CN110669722A

CN110669722A - 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法

Info

Publication number: CN110669722A
Application number: CN201911009909.2A
Authority: CN
Inventors: 吴业红; 张雪梅; 李爽; 姚为民; 徐军; 郭骐源; 席莉; 韩惠利
Original assignee: Changchun Institute of Biological Products
Current assignee: Changchun Institute of Biological Products
Priority date: 2019-10-23
Filing date: 2019-10-23
Publication date: 2020-01-10

Abstract

本发明公开了一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括：步骤一、将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％时，更换培养基为含10％胎牛血清的无血清培养基；步骤二、将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到100％时，弃去三分之二的培养基，并添加等量的无血清培养基；待附着的细胞变圆后将其上清计数并回收到原瓶继续培养，直至上清中的悬浮细胞密度达到1.0×10⁶cell/mL得到细胞悬液；步骤三、将所述细胞悬液加入摇瓶中，并至于恒温培养振荡器中培养，细胞倍增后，获得单个悬浮的MDCK细胞。

Description

一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法

技术领域

本发明涉及细胞培养驯化领域，具体涉及一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法。

背景技术

目前，流感疫苗主要以鸡胚作为病毒生长基质，每批次需大量鸡胚，疫苗成本高，且无法应对流感大规模流行；易产生过敏，对鸡蛋过敏者无法使用。有少数厂家以贴壁细胞研制流感疫苗，其最大弊端在于无法产业化，而且培养时需要依赖于微载体，微载体不能重复多次使用，增加成本；另外，贴壁细胞的生长与附着需要在培养基中加入血清，接种病毒时更换培养基，造成培养基的浪费以及增加污染风险。最好的选择是使用无血清全悬浮细胞培养流感病毒，其优点在于在大规模下实现不用换液即可用于流感病毒的增殖，原料来源容易，无血清成分，降低生产成本，简化操作步骤及下游纯化压力，降低污染发生的风险。

专利US6825036B2公开了一种适应于无血清培养的悬浮MDCK细胞。该专利驯化MDCK细胞步骤如下：1)获得适应于无血清培养的细胞系；2)使用载体驯化使细胞在载体存在情况下适应悬浮培养；和3)使细胞在无载体存在情况下适应悬浮培养。该方法操作复杂。

专利CN104862267A公开的无血清培养的悬浮MDCK细胞的步骤如下：1)用无血清培养基驯化原始MDCK细胞系，以制备适应于无血清培养的细胞系；和2)在不经载体驯化的情况下直接用悬浮培养驯化适用于无血清培养的细胞系，并筛选目的细胞系。该方法得到的适应于无血清培养的悬浮细胞生长曲线中密度集中于2.5×10⁶cells/ml，没有体现适用于高密度大规模生产。

另外，专利CN106011083A记载了无血清全悬浮MDCK细胞驯化过程，其利用胰酶消化10％新牛血清DMEM培养基培养的贴壁MDCK细胞后，将细胞直接重悬在无血清培养基，然后加入到方瓶中在转速30rpm、温度37℃、5％CO₂条件下培养，即能获得无血清全悬浮培养MDCK细胞。即其驯化方法也比较简单，但其驯化过程使用了胰酶，增加外源因子污染的风险且获得的悬浮细胞密度也较不理想。

发明内容

基于上述问题，本发明设计开发了一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，本发明的发明目的是解决现有技术中，适应于无血清培养的悬浮细胞驯化过程繁琐或密度不高或使用胰酶，获得大量细胞时增加培养时间及代次，并带入了成瘤性、致瘤性以及外源因子污染的风险，不利于大规模生产的问题。

本发明提供的技术方案为：

一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：

步骤一、将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％时，更换培养基为含10％胎牛血清的无血培养基；

步骤二、将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到100％时，弃去三分之二的培养基，并添加三分之二的无血培养基；待附着的细胞变圆后将其上清计数并回收到原瓶继续培养，直至上清中的悬浮细胞密度达到1.0×10⁶cell/mL得到细胞悬液；

步骤三、将所述细胞悬液加入摇瓶中，并至于恒温培养振荡器中培养，细胞倍增后，获得单个悬浮的MDCK细胞。

优选的是，在所述步骤一中，将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％所使用的培养基为含10％胎牛血清的EMEM。

优选的是，在所述步骤一中，将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％的培养条件为：温度为37℃、5％CO₂。

优选的是，在所述步骤二中，首次弃去三分之二的培养基，并添加等量的无血清培养基后，经过2～3天，再次弃去三分之二的培养基，并添加等量的无血清培养基。

优选的是，在所述步骤三、在至于恒温培养振荡器中培养的条件为：转速80rpm、温度为37℃和5％CO₂。

优选的是，在所述步骤三中，细胞倍增后，将转速提升至120rpm，获得单个悬浮的MDCK细胞。

本发明与现有技术相比较所具有的有益效果：增加现有适应于无血清培养的全悬浮细胞密度，使细胞密度高，在大规模培养时减少前期培养时间，并且在驯化过程中无需传代，无需添加胰酶，在培养病毒时只需将高密度细胞稀释至所需密度，无需换液，降低成本，减少外源因子污染风险，且流感病毒对其敏感，适用于大规模流感病毒制备，获得驯化细胞的方法简便易行。

附图说明

图1为经过本发明所述的无血清全悬浮驯化方法中不传代方式驯化的MDCK细胞示意图。

图2为经过本发明所述的无血清全悬浮驯化方法中传代方式驯化的MDCK细胞示意图。

图3为经过本发明所述的无血清全悬浮驯化的MDCK细胞生长曲线示意图。

图4为经过本发明所述的无血清全悬浮驯化的MDCK细胞系传代稳定性评估示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供的一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，包括如下步骤：

步骤一、在T瓶中逐步降低血清直至无血清，以不传代只换液的方式驯化原始MDCK细胞，即初始血清浓度为10％，每次弃掉三分之二原有培养基，并添加三分之二无血清培养基，2-3天后重复此操作，直至上清中的悬浮细胞密度达到1.0×10⁶cells/mL，使其适应于无血清生长；

步骤二、直接在摇瓶中逐步增加转速培养，筛选适应于悬浮培养的细胞。

根据本发明的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，针对该方法进行对照试验，包括如下步骤：

步骤一、在T瓶中逐步降低血清直至无血清，以传代的方式驯化原始MDCK细胞，即初始血清浓度为10％，2-3天传代，传代2次后，血清浓度为5％，继续传代并观察细胞状态，待其适应时改为用血清浓度2.5％继续传代，并重复此传代并逐渐减少血清的步骤最终以使其适应无血清培养；

步骤二、将细胞转移至125mL摇瓶中，开始以80rpm进行悬浮驯化，待细胞密度增加1倍之后，将其进行传代，并将转速提高到120rpm。

实施例

MDCK细胞来源及编号为ATCC CCL-34，使其在T225瓶中生长，培养基为含10％胎牛血清的EMEM，培养条件为37℃，5％CO₂，潮湿。待细胞融合度达90％以上时更换培养基为含10％胎牛血清的无血清培养基。细胞融合度为100％时弃掉三分之二原有培养基，并添加三分之二无血清培养基，此时血清浓度约为3.3％。2-3天后重复操作，即弃掉三分之二原有培养基，并添加三分之二无血清培养基，期间会不断有自发悬起细胞，且继续附着的细胞会逐渐由梭形向圆形变化，将其上清计数并回收到原瓶继续培养，直至上清中的悬浮细胞密度达到1.0×10⁶cells/mL。将最后收集的适应无血清生长的MDCK细胞转于摇瓶中培养，温度37℃，转速开始为80rpm，细胞倍增后增大转速至120rpm，获得单个悬浮的MDCK细胞。

对比例

MDCK细胞来源及编号为ATCC CCL-34，使其在T225瓶中生长，培养基为含10％胎牛血清的EMEM，培养条件为37℃，5％CO₂，潮湿。以传代的方式驯化原始MDCK细胞，即初始血清浓度为10％，2-3天传代，传代2次后，血清浓度为5％，继续传3-4代后改用血清浓度2.5％继续传代，并重复此传代并逐渐减少血清的步骤最终以使其适应无血清培养。以1.0×10⁶cells/mL细胞密度将其转移至125mL摇瓶中，以80rpm进行悬浮驯化，每天取样进行细胞计数，待细胞密度增加1倍之后，将其进行传代，并将转速提高到120rpm。

本发明使用的驯化的马丁达比犬肾传代细胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)来源的细胞系，该MDCK来源的细胞系来源于保藏的编号为ATCC CCL-34的MDCK来源的细胞，该MDCK来源的细胞系适应于无血清培养及全悬浮培养，并且对流感病毒敏感，适合用于大规模制备流感疫苗病毒。

实施例和对比例的结果对比。

试验例1

如图1、图2所示，经两种方法驯化获得的细胞状态，明显看出经不传代方法获得的细胞状态好，大小均一，呈单个分散，而经传代方法获得的细胞呈现明显结团，分散性不好。

试验例2

如图3所示，将适应无血清悬浮生长的两个MDCK细胞系分别以1×10⁶cells/ml接种至125ml摇瓶中，培养体积30ml，置恒温培养振荡器中37℃培养。每24小时取样，连续6天。两个细胞系的细胞密度都在第四天达到峰值，其中不传代方法获得的细胞系密度最高时达到1.2×10⁷cells/ml，明显高于传代方法获得的细胞系密度。

试验例3

如图4所示，获得驯化的MDCK细胞系后，将其连续传代，评价其传代稳定性。培养温度37℃，5％CO₂，潮湿，转速120rpm，培养瓶为500ml三角摇瓶，培养体积为100ml。细胞接种密度约为1×10⁶cells/ml，培养72h后，经不传代驯化的细胞密度基本达到8×10⁶cells/ml以上，而经传代驯化的细胞密度基本保持在5×10⁶cells/ml左右。

试验例4

将培养72h后细胞稀释至2×10⁶cells/ml，直接接种流感病毒，并补加胰酶，培养条件为5％CO₂，潮湿，转速120rpm，培养瓶为125ml摇瓶，培养体积30ml，H1N1和H3N2培养温度为34.5℃，B/Phuket和B/Brisbane培养温度为33.5℃，72h后，通过测血凝滴度评价流感病毒对驯化MDCK来源的细胞系的敏感性。结果乙型对两个细胞系的敏感度差别不大，甲型对不传代方法获得的细胞系的敏感度略高。

表1流感病毒对驯化MDCK来源的细胞系的敏感性试验

流感病毒	不传代方法	传代方法
			A/California/7/09(NYMC-179A)	256	128
A/Texas/50/2012(NYMC-223A)	512	256
			B/Brisbane/60/2008(NYMC-BX-35)	2048	2048
B/Phuket/3073/2013	2048	2048

试验例5

将生长状态良好的细胞按8×10⁵cells/ml接种7L生物反应器，接种体积约为2L，在生物反应器中增殖72h后，将细胞密度稀释到2×10⁶cells/ml并接种流感病毒，48-72h后测定血凝效价并收毒，结果如表2所示。

表2生物反应器制备的流感病毒血凝滴度

流感病毒	不传代方法	传代方法
			A/California/7/09(NYMC-179A)	256	256
A/Texas/50/2012(NYMC-223A)	512	256
			B/Brisbane/60/2008(NYMC-BX-35)	1024	1024
B/Phuket/3073/2013	1024	1024

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims

1.一种用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在所述步骤一中，将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％所使用的培养基为含10％胎牛血清的EMEM。

3.如权利要求2所述的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在所述步骤一中，将需血清贴壁培养的MDCK细胞培养至细胞融合度达到90％的培养条件为：温度为37℃、5％CO₂。

4.如权利要求1所述的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在所述步骤二中，首次弃去三分之二的培养基，并添加等量的无血清培养基后，经过2～3天，再次弃去三分之二的培养基，并添加等量的无血清培养基。

5.如权利要求1所述的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在所述步骤三、在至于恒温培养振荡器中培养的条件为：转速80rpm、温度为37℃和5％CO₂。

6.如权利要求5所述的用于MDCK细胞的无血清全悬浮驯化方法，其特征在于，在所述步骤三中，细胞倍增后，将转速提升至120rpm，获得单个悬浮的MDCK细胞。