WO2012033236A1 - 무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 - Google Patents

무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ｍｄｃｋ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ATCC CCL-34 세포주로서 기탁된 MDCK 세포로부터 유도되고, 혈청 없이 배양이 가능하며, 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주, 바람직하게는 세포주 MDCK S1023, MDCK S10234, 및 MDCK S3851에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 MDCK 세포를 성장시키는 배양 방법 및 상기 MDCK 세포를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

무혈청 배양 및 부유 배양에 적응된 ＭＤＣＫ 세포주 및 상기 세포를 사용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법
본 발명은 혈청 없이 배양 가능하며, 담체에 부착하지 않고 부유 배양이 가능한 MDCK 신규 세포주, 이러한 세포주를 제조하는 방법, 및 이러한 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 백신의 생산을 위해서는 유정란, 마우스 뇌, 일차 세포 혹은 확립 세포가 사용된다. 이러한 전통적인 방법들은 몇 가지 문제를 가지고 있다. 예를 들어, 유정란을 사용할 경우 닭의 사육, 백신 생산 계획에 따른 수정란의 관리, 계란 단백질 유래 성분 제거를 위한 정제의 어려움 등의 문제가 있다.
세포 배양의 경우 일반적으로 증식 인자로 소태아 혈청을 첨가해준다. 혈청의 경우 프리온이나 바이러스에 의한 오염이 있을 수 있고, 제품간 품질의 차이가 날 수 있다. 게다가 호주나 뉴질랜드에서 유래된 고품질 혈청의 경우 매우 비싸기 때문에 제조 비용이 증가된다.
MDCK 세포주는 다양한 바이러스가 증식할 수 있는 확립 세포주이다. 그러나 MDCK 세포주는 표면에 대한 부착성이 매우 강하기 때문에 대량 배양을 위해서는 매우 넓은 면적의 배양 용기나 담체가 필요하고 이는 많은 비용이 든다. 따라서 시설 또는 담체에 대한 비용이 막대하며 담체에 부착된 세포를 제거하는 단계가 필요하며 이로 인해 세포의 손실 및 손상이 있다. 따라서 저렴하고 안전하게 동물세포 배양을 통한 백신을 제조하기 위해서는 무혈청 및 부유 배양이 가능한 세포주가 필요하다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하다는 장점이 있는, 백신용 바이러스 증식에 사용될 수 있는 MDCK 세포주를 제공하는 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK (Madin Darby Canine Kidney) 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주를 제공한다.
상기 바람직한 특성인 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주는 a) MDCK 세포주를 무혈청 배지에 적응시켜 무혈청 배양이 가능한 세포주를 제조하고, b) 무혈청 배양이 가능한 세포주를 부유 배양에 적응시켜 담체 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 선별하는 방법으로 제조할 수 있다.
바람직하게, 상기 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주는 MDCK S1023, MDCK S10234, 또는 MDCK S3851이다.
본 발명은 또한 (a) ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포를 준비하는 단계; (b) 상기 MDCK 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및 (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 MDCK 세포를, 화학적으로 정의된 무혈청 배지 중에서 담체를 필요로 하지 않고 부유 상태에서 생장하도록 적응시킨 MDCK 세포를 수득하는 단계를 포함하는 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 제조하는 방법 및 이러한 방법을 통해 얻어진 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주를 제공한다.
본 발명에 있어, 용어 "무혈청 배지"는 혈청이 실질적으로 첨가되지 않은, 본 발명에 따른 확립세포주가 배양될 수 있는 배지를 의미하며, 용어 "실질적으로 첨가되지 않은"은 혈청을 0.5 (v/v) % 이하 포함하는 것을 의미하며, 바람직하게는 0.1 (v/v) % 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 (v/v) % 이하, 가장 바람직하게는 전혀 포함하지 않는 것을 의미한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 세포주를 이용하여 증식될 수 있는 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스, 백시니아바이러스 등이 있으며, 본 발명에 따른 세포주는 이러한 바이러스들 중 인플루엔자 바이러스의 생산에 더욱 적합하다.
보다 구체적으로, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 MDCK 세포를 이용하여 약 1×104개 내지 약 1×106개 세포/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계; (b) 약 40-100 rpm의 교반 속도, 약 6.5-7.5의 pH 및 약 35-100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 일회용 생물반응기 시스템에서 상기 MDCK 세포를 약 5×106개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계; (c) 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; (d) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 배양하는 단계; 및 (e) 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공하며, 바람직하게, 본 발명의 이러한 방법은 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원을 제공하며, 이러한 바이러스 항원을 포함하는 면역원성 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능하다는 장점이 있는, 바이러스 증식에 효율적으로 사용될 수 있는 신규 MDCK 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 세포주를 이용하여 바이러스, 특히 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
본 명세서에 첨부되는 다음의 도면들은 본 발명의 바람직한 실시예를 예시하는 것이며, 전술한 발명의 내용과 함께 본 발명의 기술사상을 더욱 이해시키는 역할을 하는 것이므로, 본 발명은 그러한 도면에 기재된 사항에만 한정되어 해석되어서는 아니 된다.
도 1은 본 발명에 따른 MDCK 세포주들을 스피너(spinner) 플라스크에서 부유 배양한 결과로, 계대에 따른 세포 농도 증가 형태를 보여준다.
도 2는 인플루엔자 바이러스의 대표적인 정제공정 흐름도이다.
도 3은 본 발명의 MDCK 세포주에서 증식된 바이러스 정제 시료를 이용한 동물 실험 혈청의 HI test 결과이다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 무혈청 MDCK 세포주의 제조
MDCK 세포주는 ATCC (CCL-34)에서 분양 받았다. T-25 플라스크 내 10% 혈청을 포함한 EMEM 배지에서 배양 온도 37℃이고 5% CO2 조건에서 배양하였다. 상기 세포를 확장한 후 상기 배지에 무혈청 배지를 50% 포함한 배지에 배양을 하고 세포의 이상이 없는지 확인하였다. 세포의 성장에 이상이 없을 경우 무혈청 배지 75% 포함한 배지에서 배양을 해주고 상기 방법을 반복하여 100% 무혈청 배지에 적응된 세포주를 확보하였다. 무혈청 배양에 사용된 배지는 예를 들면 EX-CELL MDCK (Sigma), UltraMDCK (Lonza), VP-SFM (Invitrogen) 등을 들 수 있다.
무혈청 배지에 적응된 세포주를 T-플라스크에서 충분히 확장한 후 스피너(spinner) 플라스크(Corning)에서 부유 배양 적응을 시작하였다. 교반속도는 40~80rpm이고 배양 온도 37℃이고 5% CO2 조건에서 배양하였다. 배양 배지의 pH가 낮아지거나 세포가 일정 수준이상으로 자랐을 경우 배지 교환을 해주거나 계대 배양을 해주었다. 3~6개월의 부유 배양 적응을 거친 후 세포 농도가 2x106 cells/ml 이상이 되었으며 세포의 생존율는 95% 이상이고 단일 세포로 부유 배양이 되는 것을 확인하였다. 부유 배양에 사용된 배지는 예를 들면 EX-CELL 302 CHO (Sigma), UltraCHO (Lonza), SMIF-6 (Invitrogen) 등을 들 수 있다. 상기 방법으로 무혈청 배양 및 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주 3종을 확보하였으며 각각 MDCK S1023, MDCK S10234, MDCK S3851로 명명하였다.
<실시예 2> 세포주의 증식성 평가
무혈청 배양 MDCK 세포주를 하기 표 1의 조건 하에서 배양하여 그 증식성을 평가하였다. 대조군으로서 10% 혈청을 포함한 배지에서 성장하는 MDCK 세포(ATCC CCL-34)를 사용하였다.
표 1
본 발명 세포주들 대조군(ATCC CCL-34)
배양배지 EX-CELL MDCK(Sigma), UltraMDCK(Lonza), VP-SFM(Invitrogen) EMEM(Lonza)
첨가물 L-글루타민(Lonza) 2% v/v L-글루타민(Lonza) 2% v/v, 우태아 혈청(Lonza) 10% v/v
배양조건 37℃, 5% CO2, 습윤하 37℃, 5% CO2, 습윤하
배양부피 T-75 flask (15ml) T-75 flask (15ml)
배양 개시 당시의 세포 농도는 약 1x 105 cells/ml이었으며, 계대 조건은 세포 농도가 약 1x 106 cells/ml에 도달하였을 때, 혹은 배양 3일 내지 4일경과 후에 계대 배양을 수행하였고, 개시 세포 농도는 1x 105 cells/ml로 다시 조정하였다.
본 발명에서 만들어진 무혈청 MDCK 세포주들은 혈청 배지에서 성장하는 MDCK 세포주와 비교했을 때 동등한 수준의 세포 성장율을 보였다.
<실시예 3> 세포주의 증식 형태 및 계대 안정성 평가
무혈청 배양 및 부유배양 적응된 세포주 3종에 대하여 스피너(spinner) 플라스크에서 연속적으로 배양하여 세포 증식 형태 및 계대에 따른 안정성을 확인하였다. 배양 개시 세포 농도는 약 4x 105 cells/ml로 하였고 배양 약 3일 내지 4일 경과 후 세포 농도는 약 2x 106 cells/ml 이상까지 도달하였다. 배양 조건은 하기와 같다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
개시 세포 농도: 4x 105 cells/ml
배양 규모: 50ml spinner flask
Spinner 회전수: 60 rpm
배양 조건: 37℃, 5% CO2, 습윤하
계대 조건: 배양 3~4일 경과 후
<실시예 4> 바이러스 증식 평가
본 발명의 상기 MDCK 세포들을 이용하여 부유 배양 조건에서 바이러스를 증식시켰다. 본 실험에 사용된 바이러스는 2010/2011년 인플루엔자 백신 균주였으며, 배양 조건은 하기와 같다.
세포 농도: 2x 106 cells/ml
배양 규모: 1000ml spinner flask
Spinner 회전수: 60 rpm
배양 조건: 34℃, 5% CO2, 습윤하
배양 기간: 3일
통상적으로, 인플루엔자 바이러스의 배양 시 37℃ 보다 34℃에서 더 증식이 잘 된다고 알려져 있으며, 이를 실험을 통하여 확인하였다. 또한, 세포주를 이용한 바이러스 배양 시 감염을 위하여 트립신을 배양배지에 포함하였다. 인플루엔자 바이러스의 역가 측정은 heamagglutination assay를 수행하여 측정하였다. 3일간 배양 후, 대부분의 세포가 사멸하였으며, 배양 상층액을 회수하고 바이러스 역가를 측정하였다. 측정 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타난 바와 같이 대부분 1024 이상의 HA 역가(titer)를 나타냈다. 이러한 바이러스 증식은 발육중인 계란 또는 10% 혈청에서 배양된 MDCK 세포의 것과 유사한 수준이었다. 따라서, 본 발명의 MDCK 세포주가 무혈청 및 부유 배양 상태에서 바이러스를 효율적으로 제조할 수 있음이 판명되었다.
표 2
바이러스 S1023 세포주 S10234 세포주 S3851 세포주
A/California/07/2009(H1N1) 512 1024 2048
A/perth/16/2009(H3N2) 1024 1024 4096
B/Brisbane/60/2008 4096 2048 4096
<실시예 5> 증식된 바이러스의 항체 형성능 확인
본 발명의 상기 MDCK 세포에서 증식된 인플루엔자 바이러스의 항체 형성능을 확인하기 위하여 배양액으로부터 바이러스를 정제한 후 마우스에 접종하여 항체가를 확인하였다. 정제공정 흐름도를 도 2에 나타냈으며, 대략의 정제공정은 하기와 같다.
먼저 바이러스 배양액을 원심분리하여 세포 잔존물을 제거하고 0.45 마이크로미터 크기의 필터를 이용하여 여과하였다. 300kDa cut-off 크기의 한외여과 필터를 이용하여 농축 한 후 포르말린으로 바이러스를 불활화하였다. 이 후 바이러스 배양액을 수크로오스 농도구배를 이용한 초원심분리를 이용하여 바이러스를 분리하였고, Triton X-100을 처리하여 바이러스를 분쇄한 후 한외여과를 통하여 농축 및 세정제(detergent)를 제거하였으며, 0.2 마이크로미터 크기의 필터로 제균 및 여과하여 백신 원액을 획득하였다.
효력 확인을 위한 동물실험은 본 발명의 MDCK 세포주인 S1023, S10234, 및 S3851 3개의 세포주를 이용하여 증식된 A/California/07/2009(H1N1) 바이러스주의 정제 원액을 사용하였으며, 대조군으로서 08/09년도(IVR-148, NYMC X-175C, B/Florida/4/2006)의 인플루엔자 백신을 사용하였다. 시험군은 총 6군으로 하여 한 시료당 마우스 5마리씩 접종하였으며 항체가는 5마리의 혈청을 합하여 HI (Heamagglutination inhibition) test를 수행하여 측정하였다.
시료를 마우스에 주사하기 전에 모세관을 이용하여 안와정맥총에서 0주차 혈청을 얻기 위해 채혈하였다. 채혈 후 마우스 뒷다리에 각각 100㎕씩 총 200㎕를 IM 경로로 주사하였고, 2주 후 2주차 혈청을 얻기 위해 안와정맥총에서 동일한 방법으로 채혈하고 0주차에 주사하였던 시료를 동량으로 재접종하여 boosting 시켰다. 2주 후 4주차 혈청을 얻기 위해 안와정맥총에서 채혈하였다.
HI 시험을 수행하기 위하여 하기와 같은 방법으로 혈청을 처리하였다. 마우스로부터 채혈하여 모두 합친 혈청에서 30㎕씩 따로 혈청을 취하여 RDE 90㎕를 넣고 37℃에서 18시간 이상 방치하였다. RDE를 불활화시키기 위하여 56℃에서 30분 이상 방치하였다. 이어서0.85% 생리식염수(saline) 120㎕를 넣고 닭 적혈구를 총량의 1/20 부피인 15㎕씩 넣고 잘 부유시킨 후 4℃에서 1시간 방치하였으며, 이 때 30분 간격으로 가라앉은 혈구를 재부유 시켜주었다. 이 후 1200rpm에서 10분간 원심분리한 후 혈청만 따로 분리하였고, 이렇게 얻어진 혈청으로 HI test를 수행하여 항체가를 측정하였다.
그 측정 결과를 표 3에 나타내었다. 모든 실험군에서 HI 역가가 40 이상 측정되었다. 즉, 본 발명의 MDCK 세포로부터 배양된 바이러스가 기존 백신과 유사하게 동물에 주사하였을 때 바이러스에 대한 항체가 형성됨을 확인할 수 있었다. 이 결과로 미루어 보아, 본 발명의 MDCK 세포주가 바이러스 백신의 제조에 사용 가능하다는 점을 확인할 수 있었다.
표 3
실험군 세포주 접종 항원량 HI titer
1 S1023 15ug/마리 80
2 S10234 15ug/마리 160
3 S10234 7.5ug/마리 160
4 S3851 15ug/마리 80
5 S3851 7.5ug/마리 80
6 reference vaccine 320

Claims (10)

  1. ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포로부터 유도되고, 세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 MDCK 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세포주는 MDCK S1023, MDCK S10234, 또는 MDCK S3851인 것을 특징으로 하는 MDCK 세포주.
  3. 제 1항 또는 제 2항의 세포주를 이용하여 백신용 바이러스를 제조하는 방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 홍역바이러스, 일본뇌염바이러스, 이하선염바이러스, 풍진바이러스, 폴리오바이러스, HSV-1, HSV-2, 광견병바이러스, RS바이러스, 레오바이러스 3형, 황열바이러스, 파보바이러스, 콕사키바이러스, 아데노바이러스 1형 내지 47형, 라사바이러스 및 백시니아바이러스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 바이러스는 인플루엔자 바이러스인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. (a) ATCC CCL-34로서 기탁된 MDCK 세포를 준비하는 단계;
    (b) 상기 MDCK 세포를 무혈청 배지에서 생장하도록 적응시키는 단계; 및
    (c) 단계 (b)에서 적응된 부착성인 상기 MDCK 세포를 무혈청 배지 중에서 담체를 필요로 하지 않고 부유 상태에서 생장하도록 적응시킨 MDCK 세포를 수득하는 단계를 포함하는
    세포 성장을 위하여 혈청을 필요로 하지 않으며, 부착을 위한 담체가 필요 없이 부유 배양이 가능한 세포주를 제조하는 방법.
  7. 제 6항의 방법에 의해 수득된 MDCK 세포주.
  8. (a) 제 1항 또는 제 2항의 MDCK 세포를 이용하여 1×104개 내지 1×106개 세포/㎖의 접종 농도로 무혈청 세포 배양 배지를 접종하는 단계;
    (b) 40-100 rpm의 교반 속도, 6.5-7.5의 pH 및 35-100%의 용존 산소량(DO)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 배양 조건을 유지 하면서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하여, 일회용 생물반응기 시스템에서 상기 MDCK 세포를 5×106개 이상 세포/㎖의 세포 밀도로 증식시키는 단계;
    (c) 상기 증식된 MDCK 세포를 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계;
    (d) 인플루엔자 바이러스의 복제를 허용하는 조건 하에 상기 감염된 증식 MDCK 세포를 배양하는 단계; 및
    (e) 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 단계를
    포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 단계 (b) 동안에는 상기 세포 배양물에 신선한 배지의 추가 또는 배지를 일부 제거하여 신선한 배지로 대체하는 방법.
  10. 제 8항 또는 제 9항의 방법에 의해 제조된 바이러스 또는 바이러스 항원.
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