胞2次，加入100μL一定含量TPCK-胰酶维持培养基(以常用病毒维持培养基做对照)，放入二氧化碳培养箱培养，24hr、48hr、72hr后用100μL RLT细胞裂解液裂解细胞，用核酸提取仪提取核酸后进行定量PCR检测，确定在不同TPCK-胰酶浓度培养条件下，病毒的Ct 值和管家基因GAPDH的Ct值(表4)；并以含2％FBS常规病毒培养基的病毒Ct值为参照，计算病毒在不同TPCK-胰酶浓度的维持培养基中基的扩增效率(表5)。
表4不同浓度TPCK胰酶、不同培养时间下SARS-CoV-2病毒扩增Ct值
表5不同浓度TPCK胰酶对SARS-CoV-2病毒扩增的影响
由表4-5可知：无论是在常规病毒维持培养基还是在含有TPCK-胰酶的维持培养基中， SARS-CoV-2病毒在Vero E6细胞中都具有良好的增殖性。在常规病毒培养基中，SARS-CoV-2病毒在24小时就开始了增殖，随着培养时间的增加，病毒含量也随之增加，72小时后，病毒增殖为接种前的3.39E+05倍。在低浓度(0.125μg/mL～0.5μg/mL)的TPCK-胰酶维持培养基中，病毒的扩增在48小时就达到最高，与常规病毒培养基相比，培养时间减少24 小时。培养48小时，含量为0.25μg/mL TPCK-胰酶的病毒维持培养基与常规病毒培养基相比，扩增效率提高2.9倍。
实施例6用含有一定量的TPCK-胰酶的病毒维持培养基分离培养SARS-CoV-2弱阳性样本
用常用病毒维持培养基不能分离SARS-CoV-2弱阳性样本(Ct值≥30)，在2021年5月11日发布的《关于印发新型冠状病毒肺炎防控方案(第八版)的通知》联防联控综发[2021]51号文中就明确提到核酸检测Ct值低于30的阳性样本才开展病毒分离培养。在本实施例中，选取2020年4月至2021年8月收集的新冠阳性患者的咽拭、鼻咽拭和痰液样本 12份(Ct值≥30)，采用含2μg/mL TPCK-胰酶的病毒维持培养基进行病毒分离培养，3天后收获培养物，取200μL培养物加入等体积的RLT细胞裂解液裂解细胞，提取核酸进行 PCR检测(表6)，发现采用2μg/mL TPCK-胰酶的病毒维持液进行培养，有一定几率分离到COVID-19病毒。
表6含TPCK-胰酶的病毒培养基对弱阳性样本培养结果
由表6可知：从12份新冠阳性样本(Ct值≥30)中，分离到4株新冠病毒，分离成功率为33.3％，说明采用含TPCK-胰酶的病毒维持培养基能从Ct值≥30的新冠阳性样本中分离到新冠病毒。从弱阳性样本中成功分离到新冠病毒，对新冠病毒的病原监测、病毒变异和分子溯源研究起到了促进作用。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干改进和变换，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，其特征在于采用初始细胞传代浓度为3×104个/mL～5×105个/mL的人肝癌细胞或非洲绿猴肾细胞，培养24～48小时后，接种SARS-CoV-2病毒，接种1～2小时后，用无菌洗液洗涤细胞，然后再以含有TPCK胰酶的维持培养基进行培养1～3天，从而扩增SARS-CoV-2病毒来提高培养滴度；
其中，维持培养基所含有TPCK胰酶的浓度为0～4μg/mL且不为0。
2.根据权利要求1所述的利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，其特征在于维持培养基由DMEM培养液、BSA、青-链霉素和TPCK胰酶组成。
3.根据权利要求1所述的利用TPCK胰酶提高SARS-CoV-2病毒细胞培养滴度的方法，其特征在于接种的SARS-CoV-2病毒与接种细胞的数量比值在0.01~100之间。
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