CN103555674A - 微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺 - Google Patents

Abstract

本发明公开了微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，是以2g/L-10g/LCytodex-1或GF-240两种微载体培养Marc-145细胞，以M.O.I为0.01—0.1接种PRRS病毒液，各分成两组，一组为对照组，另一组为试验组，对照组接种病毒后的24h、48h和72h取样测定TCID₅₀，试验组接种病毒后每隔24-28h分别收获上清病毒液后补加维持液继续培养，可收获2-3次。本发明的有益效果为：本发明提供一种微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺技术，在微载体培养条件下Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒时多次收毒方式所获符合标准的病毒液是正常收毒方式的两倍以上，提高了微载体和种子细胞的利用率，降低疫苗的生产成本。

Description

微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺

技术领域

本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺。

背景技术

Marc-145细胞即恒河猴胚肾上皮细胞，广泛用于猪繁殖与呼吸综合征疫苗的生产。目前，国内各厂家使用的是传统的转瓶培养工艺生产该疫苗。微载体悬浮培养技术将逐步代替传统技术，但是进口微载体的价格较高。从生产成本方面考虑，多次收毒工艺和国产明胶微载体的使用，可提高病毒液收获量和降低生产成本，在实际生产中具有应用前景。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种能够降低猪繁殖与呼吸综合征疫苗生产成本的微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺。

PRRS (即猪繁殖与呼吸综合征，英文：Porcine reproductive and respiratory syndrome，简写：PRRS)。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，包括以下步骤： 

1）微载体处理：将Cytodex-1型微载体经pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液浸泡3h，1g微载体需用20—100ml的缓冲液浸泡,所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间，并洗涤2次，将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS（即新生牛血清，英文为：New Bovine Serum,简写为：NBS）的DMEM培养液清洗2遍后备用；

或

将GF-240型微载体先用含体积百分含量万分之一吐温的纯净水浸泡溶胀3h，1g微载体需用20—100ml的含吐温的纯净水浸泡，用pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗2次，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间。将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用。

2）微载体培养Marc-145细胞：利用方瓶、转瓶等细胞培养器皿扩大培养Marc-145细胞，经质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶消化，按每个微载体15—20个细胞的量接种到步骤1）所述的微载体悬液中，补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最培养终体积的一半后培养。生物反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间。在培养前3h内采用间歇搅拌的方式，所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止25—30min,再搅拌3-5min的反复搅停过程。培养3h后采用固定转速持续搅拌。培养24h时补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最终体积。

3）细胞培养过程监控和处理：从培养的24h起每12—24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液，以保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L（因含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液中的葡萄糖含量约4.5g/L），至到每克微载体上细胞总数达到2.5×10⁸个以上。

4）接种病毒：

将步骤3）得到的微载体培养的Marc-145细胞，停止搅拌5-10 min待微载体沉到反应器底部时弃去上清，按M.O.I（即感染复数，英文：multiplicity of infection，简写：M.O.I）为0.01—0.1接种PRRS病毒液，补加细胞培养最终体积一半的维持液培养。生物反应器参数设置：温度37℃、pH7.3±0.1、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间。按步骤2）的方法在培养前2h内采用间歇搅拌的方式，培养2h后补加维持液至终体积。所述维持液为含体积百分含量3%NBS的DMEM培养液。

5）收获病毒：

在接毒培养后每隔24h—28h，停止搅拌5-10 min，待微载体沉到反应器底部时收获上清液，收获后加维持液到最培养终体积继续培养再收获上清液，可收获2-3次。

6）国产明胶微载体的使用，可降低生产成本。

本发明的有益效果为：本发明一种微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒时多次收毒工艺技术，微载体培养条件下多次收毒方式所获符合标准的病毒液是正常收毒方式的两倍以上，提高微载体和种子细胞的利用率，降低疫苗生产成本。

在生物反应器中以2—10g/L Cytodex-1和GF-240两种微载体培养Marc-145细胞，待至到每克微载体上细胞总数达到2.5×10⁸个以上，弃去上清，以M.O.I为0.01—0.1接种PRRS病毒液，各分成两组，一组为对照组，另一组为试验组，对照组每24-28h取样测定TCID50，试验组每24—28h收获一次上清。多次收毒试验组表现为第一次收获的病毒液毒价最高，之后呈下降趋势。接毒后第1和第2次收毒所获病毒液毒价均达到PRRS灭活疫苗半成品检验标准（≥6.0 LgTCID50/mL），三次所获病毒液混合后毒价也达到上述标准，说明Cytodex-1和GF-240两种微载体培养Marc-145细胞增殖PRRSV多次收毒是可行的。

Cytodex-1为一种进口的葡聚糖微载体，广泛运用于动物细胞的培养和疫苗生产。

GF-240为一种国产化的明胶微载体，价格便宜，替代进口载体用于疫苗生产，降低疫苗的生产成本。

具体实施方式

实施例1：

1、材料：

1)细胞株：Marc-145细胞 从CCTCC引进；

2)DMEM培养液，Invitrigen Corporation；

3)胰蛋白酶，Invitrigen Corporation；

4)微载体：Cytodex-1，GE公司,每克含4.3×10⁶个载体；GF-240，兰州百灵生物技术有限公司，每克含3.1×10⁶个载体；

5)新生牛血清，兰州民海生物工程有限公司；

6)PRRS病毒（TJM-F92株）,由中国兽医药品监察所提供。

2、仪器设备：

1)CO₂培养箱，Thermo Fisher Scientific Corporation ，3111；

2)转瓶培养机，兰飞生化设备厂，SHXJ-Ⅵ;

3)相差倒置显微镜， OLYMPUS CKX41；

4)生物反应器，NBS，310，培养罐总体积5L，培养终体积3.5L。

3、其它：

凯氏细胞培养方瓶(T-75)。

4、方法：

1）微载体处理：

Cytodex-1微载体：

称取15gCytodex-1型微载体，用1L的pH为7.4的无Ca²⁺、Mg²⁺PBS缓冲液（渗透压为301mmol/kg）浸泡3h，并洗涤2次，每次清洗用量2L，再用2L的PBS缓冲液悬浮后移到生物反应器中，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，弃PBS缓冲液，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2次，每次清洗用量2L，备用；

GF-240微载体：

称取17.5g GF-240微载体，用1L的含体积百分含量万分之一吐温的纯净水浸泡溶胀3h，用pH为7.4的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗2次，每次清洗用量2L，再用2L的PBS缓冲液悬浮后移到生物反应器中，所述PBS缓冲液的渗透压为301mmol/kg。以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，弃PBS缓冲液，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2次，每次清洗用量2L，备用。

2）微载体培养Marc-145细胞：

复苏Marc-145细胞后，利用常规酶蛋白酶消化方法传代细胞的方法扩大培养Marc-145细胞至总数1.1×10⁹个以上，细胞扩大培养的方式为1个75方瓶→4个75方瓶→16个75方瓶→1个15L转瓶→3个15L转瓶，取1.032×10⁹个细胞接种到上述步骤4第1）条已备好Cytodex-1微载体的生物反应器中培养（即:16个细胞/微载体）补加10%NBS的DMEM培养液至1.75L(1/2终体积)。生物反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧60%，在培养前3h内采用45 rpm搅拌3min停止27min的间歇搅拌方式，培养3h后采用30rpm固定转速持续搅拌。培养24h时补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至培养终体积3.5L。

3）细胞培养过程监控和处理：从接种培养起每24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液，以保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至到每克微载体上细胞总数达到2.5×10⁸个以上。

4）接种病毒：

将步骤3）得到的微载体培养的停止搅拌10 min待微载体沉到反应器底部时弃去上清，按M.O.I=0.05接种PRRS病毒液，补加维持液培养至1.75L(1/2终体积)。生物反应器参数设置：温度37℃、pH7.4、溶氧60%，在培养前2h内采用45 rpm搅拌3min停止27min的间歇搅拌的方式，培养2h后补加维持液至终体积采用30rpm固定转速持续搅拌。

5）收获病毒

实验组在接毒培养后每隔24h停止搅拌10 min，待微载体沉到反应器底时收获上清液3L，收获后加3L维持液到最培养终体积继续培养再收获上清液，共收获3次，取三次收获的毒液样品和三次收获毒液1：1：1混合后分别测定TCID₅₀。对照组在接毒培养后的24h、48h和72h取样测定TCID₅₀。

6）TCID₅₀测定：

将各待检样品分别做10倍系列稀释，从10^-1稀释至10^-7，将不同稀释度分别接种于长成单层的Marc-145细胞96孔细胞培养板中，每个稀释度接种5孔，每孔100μL，另设5孔只接种稀释液作为阴性对照，每孔100μL。吸附1h后各孔再加100μL维持液，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养7d，每天观察并记录各孔细胞病变情况，按Reed-Muench法计算 TCID₅₀。

7）GF-240微载体培养：

按上述步骤2）的方法，取8.68×10⁸个Marc-145细胞接种到上述步骤4第1）条已备好GF-240微载体的生物反应器中培养（即:16个细胞/微载体），并按上述步骤2）—6）培养、接毒、收获和测定。

表1 

。

a 按最培养终体积3.5L计算的结果

表2 

。

利用在培养体积为3.5L的生物反应器以15g Cytodex-1和17.5g GF-240微载体培养Marc-145细胞，培养至72h时，细胞密度分别为15.67×10⁵/mL和15.32×10⁵/mL, 每克微载体上的细胞数量分别达到3.66×10⁸和3.06×10⁸，细胞生长增殖变化情况如表1。以M.O.I=0.05接种PRRSV，不同微载体多次收获毒液的毒价和各时间取样的毒价（单位：LgTCID₅₀/mL）如表2所示，多次收毒组和病毒正常增殖对照组均表现为接种后24h病毒液毒价最高，之后逐渐下降。Cytodex-1和GF-240微载体培养下24h第1次收获病毒液毒价分别为7.63和7.83LgTCID₅₀/mL，48h第2次收获病毒液毒价分别为6.50和6.83LgTCID₅₀/mL，72h第3次收获病毒液毒价分别为5.83和5.63LgTCID₅₀/mL，三批收获病毒液毒价分别6.63和6.68LgTCID₅₀/mL可用于后续疫苗生产。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.微载体培养Marc-145细胞增殖猪繁殖与呼吸综合征病毒的多次收毒工艺，其特征在于，包括以下步骤： 

1）微载体处理：

将Cytodex-1型微载体经pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液浸泡3h，1g微载体需用20-100ml的缓冲液浸泡之间，并洗涤2次，用PBS将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器中，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg，或将GF-240型微载体先用含体积百分含量万分之一吐温的纯净水浸泡溶胀3h，1g微载体需用20—100ml的含吐温的纯净水浸泡，用pH为7.2±0.1的无Ca²⁺、Mg²⁺的PBS缓冲液洗2次，用PBS将微载体配成2-10g/L的浓度后转移到生物反应器中，以121℃高压蒸汽灭菌30min，自然冷却后静置，用含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液清洗2遍后备用，所述PBS缓冲液的渗透压在290～320mmol/kg之间；

2）微载体培养Marc-145细胞：

利用方瓶或转瓶扩大培养Marc-145细胞，经质量百分比浓度为0.25%胰蛋白酶消化，按每个微载体15—20个细胞的量接种到步骤1）所述的微载体悬液中，补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至培养终体积的一半后培养，生物反应器的参数设置为：温度37℃、pH7.2、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间，在培养前3h内采用间歇搅拌的方式，所述间歇搅拌是搅拌3-5min,停止25—30min,再搅拌3-5min的反复搅停过程，培养3h后采用固定转速持续搅拌，培养24h时补加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液至最终体积；

3）细胞培养过程监控和处理：

从培养的24h起每12—24h取样观察细胞生长情况、计数细胞密度和检测培养液中葡萄糖的剩余量，并根据培养液葡萄糖的含量换加含体积百分含量10%NBS的DMEM培养液，以保证生物反应器中细胞液的葡萄糖含量≥1g/L，至到每克微载体上细胞总数达到2.5×10⁸个以上，若培养体积为3.5L的生物反应器中微载体投放量为15g，则细胞总量要达到3.75×10⁹个以上；

4）接种病毒：

将步骤3）得到的微载体培养的停止搅拌5-10 min待微载体沉到反应器底时弃去上清，按M.O.I0.01—0.1接种PRRS病毒液，补加细胞培养最终体积一半的维持液培养，生物反应器参数设置：温度37℃、pH7.3±0.1、溶氧30-60%，转速以微载体能完全搅成悬浮状的最低转速，在25—50rpm之间，按步骤2）的方法在培养前2h内采用间歇搅拌的方式，培养2h后采用固定转速持续搅拌，所述维持液为含体积百分含量3%NBS的DMEM培养液；

5）收获病毒：

在接毒培养后每隔24h—28h，停止搅拌5-10 min，待微载体沉到反应器底时收获上清液，收获后加维持液到培养终体积继续培养再收获上清液，可收获2-3次。