JP2018533374A - ワクチン生産のための無血清合成培地中のmdck浮遊細胞株 - Google Patents
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Abstract
Description
a)接着性MDCK細胞株を準備することと、
b)MDCK細胞株を浮遊培養に適応させるために十分な時間、マイクロキャリアの非存在下で、攪拌しながら、5%(体積/体積、v/v)血清を含む増殖培地中で、上記接着性MDCK細胞株を培養することと、
c)血清を含まない合成培地中の浮遊培養で浮遊培養適応MDCK細胞を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できる適応MDCK細胞を提供することと
を含む、方法に関する。
本開示は、適応MDCK細胞および合成増殖培地を含む組成物に関する。本組成物は、血清または他の動物由来成分を含まない。
一態様では、本開示は、合成培地を含む浮遊培養で、血清を用いずに生育および/または増殖できる適応MDCK細胞に関する。適応MDCK細胞は、浮遊培養での生育または増殖のために、ある面(たとえばマイクロキャリア)を必要とするものではない。この細胞は、ワクチン生産用のウイルスを生産するために使用できる。
合成培地は、血清、加水分解物、または他の動物由来成分を含まないいずれかの合成培地とすることができる。好ましい実施形態では、合成培地は、BALANCD(登録商標)Simple MDCK(Irvine Scientific, catalog ID:91136)である。一部の実施形態では、合成培地は、表1に記載されているアミノ酸のうちの1つまたは複数を含む。一部の実施形態では、アミノ酸は、表1に記載されている範囲内の濃度で培地に存在する。この濃度は、終点を含む所定の範囲内のいずれかの部分範囲または値であってもよい。一部の実施形態では、1つまたは複数のアミノ酸は、表1に提示されている好ましい濃度で培地に存在する。
本開示は、無血清合成培地でのMDCK細胞/細胞株の作製および/または培養の方法に関する。MDCK細胞は浮遊状態で培養され、培養容器またはマイクロキャリアへの接着を必要としない。
一態様では、本開示は、合成培地での生育および/または増殖を行うことができる浮遊培養適応MDCK細胞株(MDCK細胞)を作製する方法に関する。
a)接着性MDCK細胞を準備することと、
b)MDCK細胞を浮遊培養に適応させるために十分な時間、マイクロキャリアの非存在下、血清を含む増殖培地中で上記接着MDCK細胞を培養することにより、浮遊培養適応MDCK細胞を産生させることと、
c)血清を含まない合成培地中、浮遊培養で浮遊培養適応MDCK細胞を培養することにより、合成培地中マイクロキャリアを含まない浮遊培養で培養できるMDCK細胞を提供することと
を含む、方法に関する。
一態様では、本開示は、マイクロキャリアを含まない浮遊状態でメイディン・ダービー・イヌ腎(MDCK)細胞を培養する方法に関する。一実施形態では、本方法は、合成培地と浮遊培養適応MDCK細胞を接触させることを含む。好ましい実施形態では、血清または他の動物由来成分は増殖培地に存在しない。一実施形態では、細胞は、5%CO2で生育する。一実施形態では、細胞を、約3〜5日ごとに継代する。好ましくは細胞を、約4日ごとに継代する。特に好ましい実施形態では、培地は培養の間(たとえば細胞が培養において確立された後)、交換しない。
MDCK細胞からのウイルスの生産性が最適化される場合、当該細胞から生産されたウイルスが、改変されていない細胞またはプロトコルにより生産されたウイルスと類似の抗原性を維持しているかどうかは予測することができない。本開示は、本明細書中記載される組成物および培養方法を使用したワクチン用のウイルスを生産する方法に関する。好ましい実施形態では、ウイルスの抗原性は維持されている。一実施形態では、本開示は、MDCK細胞でワクチンを生産する方法であって、上記MDCK細胞を、マイクロキャリアを用いず血清を含まない浮遊状態で培養することができる、方法に関する。好ましい実施形態では、細胞を、合成培地中で培養する。一実施形態では、合成培地はBALANCD(登録商標)Simple MDCK培地である。
追加の実施形態を、以下の実施例でさらに詳細に開示するが、これは特許請求の範囲を限定する意図は全くない。
接着MDCK細胞を無血清浮遊培養に適応させるための1つの非限定的な例のプロトコルの概略を、図1に提供する。簡単に述べると、接着MDCK細胞(aMDCK)(1)を、5%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)を含む培地を使用して浮遊培養に段階的に適応させた(2)。次に、浮遊培養適応MDCK細胞(sMDCK)を、無血清のBALANCD(登録商標)Simple MDCK培地(Irvine Scientific)に適応させた(3)。また、CYTODEX(商標)1ビーズ(GE Life Sciences)上で生育させたaMDCK細胞を、浮遊培養に適応させることなく、無血清培地に適応させた。各条件でのウイルスの生産性および倍化時間を提供する。
図2Aは、無血清培養物中のCytodexlビーズに付着したaMDCK細胞の顕微鏡写真を示す。図2Bは、無血清のBALANCD(登録商標)Simple MDCK中の遊離浮遊培養でのsMDCK細胞の顕微鏡写真を示す。
MDCK細胞の生育速度を評価した。MDCK細胞を、0.2×106細胞/ml〜0.25×106細胞/mlの密度で125mlのスピナーフラスコに播種し、37℃および5%CO2のインキュベーター中、50回転/分(rpm)の攪拌速度で生育させた。細胞を4日ごとに継代培養した。sMDCK細胞を、マイクロキャリアを用いることなく、4mMのL―グルタミンを補充したBALANCD(登録商標)Simple MDCK培地(Irvine Scientific)で培養した。aMDCK細胞は、4mMのL―グルタミンを補充したOPTIPRO(商標)SFM(Life Technologies)で生育させ、5g/LのCYTODEX(登録商標)1ビーズ(GE Healthcare)に付着させた。培養の2日目から、aMDCK細胞から培養培地の70%を除去し、新鮮な培地と交換した。sMDCK細胞では培地交換を行わなかった。
sMDCK細胞のウイルスを生産する能力を決定した。MDCK細胞を、0.2×106細胞/ml〜0.25×106細胞/mlの密度で125mlのスピナーフラスコに播種し、実施例3に記載されるように生育させた。培地に追加のグルコースは添加しなかった。
実施例4由来のインフルエンザウイルスの抗原性の分析を、国立生物製品基準規制機構(NIBSC)から購入した標準抗体を使用した血液凝集(HI)アッセイにより行った。HIアッセイは、1:40の血清希釈物で開始した。各試料を3回の反復実験で行った。
Claims (32)
- 適応メイディン・ダービー・イヌ腎(MDCK)細胞および増殖培地を含む組成物であって、前記増殖培地が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない培地を含み、前記適応MDCK細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊培養物中にある、組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、約30時間〜約35時間の平均倍加時間を有する、請求項1に記載の組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、ワクチン用のウイルスを生産するのに適している、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項3に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項3または4に記載の組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のDSMZ−ドイツ微生物細胞培養コレクション(Leibniz−Institut DSMZ−Deutsche Sammlung von Mikro−organismen und Zellkulturen GmbH)での[寄託番号]である、請求項1または2に記載の組成物。
- マイクロキャリアを含まない浮遊状態で適応メイディン・ダービー・イヌ腎(MDCK)細胞を培養する方法であって、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応MDCK細胞を接触させること、および前記細胞を5%CO2で生育させることを含み、前記適応MDCK細胞はマイクロキャリアを含まない浮遊培養で生育することができる、方法。
- 前記適応MDCK細胞が、約30時間〜約35時間の平均倍化時間を有する、請求項8に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項8または9に記載の方法。
- 前記ウイルスが、抗原性を維持している、請求項10に記載の方法。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項10または11に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項8〜12のいずれか1項に記載の方法。
- 適応メイディン・ダービー・イヌ腎(MDCK)細胞においてワクチン生産用のウイルスを生産する方法であって、前記適応MDCK細胞が、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養することができ、前記方法が、合成培地でありかつ動物性成分を含まない増殖培地と前記適応MDCK細胞を接触させることと、前記細胞にウイルスを感染させることと、前記ウイルスを回収することとを含む、方法。
- 前記培地に追加のグルコースを添加しない、請求項14に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のDSMZ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでの[寄託番号]である、請求項14または15に記載の方法。
- 血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるメイディン・ダービー・イヌ腎(MDCK)細胞を産生する方法であって、前記方法が、
a)接着MDCK細胞を準備することと、
b)前記MDCK細胞を浮遊培養に適応させるために十分な時間、攪拌されたバイオリアクター中、マイクロキャリアの非存在下で、血清を含む増殖培地中で前記接着MDCK細胞を培養することと、
c)血清を含まない合成培地中の浮遊培養で前記浮遊培養適応MDCK細胞を培養することにより、血清を含まない合成培地中、マイクロキャリアを含まない浮遊状態で培養できるMDCK細胞を提供することと
を含む、方法。 - 前記増殖培地が、約1%〜約10%血清を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記増殖培地が、約5%血清を含む、請求項18に記載の方法。
- ステップb)およびc)で、前記MDCK細胞を5%CO2の存在下で培養する、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、約30時間〜約35時間の平均倍化時間を有する、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、有限会社ライプニッツ研究所のDSMZ−ドイツ微生物細胞培養コレクションでの[寄託番号]である、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項23に記載の方法。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項24に記載の方法。
- 前記適応MDCK細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法により産生された適応MDCK細胞を含む、組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、約30時間〜約35時間の平均倍化時間を有する、請求項27に記載の組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、ヒト用ワクチンのためのウイルスを生産するのに適している、請求項27に記載の組成物。
- ウイルスが生産され、前記ウイルスが抗原性を維持している、請求項29に記載の組成物。
- 前記ウイルスが、インフルエンザウイルスである、請求項30に記載の組成物。
- 前記適応MDCK細胞が、培養の間培地交換を必要としない、請求項27〜31のいずれか1項に記載の組成物。
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