CN105597095A - 一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法 - Google Patents

一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，包括以下步骤：S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备BAC-HSV-△UL5质粒；S2、制备表达UL5蛋白的Vero细胞；S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞；S4、制备病毒悬液；S5、将S4制备的病毒悬液添加到S3中应用微载体培养的培养基中；S6、收集培养液上清，过滤，得病毒液；S7、病毒液加入冻干保护剂，制成疫苗。本发明提供的方法可以实现工业大规模生产高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗，同时，本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答，降低疱疹病毒对人体的感染。

Description

一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法。
背景技术
单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的常见病原体，HSV- 1最常见的感染部位是口腔和唇，HSV- 2主要通过性传播。美国每年有生殖器疱疹5万多例，70多万孕妇为预防胎儿经产道感染HSV而被迫施行剖宫产分娩。据WHO估计，每年生殖器疱疹的新发病例约2000万。临床上80%HSV感染者表现为无症状感染或症状未被识别，这是造成HSV感染流行的重要因素。
尽管现有的抗病毒药物应用能缩短生殖器疱疹感染的病程，并且其治疗复发性感染具有一定的效果，但这些抗病毒药物不能有效预防疱疹病毒原发感染以及控制疱疹病毒潜伏感染和复发性感染。研制和接种HSV疫苗是预防该病毒感染的理想方法。
动物实验的结果显示，HSV疫苗能预防病毒原发感染，并能有效地控制复发性生殖器疱疹感染。目前HSV疫苗的研制日益受到人们的重视，研究较多的HSV疫苗主要有灭活病毒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗、复制受限疫苗、活载体疫苗以及DNA疫苗等。
早期的灭活病毒疫苗是利用加热、化学处理、紫外线照射等方法将接种在鸡胚中的HSV病毒灭活制备疫苗。现在的灭活疫苗是将在细胞中培养的病毒灭活并经过一系列的纯化过程制成的。但灭活疫苗存在免疫原性弱、不能诱导机体产生广泛持久的免疫反应、不能确定是否所有病毒均被灭活、裂解的DNA片段潜在致癌的可能性、生产费用高等缺点。
近年来，HSV减毒活疫苗的研制主要集中在特异性地造成HSV病毒基因缺失某一区段，使HSV的神经毒性减弱，建立潜伏感染的能力降低，DNA复制障碍等，同时保持病毒的增殖能力和免疫原性这一目标上。但有报道指减毒活疫苗隐患较多，一方面，重组的HSV病毒经过反复的细胞培养后，仍然不能获得稳定的减毒株，减毒活疫苗可能重新获得病毒毒性；另一方面，减毒的病毒可能会潜伏于病人体内，有可能会与感染的HSV野生病毒株重组，重新获得病毒毒性。此外，某些HSV基因也存在致癌的潜在可能。新型DNA疫苗虽能同时诱导体液和细胞免疫，但是其转染效率较低，经粘膜免疫诱导有效的粘膜免疫应答能力更低。而在单纯疱疹病毒的免疫应答过程中，细胞免疫和粘膜免疫发挥着重要的作用，由于上述现有的几类疫苗均不能有效诱导细胞免疫和粘膜免疫应答，因此，到目前为止，尚无可以在临床上应用的单纯疱疹病毒疫苗上市，单纯疱疹病毒疫苗基本上都处于临床前或临床研究阶段。基因缺陷减毒疫苗是一种利用基因技术方法制备得到的疫苗，结合了减毒活疫苗以及灭活疫苗的优点。制备方法是将病毒复制必需的基因部分去除后，缺陷性病毒疫苗在经过遗传改造过的细胞株里生长，以构成性地表达缺失基因的病毒产物。子代病毒缺乏必需基因产物，因而没有传染性。研究表明，在动物实验中，这种疫苗具有抗HSV原发感染作用。
传统的细胞培养生产病毒疫苗，产量低，纯度不高。微载体为单层贴壁细胞的生长繁殖提供了一个大的表面区域，为细胞生长提供了一个匀质的悬浮培养系统。反应器微载体培养系统具有很大的优势：1）比表面积大，1g微载体提供的表面积约等于15个T75规格的细胞培养瓶提供的表面积，较大的比表面积可有效的节省空间和培养基以及昂贵的添加剂如血清、生长因子等的成本，提高了培养基的利用率和单位体积细胞的产率；2）有利于反应器中高效的气液传递，有效的维持细胞生长的关键物理、化学和生物环境；3）反应器微载体培养系统可用于调整和检测细胞培养所需的pH、pO2、剪切力水平、搅拌和营养成分，因此可实现更严格的调整细胞增殖、分化等不同的生物过程，批次间具有较高的重现性；4）微载体密度和体积远大于细胞，产物与细胞可方便的分离，换液简单，除了作为锚地依赖型细胞增殖的基质外，微载体也用来提供分化和未分化细胞的放大培养。贴壁细胞的微载体培养系统被认为是今后对抗传染性疾病大流行的一种关键技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法。本发明提供的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法可以大量制备高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗，可以实现工业大规模生产疱疹病毒疫苗，同时，本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答，降低疱疹病毒对人体的感染。
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失质粒，即BAC-HSV-△UL5质粒；S2、构建pcDNA3.1-UL5真核表达质粒并转染到Vero细胞，使Vero细胞表达UL5蛋白，制备表达UL5蛋白的Vero细胞；S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞；S4、将S1所述的BAC-HSV-△UL5质粒转染至不加微载体常规培养的表达UL5蛋白的Vero细胞中，3-5天后观察到细胞有病变并且出现空斑，再收集细胞反复冻融获得病毒悬液；S5、将S4收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到S3中微载体培养的表达UL5蛋白的Vero细胞培养基中；S6、收集S5中的培养液上清，过滤，得病毒液；S6、病毒加入冻干保护剂，制成疫苗；
所述单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因敲除制备BAC-HSV-△UL5质粒的方法包括以下步骤：1）制备UL5同源重组片段UL5-Kam-sacB；2）将UL5-Kam-sacB基因片段转染至含有BAC-HSV-1质粒的大肠杆菌中，经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了UL5-Kam-sacB基因片段的大肠杆菌；3）鉴定UL5成功敲除的菌落，提取BAC-HSV-△UL5质粒。
优选地，所述的UL5同源重组片段的制备方法包括以下步骤：1）以抗卡那霉素基因Kam-sacB为模板，通过PCR扩增制备UL5C-Kam-sacB片段，所述PCR扩增的引物包括上游引物CBUL5，其序列为5’-CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA-3’（SEQ ID NO.1）和下游引物UL5ab2，其序列为5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3'（SEQ ID NO.2）；2）以UL5C-Kam-sacB片段为模板，通过PCR扩增制备UL5同源重组片段，所述PCR扩增的引物包括上游引物UL5ab1，其序列为5'-GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC-3'（SEQ ID NO.3）和下游引物UL5ab2，其序列为5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3'（SEQ ID NO.2）。
优选地，所述的抗卡那霉素基因Kam-sacB是以 Kam-sacB全片段为模板，通过PCR扩增获得，所述PCR扩增的引物包括上游引物Kam-sacB sense，其序列为 5'-CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAA-3'（SEQ ID NO.4）和下游引物Kam-sacBantisense，其序列为5' -GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG -3'（SEQ ID NO.5）。
优选地，所述的pcDNA3.1-UL5真核表达质粒载体的构建包括以下步骤：1）以BAC-HSV-1质粒为模板，通过PCR扩增UL5基因片段，所述PCR扩增引物包括上游引物为UL5_F，其序列为5'-AATTGGATCCGAGCGTGGT-GCGGTCATG -3’（SEQ ID NO.6）和下游引物UL5_R，其序列为5’-AAGCTCGAGAGGGGACG-GCGGGTTAATAG -3’（SEQ ID NO.7）；2）用BamHI，Xhol双酶切pcDNA3.1和扩增的UL5基因片段，再用T4连接酶连接pcDNA3.1和UL5基因片段的酶切产物得到pcDNA3.1-UL5真核表达质粒。
优选地，所述的微载体扩增培养表达UL5蛋白的Vero细胞的方法包括以下步骤：1）微载体的预处理，将微载体加入已用二甲基二氯硅烷硅化的转瓶或瓶子内，加入PBS水化，PBS与微载体的比例为80~150g/mL，2-4h后弃去PBS，加入新的PBS继续水化3~10h，弃去PBS并用新的PBS洗涤一次；加入新的PBS后高压蒸汽灭菌，灭菌完成冷却后弃去PBS；2）用2-5mL无血清培养液洗涤一次后弃去培养基，重新加入新的无血清培养液置4℃冰箱平衡过夜；3）将表达UL5蛋白的Vero细胞按1.5×105-2.5×105cells/mL接种于25 cm2组织培养瓶和2000mL转瓶，加入含10% (v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养液，置37℃培养箱或转速为 20-30 r/min 的转床中培养，待细胞形成致密单层后用0.20-0.25% (w/v) 胰蛋白酶消化，进行细胞传代或作为微载体固定化培养的种子细胞；4）Vero细胞的微载体固定化培养，微载体加入量为3~4g/L，接种步骤3）所述的种子细胞2.0×105-3.0×105cells/mL，置于摇床中培养，培养条件为：转速42-48r/min，温度37~38℃，溶解氧浓度为40~60%，PH维持在7.1~7.2。
优选地，所述的微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和Biosilon微载体中的一种或多种。
优选地，所述步骤S6中病毒液收获时间为种毒后第2、4、6、8、10、12天。
优选地，所述步骤S6中将培养液上清的病毒滴度调整为1×107IU/mL后采用0.45-1.0微米的滤膜过滤澄清。
优选地，所述步骤S7中疫苗的制备方法包括以下步骤：往所述S6中过滤后的病毒液添加2％（W/W）谷氨酸钠，2％（W/W）甘露醇，3％（W/W）右旋糖酐， 0.2％（W/W）盐酸精氨酸，1％（W/W）尿素和0.2％（W/W）人血球白蛋白，制成单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗冻干成品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法。本发明提供的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法可以大量制备高质量的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗，可以实现工业大规模生产疱疹病毒疫苗，同时，本发明制备的疫苗可以安全有效的激活人体的免疫应答，降低疱疹病毒对人体的感染。
附图说明
图1 Kam-sacB基因的PCR扩增产物鉴定电泳图；其中，M指DNA marker，2、3指Kam-sacB基因目标条带。
图2 UL5C-Kam-sacB基因和UL5-Kam-sacB基因的PCR扩增产物鉴定电泳图；其中，M指DNA marker，2指UL5-Kam-sacB基因目标条带，4指UL5C-Kam-sacB基因目标条带。
图3 UL5敲除鉴定电泳图；其中，M指DNA marker，1指病毒的γ3451基因目标条带，2为Kam-sacB基因目标条带，3为UL5基因检测电泳道，无条带。
图4 UL5基因PCR的扩增产物鉴定电泳图；其中，M指DNA marker，1指UL5基因目标条带。
图5 UL5蛋白Western Blot鉴定图；其中，1指阴性对照，2、3指转染pcDNA3.1-UL5质粒的Vero细胞表达的UL5蛋白。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明实施例中部分材料的厂家和货号如下：
名称 厂家 货号
GelExtractionKitII胶回收试剂盒 Omega公司 D2500-01
抽提质粒试剂盒 Thermo公司 K2100-06
限制性内切酶BamHI Takara公司 1010A
限制性内切酶Xhol Takara公司 D1094A
T4连接酶 Takara公司 D2011A
Lipofectamine® 2000转染试剂 Thermo公司 11668030
HRP-羊抗鼠 IgG Abcam公司 ab19195
小鼠IFN-γElisa试剂盒 嘉美公司 CMK0016
小鼠IL2 Elisa试剂盒 Elabscience公司 E-ELN-M0042c
小鼠IL4 Elisa试剂盒 Sigma公司 RAB0299-1KT
小鼠IL10 Elisa试剂盒 Sigma公司 RAB0590-1KT
实施例1 应用微载体培养Vero细胞制备单纯疱疹病毒Ⅰ型基因缺失减毒疫苗
本发明提供的引物如表1所示：
本发明涉及的BAC-HSV-1质粒从 BAC-HSV-1-1737细菌（EPI300 E.Coli）（Gierasch WW, Zimmerman D L, Ward S L, et al. Construction and characterization ofbacterial artificial chromosomes containing HSV-1 strains 17 and KOS[J].Journal of virological methods, 2006, 135(2): 197-206.）中提取得到，可表达完整的HSV-1基因。
应用微载体培养Vero细胞制备单纯疱疹病毒Ⅰ型基因缺失减毒疫苗的方法包括如下步骤：
S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备BAC-HSV-△UL5质粒：
1）以 Kam-sacB全片段为模板，Kam-sacB sense和Kam-sacB antisense为上下游引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后将PCR产物用GelExtractionKitII胶回收试剂盒进行纯化，得到抗卡那霉素基因Kam-sacB；鉴定结果见图1；
2）以抗卡那霉素基因Kam-sacB为模板，CBUL5、UL5ab2为上下游引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后将PCR产物用GelExtractionKitII胶回收试剂盒进行纯化，得到UL5C-Kam-sacB片段；鉴定结果见图2；
3）以UL5C-Kam-sacB片段为模板，UL5ab1、UL5ab2为上下游引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后将PCR产物用GelExtractionKitII胶回收试剂盒进行纯化，得到UL5同源重组片段UL5-Kam-sacB；鉴定结果见图2；
4）将UL5-Kam-sacB基因片段转染至含有BAC-HSV-1质粒的大肠杆菌中，经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了UL5-Kam-sacB基因片段的大肠杆菌；
5）鉴定UL5成功敲除的菌落，使用抽提质粒试剂盒提取菌落质粒，得到纯化的BAC-HSV-△UL5质粒，鉴定结果见图3。
S2、构建表达UL5蛋白的Vero细胞
1）以BAC-HSV-1质粒为模板，UL5_F和UL5_R为上下游引物进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后将PCR产物用GelExtractionKitII胶回收试剂盒进行纯化，得到UL5基因片段；鉴定结果见图4；
2）利用限制性内切酶BamHI和Xhol对UL5基因片段和pcDNA3.1质粒（优宝生物公司，编号：VT1001）分别进行双酶切；
3)利用T4连接酶将上述UL5基因片段和pcDNA3.1质粒的酶切产物进行连接构成pcDNA3.1-UL5质粒；
4）将pcDNA3.1-UL5质粒用Lipofectamine® 2000转染试剂转染到Vero细胞中，构建表达UL5蛋白的Vero细胞，通过western blot鉴定Vero细胞成功表达UL5蛋白，鉴定结果见图5。
S3、微载体扩增培养Vero细胞
1）微载体的预处理，将微载体加入已用二甲基二氯硅烷硅化的转瓶或瓶子内，加入PBS水化，PBS与微载体的比例为100g/mL，3h后弃去PBS，加入新的PBS继续水化5h，弃去PBS并用新的PBS洗涤一次；加入新的PBS后高压蒸汽灭菌；
2）灭菌完成冷却后弃去PBS，用无血清培养液洗涤一次后弃去培养液，重新加入新鲜无血清培养液置4℃冰箱平衡过夜；
3）将表达UL5蛋白的Vero细胞按2.0×105cells/mL接种于25 cm2组织培养瓶和2000mL转瓶，加入含 10% (v/v)胎牛血清的 DMEM/F12培养液，置37℃培养箱或转速为30r/min的转床中培养，待细胞形成致密单层后用0.25% (w/v) 胰蛋白酶消化，进行细胞传代或作为微载体固定化培养的种子细胞；
4）Vero细胞的微载体固定化培养，微载体加入量为4g/L，接种步骤3）所述的种子细胞2.5×105cells/mL，置于摇床中培养，培养条件为：转速45r/min，温度37℃，溶解氧浓度为50%，PH维持在7.2。
S4、将BAC-HSV-△UL5质粒用Lipofectamine® 2000转染试剂转染到表达UL5蛋白的Vero细胞中，4天后观察到细胞有病变并且出现空斑，再收集细胞反复冻融获得病毒悬液。
S5、将收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到应用微载体培养的表达UL蛋白的Vero细胞培养基中。
S6、于种毒后第2、4、6、8、10、12天各收取培养液上清一次，将培养液上清的病毒滴度调整为1×107IU/mL后采用0.45微米的滤膜过滤，得到病毒液。
S7、往病毒液中添加2％（W/W）谷氨酸钠，2％（W/W）甘露醇，3％（W/W）右旋糖酐，0.2％（W/W）盐酸精氨酸，1％（W/W）尿素和0.2％（W/W）人血球白蛋白，制得单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗（HSV-△UL5减毒疫苗）。
实施例2 本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗安全性试验
1、试验动物：6周龄雄性昆明小鼠12只，SPF级别，体重30~34g。
2、试验指标：
1）一般状况观察，主要包括实验动物的外观、行为、对刺激的反应、分泌物，排泄物等。填写一般状况观察表，观察记录的内容包括皮肤、粘膜、毛色、眼睛、呼吸、循环、自主活动及中枢神经系统行为表现等，准确记录动物死亡时间。
2）体重测量；
3）LD50测定。
3、试验方案：将小鼠随机分成实验组和正常对照组，每组各6只小鼠；实验组进行腿部肌肉注射实施例1制备的HSV-△UL5减毒疫苗溶液（病毒滴度调整为1×107IU/mL）200μL/只，正常对照组注射等容积的PBS溶液，注射时针头使用橡皮挡，使针尖斜面部分完全露出约lmm，以保证穿刺深度一致。免疫时先用0.3%(w/v)戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠(75mg/kg)，待小鼠麻醉后，在双侧股四头肌相同部位垂直注射减毒疫苗溶液。每天观察各组小鼠状态并称重，3周后记录小鼠死亡情况，计算LD50。
4、实验结果：与正常对照组相比较，实验组小鼠外观、行为、对刺激的反应、分泌物、排泄物等无异常，3周后实验组和正常对照组均无小鼠死亡情况，小鼠HSV-△UL5减毒疫苗的LD50大于200μL/30g。实验前后各小鼠的的体重情况如表2所示，实验前后实验组和对照组小鼠体重均无显著变化。
5、实验结论：本发明制备的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗安全性良好，没有致病能力。
实施例3 本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗免疫试原性验
1、试验动物：6周龄雄性昆明小鼠48只，SPF级别，体重32~34g。
2、试验指标：1）小鼠免疫后采血，检测血清中特异性总IgG的量；2）ELISA检测细胞因子分泌情况。
3、试验方案：
1）动物免疫
将48只小鼠随机分成4组，每组12只，分别为实验组（试验材料为本发明实施例1制备的HSV-△UL5减毒病毒溶液，病毒滴度调整为1×107IU/mL），UL5阴性对照组（试验材料为UL5蛋白溶液），HSV-1阳性对照组（试验材料为HSV-1病毒溶液，病毒滴度调整为1×107IU/mL）和正常对照组。除正常对照组注射等容积PBS溶液外，其余各组小鼠按100μL/只的剂量进行免疫，免疫方法如实施例2，分三次免疫，每隔一周免疫一次，共21天。末次免疫后1周后进行取样检测。
2）取样
眼眶取血：每组取6只小鼠摘取眼球取血，血液37℃水浴30min后，1000rpm离心10min，取上清，样品用于ELISA检测血清中IgG含量实验；
分离脾淋巴细胞：每组取6只小鼠断颈法处死，无菌条件打开腹腔取出脾脏，将脾浸入DMEM中，剪碎脾脏，加入胶原酶消化30min，过80目筛收集脾细胞，1000rpm离心10min，弃上清，加入DMEM溶液重悬细胞静置5min，加入3.6%的NaCL 1mL，DMEM洗涤2次后再次重悬细胞，进行细胞计数。计数细胞浓度为5×106cells/mL。细胞用于进行细胞因子测定。
3）免疫检测
（1）ELISA法检测血清中IgG：1）取包被抗原HSV-1灭活液100µL/孔，4℃放置10h；2）取5mL3% BSA5组，室温封闭2h；3）PBST 洗板3次；4）加入100µL不同稀释度的免疫后样本血清（1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800），同时以免疫前血清（1:100 稀释）作为阴性对照；5）室温放置1h后，PBST洗板3次；4）加入100µl HRP-羊抗鼠 IgG（1:1000 稀释）室温反应1h；5）PBST洗板3次；6）加入100µl 邻苯二胺显色液，闭光反应10min后，用0.2M H2SO4终止反应，于492nm处读取光密度值。
（2）细胞因子测定实验：调整分离获取的脾细胞悬液细胞计数浓度为5×105/mL，接种至24孔细胞培养板内，每孔1mL细胞悬液。24h后实验组加入相应的样品溶液，终浓度为10μg/mL。同时设置细胞对照组，PBS溶剂阴性对照组。继续培养48h后，取上清，用ELISA试剂盒检测IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平。
4、实验结果：见表3和表4。与正常组相比，实验组和阳性对照组血清IgG含量及其IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的分泌水平具有极显著性的差异，而阴性对照组与正常组相比无显著的差异，同时，实验组与阳性对照组无明显差异，说明本发明制备的疫苗可诱导机体产生更多的抗体，可刺激机体产生更强的免疫反应，效果与HSV-1病毒相当。
注：与正常组比较，*P<0.01。
注：与正常组相比，*P<0.01。
5、实验结论: 本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗能刺激机体产生对HSV的免疫反应。
实施例4 本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗DTH反应检测
1、试验动物：6周龄雄性昆明小鼠48只，SPF级别，体重28~34g。
2、试验方案：
DTH反应检测（超敏反应）：将48只小鼠随机分成4组，每组12只，分别为实验组（试验材料为本发明实施例1制备的HSV-△UL5减毒疫苗，病毒滴度调整为1×107IU/mL），UL5阴性对照（试验材料为UL5蛋白溶液），HSV-1阳性对照（试验材料为HSV-1病毒溶液，病毒滴度调整为1×107IU/mL）和正常对照组。除正常对照组注射等容积PBS溶液外，其余各组小鼠按100μL/只的剂量进行免疫，免疫方法如实施例2，分三次免疫，每隔一周免疫一次，共21天。小鼠末次免疫1周后，在各组各取6只小鼠的右耳廓皮内注射10μL相应的样品溶液，左侧耳廓注射同样体积的PBS溶剂。于48h后用游标卡尺测量耳廓厚度，DTH表示为右耳廓和左耳廓的差值。
3、实验结果：见表5，与正常对照组相比，实验组和阴性对照组DTH值无明显差异，而阳性对照组DTH值具有极显著差异。
注：与正常对照组相比，*P<0.01。
4、实验结论：本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗不会引起机体超敏反应。
实施例5 本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗病毒攻击保护实验
1、试验动物：6周龄雄性昆明小鼠24只，SPF级别，体重28~34g.
2、实验方案：
病毒攻击保护实验：将24只小鼠随机分成4组，每组6只，分别为实验组（试验材料为本发明实施例1制备的HSV-△UL5减毒疫苗，病毒滴度调整为1×107IU/mL），UL5阴性对照（试验材料为UL5蛋白溶液），BAC-HSV-1阳性对照（试验材料为HSV-1病毒溶液，病毒滴度调整为1×107IU/mL）和正常对照组。除正常对照组注射等容积PBS溶液外，其余各组小鼠按100μL/只的剂量进行免疫，免疫方法如实施例2，分三次免疫，每隔一周免疫一次，共21天。小鼠末次免疫1周后，每天观察小鼠的生存情况，共观察3周，记录各组小鼠存活率。
3、实验结果：阳性对照组有2只小鼠死亡，阴性对照组有4只小鼠死亡，正常组有5只小鼠死亡，实验组无小鼠死亡。
4、实验结论：本发明制备的HSV-△UL5减毒疫苗可以抵抗病毒的攻击，而且具有较好的安全性。
以上实验表明，相比传统疫苗而言，本发明利用微载体培养Vero细胞制备的单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗是经过基因工程敲除HSV-Ⅰ生长复制所必须的UL5基因实现的，不发生毒力回复，其生物学特性和野生型单纯疱疹病毒相似，但其进入机体后仅能刺激机体产生免疫应答而无致病作用，具有良好的安全性。本疫苗保留了单纯疱疹病毒I型的大部分抗原，具有较高的免疫原性，能有效地诱导机体粘膜和体液免疫应答，构建机体抵抗疱疹感染的第一道防线，降低人群发病率。同时，本疫苗可激发细胞免疫应答，构建机体的第二道防线，有可能清除已感染病毒，控制疱疹的复发和传播。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 暨南大学
<120> 一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法
<130> 2015
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catgaccgca ccacgctcgc gggcccccac tacgcgtgcg cggggggaca cgatttattc 60
aacaaagcca 70
<210> 2
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggccgaggcc tttttaaatt ttacgtctat gcacggggtg cagccaatcc gcatcttgca 60
agaatggcgc 70
<210> 3
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtgagtcccc cgggccgggt tcggtggaac tgtaagggga cggcgggtta catgaccgca 60
ccacgctcgc 70
<210> 4
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgatttattc aacaaagcca cgttgtgtct caa 33
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcatcttgca agaatggcgc tcgtttaata g 31
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aattggatcc gagcgtggtg cggtcatg 28
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aagctcgaga ggggacggcg ggttaata 28

Claims (9)

1.一种应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、敲除单纯疱疹病毒Ⅰ型的UL5基因，制备单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失质粒，即BAC-HSV-△UL5质粒；S2、构建pcDNA3.1-UL5真核表达质粒并转染到Vero细胞，使Vero细胞表达UL5蛋白，制备表达UL5蛋白的Vero细胞；S3、微载体扩增培养S2所述的表达UL5蛋白的Vero细胞；S4、将S1所述的BAC-HSV-△UL5质粒转染至不加微载体常规培养的表达UL5蛋白的Vero细胞中，3-5天后观察到细胞有病变并且出现空斑，再收集细胞反复冻融获得病毒悬液；S5、将S4收集的病毒悬液按病毒感染复数MOI为0.001:1的量接种病毒到S3中应用微载体培养的表达UL5蛋白的Vero细胞培养基中；S6、收集S5中的培养液上清，过滤，得病毒液；S6、病毒加入冻干保护剂，制成疫苗；
所述单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因敲除制备BAC-HSV-△UL5质粒的方法包括以下步骤：1）制备UL5同源重组片段UL5-Kam-sacB；2）将UL5-Kam-sacB基因片段转染至含有BAC-HSV-1质粒的大肠杆菌中，经卡那霉素挑单克隆筛选出插入了UL5-Kam-sacB基因片段的大肠杆菌；3）鉴定UL5成功敲除的菌落，提取BAC-HSV-△UL5质粒。
2.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述的UL5同源重组片段的制备方法包括以下步骤：1）以抗卡那霉素基因Kam-sacB全片段为模板，通过PCR扩增制备UL5C-Kam-sacB片段，所述PCR扩增的引物包括上游引物CBUL5，其序列为5’-CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGATTTATTCAACAAAGCCA-3’和下游引物UL5ab2，其序列为5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3'；2）以UL5C-Kam-sacB片段为模板，通过PCR扩增制备UL5同源重组片段UL5-Kam-sacB，所述PCR扩增的引物包括上游引物UL5ab1，其序列为5'-GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC-3'和下游引物UL5ab2，其序列为5'-GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC -3'。
3.根据权利要求2所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述的抗卡那霉素基因Kam-sacB是以Kam-sacB全片段为模板，通过PCR扩增获得，所述PCR扩增的引物包括上游引物Kam-sacB sense，其序列为 5'-CGATTTATTCAACAAAGCCACGTTGTGTCTCAA-3'和下游引物Kam-sacB antisense，其序列为5' -GCATCTTGCAAGAATGGCGCTCGTTTAATAG -3'。
4.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述的pcDNA3.1-UL5真核表达质粒载体的构建包括以下步骤：1）以BAC-HSV-1质粒为模板，通过PCR扩增UL5基因片段，所述PCR扩增引物包括上游引物为UL5_F，其序列为5′-AATTGGATCCGAGCGTGGT-GCGGTCATG -3′和下游引物UL5_R，其序列为5′-AAGCTCGAGAGGGGACG-GCGGGTTAATAG -3′；2）用BamHI，Xhol双酶切pcDNA3.1和扩增的UL5基因片段，再用T4连接酶连接pcDNA3.1和UL5基因片段的酶切产物得到pcDNA3.1-UL5真核表达质粒。
5.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述的微载体扩增培养表达UL5蛋白的Vero细胞的方法包括以下步骤：1）微载体的预处理，将微载体加入已用二甲基二氯硅烷硅化的转瓶或瓶子内，加入PBS水化，PBS与微载体的比例为80~150g/mL，2-4h后弃去PBS，加入新的PBS继续水化3~10h，弃去PBS并用新的PBS洗涤一次；加入新的PBS后高压蒸汽灭菌，灭菌完成冷却后弃去PBS；2）用2-5mL无血清培养液洗涤一次后弃去培养基，重新加入新的无血清培养液置4℃冰箱平衡过夜；3）将表达UL5蛋白的Vero细胞按1.5×105-2.5×105cells/mL接种于25 cm2组织培养瓶和2000 mL转瓶，加入含10% (v/v)胎牛血清的DMEM/F12培养液，置37℃培养箱或转速为20-30 r/min的转床中培养，待细胞形成致密单层后用0.20-0.25% (w/v)胰蛋白酶消化，进行细胞传代或作为微载体固定化培养的种子细胞；4）Vero细胞的微载体固定化培养，微载体加入量为3~4g/L，接种步骤3）所述的种子细胞2.0×105-3.0×105cells/mL，置于摇床中培养，培养条件为：转速42-48r/min，温度37~38℃，溶解氧浓度为40~60%，PH维持在7.1~7.2。
6.根据权利要求5所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述的微载体为Cytodex系列微载体、Cytopore系列微载体、Cytoline系列微载体和Biosilon微载体中的一种或多种。
7.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S6中病毒液收获时间为种毒后第2、4、6、8、10、12天。
8.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S6中将培养液上清的病毒滴度调整为1×107IU/mL后采用0.45-1.0微米的滤膜过滤澄清。
9.根据权利要求1所述的应用微载体培养Vero细胞制备基因缺失减毒疫苗的方法，其特征在于，所述步骤S7中疫苗的制备方法包括以下步骤：往所述步骤S6中过滤后的病毒液添加2％（W/W）谷氨酸钠，2％（W/W）甘露醇，3％（W/W）右旋糖酐， 0.2％（W/W）盐酸精氨酸，1％（W/W）尿素和0.2％（W/W）人血球白蛋白，制成单纯疱疹病毒Ⅰ型UL5基因缺失减毒疫苗冻干成品。
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林美玲: "Vero细胞低血清微载体悬浮培养模式的优化及溶瘤单纯疱疹病毒生产工艺研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库.基础科学辑》 *

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