CN112680422A - 一种全悬浮无血清mdck细胞增殖h9n2亚型禽流感病毒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，本发明将MDCK‑sus细胞进行两次传代与培养，然后接种H9N2亚型禽流感病毒和TPCK‑胰酶并培养收获病毒液，通过优化细胞接种密度、TPCK‑胰酶浓度、培养温度、感染时间TOI和感染复数MOI，优化生产工艺，能扩大培养，生产高质量、高滴度的H9N2亚型禽流感病毒。
Description
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法。
背景技术
目前，家禽年出栏量和产值在逐年上升，但禽流感的持续爆发严重危害了养禽业，不仅造成了巨大的经济损失，还引起了多起公共卫生事件，接种禽流感疫苗是最有效的防控手段，因此必须提高禽流感疫苗技术水平。
传统禽流感疫苗通过鸡胚培养生产，效率低、成本高、品质不稳定。国外流感细胞苗主要采用MDCK、Vero等细胞载体贴壁生产；国内多家单位也开展了禽流感细胞苗的研究，但由于微载体工艺扩大困难、细胞密度和病毒滴度较低等的因素制约了其产业化进程。而细胞悬浮培养是大规模培养动物细胞生产生物制品的核心技术，是生物制药行业发展的必然趋势，该技术完全克服了以往技术的弊端。
全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒是旨在克服鸡胚或贴壁细胞生产禽流感病毒缺点基础之上建立的一种先进的培养方式，即能节约成本、省时省力、又能扩大培养，生产高质量、高滴度的禽流感病毒。然而目前全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒工艺尚未成熟，未能把握 H9N2亚型禽流感病毒增值的关键因素,无法来满足市场对大量生产H9N2亚型禽流感病毒疫苗的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，将MDCK-sus细胞接种H9N2亚型禽流感病毒和TPCK-胰酶并培养收获病毒液，通过优化细胞接种密度、TPCK-胰酶浓度、培养温度、感染时间TOI和感染复数MOI，优化生产工艺，能扩大培养，生产高质量、高滴度的H9N2 亚型禽流感病毒。
本发明的技术方案为：
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，包括以下步骤：取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液采用起始活细胞接种密度 1×106cells/mL，设置转速为130r/min、温度为37℃、通入浓度为5％的CO2的条件下，在125mL摇瓶30mL培养体系中进行无血清全悬浮培养并扩繁传代，细胞密度达到对数生长期密度且总量达到一定规模时，分瓶培养，均是125mL 摇瓶30mL培养体系，细胞培养至第48h，设计MOI为0.01，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的AIV体积，同时加入TPCK-胰酶，并转移至5％CO2培养箱继续培养，温度设为33℃，感染病毒36h或48h后收获病毒。
在上述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法中，在接种AIV后，TPCK-胰酶的终浓度调节为3～11ug/mL。
在上述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法中，在接种AIV后，TPCK-胰酶的终浓度调节为7ug/mL。
在上述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法中，在进行病毒接种的同时，还补加培养体系，所述补加的培养体系相当于原培养体系的体积的2/3。
本发明的有益效果如下：
本发明全悬浮无血清MDCK细胞培养H9N2亚型禽流感病毒克服了鸡胚或贴壁细胞生产禽流感病毒的缺点，较于有血清贴壁细胞具有经济，操作简单，减少外源蛋白污染，病毒滴度高等优势，进一步提高病毒增值能力，可满足市场对大量生产H9N2亚型禽流感病毒疫苗的需求。
附图说明
附图1为实施例中不同MOI时病毒HA滴度的比较图，*表示有显著性差异 (p＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)；
附图2为实施例中不同MOI时病毒含量的比较图，*表示有显著性差异(p ＜0.05)；**表示极显著性差异(p＜0.01)。
附图3为实施例2(优化后)和实施例3(优化前)中工艺优化前后HA滴度比对图，其中***表示极显著性差异(p＜0.001)；
附图4为实施例2和实施例3中工艺优化前后病毒含量比对图，其中***表示极显著性差异(p＜0.001)；
附图5为实施例4中不同TPCK-胰酶浓度下HA滴度的比较图，其中*表示有统计学差异(p＜0.05)；**表示显著性差异(p＜0.01)；***表示极显著性差异(p ＜0.001)；
附图6为实施例4中不同TPCK-胰酶浓度下EID50比较图，其中*表示有统计学差异(p＜0.05)；
附图7为实施例5中不同温度下HA滴度的比较图，其中*表示有统计学差异(p＜0.05)；
附图8为实施例5中不同温度下EID50比较图，其中*表示有统计学差异(p ＜0.05)；**表示显著性差异(p＜0.01)；
附图9为实施例6中不同TOI下HA滴度比较图，其中*表示有统计学差异 (p＜0.05)；**表示显著性差异(p＜0.01)；
图9-1为实施例6中按照活细胞密度1.5×106cells/mL接种感染病毒后细胞活密度生长曲线；
附图10为实施例7中不同MOI下HA滴度比较图，其中*表示有统计学差异(p＜0.05)；**表示显著性差异(p＜0.01)；
附图11为实施例7中不同MOI下EID50比较图，其中*表示有统计学差异 (p＜0.05)；**表示显著性差异(p＜0.01)；***表示极显著性差异(p＜0.001)；
附图12为实施例8中不同接种密度培养MDCK-sus细胞活细胞密度变化曲线。
附图13为实施例10中细胞感染禽流感病毒与未感染禽流感病毒葡萄糖、乳酸浓度变化曲线；
附图14为实施例10中细胞感染禽流感病毒与未感染禽流感病毒谷氨酰胺、铵离子浓度变化曲线；
附图15为实施例11中不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同时间细胞密度曲线；
附图16为实施例11中不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同HA价曲线；
附图17为实施例11中不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同时间病毒含量曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
以下实施例中的试剂：
仪器与试剂
生物安全柜1300SERIES A2(Thermo公司)；恒温水浴锅DK-8D(一恒/ 上海)；二氧化碳培养箱Forma 371(Thermo公司)；生化培养箱DHP-9162(一恒/上海)；高性能高速台式冷冻离心机5804R(Eppendorf/德国)；电热恒温培养箱DHP-9162(一恒/上海)；涡旋振荡器Vortex(Thermo公司)；移液器Research plus(Eppendorf/德国)；倒置显微镜DMI1(德国徕卡)；countstar细胞计数仪 IC-1000(上海睿钰生物科技有限公司)；Nova多参数生化分析仪BIOPROFILE (美国)；FR980凝胶成像系统(上海复日科技有限公司)；SMA4000微量分光光度计(merinton)。
Driving-M MDCK细胞无血清培养基购自上海倍谙基生物科技有限公司； TPCK-胰酶、PBS、SPF鸡胚由广东温氏大华农生物科技有限公司提供；TaqDNA 聚合酶、10×PCRBufferMgCl2(25mM)、dNTP(10mM)、Marker、6×DNA Loading Dye、10×TAE、一步法快速感受态细胞制备试剂盒，SanPrep柱式质粒DNA少量抽提试剂盒、琼脂糖、DNA柱式胶回收试剂盒购自生工生物工程股份有限公司；4SRed Plus核酸染色剂购自BBI血；胎牛血清(FetalBovine Serum)、胰酶(0.25％Trypsin-EDTA)、DMEM培养基(DMEM/High glucose)、0.25％Trypsin-EDTA等试剂均来自Gibco公司。
病毒和细胞
H9亚型禽流感病毒SS株(细胞适应株)，病毒含量为109.0EID50/0.2mL，全悬浮MDCK-sus细胞均由肇庆大华农农业部动物疫控生物技术与制品创制重点实验室保存供应
实施例1
取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液采用起始活细胞接种密度 1×106cells/mL，设置转速为130r/min、温度为37℃、通入浓度为5％的CO2的条件下，在125mL摇瓶30mLDriving-M MDCK细胞无血清培养基培养体系中进行无血清全悬浮培养并扩繁传代，细胞密度达到对数生长期密度且总量达到一定规模时，分瓶培养，均是125mL摇瓶30mL培养体系。细胞培养至第48H，设计MOI分别为0.1、0.01、0.001、0.0001，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的AIV体积，同时加入TPCK-胰酶，并转移至5％CO2 培养箱继续培养，温度设为33℃。接种病毒24小时起，每12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时，做三次重复。
得到的不同MOI时病毒HA滴度的比较图如附图1所示，通过各实验组感染后HA滴度比较，MOI为0.001和0.0001时，感染后HA滴度均在第48小时达到峰值为9.32±0.44log2；当MOI为0.1时，感染后HA滴度值最高为8.73 ±0.44log2，低于其它实验组；当MOI为0.01时，感染后HA滴度高于其它实验组，且于感染后36小时达到峰值为10log2，随后至72小时，HA滴度保持不变；不同MOI时病毒含量的比较图如附图2所示；当MOI为0.1时，病毒含量最高仅为104.00EID50/0.1mL，而当MOI为0.01、0.001、0.0001时，病毒含量均在48h达到最高点，最高点分别为108.21±0.61EID50/0.1mL、108.00±0.67EID50/0.1 mL、107.54±0.07EID50/0.1mL，因此当MOI为0.01时，病毒含量高于其它实验组，且MOI为0.01时病毒含量与MOI为0.1时病毒含量有极显著性差异。
据上判断：MOI为0.01接种病毒为最佳MOI。
实施例1中温度为37℃，CO2的浓度为5％，MOI为0.01，针对这些参数，进行如下的试验来验证上述参数选择的基本过程。
实施例2
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，包括以下步骤：
(1)取F1代MDCK-sus细胞，连续2代扩繁；
(2)取4.5mL扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，以1.5×106cells/mL 的活细胞接种密度，加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在125mL 摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2 的条件下进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，取30 mLMDCK-sus细胞悬液，传至125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下继续培养；
(4)当分瓶培养时间达到60小时，按照感染复数MOI为0.01接种H9N2 亚型禽流感病毒，同时加入终浓度为7ug/mL的TPCK-胰酶，在125mL摇瓶30 mL培养体系中，转速为130r/min，通入浓度为5％的CO2的条件下继续培养，控制培养温度33℃，48小时后收获病毒液。
本实施例制备的病毒液HA滴度为10±0.23log2，病毒含量为108.21±0.61 EID50/0.1mL。
实施例3
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，包括以下步骤：
(1)取F1代MDCK-sus细胞，连续2代扩繁；
(2)取4.5mL扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，以1.5×106cells/mL 的活细胞接种密度，加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在125mL 摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，取30 mLMDCK-sus细胞悬液，传至125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下继续培养；
(4)当分瓶培养时间达到48小时，按照感染复数MOI为0.1接种H9N2 亚型禽流感病毒，同时加入终浓度为3ug/mL的TPCK-胰酶，在125mL摇瓶30 mL培养体系中，转速为130r/min，通入浓度为5％的CO2的条件下继续培养，控制培养温度37℃，48小时后收获病毒液。本实施例制备的病毒液HA滴度为 6.33±0.57log2，病毒含量为107.16±0.23EID50/0.1mL。
实施例4
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，具体步骤按照实施例2进行操作，不同点在于：步骤(4)中设置5个不同的TPCK- 胰酶终浓度，即3ug/mL、5ug/mL、7ug/mL、9ug/mL、11ug/mL,接种H9N2亚型禽流感病毒24小时起，每隔12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时。做三次重复。
绘制的不同TPCK-胰酶浓度下HA滴度的比较图如附图5所示，当TPCK- 胰酶浓度为7ug/mL时，感染后HA滴度略高于其他实验组，且最大值为(9.33 ±0.44)log2；绘制的不同TPCK-胰酶浓度下EID50比较图如附图6所示，当TPCK- 胰酶浓度为7ug/mL时，在48小时病毒含量达到最大值107.94±0.29EID50/0.1mL, 其他时间点的病毒含量也均高于其他组，故最终确定TPCK-胰酶优化浓度为 7ug/mL。
实施例5
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，具体步骤按照实施例2进行操作，不同点在于：步骤(4)中TPCK-胰酶终浓度为 7ug/mL，设置3个不同的培养温度，即33℃、35℃、37℃，接种H9N2亚型禽流感病毒24小时起，每隔12小时取样监测细胞活度及密度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察72小时，做三次重复。
绘制的不同温度下HA滴度的比较图如附图7所示，当温度为33℃时，感染后HA滴度高于其它实验组，且于感染后48小时达到最高值10log2；绘制的不同温度下EID50比较图如附图8所示，当温度为33℃、35℃、37℃时，感染后 48小时的病毒含量分别为108.01± 0.17EID50/0.1mL、107.51±0.05EID50/0.1mL、106.82±0.27EID50/0.1mL，温度为33℃时病毒含量与温度为35℃时病毒含量有统计学差异，温度为33℃时病毒含量与温度为37℃时病毒含量有显著性差异。结果表明：温度为33℃时，感染后HA滴度和病毒含量都高于其它实验组，因此确定感染病毒后的优化培养温度设为33℃。
实施例6
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，具体步骤按照实施例2进行操作，不同点在于：步骤(4)中TPCK-胰酶终浓度为 7ug/mL，培养温度为33℃，设置5个不同的培养时间，即24小时、36小时、 48小时、60小时、72小时，接种H9N2亚型禽流感病毒24小时起，每隔12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时，做三次重复。
绘制的不同培养时间下HA滴度比较图如附图9所示，细胞培养第60小时后接毒，有较高的HA滴度，且最大滴度值达到10log2；且观察此时细胞生长状态良好，营养物质比较充足，为病毒增殖提供了一个良好的生存环境，综合考虑培养时间为60小时时最优。
如图9-1，按照活细胞密度1.5×106cells/mL接种，每24小时取一次样，培养至120小时，当细胞培养至约96小时能达到最高密度约1.93×107cells/mL，随后细胞密度开始下降，在第48小时至72小时,细胞的生长处于对数期，而第60 小时处于细胞生长的对数中期，细胞的活率达到99.83％，此时细胞生长状态良好，营养物质比较充足，为病毒增殖提供了一个良好的生存环境。综合考虑将 TOI设为细胞培养第60小时,后续实验中保持TOI不变。
实施例7
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的优化方法，具体步骤按照实施例2进行操作，不同点在于：步骤(4)中TPCK-胰酶终浓度为 7ug/mL，培养温度为33℃，培养时间为60小时，设置4个不同的感染复数MOI，即0.1、0.01、0.001、0.0001，接种H9N2亚型禽流感病毒24小时起，每12小时取样监测细胞密度和活度；每12小时留取培养液样本待测HA血凝效价和病毒含量，连续观察96小时，做三次重复。
绘制的不同MOI下HA滴度比较图如附图10所示，当MOI为0.1时，感染后HA滴度值最高为(8.73±0.44)log2，低于其它实验组；MOI为0.001和0.0001 时，感染后HA滴度均在第48小时达到峰值为(9.32±0.44)log2；当MOI为 0.01时，感染后HA滴度高于其它实验组，且于感染后36小时达到峰值为10 log2，随后至72小时,HA滴度保持不变；绘制的不同MOI下EID50比较图如附图11所示，当MOI为0.01、0.001、0.0001时，病毒含量均在48h达到最高点，最高点分别为108.21±0.61EID50/0.1mL、108.00±0.67EID50/0.1mL、107.54±0.07 EID50/0.1mL，而当MOI为0.1时，病毒含量最高仅为104.00EID50/0.1mL，因此当MOI为0.01时，病毒含量高于其它实验组，且MOI为0.01时病毒含量与 MOI为0.1时病毒含量有极显著性差异，故MOI为0.01接种病毒为最优选择。
实施例8
按照实施例方法，其中，取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL时，控制起始活细胞密度为0.5×106cells/mL、 1.0×106cells/mL、1.5×106cells/mL、2.0×106cells/mL；在125mL摇瓶培养，每24小时取样计算活细胞密度。连续观察至第120小时，每个细胞密度做 3个摇瓶重复。
利用摇瓶分别以不同起始活细胞密度进行MDCK-sus细胞扩繁培养，绘制的生长密度曲线(图12)表明，随着时间的变化，活细胞密度逐渐上升。其中， 0.5×106cells/mL组的细胞密度增加比较缓慢，培养第5天(120小时)约为19×106 cells/mL，尚未达到最高密度，但增长幅度开始变慢；1×106cells/mL组、1.5×106 cells/mL组峰值则随着起始活细胞的密度提高而明显提高，到达峰值的时间也相应提前，1.5×106cells/mL组峰值位于培养第4天(96小时)，达到约20×106 cells/mL，且培养60小时即进入对数生长中期，而1×106cells/mL组培养第5天 (120小时)接近峰值，达到约19×106cells/mL；2×106cells/mL组培养第3天(72 小时)左右达到峰值，但仅比1.5×106cells/mL略高，此后细胞密度开始降低，可能是因为其细胞起始数量过多，导致生长液营养消耗加快，代谢产物增加导致培养基环境不利于细胞生长。
由此可见，起始细胞密度过高虽然可以缩短细胞到达峰值平台期的时间，但是细胞对培养基营养消耗得也快，细胞提前进入衰老期，最高倍增幅度也难以相应提高，消耗细胞种子较多，降低了细胞传代扩增效率。而过低的起始细胞密度则要形成一定规模的细胞数量需要更长的时间。综合考虑，以1×106 cells/mL的活细胞接种密度培养具有最优的效率，确定其为最优的细胞传代扩繁方法。
通过实施例2-8可以看出，1×106cells/mL的活细胞接种密度、温度为37℃， CO2的浓度为5％，MOI为0.01这些参数都是经过反复试验和调整得到的。
实施例2-7虽然其活细胞接种密度为1.5×106cells/mL，但是经过实施例1 的验证，上述优选地参数同样适用于1×106cells/mL的活细胞接种密度。
实施例9
本实施例主要考察补加培养基对病毒增殖的影响。
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，包括以下步骤：
(1)取F1代MDCK-sus细胞，连续2代扩繁；
(2)取4.5mL扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液，按照1.5×106cells/mL 的起始活细胞密度加Driving-M MDCK细胞无血清培养基至30mL，在125mL 摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2 的条件下进行全悬浮无血清培养并扩繁传代；
(3)当步骤(2)中的MDCK-sus细胞密度达到对数生长期密度时，取30 mLMDCK-sus细胞悬液，传至125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，温度为37℃，通入浓度为5％的CO2的条件下继续培养；
(4)当分瓶培养时间达到60小时，按照补加MDCK细胞无血清培养基与 MDCK-sus细胞悬液的体积比为2:3补加MDCK细胞无血清培养基，并按照感染复数MOI为0.01接种H9N2亚型禽流感病毒，同时加入终浓度为7ug/mL的 TPCK-胰酶，在125mL摇瓶30mL培养体系中，转速为130r/min，通入浓度为 5％的CO2的条件下继续培养，控制培养温度33℃，48小时后收获病毒液。
本实施例制备的病毒液HA滴度为10.33±0.44log2，病毒含量为108.38±0.08 EID50/0.1mL。
实施例9和实施例2对比可发现，通过增补MDCK细胞无血清培养基可提高病毒滴度和含量。
实施例2和9的试验细胞基数为1.5×106cells/mL，在1×106cells/mL的体系中同样适用。
通过实施例2-8可以看出，1×106cells/mL的活细胞接种密度、温度为37℃， CO2的浓度为5％，MOI为0.01这些参数以及该如何补加培养基等条件都是经过反复试验和调整得到的。
实施例10
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，具体步骤按照实施例9进行操作，不同点在于：步骤(4)中进行分组实验，共分为两组：一组将细胞培养60h后，按照感染复数MOI为0.01接种H9N2亚型禽流感病毒，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的病毒液体积，同时加入设置浓度为7μg/mL的TPCK-胰酶，并转移至5％CO2培养箱继续培养，温度设为33℃；另一组不接种病毒作为空白对照。接毒后0小时起，每12 小时取样监测培养液样本中细胞感染组和对照组乳酸的浓度、葡萄糖的浓度、铵离子的浓度及谷氨酰胺的浓度变化，做3次重复。
绘制的细胞感染禽流感病毒与未感染禽流感病毒葡萄糖、乳酸浓度变化曲线如附图13所示，细胞感染禽流感病毒与未感染禽流感病毒谷氨酰胺、铵离子浓度变化曲线如附图14所示；由附图13可知，感染病毒96小时后，感染组的葡萄糖浓度从3.9±0.19g/L下降至0.43±0.01g/L，对照组的葡萄糖浓度从 3.9±0.19g/L下降至1.99±0.43g/L；感染组的乳酸浓度从0.78±0.01g/L上升至 1.90±0.04g/L，对照组的乳酸浓度从0.78±0.01g/L上升至1.71±0.02g/L。由附图 14可知，感染组的谷氨酰胺浓度从4.23±0.08mmol/L下降至0.25±0.01mmol/L，对照组的谷氨酰胺浓度从4.23±0.08mmol/L下降至1.15±0.04mmol/L；感染组的铵离子浓度从5.64±0.01mmol/L上升至6.30±0.02mmol/L，对照组的铵离子浓度从5.64±0.01mmol/L上升至6.04±0.10mmol/L。
综上：感染组葡萄糖和谷氨酰胺消耗量高于对照组，感染组的乳酸和铵离子生成的浓度高于对照组；说明H9N2亚型禽流感病毒在MDCK-sus细胞增殖过程中既加快了谷氨酰胺和葡萄糖等营养物质的消耗，也加快了乳酸和铵离子等代谢产物的生成。
实施例11
一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，具体步骤按照实施例9进行操作，不同点在于：步骤(4)中设置3个不同的新鲜 Driving-M MDCK细胞无血清培养基的补加比例，即1/3、2/3、3/3，接种H9N2 亚型禽流感病毒24小时起，每隔12小时收取培养液样本待测HA滴度值和病毒的含量；接种病毒起每12小时收取培养液样本待测活细胞的密度，连续观察 72小时，做3次重复。
绘制的不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同时间细胞密度曲线如附图15所示，不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同HA价曲线如附图16 所示；不同比例补加新鲜培养基及接种病毒后不同时间病毒含量曲线如附图17 所示；由附图15可知，各比例组补加新鲜培养基并接种病毒后,细胞密度均继续増长到12小时出现峰值,其中2/3组在前12小时的细胞密度增加速度高于3/3 组与1/3组，此后可能由于病毒感染和培养环境营养物质减少及有害物质产生等原因，细胞密度均开始持续下降,72小时后接近最低值；由附图16可知，各比例组加新鲜培养基组的HA滴度均在48小时达到峰值,其中2/3组最优HA滴度可达到10.33±0.44log2；由附图17可知,各组的病毒含量都在48小时达到最高, 且2/3组的病毒含量最高,其48小时峰值可达到108.38±0.08EID50/0.1mL优于3/3 组的108.08±0.11EID50/0.1mL。说明补加适量的新鲜培养基可以降低代谢有害物质对细胞的负面影响,有利于提高细胞扩繁和培养病毒的效率。
实施例10和实施例11证明补加培养基对于病毒的峰值、滴度都有促进作用。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其它的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取扩繁传代之后的MDCK-sus细胞悬液采用起始活细胞接种密度1×106cells/mL，温度为37℃、通入浓度为5％的CO2的条件下，在125mL摇瓶30mL培养体系中进行无血清全悬浮培养并扩繁传代，细胞密度达到对数生长期密度且总量达到一定规模时，分瓶培养，均是125mL摇瓶30mL培养体系，细胞培养至第48h，设计MOI为0.01，根据接种病毒含量与细胞数量比例关系，计算所需接种的AIV体积，同时加入TPCK-胰酶，并转移至5％CO2培养箱继续培养，温度设为33℃，感染病毒36h或48h后收获病毒。
2.根据权利要求1所述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，在接种AIV后，TPCK-胰酶的终浓度调节为3～11ug/mL。
3.根据权利要求1所述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，在接种AIV后，TPCK-胰酶的终浓度调节为7ug/mL。
4.根据权利要求1所述的全悬浮无血清MDCK细胞增殖H9N2亚型禽流感病毒的方法，其特征在于，在进行病毒接种的同时，还补加培养体系，所述补加的培养体系相当于原培养体系的体积的2/3。
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