CN103289948A - 一种细胞培养用gf微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供上述细胞培养用GF微载体在贴壁培养型细胞培养中的应用。所述贴壁依赖型细胞培养包括贴壁依赖型动物细胞培养、人二倍体细胞培养和皮肤细胞培养。是将所述GF微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养，在培养48～120小时后，更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。本发明可以采用高压灭菌、使用前不需对细胞培养容器预先硅化、工艺简单、使用方便、价格低廉，在搅拌状态下悬浮培养，细胞不容易脱落，适合于多种贴壁细胞的大规模微载体悬浮培养。

Description

一种细胞培养用GF微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种细胞培养用微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。

背景技术

动物细胞生物反应器微载体培养技术是当前生物制药行业贴壁依赖性细胞培养的领先技术。微载体是细胞培养中所使用的一类无毒性、非刚性、密度均一、透明的小颗粒。能使贴壁依赖性细胞贴附在颗粒表面进行悬浮培养，从而增加细胞贴附生长的面积，有利于细胞的大规模培养和收集。

自1967年Van Wezel第一个用DEAE-Sephadex A 50作为贴壁细胞培养用微载体以来，研究报道的细胞培养用微载体已有十多种，包括葡聚糖微载体、聚赖氨酸液体微载体、大孔明胶微载体、纤维素微载体、壳聚糖微载体、甲壳质微载体、聚苯乙烯微载体、聚氨酯泡沫微载体、藻酸盐凝胶微载体以及磁性微载体等。我国目前使用的商品化微载体主要有：如GE公司的CytodexⅠ、Cytodex Ⅱ、Cytodex Ⅲ和Thermo 公司的Cytopore，Cytoline，Biosilon、Cultispher G等，均为进口产品，价格昂贵，目前的市场价已达每公斤3-10万元人民币，还时常出现供货不及时的现象，而国产微载体大多数尚在研制之中，或生产规模小，不能满足我国生物制药领域疫苗、重组药物蛋白、单克隆抗体、细胞因子及其受体等医用生物制品生产的需要，是限制我国动物细胞培养技术从转瓶细胞培养工艺向生物反应器微载体培养工艺转型的技术瓶颈之一。 

目前，在发达国家，生物制药行业贴壁依赖型动物细胞培养工艺已普遍采用生物反应器微载体培养工艺，几千升、上万升的动物细胞培养生物反应器已用于抗体或人用及兽用疫苗的生产，微载体细胞培养的规模已达到6000L以上。而我国绝大多数疫苗类制药企业仍然沿用传统的转瓶（滚瓶）培养工艺。该工艺劳动强度大，细胞产量低，产品批间差异大，且容易造成污染，耗时耗力，导致我国绝大多数制药企业的生物医药产品生产成本高，产值低，无法与国外产品竞争。要提高产品竞争力，只有采用生物反应器微载体大规模培养技术。

因此，开发适合于我国生物医药领域多种动物细胞培养用的具有自主知识产权的国产微载体，具有广泛的应用前景，对促进我国生物反应器微载体大规模细胞培养技术的发展具有重要的历史意义。

利用胶原蛋白制备微载体首先是1985年由Verax公司开创的Verax系列多孔胶原微载体1，由于不能高压灭菌，只能采用γ射线灭菌，限制了Verax系列多孔胶原微载体的使用。1986年Nilsson首先报道了大孔明胶微载体的制备及在细胞培养中的应用，利用Span、甲苯和加有Tween的明胶制备大孔明胶微载体，但所用的明胶（即基质）浓度较低。使得微载体收率低，价格昂贵（每公斤超过10万元人民币）。1997年华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室张孝兵等在Nilsson的方法基础上，经过改进，使明胶浓度达到2.5-10%，制备了大孔明胶微载体（但未见产品上市）；目前市场上商品化的明胶制备的生物可降解微载体有Gultispher G 和Gultispher S，二者都具有孔隙，为多孔微载体；Cytodex3是猪明胶包被葡聚糖为材质可高压灭菌的实心微载体，适用于多种较难培养的动物细胞，但其使用前需要对细胞培养容器进行预先硅化，并且价格昂贵，每公斤3～10万元人民币。Cellagen是牛Ⅰ型胶原交联而成。2004年南京工业大学黄任远等以天然胶原蛋白为原料，采用铬、甲醛、戊二醛改性试剂及铬、戊二醛、铝-植物单宁复合改性试剂，制备动物细胞培养用微载体，并进行了CHO细胞培养研究，但载体制备规模小，适宜的细胞少（未见产品上市）；。2004年中国科学院动物研究所发明了壳聚糖-明胶实心和多孔微载体，适合于大规模生产（有专利：CN1641017A, 未见产品上市），但其是用壳聚糖酸溶液和明胶按照一定比例混合后，在加有一定Span的矿物油中制成，在戊二醛交联固定后，用甘氨酸封闭多余的醛基，再用氢氧化钠中和醋酸等工艺制成，工艺相对复杂，所用基质材料为壳聚糖和明胶，由于是两种基质，其实心微载体与传统实心微载体一样，在培养后期，细胞容易从载体上脱落，不适合于细胞在低血清和无血清培养基中长期培养。

发明内容

本发明提供了一种细胞培养用GF微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。本发明的微载体在应用时可以采用高压灭菌、使用前不需对细胞培养容器进行预先硅化、工艺简单、价格低廉、适合多种细胞培养，在培养后期，细胞不容易脱落，适宜于在低血清和无血清培养基中培养贴壁细胞。

本发明的一种细胞培养用GF微载体的制备方法，步骤如下：

（1）配制胶液：水浴中，加水使变性胶原或明胶溶胀，终浓度为5%-20%；

（2）油乳液制球：将无毒高密度油与异辛醇按适当比例混合，搅拌制成油乳液，并在搅拌状态下将胶液倒入油乳液中，形成微球；

（3）交联固定：用戊二醛交联固定；

（4）凝固：10℃以下或冰浴中静置；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物用表面活性剂进行除油；

（6）还原脱色：用B还原剂进行还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂脱水：用梯度酒精进行脱脂脱水，并进一步固定，完成细胞培养用GF微载体的制备。

进一步地，步骤（1）中所述变性胶原可以选择多种动物变性胶原，如可以为马、牛、羊、猪、兔及鱼的皮变性胶原、骨变性胶原或跟腱变性胶原；所述明胶为A型明胶和B型明胶。

进一步地，步骤（2）中所述的无毒高密度油包括矿物油、植物油或有机油；优选地，所述无毒高密度油为液体石蜡、花生油、大豆油或机油。

步骤（2）中，可依据所需载体粒径的大小，改变搅拌速度。需要的载体粒径大，则搅拌速度慢；反之，粒径小，则搅拌速度快。

进一步地，步骤（3）中，用占微球总体积1-5%的浓度为25%或50%的戊二醛进行交联固定1-12h；优选地，用占微球总体积3%的浓度为25%的戊二醛进行交联固定5-6h。此时，交联固定的效果最好。

进一步地，步骤（4）中，所述凝固为在4℃静置过夜。此时，凝固效果最佳。

进一步地，步骤（5）中，所述表面活性剂的质量百分浓度为1-5%，所述表面活性剂可选择具有除油效果的任一表面活性剂，优选为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80、TRITON-100、OP-10或其它化学去污剂。此时，除油效果最佳。

进一步地，步骤（6）中，所述还原脱色为用1-10%的硼还原剂还原脱色1-12h, 同时中和多余的戊二醛；优选用2%的B还原剂还原脱色4-6h。此时，还原脱色效果最佳。

当然，也可以选用其他具有还原脱色功能的还原剂进行还原脱色。

进一步地，所述步骤（7）之后，还包括筛分的步骤。

经实验，如未经筛分处理微载体，在应用于细胞培养时，不管微载体粒径大小，细胞均能在其上很好的生长。进行筛分操作，只是为了使培养的细胞生长周期同步。

    进一步地，所述步骤（7）之后，还包括灭菌的步骤，所述灭菌是将细胞培养用GF微载体洗涤后，用高压蒸汽灭菌或用75%酒精浸泡灭菌,或用Co60辐照灭菌。

灭菌步骤中，是用纯净水洗涤数遍后，将制备的GF微载体浸泡于pH7.0-7.4 的PBS缓冲液中，进行121℃高压蒸汽灭菌30min；或用75%酒精浸泡灭菌1h；或将微载体分装后用Co60辐照灭菌, 辐照剂量18-20KGy。

步骤（7）中，梯度酒精可以选用浓度依次为75%、85%、95%、100%的酒精，也可以选用浓度依次为70%、80%、90%、100%的酒精，都能达到很好的脱脂脱水的效果。

本发明还提供应用上述制备方法制备的细胞培养用GF微载体。

本发明提供上述细胞培养用GF微载体在贴壁培养型细胞培养中的应用。

    优选地，所述贴壁依赖型细胞培养包括贴壁依赖型动物细胞培养、人二倍体细胞培养、和皮肤细胞培养。

优选地，所述贴壁依赖型细胞在细胞培养时使用所述GF微载体的情况下，在含5-10%新生牛血清的培养基中接种细胞，在培养48～120小时后更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

在细胞培养48-120小时，微载体上面长满细胞后，就可以根据实际需要，更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒以进行病毒的培养。

在无新生牛血清或低新生牛血清培养基中继续培养时，不影响细胞的继续生长，细胞可在含1.5～2%新生牛血清的培养基中维持30天以上，这样，可降低生产企业的成本。因此，本发明的微载体适合多种细胞培养，尤其是有利于ST细胞、CHO细胞、MDCK细胞、Vero细胞、Marc145细胞、BHK21细胞、MRC-5细胞和婴儿皮肤细胞的培养。

优选地，所述应用的步骤为：将所述GF微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；更优选地，在培养48～120小时后，更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

进一步地，所述应用的步骤为：将所述GF微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度8-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；更优选地，在培养48～120小时后，更换成含2～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

现有技术中，正常细胞培养用新生牛血清量通常在8～10%，而本发明实验的结果，在本发明的细胞培养用GF微载体上培养，在新生牛血清质量能够保证和接种细胞状态良好的前提下，5～8%的血清量也能保证细胞的贴壁生长。这也是以往人们认为明胶载体会吸附血清是个缺点，在我们认为，它可能是个优点，能维持细胞在低血清状态下的生长。

在2～4%新生牛血清的低血清培养基中，细胞能贴壁生长，但在含5～10%新生牛血清的培养基中，生长效果最佳。

细胞培养液可以是DMEM、M199、 F12、MEM、D-MEM/F-12等常用培养基。

优选地，所述GF微载体的浓度为3-20g/L,所述待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cell/ml。

此时，细胞生长速度快。    

优选地，所述GF微载体与所述待培养细胞的比例为15-30个细胞/1个GF微载体。

在此条件下，细胞的增殖速度最快。

优选地，所述细胞培养为在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中进行细胞培养。

粒径在200～400μm的GF-120～GF-180微载体适合在细胞培养方瓶、转瓶或细胞工厂中使用，GF微载体的浓度为3-20g/L,以3～5g/L为最佳，所述待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cell/ml。粒径在100～200μm的GF-200～GF-240微载体适合在磁悬浮瓶和生物反应器中使用，GF微载体的浓度为3-20g/L,以5～8g/L为最佳，所述待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cell/ml。

优选地，所述微载体在细胞培养中使用时无需对细胞培养容器进行预先硅化处理。

本发明提供的一种细胞培养用GF系列实心微载体及其制备方法，是以单纯的5-20%的高浓度变性胶原或明胶为基质，以无毒高密度油（包括矿物油、植物油和有机油）和异辛醇为油相，利用微球制备技术乳化成球，在戊二醛交联后，通过硼还原剂还原脱色处理，去除戊二醛的毒性。此过程不仅中和了多余的戊二醛，还激活了载体内外相关的活性基团，提高了变性胶原的收缩温度，使其能够耐受至少5次以上121℃30min的高压蒸汽灭菌。胶原基质浓度高，在低血清培养时，似乎还能为细胞提供营养，细胞能向复层生长，生物相容性好、可以采用高压灭菌、使用前不需对细胞培养容器进行预先硅化、工艺简单、价格低廉、适合多种细胞包括较难培养的细胞如人二倍体细胞（MRC5）、狗肾细胞(MDCK)和猪睾丸细胞（ST）等的低血清培养培养），并且，在培养后期，细胞不容易脱落。

在细胞培养中，通常在培养基中加入8～10%的新生牛血清或胎牛血清提供营养和贴壁因子。用2～5%的血清含量，即为低血清培养。降低血清含量，即可降低使用者的生产成本。用GF微载体培养细胞时，由于载体与细胞的相容性好，细胞容易贴附到载体表面，故在接种细胞时，使用较低的血清浓度，也能达到较好的效果，一般可用含新生牛血清5～10%的培养基，在细胞长满微载体后，再更换成含新生牛血清2～3%的培养液，不致于导致细胞脱落，能够达到进口Cytodex系列载体的效果。对ST细胞培养的结果表明：在培养120h细胞长满GF载体后，换用含1.5～2%的新生牛血清的DMEM培养基，维持30天以上细胞未脱落，这在利用ST细胞生产猪瘟等慢病毒疫苗生产方面有重要意义。

由于制备载体的基质是变性胶原或明胶，成分单一，而且与细胞外基质完全相同，细胞与载体的结合和细胞在动物体内与组织中的细胞外基质结合一样，成紧密结合，细胞在载体表面生长后不易脱落，而且还能向复层生长【见附图6】，克服了传统的多组分基质制备的实心微载体（如壳聚糖-明胶微载体或海藻酸钠-明胶微载体）只能在培养前期支持细胞生长，到培养后期细胞易脱落，不适宜在低血清培养基中使用等缺点，使多种动物细胞（如BHK21、Vero、ST、CHO、Marc-145、MDCK等）和人二倍体细胞（如MRC5）能够在含2-10%新生牛血清的培养基中生长和进行功能表达（如生产病毒等）。这正是本发明的GF微载体能够批量生产上市，而之前有大量相关微载体的研究报道，却尚没有国产实心微载体批量生产上市的原因。

而且，变性胶原和明胶具有良好的生物相容性及降解性，已广泛应用于生物、医学和化工领域。明胶是胶原的胶解产物，变性胶原和明胶都是蛋白质大分子化合物，由18种氨基酸组成的多肽链，其化学结构与胶原基本相似，其化学活性主要表现在侧基上，如羟基、羧基、氨基、咪唑基、胍基及甲硫基等。利用醛类交联，可在微载体表面形成较高密度的交联键而固化，经硼氢化钠处理后不仅中和了戊二醛交联产生的毒性，还使活性基团活化，与细胞表面分子的粘附作用增强，细胞贴附更好。此外，由于变性胶原和明胶是两性蛋白分子，可在细胞培养过程中对细胞代谢所引起的PH改变有很好的缓冲作用。另外，变性胶原和明胶含水量高，制备的微球较聚苯乙烯微载体和甲壳质微载体的弹性好，在悬浮培养中比上述载体更耐剪切力。大量细胞培养和动物实验证明：本发明的微载体无毒性，与我国疫苗等生物制药领域常用的动物细胞（如BHK21、MDCK、Vero、ST、CHO、Mark145等）和人二倍体细胞（MRC5细胞）及婴儿皮肤细胞等有极好的生物相容性，上述细胞能够在GF微载体上良好生长【见附图】，可用于上述细胞在细胞培养方瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）、细胞工厂及大型动物细胞生物反应器中进行微载体培养。适合于应用上述细胞进行的疫苗、重组药物蛋白、抗体和细胞因子等生物制品生产及组织工程领域。

此外，由于其在使用前无需对细胞培养容器进行预先硅化处理，使用方法比进口实心微载体更简便；其变性胶原或明胶的降解产物可以被细胞直接利用，生长在变性胶原上的细胞在培养48-96h后, 不论从培养的细胞形态还是细胞功能（如产毒和分泌代谢产物）上都与进口的Cytodex相当，甚至更优，比如用GF微载体培养MDCK细胞，在细胞密度达到230-260×10^4时，接种流感病毒48h,血凝价即可达2⁸，而相同条件下，用Cytodex-1培养时，细胞密度即使达到360×10^4，血凝价也只在2⁶-2⁷。再比如用本发明的GF微载体培养ST细胞，在细胞长满载体表面后，再增殖的细胞可与载体表面的细胞相叠，形成复层生长，细胞饱满；而用Cytodex-1培养ST细胞，在细胞长满载体后，未发现细胞向复层生长的现象，显微镜下观察，细胞形态也不如用本发明培养的ST细胞饱满，培养132小时后细胞有脱落现象。。本发明的GF微载体比表面积大、机械性能稳定、带有均匀分布的活性功能基团，有利于细胞的粘附、增殖、生长与功能表达。且其制备方法简单，产率高，达到所用变性胶原或明胶重量的60%以上，生产成本相对较低，可进行大规模生产，极其有利于其在疫苗类生物制品生产和组织工程领域的广泛应用。

依据GF微载体的粒径不同，分为GF-100、GF-120、GF-150、GF-180、GF-200、GF-240、GF-300等, 其中GF-120、GF-200和GF-240的主要技术参数如表1所示。

附图说明

图1为用GF-120微载体对CHO细胞转瓶培养50小时，200倍放大效果图；

图2为用GF-140微载体对Marc-145细胞转瓶培养48小时，200倍放大效果图；

图3为用GF-120微载体对BHK21细胞转瓶培养50小时，200倍放大效果图；

图4为用GF-140微载体对MDCK细胞转瓶培养48小时，200倍放大；

图5为用GF-120微载体对ST细胞转瓶培养120小时，200倍放大效果图（相差）；

图6为用GF-120微载体对ST细胞转瓶培养144小时，200倍放大效果图；

图7为用GF-120微载体对Vero细胞转瓶培养72小时，200倍放大效果图；

图8为用GF-240微载体对Vero细胞磁悬浮瓶培养72小时,100倍放大效果图；

图9 为用未经筛分处理的GF载体对婴儿皮肤细胞磁悬浮瓶培养48小时，100倍放大效果图。

图10为未经筛分处理的GF载体对CHO细胞细胞瓶中培养50小时，100倍放大的效果图；

图11为用GF-240载体对ST细胞磁悬浮瓶培养120小时，于载体长满细胞后换用2%低血清培养液维持264小时, 100倍放大的效果图。

图12为用GF-240载体对人二倍体细胞MRC5细胞(人胚肺成纤维细胞)磁悬浮瓶培养72小时，100倍放大的效果图。

图13为用GF-240载体对Marc-145细胞5L生物反应器,5g/L培养72小时，100倍放大的效果图。

图14 为用GF-240载体对ST细胞5L生物反应器,3g/L培养72小时，100倍放大的效果图。

图15为用GF-200载体对Vero细胞5L生物反应器,3g/L培养96小时，100倍放大的效果图。

图16为用GF-240载体对Marc-145细胞3L细胞培养转瓶，A、B、C分别为用3%、5%、8%新生牛血清-DMEM高糖培养基，3g/L 培养24小时，100倍放大的效果图。

图17为用GF-240载体对Marc-145细胞3L细胞培养转瓶，A、B、C分别为用3%、5%、8%新生牛血清，3g/L培养48小时，100倍放大的效果图。

图18为用GF-240载体对Marc-145细胞3L细胞培养转瓶，A、B、C分别为用3%、5%、8%新生牛血清，3g/L培养72小时，100倍放大的效果图（相差）。

图19为用GF-240载体对Marc-145细胞3L细胞培养转瓶，A、B、C分别为用3%、5%、8%新生牛血清，3g/L培养96小时，100倍放大的效果图（相差）。

图20为用Cytodex-1载体【GE公司】对ST细胞在5L反应器中，10%新生牛血清，3g/L培养96小时、120小时和132小时，100倍放大的效果图（相差）。

图21为用Cytodex-3载体【GE公司】对Marc-145细胞在250ml磁悬浮瓶中，10%新生牛血清，3g/L培养72小时，100倍放大的效果图（相差）。

具体实施方式

下述实施实例中所用方法，如无特别说明，均为常规方法，所述百分比浓度均为质量百分比浓度。

变性胶原（小牛跟腱变性胶原蛋白、牛皮变性胶原蛋白、牛骨变性胶原蛋白）由甘肃省甘南州高原生物工程有限责任公司提供，牛羊皮、骨明胶购自甘肃阿敏清真生物明胶有限公司，猪皮、骨明胶购自山东莱阳双双化工有限公司。

实施例1：一种动物细胞培养用GF-120微载体的制备方法

以小牛跟腱变性胶原蛋白为基质，制备动物细胞培养用GF-120微载体的过程包括如下步骤：

（1）配制变性胶原液：取小牛跟腱变性胶原蛋白1kg溶解在含0.2%冰醋酸的水溶液中，45-55℃溶胀3h以上，制成均匀的胶液，变性胶原的终浓度达到5%-10%（质量体积比）；

（2）油乳液制球：将无毒高密度花生油与异辛醇按10:1（体积比 V/V）比例混合，在800-1000转/分钟转速下搅拌10min制成油乳液，在搅拌状态下将变性胶原液倒入油乳液中，形成微球。其中，变性胶原液和油乳液的比例为1:2-1:3（体积比V/V）。

（3）交联固定：加占微球总体积1.5%的浓度为25%的戊二醛交联固定6h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含5%的吐温-20的溶液中浸泡、洗涤至无油；

（6）还原脱色：用5%硼氢化钠作用4h，进行还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精中浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用100目和120目筛网进行筛分，取120目筛网中的变性胶原微载体，即得到本发明的GF-120实心微载体，为淡黄色透明微球。

使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤8）筛分的变性胶原微载体以1：100（质量体积比）的比例用纯净水洗涤10遍以上，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

灭菌前使用的PBS液可以是没经过灭菌的，也不需要用无血清的细胞培养液洗涤，否则会增加使用者的成本。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到细胞培养容器（细胞瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）或细胞工厂等）中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续步骤。

实施例2：一种动物细胞培养用GF-140微载体的制备方法

以牛皮变性胶原蛋白为基质，制备动物细胞培养用GF-140微载体的过程包括如下步骤：

（1）配制变性胶原液：取牛皮变性胶原蛋白0.5kg，溶解在含0.2%冰醋酸的水溶液中，35-45℃溶胀3h以上，制成均匀的胶液，使变性胶原的终浓度达到5%-8%（质量体积比）；

（2）油乳液制球：将无毒高密度花生油与异辛醇按8:1（体积比V/V）比例混合，在900-1100转/分钟的转速下搅拌10min制成油乳液，在搅拌状态下将变性胶原液倒入油乳液中，形成微球，变性胶原液和油乳液的体积比（V/V）为1:2-1:3；

（3）交联固定：加占微球总体积2%的浓度为25%戊二醛交联固定5h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含5%吐温-40的溶液中浸泡、洗涤至无油；

（6）还原脱色：用10%硼氢化钠作用0.5h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精中浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用120目和140目筛网进行筛分，取140目筛网中的变性胶原微载体；即为GF-140实心微载体，为淡黄色透明微球。

使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤8）筛分的变性胶原微载体以1：100（质量体积比）的比例用纯净水洗涤10遍以上，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

灭菌前使用的PBS液可以是没经过灭菌的，也不需要用无血清的细胞培养液洗涤，否则会增加使用者的成本。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到细胞培养容器（细胞瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）或细胞工厂等）中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续步骤。

实施例3：一种动物细胞培养用GF-160微载体的制备方法

以牛骨变性胶原蛋白为基质，制备动物细胞培养用GF-160微载体的过程包括如下步骤：

（1）配制变性胶原液：取牛骨变性胶原蛋白1kg溶解在含0.2%冰醋酸的水溶液中，35-45℃溶胀3h以上，制成均匀的胶液，变性胶原的终浓度达到8%-10%（质量体积比）；

（2）油乳液制球：将无毒高密度花生油与异辛醇按7:1（体积比V/V）比例混合，在1000-1200转/分钟转速下搅拌10min，制成油乳液，在搅拌状态下将变性胶原液倒入油乳液中，形成微球。其中，变性胶原液和油乳液的体积比（V/V）为1:2-1:3；

（3）交联固定：加占微球总体积4%的浓度为25%戊二醛交联固定3h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含3%OP-10的溶液中浸泡、洗涤至无油；

（6）还原脱色：用1%硼氢化钠作用12h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用140目和160目筛网进行筛分，取160目筛网中的变性胶原微载体，即得GF-160实心微载体，为淡黄色透明微球。

使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤8）筛分的变性胶原微载体以1：100（质量体积比）的比例用纯净水洗涤10遍以上，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

灭菌前使用的PBS液可以是没经过灭菌的，也不需要用无血清的细胞培养液洗涤，否则会增加使用者的成本。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到细胞培养容器（细胞瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）或细胞工厂等）中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续步骤。

实施例4：一种动物细胞培养用GF-180微载体的制备方法

以牛、羊骨明胶为基质，制备动物细胞培养用GF-180微载体的过程包括如下步骤：

（1） 配制明胶液：取1kg干燥牛、羊骨明胶, 加入10kg纯净水，在45-70℃水浴中溶胀3h以上，制成终浓度10%（质量体积比）均匀的明胶液。

（2）油乳液制球：将无毒高密度液体石蜡与异辛醇按9:1（体积比V/V）比例混合，在1000-1500转/分钟转速下搅拌10min，制成油乳液，在搅拌状态下将明胶液倒入油乳液中，形成微球，其中，明胶液和油乳液的体积比为1:2-1:3。

（3）交联固定：加占微球总体积2%的浓度为25%戊二醛交联固定8h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含3%吐温-80的溶液中浸泡、洗涤至无油；

（6）还原脱色：用1%硼氢化钠作用10h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%、100%的梯度酒精浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用160目和180目筛网进行筛分，取180目筛网中的明胶微载体；即得到GF-180实心微载体，为淡黄色透明微球。

使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤8）筛分的变性胶原微载体以1：100（质量体积比）的比例用纯净水洗涤10遍以上，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

灭菌前使用的PBS液可以是没经过灭菌的，也不需要用无血清的细胞培养液洗涤，否则会增加使用者的成本。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到细胞培养容器（细胞瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）或细胞工厂等）中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续步骤。

实施例5：一种动物细胞培养用GF-200微载体的制备方法

以牛、羊皮明胶为基质，制备动物细胞培养用GF-200微载体的过程包括如下步骤：

（1）配制明胶液：取1kg干燥牛羊皮明胶, 加入10kg纯净水，在45-60℃水浴中溶胀3h以上，制成均匀的胶液，终浓度在10-11%（质量体积比）；

（2）油乳液制球：将无毒高密度大豆油与异辛醇按体积比（V/V）9:1的比例混合，在1500-1800转/分钟转速下搅拌10min，制成油乳液，在搅拌状态下将明胶液倒入油乳液中，形成微球，其中胶液和油乳液的体积比（V/V）为1:2-1:3；

（3）交联固定：加占微球总体积4%的浓度为25%戊二醛交联固定6h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含3%吐温-80的溶液中浸泡、洗涤至无油；

（6）还原脱色：用2%硼氢化钠作用8-10h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用180目和200目筛网进行筛分，取200目筛网中的明胶微载体，即可得到GF-200实心微载体，为淡黄色透明微球。

使用时，首先进行灭菌处理：将经步骤8）筛分的变性胶原微载体以1：100（质量体积比）的比例用纯净水洗涤10遍以上，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

灭菌前使用的PBS液可以是没经过灭菌的，也不需要用无血清的细胞培养液洗涤，否则会增加使用者的成本。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到细胞培养容器（细胞瓶、磁悬浮瓶、转瓶（滚瓶）或细胞工厂等）中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续步骤。

实施例6：一种动物细胞培养用GF-240微载体的制备方法

以猪皮明胶为基质，制备动物细胞培养用GF-240微载体的过程包括如下步骤：

（1）配制明胶液：取1kg干燥猪皮明胶, 加入10kg纯净水，在45-60℃水浴中溶胀3h以上，制成终浓度为10%（质量体积比）的均匀胶液；

（2）油乳液制球：将无毒高密度大豆油与异辛醇按6:1（体积比 V/V）比例混合，在1500-2500转/分钟转速下搅拌10min，制成油乳液，在搅拌状态下将明胶液倒入油乳液中，形成微球，明胶液和油乳液的体积比为1:2-1:3；

（3）交联固定：加占微球总体积4%的浓度为25%戊二醛交联固定6h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，将固形物在含3%吐温-20的溶液中浸泡1h, 搅拌、再沉淀，弃上清液后，固形物用热水洗涤至无油；

（6）还原脱色：用1%硼氢化钠作用12h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精中浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用200目和240目筛网进行筛分，取240目筛网中的明胶微载体,即得到GF-240实心微载体，为淡黄色透明微球。

（9）灭菌：使用时，首先将经步骤（8）筛分所得变性胶原微载体以质量体积比(W/V)为1：100的比例用纯净水洗涤至少10遍，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

之后，用pH7.0-7.4的无菌 PBS缓冲液和细胞培养用培养液各洗涤1-2遍，按照3-20g微载体/L的用量，与待培养细胞一起接种到磁悬浮瓶或生物反应器中，加入培养基，进行微载体细胞培养。

在生物反应器中使用时，也可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与反应器一起高压灭菌，再进行后续细胞接种步骤。

使用方法：可根据需要，以3-20g/L的载体量计算出总载体量后，称取步骤8）得到的GF-240实心微载体，用步骤9)中所述的方法洗涤、灭菌。然后接种，培养。

例如：使用7.5L NBS生物反应器，其有效培养体积为5L，以5g/L载体量培养Vero细胞，可取25g GF-240实心微载体，用2500ml纯净水洗涤10遍以上，用pH7.0-7.4的 PBS缓冲液浸泡3h，洗涤2-3遍，然后将载体移入生物反应器中，121℃高压蒸汽灭菌30min。再用pH7.0-7.4的无菌 PBS液洗涤1遍，无血清细胞培养基洗涤1遍，即可按3-5×10⁵cell/ml的细胞密度接入细胞，加入培养基，进行培养。

实施例7. 一种动物细胞培养用GF-300微载体的制备方法

以猪骨明胶为基质，制备动物细胞培养用GF-300微载体的过程包括如下步骤： 

（1） 配制明胶液：取1kg干燥猪骨明胶, 加入8kg纯净水，在55-70℃水浴中溶胀3h以上，制成终浓度为12.5%（质量比）的均匀胶液； 

（2）油乳液制球：将无毒高密度机油与异辛醇按1:1（质量体积比W/V）比例混合，在1800-2200转/分钟转速下搅拌10min，制成油乳液，在搅拌状态下将明胶液倒入油乳液中，形成微球，明胶液和油乳液的体积比（V/V）为1:2-1:3；

（3）交联固定：加占微球总体积4%的浓度为25%戊二醛交联固定6h；

（4）凝固：冰浴中静置过夜；

（5）除油：除去上清油乳液，固形物在含3%吐温-40的溶液中浸泡1h, 搅拌、再沉淀，弃上清液后，固形物用热水洗涤至无油；

（6）还原脱色：用2%硼氢化钠作用8h, 还原脱色，并中和多余的戊二醛；

（7）脱脂、脱水：将步骤6）处理的固形物分别在70%、80%、90%及100%的梯度酒精中浸泡2h, 脱脂、脱水，并进一步固定；

（8）筛分：用240目和300目筛网进行筛分，取300目筛网中的明胶微载体,即得到GF-300实心微载体，为淡黄色透明微球。

（9）灭菌：将经步骤（8）筛分所得变性胶原微载体以质量体积比(W/V)为1：100的比例用纯净水洗涤至少10遍，在pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍，121℃，高压灭菌30min。

之后，分别用pH值7.0-7.4的无菌PBS液和无血清的细胞培养液洗涤1-2遍，即可与待培养细胞一起接种到磁悬浮瓶中进行微载体细胞培养。

如要在生物反应器器中使用时，可将经pH7.0-7.4的 PBS缓冲液中浸泡3h以上，洗涤2-3遍后的微载体移入反应器中，与生物反应器一起灭菌。再进行后续步骤。（湿球粒径在50～95μm的微载体不适宜于在20转每分钟以下转速的转瓶和静止状态的细胞工厂中使用，因为粒径太小，载体容易贴壁。湿球粒径即微载体浸泡在液体培养基中的直径）

使用方法：可根据需要，以3-20g/L的载体量计算出总载体量后，称取步骤8）得到的GF-300实心微载体，用步骤9)中所述的方法洗涤、灭菌。然后接种，培养。

例如：使用7.5L NBS生物反应器，其有效培养体积为5L，以6g/L载体量培养Vero细胞，可取30g GF-300实心微载体，用3000ml纯净水洗涤10遍以上，用pH7.0-7.4的 PBS缓冲液浸泡3h，洗涤2-3遍，然后将载体移入生物反应器中，121℃高压蒸汽灭菌30min。再用pH7.0-7.4的无菌 PBS液洗涤1遍，无血清细胞培养基洗涤1遍，即可按3-5×10⁵cell/ml的细胞密度接入细胞，进行培养。

实施例8：本发明的细胞培养用GF微载体在动物细胞转瓶培养中的应用及效果

一、以15L转瓶、GF-120微载体培养CHO细胞为例：

在15L转瓶中，以3-5g/L的微载体密度和3-5×10⁵cell/ml的细胞密度接种CHO细胞到含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的F12培养液【购自GIBCO公司】中,每瓶培养体积为1.5L, 微载体量4.5-7.5g, 细胞接种量2.7～4.5×10⁸个细胞。轻轻混匀细胞和微载体，封口，放置在转瓶机上，37℃恒温培养，前3-6h采用8-10转/小时的旋转培养，一般20-60分钟细胞就能贴附到载体上，并且细胞在微载体上的生长和增殖与在转瓶中培养一样，不受影响，多余的细胞也可在转瓶壁上生长。在培养6h以后，转速可调整到18～20转/小时。如以3g/L的微载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养48h, 细胞就可长满微载体，见附图1；如以3g/L的微载体密度，3×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养96h, 细胞可长满微载体；如3g/L的微载体密度，以4×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养72h, 细胞就可长满微载体；只是由于培养细胞总量是正常转瓶培养的3到5倍，故48h之后，每12h需要半量更换营养液一次。

因此，在研究与生产应用中，若需要为下一级放大培养提供种子细胞时，可通过在细胞瓶或转瓶中加入一定量的GF微载体，增加细胞的培养表面积，即可用一个细胞瓶收获2-3倍的细胞量，或在一个转瓶中收获3-5倍于无载体状态下培养的细胞量。

二、以15L转瓶、GF-140微载体培养Marc-145细胞，与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为GF-140微载体，细胞为Marc-145细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以3g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养Marc-145细胞 48小时时的效果见图2。

三、以15L转瓶、GF-120微载体培养BHK21细胞，与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为GF-120微载体，细胞为BHK21细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以4.5g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养至 50小时时的效果见图3。

四、以15L转瓶、GF-140微载体培养MDCK细胞，与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为GF-140微载体，细胞为MDCK细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以4.5g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养至48小时时的效果见图4。

五、以15L转瓶、GF-120微载体培养ST细胞，与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：细胞为ST细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以4.5g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种至120小时时的效果见图5。图5为使用相差显微镜进行观察的图片。培养至144小时时的效果见图6。可见细胞在载体表面呈复层生长。

六、以15L转瓶、GF-120微载体培养Vero细胞，与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为GF-120微载体，细胞为Vero细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以4.5g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，至培养72小时时的效果见图7。

实施例9：本发明的细胞培养用GF微载体在磁悬浮瓶中培养动物细胞的应用及效果

一、以250mL磁悬浮瓶、GF-240微载体培养Vero细胞为例：

在250mL磁悬浮瓶中，以3-5g/L的微载体密度和2-5×10⁵cell/ml的细胞密度接种Vero细胞到含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司DMEM高糖培养基，】中,每瓶初始培养体积为100mL, 微载体量0.6-1g, 细胞接种量3.6-6×10⁷个细胞。轻轻混匀细胞和微载体，封口，放置在磁力搅拌器上，37℃恒温培养，前3-6h采用20～30转/分钟的搅拌速度，一般1～3小时能贴附到载体上。在培养6h以后，转速可调整到40～50转/分钟。培养12h后，补充新鲜培养液到200ml,继续培养至24h后，静置10分钟，弃去100ml上清液，补加新鲜培养液至到最大培养体积250ml,继续培养。以后每12h半量更换培养基一次。如以5g/L载体量，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养至96h, 细胞就可长满微载体；如以5g/L载体量，3×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养至120h, 细胞可长满微载体。以3g/L的载体密度，3×10⁵cell/ml的细胞密度接种，至培养72小时时的效果见附图8。

二、以250mL磁悬浮瓶、未经筛分处理的GF微载体培养婴儿皮肤细胞：

与本实施例中的第一部分实验实验条件不同的是：微载体为未经筛分处理的GF微载体，细胞为婴儿皮肤细胞（甘肃省动物细胞工程中心提供），培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件包括载体量均相同。以3g/L载体密度, 3×10⁵cell/ml的细胞密度接种，至培养48小时时的效果见图9。

三、以250ml磁悬浮瓶、未经筛分处理的GF微载体培养CHO细胞：

与本实施例中的第一部分实验中的实验条件不同的是：微载体为未经筛分处理的GF微载体，细胞为CHO细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的D-MEM/F-12培养液【购自GIBCO公司】, 以3g/L的载体密度，5×10⁵cell/ml的细胞密度接种,至培养50小时时的效果见图10。（也可用纯粹的F12培养基，只是成本相对较高）,其余实验条件均相同。由图10可知，不管粒径大小，细胞均能良好生长。只是为了使培养细胞的生长周期同步，而对载体进行筛分。

四、以250ml磁悬浮瓶、GF-240微载体培养ST细胞：

与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：细胞为ST细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以3～5×10⁵细胞密度， 3～5g/L载体密度接种到含8～10%新生牛血清的DMEM培养基中培养120h，可长满载体。之后换用低血清维持液，可在含1.5～2%的新生牛血清DMEM培养基中维持30天以上不脱落；若更换成不含新生牛血清的DMEM培养液，维持至10日时仍未脱落。这在猪瘟病毒培养生产猪瘟疫苗中有重要意义。

其中，以4.5g/L的载体密度，4×10⁵cell/ml的细胞密度接种,在含10%新生牛血清的DMEM高糖培养基中培养120h细胞长满载体，然后更换成含2%新生牛血清（低血清）的DMEM培养液，每3天换一次培养液，维持至264小时时的效果见图11，可见细胞牢固地生长在微载体上，没有细胞脱落现象发生。继续培养至30天，仍未见脱落。若接种培养120h后更换成不含新生牛血清的DMEM培养液，维持至10日时仍未脱落。

五、以250ml磁悬浮瓶、GF-240微载体培养人二倍体细胞——MRC5（人胚肺成纤维细胞）：

与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：细胞为MRC5细胞，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。以4.5g/L的载体密度，4×10⁵cell/ml的细胞密度接种,培养MRC5细胞至72小时时的效果见图12。

实施例10：本发明的细胞培养用GF微载体在动物细胞生物反应器中的应用及效果

一、 以5L NBS生物反应器、GF-240微载体培养Marc-145细胞为例：

在5LNBS生物反应器中，以3.5L培养体积，5g/L的微载体密度和3～5×10⁵cell/ml的细胞接种密度计算载体量和细胞量，将10.5g GF-240载体洗涤后浸泡在1500mlpH7.2～7.4的PBS液中，与5L NBS生物反应器的罐体一起高压灭菌，然后用pH7.2～7.4无菌PBS洗涤1遍、不含血清的DMEM培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基，】洗涤1遍，启动搅拌桨，在10转每分钟的搅拌速度下，无菌接入6～7×10⁸个Marc-145细胞，补足DMEM高糖培养液和新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】,使初始培养体积达到2.5L,新生牛血清的含量达到培养液总量的10%。设定温度37℃，pH7.2,DO 50%。在培养时，前3-6h采用10转每分钟的搅拌速度，在培养6h以后，转速可调整到20转每分钟（以微载体能悬浮的最低转速为宜）。一般1～3小时细胞能贴附到载体上。培养12h后，补充新鲜培养液到3.5L,提高转速到25～30转每分钟,继续培养至48h后（培养基中葡萄糖含量下降一半时），停止搅拌，静置10分钟，弃去2～2.5L上清液，补加新鲜培养液至3.5L,继续培养，以后每12h半量更换培养基一次。如以5×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养至72h, 细胞就可长满微载体,见效果图13；如以3～4×10⁵cell/ml的细胞密度接种，培养96至120h, 细胞可长满微载体。

二、 以5L NBS生物反应器、GF-240微载体培养ST细胞, 与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：GF-240微载体的载体量为3g/L,细胞为ST细胞，细胞接种密度为3×10⁵cell/ml，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司,DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。培养72小时时的效果图14。

三、 以5L NBS生物反应器、GF-200微载体培养Vero细胞, 与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为GF-200微载体，载体量为3g/L,细胞为Vero细胞，细胞接种密度为3×10⁵cell/ml，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司,DMEM高糖培养基】,其余实验条件均相同。培养96小时时的效果图15。

四、以5L NBS生物反应器、Cytodex-1微载体【购自GE公司】培养ST细胞：

与本实施例中的第一部分实验的实验条件不同的是：载体为Cytodex-1微载体，载体量为3g/L,细胞为ST细胞，细胞接种密度为3×10⁵cell/ml，培养基为含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM培养液【购自GIBCO公司,DMEM高糖培养基】,培养罐的玻璃容器预先进行了硅化处理，其余实验条件均相同。培养96小时、120小时和132小时的效果图20（A、B、C）。可见，在培养132h后细胞没有出现复层生长的现象，部分载体上细胞开始脱落。

实施例11：本发明的细胞培养用GF微载体在不同血清含量的培养基中培养细胞的应用及效果

以3L转瓶、GF-240微载体培养Marc145细胞为例：

在3L转瓶中，以3g/L的微载体密度和3×10⁵cell/ml的细胞密度接种Marc145细胞【北京协和医科大细胞中心】分别到含3%、5%、8%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM高糖培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】中,每瓶培养体积为300ml, 微载体量0.9g, 细胞接种总量9×10⁷个细胞。轻轻混匀细胞和微载体，封口，放置在转瓶机上，37℃恒温培养，调转瓶机转速到21转/小时，每24h取样并半量更换培养液。

实验结果表明：在含3%（A）、5%(B)、8%(C)新生牛血清的DMEM高糖培养液中培养的Marc145细胞均能在GF240微载体上良好贴壁、生长，只是随着血清量的增加，贴壁的细胞数量也在增加（见图16（A、B、C）培养24小时）。而24小时前在载体上贴附的细胞数越多，细胞增殖越快，可见血清含量越高，细胞越容易贴壁。【见图17（A、B、C）培养48小时、图18（A、B、C）培养72小时，图19（A、B、C）培养96小时】。 与含10%新生牛血清DMEM高糖培养液中培养的Marc145细胞相比，细胞增殖相对较慢。

实施例12：对照试验

Cytodex-3 在250ml磁悬浮瓶中，以3g/L的微载体密度和3×10⁵cell/ml的细胞密度接种Marc145细胞到含10%新生牛血清【购自兰州民海生物，优级新生牛血清，批号20120716】的DMEM高糖培养液【购自GIBCO公司，DMEM高糖培养基】中培养72h的效果图（见图21），做为对照试验参考。其余实验条件都与实施例9中相同。

从附图可看出用本发明制备的GF微载体培养细胞的效果与Cytodex-3相当。

虽然已经参照本发明的某些实施例对本发明进行了详细的说明，但是在不偏离本发明范围的情况下可以对这些实施例进行修改或改变。所附权利要求的精神和范围不应该局限于在此所包含的优选实施例的说明，而是涵盖了落入权利要求的字面或等同含义内的所有实施例。

Claims (10)

1.细胞培养用GF微载体在贴壁依赖型细胞培养中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述贴壁依赖型细胞培养包括贴壁依赖型动物细胞培养、人二倍体细胞培养和皮肤细胞培养。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述贴壁依赖型细胞在细胞培养时使用所述GF微载体的情况下，在含5-10%新生牛血清的培养基中接种细胞，在培养48～120小时后更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述应用的步骤为：将所述GF微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度5-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；优选地，在培养48～120小时后，更换成含0～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用的步骤为：将所述GF微载体灭菌后，与待培养细胞一起接种至含有质量百分浓度8-10%新生牛血清的细胞培养液中，进行细胞培养；优选地，在培养48～120小时后，更换成含2～5%新生牛血清的培养基继续培养或接种病毒。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述GF微载体的浓度为3-20g/L,所述待培养细胞的接种密度为3-5×10⁵cell/ml。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述GF微载体与所述待培养细胞的比例为15-30个细胞/1个GF微载体。

8.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述细胞培养为在细胞培养方瓶、转瓶、磁悬浮瓶、细胞工厂或生物反应器中进行细胞培养。

9.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述细胞为ST细胞、CHO细胞、MDCK细胞、Vero细胞、Marc145细胞、BHK21细胞、MRC-5细胞和婴儿皮肤细胞。

10.根据权利要求1-9任一所述的应用，其特征在于：所述微载体在细胞培养中使用时无需对细胞培养容器进行预先硅化处理。

Images