CN110643632A - 一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆及制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体公开了一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆及制备方法和应用。此毒株的感染性克隆以缺失结构蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒（Venezuelan equine encephalitis virus，VEEV）疫苗株TC‑83复制子为载体通过在其缺失部位插入狂犬病毒糖蛋白（Glycoprotein,G）基因构建而成，其拯救出的毒株作为减毒活疫苗不仅提供了有效的免疫保护力，而且使用更加安全。

Description

一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆及制备方 法和应用

技术领域

本发明属于动物疫苗技术领域，具体涉及一种以甲病毒复制子载体的狂犬病疫苗株的构建及其制备方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus，RABV)感染以导致神经系统损伤为特征的致死性疾病，发病后的致死率几乎为100％，在全球范围内每年报告的死亡人数为59000-61000人，是威胁社会公共卫生安全的重要人畜共患病之一。众所周知，神经系统是机体免疫监控的薄弱区域，清除感染神经系统的狂犬病毒是极具挑战性的目标，目前应对狂犬病发生和发展的主要方式仍然是疫苗免疫。因此，新型狂犬病疫苗的研发和应用成为狂犬病防治工作的主要途径之一。实施暴露前免疫(Pre-exposure,Pr-EP)和暴露后预防(Post-exposure prop hylaxis,PEP)方案可以有效预防人员患狂犬病；此外，由于90％以上的狂犬病由带毒犬只撕咬感染所致，因此对流浪犬只和野生动物的免疫是减少狂犬病毒传播的主要途径。

狂犬病毒灭活疫苗及毒力弱化的活疫苗在人类防治狂犬病历史中立下汗马功劳，但是考虑到安全性因素，狂犬病毒弱毒活疫苗仅在部分国家或地区被谨慎使用，主要原因是狂犬病毒弱毒活疫苗在实验条件下经大脑注射乳鼠会导致其发病和死亡。另外，狂犬病毒活病毒仍然可能通过在机体内的复制和基因回复突变使其毒力返强。完全灭活的狂犬病毒疫苗的安全性较高，在全世界范围内受官方认可程度最高，然而繁琐的灭活工艺不仅降低了抗原的免疫原性，而且佐剂的添加大大提升了生产成本。因此，当前新型狂犬疫苗研究的主要目标之一是在提高疫苗的免疫效果的同时降低疫苗的安全风险。

狂犬病毒糖蛋白(Glycoprotein,G)的天然结构为三聚体形式，它不仅是病毒表面唯一的膜蛋白，也是唯一诱导特异性中和抗体产生的病毒抗原蛋白。近年来，重组病毒载体(如痘病毒，副粘病毒及腺病毒载体)嵌合表达G蛋白的方式为新型狂犬疫苗的研发提供了新的思路，嵌合狂犬病毒G蛋白的金丝雀痘苗病毒载体疫苗的安全性受到广泛认可，已经可用于人类临床实验；嵌合狂犬病毒G蛋白的腺病毒载体疫苗经动物口服可诱导产生较高水平的中和抗体，方便用于流浪犬只和野生动物的免疫。以上重组病毒载体疫苗在表达狂犬病毒G蛋白的同时也是弱毒活病毒疫苗，同样会诱导机体对重组病毒载体的免疫应答及存在潜在的安全隐患。

针对上述问题，本发明所制备的基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆已经将甲病毒的结构蛋白完全删除，自然情况下不存在组装为甲病毒或狂犬病毒等活病毒的可能，充分降低了重组病毒疫苗的安全隐患。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种以缺失结构蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子为载体并在其缺失部位插入狂犬病毒LBNAR毒株的糖蛋白G的VEEV-RABV G的感染性克隆，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的最后一个目的是提供了VEEV-RABV G感染性克隆在制备狂犬病毒减毒疫苗中的应用，其拯救出的病毒可作为新型的重组狂犬疫苗减毒株使用，该疫苗株不仅安全性高而且可对小鼠提供能够有效的免疫保护力。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。

上述感染性克隆的制备方法，包括：将狂犬病毒G蛋白对应的核苷酸序列插入AscI和PacI进行双酶切后的pACYC177-VEEV Replicon中得到；所述的pACYC177-VEEV Replicon是将删除了全部结构蛋白的TC-83疫苗株序列(GenBank accession no.L01443.1)，通过NotI和XbaI两个酶切位点构建到pACYC177质粒上得到。

上述感染性克隆拯救出的重组病毒也属于本发明的保护范围。

VEEV-RABV G感染性克隆在制备狂犬病毒减毒疫苗中的应用，利用该感染性克隆拯救出的病毒可用于制备狂犬病疫苗；可制备成狂犬疫苗减毒株。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本发明构建的狂犬疫苗株VEEV-RABV G所采用的反向遗传学技术，具有先进成熟、方便简捷、定位可控等优点。

2.本发明拯救的狂犬疫苗VEEV-RABV G病毒可用细胞培养的方法来大量扩增，获取方式比较简单。

3.本发明提供的狂犬病疫苗株VEEV-RABV G病毒在BHK-21细胞上连续传代10次后，噬斑和生长曲线均未发生显著性变化，基因测序结果G蛋白基因未发生突变，表明VEEV-RABV G具有很好的遗传稳定性。

4.本发明提供的VEEV-RABV G毒株在小鼠致病模型中不仅是充分减毒的，而且安全性明显高于现有狂犬疫苗弱毒株。

综上所述，基于委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子载体，构建的VEEV-RABVG狂犬疫苗株不仅可以在BHK-21细胞中大量扩增而且可以作为一种安全有效的减毒疫苗预防狂犬病毒感染，具有良好的应用前景和十分重要的现实意义。

附图说明

图1狂犬病疫苗株VEEV-RABV G感染性克隆的构建及由感染性克隆拯救出的病毒的间接免疫荧光检测示意图。

A：内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子为载体表达狂犬病毒糖蛋白G的VEEV-RABV G克隆构建示意图；

B：狂犬病疫苗株VEEV-RABV G体外转录得到的RNA转染BHK-21细胞不同时间点的间接免疫荧光图；

C：狂犬病疫苗株VEEV-RABV G感染BHK-21细胞不同时间点的间接免疫荧光图。

图2重组狂犬病毒VEEV-RABV G噬斑、生长曲线的检测；

A：狂犬病疫苗株VEEV-RABV G在BHK-21上的噬斑；

B：狂犬病疫苗株VEEV-RABV G在BHK-21上的生长曲线。

图3狂犬病疫苗株VEEV-RABV G遗传稳定性检测示意图；

A：间接免疫荧光检测P0、P5、P10代的VEEV-RABV G感染BHK-21细胞后G蛋白的表达；

B：RT-PCR比较P0、P5、P10代的VEEV-RABV G细胞及上清中G蛋白基因组的大小；

C：P0、P5、P10代VEEV-RABV G在BHK-21上的生长曲线比较；

D：P0、P5、P10代VEEV-RABV G在BHK-21上的噬斑形态比较。

图4狂犬病疫苗株VEEV-RABV G对成年鼠和乳鼠的致病性检测；

A：成年鼠的脑内感染VEEV-RABV G后的体重变化；

B：成年鼠的脑内感染VEEV-RABV G后的的存活率；

C：乳鼠的脑内感染VEEV-RABV G后的体重变化；

D：乳鼠的脑内感染VEEV-RABV G后的的存活率。

图5狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G经肌肉免疫后的小鼠血清中和抗体滴度检测和体重变化；

A：小鼠免疫VEEV-RABV G后中和抗体滴度检测；

B：小鼠免疫VEEV-RABV G后的体重变化。

图6狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G经肌肉免疫小鼠后所提供的保护率检测结果；

A：小鼠被攻毒后的体重变化；

B：小鼠被攻毒后的保护率。

具体实施方式

本部分中所涉及的PCR，酶切，连接，转化，RNA的提取，RT-PCR等实验方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。以下列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本发明公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本发明要求保护的范围。

实施例1：

狂犬病疫苗株VEEV-RABV G感染性克隆的构建及拯救的病毒：

本实施例构建了以委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子为载体表达狂犬病毒糖蛋白的感染性克隆并探索其性质：

1.狂犬病疫苗株VEEV-RABV G感染性克隆的构建：根据狂犬病毒LBNAR毒株基因序列(GenBank accession no.M31046.1)，合成扩增膜蛋白G的2条引物，其上下游引物序列如表1中F和R所示。用于G蛋白扩增模板的PcDNA3.1-G质粒由华中农业大学赵凌老师实验室提供，该质粒由SAD-B19株中的G蛋白基因通过NheI和KpnI两个酶切位点插入PcDNA3.1质粒中构建而成；用作载体的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子质粒由武汉病毒研究所黄病毒感染与防治学科组构建，TC-83复制子基因组序列是将删除了结构蛋白(Capsid和整个E蛋白)TC-83的疫苗株序列(GenBank accession no.L01443.1)，通过NotI和XbaI两个酶切位点构建到pACYC177质粒载体上得到pACYC177-VEEV Replicon(TC-83)的载体质粒。

膜蛋白G基因片段的扩增以PcDNA3.1-G为模版，F和R为引物，用PrimeSTAR HS酶(购于Takara公司)PCR扩增，PCR反应体系均为：94℃2min，94℃20s，55℃10s，68℃1.5min，68℃10min，35个循环。

将PCR产物回收，分别用AscI和PacI进行双酶切，并用相同的酶酶切委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83复制子载体pACYC177-VEEV Replicon(TC-83)连接后转化至大肠杆菌感受态HB101；质粒经过DNA测序鉴定为正确，命名为感染性克隆VEEV-RABV G(SEQ ID NO.1所示)，克隆构建示意图如图1中A。

2.质粒的线性化和酚氯仿抽提：用NotI酶切10μg的感染性克隆质粒VEEV-RABV G，37℃酶切两小时，经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100μl饱和酚(购自国药集团化学试剂公司)，振荡混匀，17000g离心5min，吸取上清于新的离心管中，并向原离心管中加入100μl无菌水振荡混匀，17000g离心5min；吸取上清与上一步所得上清合并(总体积约200μl)，加入200μl氯仿(购自国药集团化学试剂公司)混匀，17000g离心5min；吸取上清于无RNAase的离心管中(约150～200μl)，加入十分之一体积的pH5.2，3mol/l醋酸钠(购自国药集团化学试剂公司)和2.5倍体积无水乙醇(购自国药集团化学试剂公司)混匀，-20℃放置30min，17000g离心5min；吸弃上清，加入1ml 70％乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清；室温放置15min，最后加入11μl无R NAase的水溶解，使用ThermoScientific NanoDrop 2000测定DNA的浓度，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于-20℃保存备用。

3.体外转录RNA：取1μg上述酚氯仿抽提的线性化产物作为模板，使用体外转录试剂盒T7 mMESSAGE mMACHINE kit(购自美国Ambion公司)，按照试剂盒说明书得到重组VEEV-RABV G的RNA。用Thermo Scientific NanoDrop 2000测定RNA的浓度，使用0.8％新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80℃保存备用。

4.体外转录得到的重组VEEV-RABV G的RNA使用脂质体转染的方法转染于BHK-21细胞并以不转染RNA的BHK-21细胞作为对照：于转染前一天，接种2×10⁵个BHK-21细胞于35mm细胞培养皿中，每皿放置三个10mm×10mm盖玻片，使细胞在转染当天达到约80％；转染时，先弃培养皿中培养基，用1ml Opti-MEM洗一次，再加1ml Opti-MEM(使细胞处于浸润状态)；于1.5ml EP管中加入1ml Opti-MEM，加4ul DMRIE-C(DMRIE-C用前先混匀)先上下颠倒混匀，再分别加入1ug体外转录得到的重组VEEV-RABV G的RNA(对照组不加RNA)，上下颠倒混匀；迅速弃培养皿中Opti-MEM，将混匀物加入皿中(动作要轻，勿对着细胞吹打)；于37℃二氧化碳培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2mL含2％FBS的DMEM培养基。显微镜下观察实验组和对照组的细胞状态，并分别于转染后24、48、72h取一个玻片用5％丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)对细胞进行固定，室温固定15分钟，PBS洗三遍后，于4℃保存，并于转染后72h此时已具有明显的细胞病变收集细胞培养上清得到VEEV-RABV G病毒，于-80℃保存。

5.间接免疫荧光(IFA)检测重组VEEV-RABV G病毒G蛋白表达情况：于室温环境下将上述步骤4中4℃保存的玻片孵育一抗，抗体为稀释比为1:500的鼠源RABV G蛋白单克隆抗体(购自英国Abcam公司)。室温孵育一抗1～2h，PBS冲洗3遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1:125倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(FITC)羊抗鼠抗体。二抗孵育1h后，PBS冲洗3遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点一小点95％甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下使用200×放大倍数进行观察(图1中B)。

结果显示重组的VEEV-RABV G RNA转染BHK 24h后即可观察到成团的阳性细胞，且随着转染培养时间的延长，阳性率明显增加，具有明显的扩增现象。以上结果初步表明了VEEV-RABV G可以产毒拯救出具有感染性的病毒颗粒。

6.IFA检测拯救得到的重组病毒VEEV-RABV G的感染情况：为进一步验证VEEV-RABV G产毒现象并确定VEEV-RABV G病毒的感染性将上述步骤4中转染VEEV-RABV G RNA后72h收集的VEEV-RABV G病毒感染BHK-21细胞后于24、48、72h进行IFA检测(图1中C)，方法同前。结果显示重组的VEEV-RABV G病毒感染BHK-21细胞24h即可观察到明显的阳性细胞团且随时间延长，阳性率大大提高，这充分表明VEEV-RABV G重组病毒可以产生具有感染性的病毒颗粒。

表1.VEEV-RABV G感染性克隆构建所用引物

实施例2：

本发明提供的VEEV-RABV G病毒噬斑形态鉴定以及生长曲线测定：

将实施例1拯救得到的VEEV-RABV G病毒进行噬斑实验鉴定噬斑形态并测定其生长曲线：在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个BHK-21细胞，待细胞汇合度达到90％时，弃孔中的培养基，加入100μL用含2％FBS的DMEM培养基10倍比稀释的实施例1步骤4收集的病毒，37℃吸附1h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2％FBS的DMEM培养基和2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃、5％CO2的培养箱中培养3天，待噬斑形成后用含有1％结晶紫和3.7％甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后即可计数换算成病毒滴度，同时观察噬斑形态(图2中A)。从图中可以看到VEEV-RABV G病毒在BHK-21上可以产生清晰的噬斑形态。

于35mm细胞培养皿中接种2×10⁵BHK-21细胞，在37℃，5％CO₂培养条件下，待汇合度达到60％时，按照感染复数MOI为0.01，向小皿中加入500μl稀释后的VEEV-RA BV G病毒，37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％CO₂培养条件下培养，分别于感染后每24h收400μl病毒上清并补加400μl含2％胎牛血清的DMEM培养基，作为不同时间点的病毒样，于-80℃保存。按照上述噬斑实验方法测定不同时间点收集的病毒滴度，绘制生长曲线(图2中B)。结果表明VEEV-RABV G病毒在BHK-21上以MOI 0.01感染时120h滴度达到最高，最高滴度为1×10⁶PFU/ml。

实施例3：

本发明提供的VEEV-RABV G病毒具有遗传稳定性：

1.将实施例1拯救得到的VEEV-RABV G病毒(P0代)按感染复数MOI为0.01感染BHK-21细胞，5天后CPE明显收集细胞上清(P1代)，每代平行传三株病毒，重复进行10次此步骤。将P0、P5、P10代病毒再次感染细胞后用G蛋白的特异性抗体进行IFA(方法同实施例1)检测蛋白表达情况(图3中A)，IFA结果表明P0、P5、P10代的病毒均能检测到G蛋白表达；将P0、P5、P10代收集的细胞和上清分别按照Trizol以及QIAamp ViralRNA Mini Kit试剂盒的说明书提取总的细胞RNA或者病毒RNA于-80℃保存备用。用前述的扩增LBNAR狂犬疫苗株G蛋白基因组的引物对进行RT-PCR(图3中B)，并将扩增产物进行测序。结果表明P0、P5、P10代的细胞和上清样本的RT-PCR结果表明得到的目的带大小一致，说明通过10代传代后G蛋白基因大小没有发生变化且最终的测序结果也表明G蛋白上没有突变。

2.取P0、P5、P10代收集的上清病毒液进行噬斑形态比较(方法同实施例2)；将二者按感染复数MOI为0.01于BHK-21细胞中进行生长曲线比较(方法同实施例2)；噬斑(图3中D)和生长曲线(图3中C)表明P0、P5、P10代的病毒噬斑大小无明显差异，且较为均一(图3中D)，二者的生长曲线趋势也相似(图3中C)；表明VEEV-RABV G病毒具有很好的遗传稳定性。

实施例4：

本发明提供的狂犬病疫苗株VEEV-RABV G在制备减毒疫苗中的应用：

狂犬病疫苗株VEEV-RABV G的致病性。

狂犬病毒弱毒活疫苗毒株LBNAR和LBNSE均源自于狂犬病毒SAD B19株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.J Virol 85:1634-1.)。将6-8周龄的雌性ICR(Institute ofCancer Research)小鼠(购于湖北省疾病预防控制中心)分为4组(10只/组)，分别用25μL的DMEM、5×10³FFU的LBNSE、LBNAR或者5×10³PFU的VEEV-RABV G以脑内注射(i.c.)的方式进行感染，感染后每天称取小鼠体重及记录死亡情况，一直持续至感染后第15天。为了进一步检测VEEV-RABV G在免疫力不健全动物体内致病性，将3-5日龄乳鼠分为3组(13-15只/组)，分别用10μL的DMEM、5×10³FFU的LBNSE或者5×10³PFU的VEEV-RABV G以脑内注射(i.c.)的方式进行感染，感染后每天称取乳鼠体重及记录死亡情况，一直持续至感染后第15天。

结果如图4所示，成年小鼠经脑内注射(i.c.)途径感染病毒样粒子VEEV-RABV G后，小鼠在观察期内并未出现任何临床症状，体重未发生明显下降，而且与空白对照组(DMEM)相比较无显著性差异，狂犬病毒弱毒株LBNAR和LBNSE感染均导致成年鼠体重显著性下降(图4中A)，LBNAR感染组成年鼠全部死亡，然而VEEV-RABV G和LBNSE感染组成年鼠全部存活(图4中B)。然而进一步在乳鼠脑内感染的实验结果显示，LBNSE毒株感染组乳鼠在第4天和第5天体重显著性下降(图4中C)，在感染后的第6天全部死亡(图中4D)；VEEV-RABV G组小鼠在感染的第9天体重显著性低于DMEM对照组(图4中C)，然而VEEV-RABV G组小鼠在观察期内全部存活(图4中D)，然而VEEV-RABV G感染组乳鼠全部存活。综合以上结果可以说明狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G对成年鼠无明显致病性，然而会轻微影响乳鼠的体重增长，相比较而言其安全性高于狂犬病毒弱毒活疫苗，达到本发明的安全性目标要求。

实施例5：

本发明提供的狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G病毒在制备减毒活疫苗中的应用：

狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G诱导的体液免疫

由于特异性中和抗体是预防狂犬病毒感染的主要“武器，”人工主动免疫(疫苗免疫)是诱导中和抗体产生的主要方式。因此，狂犬病毒特异性中和抗体是评价狂犬病疫苗效果的指标之一。将6-8周龄的雌性ICR小鼠随机分为3组(10只/组)，分别用100μL的DMEM、2×10⁵FFU的LBNAR或者2×10⁵PFU的VEEV-RABV G进行肌肉途径(i.m.)免疫，于免疫后的6周内，每周采取并收获小鼠血清用于测定狂犬病毒特异性的中和抗体水平。同时在免疫后的15天内，每天观察小鼠健康状况并称取其体重。结果如图5所示，狂犬病疫苗毒株VEEV-RABV G诱导的中和抗体水平与狂犬病毒弱毒活疫苗毒株LBNAR诱导的相当(无显著性差异)，然而VEEV-RABV G诱导的小鼠中和抗体水平整齐性更好(图5中A)。此外肉注射VEEV-RABV G疫苗株并未显著影响小鼠的生长(图5中B)。

本实施例考察的是重组病毒VEEV-RABV G对小鼠保护率实验

将6-8周龄的雌性ICR小鼠随机分为3组(10只/组)，分别用100μL的DMEM、2×10⁵FFU的LBNAR或者2×10⁵PFU的VEEV-RABV G通过肌肉途径(i.m.)免疫。于免疫后第42天(第六周)以50倍的半数致死剂量即50LD₅₀ CVS-24脑内途径(i.c.)攻毒所有的ICR小鼠，攻毒后持续观察21天，称取小鼠体重、记录临床发病及死亡情况，统计分析小鼠的存活率(免疫保护率)。结果如图6所示，狂犬病疫苗毒株(病毒样颗粒)VEEV-RA BV G能够提供受免疫小鼠90％保护率，然而LBNAR毒株只能提供70％的保护率，小鼠生存曲线显示VEEV-RABV G组显著优于LBNAR组。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

华中农业大学

<120> 一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆及制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9135

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ataggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240

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ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900

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tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680

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ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860

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ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960

acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140

tgtataagaa attcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740

tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800

aagcctccac accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttttcaagc cccaaggtcg 6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200

aagcgcctta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatcgatg gcgcgccacc 7560

atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa 7620

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ctcagctgcc caaacaattt ggtagtggag gacgaaggat gcaccaacct gtcagggttc 7740

tcctacatgg aacttaaagt tggatacatc ttagccataa aagtgaacgg gttcacttgc 7800

acaggcgttg tgacggaggc tgaaacctac actaacttcg ttggttatgt cacaaccacg 7860

ttcaaaagaa agcatttccg cccaacacca gatgcatgta gagccgcgta caactggaag 7920

atggccggtg accccagata tgaagagtct ctacacaatc cgtaccctga ctaccgctgg 7980

cttcgaactg taaaaaccac caaggagtct ctcgttatca tatctccaag tgtggcagat 8040

ttggacccat atgacagatc ccttcactcg agggtcttcc ctagcgggaa gtgctcagga 8100

gtagcggtgt cttctaccta ctgctccact aaccacgatt acaccatttg gatgcccgag 8160

aatccgagac tagggatgtc ttgtgacatt tttacctcca gtagagggaa gagagcatcc 8220

aaagggagtg agacttgcgg ctttgtagat gaaagaggcc tatataagtc tttaaaagga 8280

gcatgcaaac tcaagttatg tggagttcta ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc 8340

tcgatgcaaa catcaaatga aaccaaatgg tgccctcccg ataagttggt gaacctgcac 8400

gactttcgct cagacgaaat tgagcacctt gttgtagagg agttggtcag gaagagagag 8460

gagtgtctgg atgcactaga gtccatcatg acaaccaagt cagtgagttt cagacgtctc 8520

agtcatttaa gaaaacttgt ccctgggttt ggaaaagcat ataccatatt caacaagacc 8580

ttgatggaag ccgatgctca ctacaagtca gtcgaaactt ggaatgagat cctcccttca 8640

aaagggtgtt taagagttgg ggggaggtgt catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat 8700

ggtataatat taggacctga cggcaatgtc ttaatcccag agatgcaatc atccctcctc 8760

cagcaacata tggagttgtt ggaatcctcg gttatccccc ttgtgcaccc cctggcagac 8820

ccgtctaccg ttttcaagga cggtgacgag gctgaggatt ttgttgaagt tcaccttccc 8880

gatgtgcaca atcaggtctc aggagttgac ttgggtctcc cgaactgggg gaagtatgta 8940

ttactgagtg caggggccct gactgccttg atgttgataa ttttcctgat gacatgttgt 9000

agaagagtca atcgatcaga acctacgcaa cacaatctca gagggacagg gagggaggtg 9060

tcagtcactc cccaaagcgg gaagatcata tcttcatggg aatcacacaa gagtgggggt 9120

gagaccagac tgtaa 9135

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttggcgcgcc accatggttc ctcaggctct cctg 34

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

actttaatta attacagtct ggtctcaccc ccactc 36

Claims (5)

1.一种基于甲病毒复制子载体的狂犬病毒感染性克隆，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的感染性克隆拯救出的重组病毒。

3.权利要求1所述的感染性克隆或权利要求2所述的重组病毒在制备狂犬病疫苗中的应用。

4.权利要求1所述的感染性克隆或权利要求2所述的重组病毒在制备狂犬病毒减毒株中的应用。

5.权利要求1所述的感染性克隆的制备方法，步骤包括：将狂犬病毒G蛋白对应的核苷酸序列插入AscI 和PacI进行双酶切后的pACYC177-VEEV Replicon中得到；所述的pACYC177-VEEV Replicon是通过将删除了全部结构蛋白的TC-83疫苗株序列（GenBankaccession no. L01443.1），通过NotI和XbaI两个酶切位点构建到pACYC177质粒上得到。

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