CN107058212B - 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用 - Google Patents

可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107058212B
CN107058212B CN201710208123.8A CN201710208123A CN107058212B CN 107058212 B CN107058212 B CN 107058212B CN 201710208123 A CN201710208123 A CN 201710208123A CN 107058212 B CN107058212 B CN 107058212B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
cell
subculture
culture
sheep
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201710208123.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058212A (zh
Inventor
路荣
刘国英
范秀丽
张燕红
高艳华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd filed Critical Spirit Jinyu Biological Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN201710208123.8A priority Critical patent/CN107058212B/zh
Publication of CN107058212A publication Critical patent/CN107058212A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058212B publication Critical patent/CN107058212B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0683—Cells of the male genital tract, e.g. prostate, epididymis; Non-germinal cells from testis, e.g. Leydig cells, Sertoli cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24211—Parapoxvirus, e.g. Orf virus
    • C12N2710/24251—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了可传代培养的羊睾丸细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用，提供了一株可传代培养的羊睾丸传代细胞LT‑1(CGMCC No.12988)以及驯化培养获得该细胞的方法。本发明采用优化的细胞培养液对羊睾丸原代细胞(LT)进行传代驯化培养，可使羊睾丸原代细胞增加传代次数，适于批量生产；并利用该细胞对羊口疮病毒进行增殖培养，结果显示，羊口疮病毒能连续传代培养3代，均能产生明显的病变，病毒含量可达107.5TCID50/mL，可用于羊口疮病毒的增殖培养和疫苗制备。

Description

可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用 培养体系与应用
技术领域
本发明属于细胞与组织培养领域中细胞的培养方法和培养体系，特别是涉及一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)得到可传代培养的羊睾丸传代细胞(LT-1)的方法及其专用培养体系与应用。
背景技术
目前，羊睾丸细胞(LT)均是来源于羔羊睾丸，经解剖、剪碎、消化、培养而成的原代细胞，该细胞生长缓慢，繁殖一定代数后(一般10代以内)停止生长，传代次数有限，随着传代次数的升高，细胞活力降低，细胞形态也随之越来越差，最后无法进行传代；并且羔羊睾丸来源有限，采集工作量大，易污染，费时费事；细胞制作过程复杂耗时，不利于批量生产使用。
发明内容
为克服羊睾丸原代细胞(LT)培养的不足，实现羊睾丸细胞的批量培养，本发明的发明人长期致力于羊睾丸原代细胞的传代驯化研究，通过个性化的培养基，优化驯化途径，最终获得了一株可以传代培养的羊睾丸细胞。
本发明的第一个目的是提供一株可传代培养的羊睾丸传代细胞，命名为LT-1，该株细胞已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12988。
本发明的第二个目的是提供一种用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的培养体系。
本发明所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系包括细胞培养液Ⅰ、细胞培养液Ⅱ和细胞培养液Ⅲ；所述细胞培养液Ⅰ为含有10％(体积百分比V/V)新生牛血清和1％-3％(质量体积百分比W/V)L-谷氨酰胺的MEM培养液，所述细胞培养液Ⅱ是含有10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液所述细胞培养液Ⅲ为含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液。
本发明所提供的用于传代驯化培养羊睾丸原代细胞的培养体系还包括消化液Ⅰ和消化液Ⅱ，所述消化液Ⅰ为0.25％(W/V)的胰酶消化液，所述消化液Ⅱ为含有0.25％(W/V)胰酶和0.02％(W/V)EDTA的EDTA-胰酶消化液。
本发明的第三个目的是提供一种传代驯化培养羊睾丸原代细胞(LT)的方法。本发明所提供的传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法，是将羊睾丸原代细胞用细胞培养液Ⅰ进行传代培养至7-8代，再逐次用细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养至20代、30代，最后用细胞培养液Ⅲ逐步适应传代至40-50代得到可传代的羊睾丸细胞LT。这里，每次传代培养后用消化液Ⅱ封口，再消化细胞后加入细胞培养液。
具体的，可包括以下步骤：
1)取用公羊睾丸；
2)获得羊睾丸原代细胞：将羊睾丸经清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，加入消化液Ⅰ，封口，将其放入水浴锅中消化约20-30分钟，取出，加入细胞培养液Ⅰ终止消化，轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睾丸细胞均匀分散开，用无菌纱布过滤，取透过液体，置于细胞瓶中，置于37℃恒温培养箱中培养，由此得到羊睾丸原代细胞；
3)羊睾丸原代细胞的传代：将羊睾丸原代细胞在恒温环境中进行培养，待羊睾丸细胞长满单层时，加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化，取出，加入细胞培养液Ⅰ进行传代培养；
4)按照步骤3)中的方法将羊睾丸原代细胞传至7-8代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；
5)按照步骤4)中的方法将羊睾丸原代细胞传至20代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅱ继续进行传代培养；
6)按照步骤5)中的方法将羊睾丸原代细胞传至30代时，将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，封口，将其放入37℃恒温培养箱中消化细胞，取出，加入细胞培养液Ⅲ继续进行传代培养；
7)按照步骤6)中的方法将羊睾丸原代细胞传至40-50代，得到可以传代的羊睾丸细胞。
在上述传代驯化培养羊睾丸原代细胞的方法中，所述步骤1)的公羊为2-4月龄的小公羊。
所述步骤2)中玻璃珠的直径为2-3mm，优选为2.5mm，粒数为100-150，优选120；消化液Ⅰ的添加量为30-50mL，优选40mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为20-30分钟，优选30分钟；细胞培养液Ⅰ的添加量为300-500mL，优选300mL；无菌纱布的层数为6-8层，优选为8层。
所述3)羊睾丸原代细胞的传代：所述羊睾丸原代细胞的培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选2分钟；细胞培养液Ⅰ的添加量为20-25mL(细胞瓶培养面积为25cm2)，优选20mL,平分为两瓶进行培养(分种比例为1:2),培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时,以细胞长满单层的时长为准。
所述步骤4)将羊睾丸原代细胞传至7-8代时，细胞开始生长更加缓慢，且形态不佳，此时需减小分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)的分种比例进行消化传代培养，优化细胞培养液为细胞培养液Ⅱ；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅱ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。
所述步骤5)将羊睾丸原代细胞传至20代时，细胞生长较快，且形态较好，可适当扩大分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(2-3)的分种比例进行消化传代培养；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅱ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。
所述步骤6)中将羊睾丸原代细胞传至30代时，优化细胞培养液为培养液Ⅲ，同时降低分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)继续进行传代培养；消化液Ⅱ的添加量为1-2mL，优选2mL，消化温度为36.5-37.5℃，优选37℃，消化时间为1-2分钟，优选1分钟；细胞培养液Ⅲ的添加量为10-15mL，优选10mL，培养温度为36.5-37.5℃，优选37℃，培养时间为48-72小时，优选为72小时，以细胞长满单层的时长为准。
所述步骤7)中将羊睾丸原代细胞传至50代时，挑选得到一株可以传代培养的羊睾丸传代细胞，命名为LT-1。该株细胞已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.12988。
本发明的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)可用于羊口疮病毒的增殖培养，包括以下步骤：用细胞培养液Ⅲ(含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液)培养羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)，培养温度为36.5-37.5℃(优选37℃)，待其长满单层细胞后，倾去培养液上清，以1％-3％(V/V，优选2％)的剂量接入羊口疮病毒，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ(含2％(V/V)胎牛血清的DMEM培养液)，维持液Ⅰ的添加量为8-10mL(优选10mL)，置于恒温培养箱中培养，培养温度为36.5-37.5℃(优选37℃)，观察单层细胞的病变情况，当80％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液；所述接入的羊口疮病毒可为之前所收获的病毒液。
具体的，1)接入羊口疮病毒(来源于金宇保灵生物药品有限公司)收获的病毒液标记为病毒液Ⅰ F1代；
2)将病毒液Ⅰ F1代接入长成单层的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)中培养，收获的病毒液标记为病毒液Ⅰ F2代；
3)将病毒液Ⅰ F2代接入长成单层的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)中培养，收获的病毒液标记为病毒液Ⅰ F3代。
病毒液Ⅰ F1代-F3代病毒液均能产生明显的病变，病毒含量可达107.5TCID50/mL，均可用于羊口疮病毒传代培养及疫苗生产。
本发明提供了一种羊睾丸原代细胞(LT)的传代驯化培养方法，并且获得了一株可以传代培养的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)，本发明具有以下有益效果：
1)采用优化细胞培养液的方法对羊睾丸原代细胞(LT)进行传代驯化培养，可使羊睾丸原代细胞增加传代次数，适于批量生产；
2)将羊口疮病毒接种于羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)进行增殖培养，结果显示，羊口疮病毒能连续传代培养3代，均能产生明显的病变，病毒含量可达107.5TCID50/mL，与羊睾丸原代细胞(LT)培养的羊口疮病毒毒价相当。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1显示羊睾丸原代细胞在37℃恒温环境中培养，细胞长满单层时形态；
图2显示羊睾丸原代细胞传至7-8代时形态，此时细胞开始生长更加缓慢，且形态不佳；
图3显示羊睾丸原代细胞传至20代时形态，此时细胞生长较快，且形态较好；
图4显示羊睾丸原代细胞传至30代时形态；
图5显示羊睾丸原代细胞传至50代时形态；
图6显示LT-1细胞能产生明显的病变，表现为细胞肿胀、变圆；
图7显示培养后期细胞大量脱落。
具体实施方式
所述百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。
实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1、羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)的传代驯化培养(获得)方法与保藏
用于传代驯化培养羊睾丸传代细胞(LT-1)的培养体系包括细胞培养液Ⅰ、细胞培养液Ⅱ和细胞培养液Ⅲ，所述细胞培养液Ⅰ为含有10％(V/V)新生牛血清(购自金源康公司，批号为20151208)和1％-3％(W/V)L-谷氨酰胺(购自gibco公司，批号为21051024)的MEM培养液(购自宜兴市赛尔生物科技有限公司，批号为150130)，所述细胞培养液Ⅱ是含有10％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液，所述细胞培养液Ⅲ为含有5％(V/V)胎牛血清(购自gibco公司，批号为10099-141)和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液(购自gibco公司，批号为12800082)；
L-谷氨酰胺用蒸馏水配制成质量/体积比(W/V)为3％的溶液后，0.22μm滤膜过滤，分装，-20℃保存备用；
用于传代驯化培养羊睾丸传代细胞(LT-1)的培养体系还包括消化液Ⅰ和消化液Ⅱ，所述消化液Ⅰ为0.25％(W/V)的胰酶(胰酶规格为1:250，购自gibco公司，批号为1596920)消化液，所述消化液Ⅱ为含有0.25％(W/V)胰酶和0.02％(W/V)EDTA(购自国药集团化学试剂有限公司，批号为20140627)的EDTA-胰酶消化液。
本发明传代驯化培养(获得)羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)的方法，包括以下步骤：
1)采取2-4月龄的小公羊睾丸；
2)获得羊睾丸原代细胞：将羊睾丸经清洗、解剖、剪碎，置于放有玻璃珠的三角瓶中，玻璃珠的直径为2.5mm(2-3mm均可)，粒数为120(100-150均可)，加入消化液Ⅰ，消化液Ⅰ的添加量为40mL(30-50mL均可)，封口，将其放入水浴锅中消化细胞，消化温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，消化时间为30分钟(20-30分钟均可分钟均可)，取出，加入细胞培养液Ⅰ终止消化，细胞培养液Ⅰ的添加量为300mL(300-500mL均可)，轻轻向一个方向摇动三角瓶，在玻璃珠的作用下，羊睾丸细胞均匀分散开，用8层(6-8层均可)无菌纱布过滤，取透过液体，置于细胞瓶中，得到羊睾丸原代细胞；
3)羊睾丸原代细胞的传代：将羊睾丸原代细胞在37℃(36.5-37.5℃均可)恒温环境中进行培养，待羊睾丸细胞长满单层时(图1)，加入消化液Ⅱ，消化液Ⅱ的添加量为2mL(1-2mL均可)，封口，将其放入恒温培养箱中进行消化，消化温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，消化时间为1分钟(1-2分钟均可)，取出，加入细胞培养液Ⅰ进行传代培养，细胞培养液Ⅰ的添加量为20-25mL(细胞瓶培养面积为25cm2)，优选20mL，平分为两瓶进行培养(分种比例为1:2)，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，培养时间为72小时(48-72小时均可，以细胞长满单层的时长为准)；
4)按照步骤3)中的方法将羊睾丸原代细胞传至7-8代时，细胞开始生长更加缓慢，且形态不佳(图2)，此时需减小分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)的分种比例进行消化传代培养，优化细胞培养液为细胞培养液Ⅱ；将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，消化液Ⅱ的添加量为2mL(1-2mL均可)，封口，将其放入恒温培养箱中消化细胞，消化温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，消化时间为1分钟(1-2分钟均可)，取出，加入细胞培养液Ⅱ进行传代培养，细胞培养液Ⅱ的添加量为15mL(10-15mL均可)，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，培养时间为72小时(48-72小时均可，以细胞长满单层的时长为准)；
5)按照步骤4)中的方法将羊睾丸原代细胞传至20代时，细胞生长较快，且形态较好(图3)，可适当扩大分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(2-3)的分种比例进行消化传代培养；将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，消化液Ⅱ的添加量为2mL(1-2mL均可)，封口，将其放入恒温培养箱中消化细胞，消化温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，消化时间为1分钟(1-2分钟均可)，取出，加入细胞培养液Ⅱ进行传代培养，细胞培养液Ⅱ的添加量为10mL(10-15mL均可)，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，培养时间为72小时(48-72小时均可,以细胞长满单层的时长为准)；
6)按照步骤5)中的方法将羊睾丸原代细胞传至30代时(图4)，优化细胞培养液为培养液Ⅲ，同时降低分种比例，以消化前羊睾丸细胞营养液的体积与消化后的羊睾丸细胞营养液的体积比为1：(1-1.5)的分种比例继续进行传代培养；将长满单层的羊睾丸细胞加入消化液Ⅱ，消化液Ⅱ的添加量为2mL(1-2mL均可)，封口，将其放入恒温培养箱中消化细胞，消化温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，消化时间为1分钟(1-2分钟均可)，取出，加入细胞培养液Ⅲ进行传代培养，细胞培养液Ⅲ的添加量为15mL(10-15mL均可)，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，培养时间为72小时(48-72小时均可，以细胞长满单层的时长为准)；
7)按照步骤6)中的方法将羊睾丸原代细胞传至50代时(图5)，得到一株可以传代培养的羊睾丸细胞，命名为LT-1。
用上述方法获得的可以传代培养的羊睾丸传代细胞LT-1已于2016年9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.12988。
实施例2、将羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)用于羊口疮病毒的增殖培养
将羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)用于羊口疮病毒的增殖培养，具体方法包括以下步骤：
1)用细胞培养液Ⅲ(含有5％(V/V)胎牛血清和5％(V/V)新生牛血清的DMEM培养液)培养羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)，培养温度为37℃，待其长满单层细胞后，倾去培养液上清，以2％(V/V，1％-3％均可)的剂量接入羊口疮病毒(来源于金宇保灵生物药品有限公司)，吸附1小时候后，加入维持液Ⅰ(含2％(V/V)胎牛血清的DMEM培养液)，维持液Ⅰ的添加量为10mL(8-10mL均可)，置于恒温培养箱中培养，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，每天观察单层细胞的病变情况，当80％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液Ⅰ F1代；
2)将病毒液Ⅰ F1代再以2％(V/V，1％-3％均可)的剂量接入长成单层的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)中，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ，维持液Ⅰ的添加量为10mL(8-10mL均可)，置于恒温培养箱中培养，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，每天观察单层细胞的病变情况，当80％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液Ⅰ F2代；
3)将病毒液Ⅰ F2代再以2％(V/V，1％-3％均可)的剂量接入长成单层的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)中，吸附1小时后，加入维持液Ⅰ，维持液Ⅰ的添加量为10mL(8-10mL均可)，置于恒温培养箱中培养，培养温度为37℃(36.5-37.5℃均可)，每天观察单层细胞的病变情况，当80％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液，标记为病毒液Ⅰ F3代。
实验例、羊睾丸传代细胞LT-1用于羊口疮病毒的增殖培养效果检测
对比例1：将羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)用于羊口疮病毒的增殖培养，具体方法与实施例2相同，不同之处在于维持液Ⅰ为不含胎牛血清的DMEM培养液。
对比例2：将未驯化的羊睾丸原代细胞(LT)用于羊口疮病毒的增殖培养，具体方法与实施例2相同。
将对比例1、2中各个阶段中收获的病毒液进行细胞感染滴度的测定。每个病毒液测毒价的方法为：取9支高压灭菌的1.5mL离心管，每管加入0.9mL病毒稀释液(含2％(V/V)胎牛血清的DMEM培养液)，再在第1管中加入0.1mL的病毒稀释液，用旋涡混合仪将液体混匀后，取0.1mL加入第2管中，如此依次稀释，最终每管中病毒的稀释度为10-1-10-9；将各稀释度的病毒液加入长满羊睾丸原代细胞(LT)的96孔细胞板中，每个稀释度病毒液接种8孔，每孔接0.1mL，置37℃、5％CO2恒温培养箱中培养，逐日观察。根据细胞病变孔数按Reed-Muench法计算TCID50/mL。
检测结果如表1所示，实施例2和对比例1中，用羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCCNo.12988)培养羊口疮病毒时，当维持液为无血清的DMEM培养液时，LT-1细胞产生的细胞病变不易观察；当维持液为含2％(V/V)胎牛血清的DMEM培养液时，LT-1细胞能产生明显的病变，表现为细胞肿胀、变圆及培养后期细胞的大量脱落(图6、图7)。当维持液为含2％(V/V)胎牛血清的DMEM培养液时，LT-1细胞毒液病毒含量达107.33TCID50/mL以上，并且与羊睾丸原代细胞(LT)毒液毒价相当，差别不明显。上述检测结果表明本发明的羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)可用于羊口疮病毒的增殖培养。
表1羊睾丸传代细胞LT-1(CGMCC No.12988)用于羊口疮病毒的增殖培养效果检测结果
Figure BDA0001260366900000081

Claims (2)

1.羊睾丸传代细胞LT-1，保藏编号为CGMCC No.12988，保藏日期为2016年9月7日，保藏地址为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.用权利要求1所述的羊睾丸传代细胞LT-1CGMCC No.12988增殖培养羊口疮病毒的方法，包括以下步骤：用含有V/V为5％的胎牛血清和V/V为5％的新生牛血清的DMEM培养液的细胞培养液Ⅲ培养羊睾丸传代细胞LT-1CGMCC No.12988，培养温度为36.5-37.5℃，待其长满单层细胞后，倾去培养液上清，以V/V为1％-3％的剂量接入羊口疮病毒，吸附1小时后，加入含V/V为2％的胎牛血清的DMEM培养液的维持液Ⅰ，维持液Ⅰ的添加量为8-10mL，置于恒温培养箱中培养，培养温度为36.5-37.5℃，观察单层细胞的病变情况，当80％以上单层细胞出现病变时，将单层细胞冻融2-3次，收获病毒液。
CN201710208123.8A 2017-03-31 2017-03-31 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用 Active CN107058212B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710208123.8A CN107058212B (zh) 2017-03-31 2017-03-31 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710208123.8A CN107058212B (zh) 2017-03-31 2017-03-31 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058212A CN107058212A (zh) 2017-08-18
CN107058212B true CN107058212B (zh) 2021-03-19

Family

ID=59602491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710208123.8A Active CN107058212B (zh) 2017-03-31 2017-03-31 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058212B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111057675A (zh) * 2018-10-16 2020-04-24 安徽东方帝维生物制品股份有限公司 一种适应全悬浮培养的羊睾丸永生化细胞驯化方法
CN113215084B (zh) * 2021-06-11 2023-04-07 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种羊胎儿皮肤成纤维细胞、其分离方法与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1155881B (de) * 1961-03-08 1963-10-17 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen Maul- und Klauenseuche
CN102533660A (zh) * 2012-03-07 2012-07-04 西北农林科技大学 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1155881B (de) * 1961-03-08 1963-10-17 Behringwerke Ag Verfahren zur Herstellung einer Lebendvaccine gegen Maul- und Klauenseuche
CN102533660A (zh) * 2012-03-07 2012-07-04 西北农林科技大学 一种用于羊口疮病毒增殖的永久细胞系制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
羊睾丸原代细胞传代试验;张玉红;《草食家畜》;20130531;第2013年卷(第3期);全文 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058212A (zh) 2017-08-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107201333B (zh) 可悬浮培养的牛肾细胞在病毒培养及疫苗生产的应用
US11629338B2 (en) Method for acclimating and suspending Vero and second order production process for virus
CN104862270B (zh) 一种适用于无血清培养系统的vero细胞驯化方法及其应用
CN105950544B (zh) 全悬浮培养型Marc-145细胞系的驯化方法
CN106085946B (zh) 可以悬浮培养的猪睾丸细胞株st-s及其获得方法与应用
CN102178946B (zh) Bhk-21细胞无血清悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用
CN107058212B (zh) 可传代培养的羊睾丸传代细胞及其传代驯化培养方法及专用培养体系与应用
CN108570445A (zh) Pk15细胞驯化悬浮方法和二阶病毒生产工艺
CN109852580A (zh) 无血清悬浮培养型mdck细胞株及其应用
CN105969737A (zh) 一种规模化生产轮状病毒疫苗的方法
CN104894054B (zh) 一种猴胚胎肾上皮细胞Marc‑145悬浮适应株及其在培养蓝耳病病毒、生产蓝耳病毒疫苗中的应用
CN101380469A (zh) 大菱鲆红体病虹彩病毒灭活疫苗的生产工艺
CN103555674A (zh) 微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺
CN110669722A (zh) 一种用于mdck细胞的无血清全悬浮驯化方法
CN105838683A (zh) 一种应用新型细胞微载体增殖水貂犬瘟热病毒的方法
CN102406927A (zh) 一种人二倍体细胞乙型脑炎灭活疫苗的生产方法
CN104593335B (zh) 低血清培养Marc‑145细胞生产猪繁殖与呼吸道综合征CH‑1R株病毒的方法
CN106916780A (zh) 高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株
CN106834209A (zh) 高密度悬浮培养的bhk21细胞克隆株
CN105820996A (zh) 一种人原代气道上皮细胞培养方法
CN109402068A (zh) 一种制备无血清残留的猪伪狂犬病毒的方法
CN102657859A (zh) 利用球形微载体生物反应器培养细胞生产禽流感疫苗的方法
CN102327609B (zh) 一种乙型脑炎疫苗的生产方法
CN108866012A (zh) 一种猪流行性腹泻病毒悬浮培养连续收毒生产方法
CN101451122A (zh) 褐点石斑鱼鳔细胞系的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant