CN113717951A - 一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒。所述溶瘤病毒还可以作为一种表达载体，用于外源基因的表达。所述溶瘤病毒在多种肿瘤细胞及小鼠荷瘤模型中具有显著的溶瘤作用，可以为临床肿瘤的治疗提供一种有效的抗癌治疗剂，具有良好的应用前景。

Description

一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途

技术领域

本公开属于生物技术领域，本公开涉及一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途，更具体地，涉及一种缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒及其作为溶瘤病毒的用途。

背景技术

肿瘤是人类面临的最大公共健康问题，也是引起死亡的第二大杀手。恶性肿瘤已经成为严重威胁中国以及全世界人群健康的主要公共卫生问题之一。目前针对肿瘤的治疗主要包括两类，一类是包括化疗/放疗/手术治疗的传统治疗方法，另一类是以细胞因子/免疫细胞及抗体为主的免疫治疗。但不管是传统治疗还是免疫治疗，都存在治疗缺陷。传统治疗最大的缺点是药物的耐药，而免疫治疗最大的缺陷是应答率低。因此，新型治疗手段，如肿瘤免疫治疗/溶瘤病毒等逐渐受到人们的重视。

溶瘤病毒是一类具有直接杀死肿瘤细胞和/或激活肿瘤免疫应答作用的天然病毒或重组病毒。与正常细胞相比，溶瘤病毒优先在肿瘤细胞中感染和复制，从而引起肿瘤细胞裂解。除直接溶瘤外，溶瘤病毒还可以作为免疫原激活先天性和适应性抗肿瘤免疫应答，导致免疫细胞有效浸润，将免疫细胞少的“冷”肿瘤微环境(TME)转化为免疫细胞多的“热”肿瘤微环境，从而增强机体识别、控制和杀死肿瘤细胞的能力。近年来，随着癌症领域朝着基于生物和免疫的方法对抗癌症的方向发展，溶瘤病毒受到了越来越多的关注。目前，多数研究通过改造一些自然界存在的致病力较弱的毒种，使其特异的在肿瘤细胞中表达包装继而实现溶瘤作用。且与天然病毒相比，具有溶瘤作用的减毒活疫苗具有安全，可控，易于生产等优势。有研究表明黄热病疫苗YFV-17D复制并杀死小鼠和人类肿瘤细胞系，但不会杀死未转化的人类细胞。肿瘤内注射具有活性的YFV-17D可以显着抑制CD 8+T细胞依赖的移植肿瘤进程，从而产生免疫介导的抗肿瘤作用，最终以溶瘤病毒的方式发挥抗肿瘤作用。同样的，研究表明间质性脊髓灰质炎病毒减毒活疫苗Pvsripo在神经胶质瘤的治疗中具有显著作用。Pvsripo病毒通过脊髓灰质炎病毒受体CD155特异性进入神经胶质瘤细胞，并在肿瘤细胞中扩增最终诱导肿瘤细胞的裂解死亡。

委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)自1943年以来就被认为是人类病原体，会引起类似流感的症状以及一些中枢神经系统疾病，例如脑炎和脑膜炎。VEEV是一种新世界alpha病毒，此病毒在蚊子、野生啮齿动物以及人类和马之间流行病周期。主要分布在美洲，主要爆发地位于中关洲和南美洲。VEEV的爆发可能导致马匹致命死亡。1995年在委内瑞拉和哥伦比亚发生的此病毒的爆发，但自1995年以来，该病毒尚未爆发，也未引起人类致病。减毒活疫苗是通过在细胞培养中连续传代或通过在病毒基因组中诱导突变而得到的一类疫苗。VEEV减毒活疫苗TC-83是用于人类疫苗接种的第一个VEEV减毒株，它是由VEEV的TrD株在豚鼠心脏细胞中传代83次产生的。TC-83与亲本TrD株的区别在于其产生的11个点突变和一个核苷酸的丢失。TC-83的减毒的主要原因其中两个突变的形成，即5′-UTR区域第3位点的G突变为A，以及E2蛋白120位氨基酸Thr突变为Arg。

目前尚未有基于马脑炎病毒的溶瘤病毒并将其用于治疗肿瘤的相关报道。

发明内容

本公开的目的在于克服现有技术中存在的缺陷与不足，提供了一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒具有广谱的溶瘤作用，可以用于治疗多种肿瘤。

在一方面，本公开提供了一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的马脑炎病毒。

在一方面，本公开提供了一种DNA，所述DNA可被转录而产生所述的溶瘤病毒。

在一方面，本公开提供了一种细胞，所述细胞包含所述溶瘤病毒或DNA。

在一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含所述溶瘤病毒、DNA和/或所述细胞。

在一方面，本公开提供了一种所述溶瘤病毒、所述DNA、所述细胞和/或所述组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

所述溶瘤病毒还可作为表达载体，用于外源基因的表达。本公开的溶瘤病毒的遗传稳定性高，并在在多种肿瘤细胞及小鼠荷瘤模型中证实所述溶瘤病毒具有显著的溶瘤作用，可以为临床肿瘤的治疗提供一种有效的抗癌治疗剂，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株TC-83感染性克隆的构建示意图及由感染性克隆拯救出的重组病毒的间接免疫荧光示意图，其中，A：缺失衣壳蛋白基因(VEEV-delC)感染性克隆的构建示意图；B：VEEV-delC转染BHK-21细胞后不同时间点间接免疫荧光图；C：VEEV-delC感染BHK-21细胞后96h间接免疫荧光图。

图2为VEEV-delC病毒遗传稳定性检测示意图，其中，A：RT-PCR比较野生型病毒VEEV-TC83(VEEV-wt)、P0代(VEEV-delC)、B株的P10代(VEEV-delC-B-P10)、B株的P11代(VEEV-delC-B-P11)、A株的P12代(VEEV-delC-A-P12)、C株的P13代(VEEV-delC-C-P13)的VEEV-delC目的带大小；B：野生型病毒VEEV-TC83(VEEV-wt)及VEEV-delC蚀斑形态比较；C：P13代的A、B和C三株VEEV-delC病毒的生长曲线比较；D：P20代的VEEV-delC病毒在BHK-21及Vero细胞中的生长曲线比较；E：P30代不同MOI感染VEEV-delC的生长曲线比较。

图3示出了VEEV-delC对肿瘤细胞的溶瘤作用，其中，A：明场观察VEEV-delC对肿瘤细胞的溶瘤作用；B：CCK8检测不同剂量VEEV-delC对肿瘤细胞的溶瘤作用。

图4示出了体内检测VEEV-delC单次给毒对小鼠黑色素瘤的溶瘤作用，其中，A：单次给毒对小鼠黑色素瘤模型治疗策略图；B：单次给毒给病毒治疗后照片示意图；C：单次给毒治疗后肿瘤重量统计示意图；D：单次给毒治疗后肿瘤体积变化示意图；E：单次给毒治疗后小鼠体重变化示意图；F：单次给毒治疗后小鼠各组织的病毒载量。

图5示出了体内检测VEEV-delC多次给毒(3天/次)对小鼠黑色素瘤的溶瘤作用，其中，A：多次给毒对小鼠黑色素瘤模型治疗策略图；B：多次给毒给病毒治疗后照片示意图；C：多次给毒治疗后肿瘤重量统计示意图；D：多次给毒治疗后肿瘤体积变化示意图；E：多次给毒治疗后小鼠体重变化示意图；F：多次给毒治疗后小鼠各组织的病毒载量。

图6示出了体内检测单次和多次给毒后VEEV-delC对人黑色素瘤的溶瘤作用，其中，A：给病毒治疗后照片示意图；B：给毒治疗后肿瘤重量统计示意图；C：给毒治疗后肿瘤体积变化示意图；D：给毒治疗后小鼠体重变化示意图；E：给毒治疗后小鼠各组织的病毒载量。

图7示出了P30代VEEV-delC病毒适应性突变检测及适应性突变验证，其中，A：P30代VEEV-delC病毒适应性突变位点测序；B：P30代VEEV-delC病毒适应性突变位点引入及验证(VEEV-delC-mut)；C：P30代VEEV-delC病毒适应性突变位点引入后病毒的生长曲线。

图8为缺失衣壳蛋白基因插入外源基因eGFP的eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆构建及应用示意图，其中，A：缺失衣壳蛋白基因，插入外源基因eGFP的eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆的构建示意图；B：eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒于BHK-21细胞传代后eGFP表达情况；C：P0代eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒在BHK上的生长曲线。

具体实施方式

I.定义

在本公开中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语的定义和解释。

如本文使用的和除非另作说明，术语“约”或“大约”是指在给定值或范围的加或减10％之内。在需要整数的情况下，该术语是指在给定值或范围的加或减10％之内、向上或向下舍入到最接近的整数。

如本文所用的，术语“溶瘤病毒”是这样一种病毒，相比非癌细胞它们在癌细胞中表现出增强的复制和裂解。某些实施方式中，溶瘤病毒在癌细胞中表现出选择性复制，在非癌细胞中表现出较少或基本上没有复制。某些实施方式中，较少复制的意思是癌细胞中的复制相比对应的非癌细胞至少高出约30％、或至少高出约50％、或至少高出约80％。

如本文所用的，术语“溶瘤作用”是指至少10％的增殖细胞被溶解(例如，至少约20％、30％、40％、50％或75％的细胞被溶解)。例如，可通过在哺乳动物中测量新生物大小或增殖细胞数量的减少或通过在体外(例如，来自增殖细胞的活组织检查)测量细胞溶解的量而确定细胞溶解的百分比。病毒的有效量将基于个体而确定，并且可基于(至少部分地)使用的特定病毒；个体的大小、年龄、性别；和异常增殖细胞的尺寸和其他特征。例如，对于治疗人类，取决于存在的增殖细胞或者新生物的类型、尺寸和数量，使用约10³至10¹²蚀斑形成单位(PFU)的病毒。有效量可以是，例如，从约1.0PFU/kg体重至约10¹⁵PFU/kg体重(例如，从约10²PFU/kg体重至约10¹³PFU/kg体重)。任选地，有效量为约1×10⁸至约1×10¹²TCID₅₀。任选地，有效量为约1×10¹⁰TCID₅₀。

如本文所用的，术语“变体”包括任何变体，特别是突变体、病毒株、剪接变体、构象、同种型、等位基因变体、物种变体和物种同源物，特别是天然存在的那些。等位基因变体涉及基因正常序列的改变，其重要性通常不清楚。完整的基因测序通常鉴定给定基因的许多等位基因变体。关于核酸分子，术语“变体”包括简并核酸序列，其中根据本公开的简并核酸是由于遗传密码的简并性而与密码子序列中的参考核酸不同的核酸。物种同源物是具有与给定核酸或氨基酸序列具有不同的起源物种的核酸或氨基酸序列。病毒同源物是与给定核酸或氨基酸序列具有不同的起源病毒的核酸或氨基酸序列。

如本文所用的，术语“活减毒病毒”或“减毒病毒”是指以其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱的方式，从原始亲代病毒或野生型病毒改变的病毒。一般而言，这样的减弱可以在病毒的若干或所有宿主中，或仅在病毒的一种或若干宿主中。因此，活减毒病毒的减弱(即是说，其感染宿主、在宿主内复制、包装、再次感染宿主或其组合的能力被减弱)通常与病毒的一种或多种宿主有关，其中在病毒的一种或多种其它宿主中活减毒病毒不显著或可测量地减弱。本文公开的活减毒病毒通常经遗传改变，或可被称为突变的、突变体、经基因工程改造、重组体或组合。

如本文所用的，术语“活减毒疫苗”或“减毒疫苗”是指包含活减毒病原体、例如病毒的药物组合物。药物组合物包含至少一种免疫活性组分，其在受试者中针对病毒诱导免疫反应，保护受试者免于由于病毒导致的死亡或可能的死亡，或二者，和任选地可包括一种或多种增强活性组分的免疫活性的另外的组分。疫苗可另外包括对药物组合物典型的其它组分。至少一种免疫活性组分是一种或多种本文所述的活减毒病毒。

如本文所用的，术语“病毒拯救”是将包含病毒序列的体外构建物导入合适细胞，产生具有侵染性或感染性的病毒的过程。“重组病毒”是指通过重组DNA技术产生的遗传工程化病毒，可人为地对病毒序列进行任意缺失、插入、颠倒、置换等遗传操作，以区别于天然存在的病毒。

如本文所用的，术语“重组RNA病毒”是指包含异源RNA的本文所述病毒。

如本文所用的，术语“野生型”在病毒的情况下，是指流行的、自然传播并发生典型疾病爆发的病毒的类型。在其它实施方案中，在病毒的情况下，术语“野生型”是指亲代病毒。

如本文所用的，术语“免疫刺激蛋白”指的是具有以特异性方式或非特异性方式刺激免疫系统的能力的蛋白质。大量的蛋白质因其发挥免疫刺激作用的能力在本领域中是已知的。在本公开的上下文中合适的免疫刺激蛋白的实例包括但不限于细胞因子(其中特别优选白细胞介素(例如IL-2、IL-6、IL-12、IL-15、IL-24))、趋化因子(例如CXCL10、CXCL9、CXCL11)、干扰素(例如IFNγ、IFNα)、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子(例如GM-CSF、C-CSF、M-CSF...)、暴露于APC(抗原呈递细胞)的蛋白(例如，B7.1、B7.2等)、生长因子(转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF、血管内皮生长因子VEGF等)、I类或II类的MHC抗原、凋亡诱导剂或抑制剂(例如，Bax、Bcl2、BclX...)、细胞抑制剂(p21、pl6、Rb…)、免疫毒素、抗原多肤(抗原多肤、表位等)和标志物(β-半乳糖苷酶、荧光素酶....)。在一些癌症中，免疫刺激蛋白是白细胞介素或集落刺激因子，其中特别优选GM-CSF。

如本文所用的，术语“自杀基因”是指编码能够将药物前体转变为细胞毒性药物的蛋白质的基因。合适的自杀基因的代表性示例包括但不限于胸苷激酶(TK)、胸苷酸激酶、胞嘧啶脱氨酶(CDase)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)。

如本文所用的，术语“感染复数”或“MOI”是每个被感染细胞的感染性病毒颗粒的平均数。通过将所加入的感染性病毒颗粒数(ml所加x PFU/ml)除以所加入的细胞数(ml所加x细胞/ml)来计算MOI。

II.具体实施方式详述

在一方面，本公开提供了一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的马脑炎病毒。

在本公开的一些优选实施方案中，通过缺失、取代或插入使所述衣壳蛋白基因的功能失活。

在本公开的一些优选实施方案中，通过缺失至少一部分所述衣壳蛋白基因使其功能失活。

在本公开的一些优选实施方案中，通过缺失全部所述衣壳蛋白基因使其功能失活。

在本公开的一些优选实施方案中，所述马脑炎病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒。

在本公开的一些优选实施方案中，所述马脑炎病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)。

在本公开的一些优选实施方案中，所述溶瘤病毒是基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒包含与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在选自以下突变中的一种或多种突变：第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变和第7461位存在a到g突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的蛋白具有选自以下的一种或多种的突变：

E1蛋白具有N360Y突变；

E1蛋白具有I387F突变；

E2蛋白具有D234N突变；

E2蛋白具有I296T突变；

nsp2蛋白具有K281E突变；

nsp2蛋白具有P484L突变；

nsp3蛋白具有S260T突变；

nsp4蛋白具有T587A突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E2蛋白具有D234N和I296T突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp2蛋白具有K281E和P484L突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp3蛋白具有S260T突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp4蛋白具有T587A突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变，E2蛋白具有D234N和I296T突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp2蛋白具有K281E和P484L突变，nsp3蛋白具有S260T突变，nsp4蛋白具有T587A突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变，E2蛋白具有D234N和I296T突变，nsp2蛋白具有K281E和P484L突变，nsp3蛋白具有S260T突变，nsp4蛋白具有T587A突变。

在本公开的一些优选实施方案中，所述溶瘤病毒还至少包含编码至少一个外源基因的序列。

在本公开的一些优选实施方案中，所述外源基因是治疗性基因。

在本公开的一些优选实施方案中，所述治疗基因是免疫刺激性基因或自杀基因。

在本公开的一些优选实施方案中，所述免疫刺激基因编码免疫刺激蛋白；优选地，所述免疫刺激蛋白选自细胞因子、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子、暴露于APC(抗原呈递细胞)的蛋白、生长因子、I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)组分、细胞凋亡诱导物或抑制物、细胞生长抑制剂、免疫毒素和免疫检查点抑制剂的免疫逃逸机制的阻滞物。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞因子是白细胞介素，更优选地，所述细胞因子选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15和IL-24。

在本公开的一些优选实施方案中，所述趋化因子选自CXCL10、CXCL9和CXCL11。

在本公开的一些优选实施方案中，所述干扰素选自IFNγ和IFNα。

在本公开的一些优选实施方案中，所述集落刺激因子选自GM-CSF、G-CSF和M-CSF。

在本公开的一些优选实施方案中，所述APC(抗原呈递细胞)的蛋白选自B7.1和B7.2。

在本公开的一些优选实施方案中，所述生长因子选自转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF和血管内皮生长因子VEGF。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞凋亡诱导物或抑制物选自Bax、Bcl2和BcIX。

在本公开的一些优选实施方案中，所述细胞生长抑制剂选自p21、p16和Rb。

在本公开的一些优选实施方案中所述自杀基因选自胸苷激酶(TK)、胸苷酸激酶、胞嘧啶脱氨酶(CDase)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)。

在一方面，本公开提供了一种DNA，所述DNA可被转录而产生所述的溶瘤病毒。

在本公开的一些优选实施方案中，所述DNA是马脑炎病毒减毒株的感染性克隆。

在本公开的一些优选实施方案中，所述感染性克隆是质粒。

在一方面，本公开提供了一种细胞，其包含所述溶瘤病毒或所述DNA。

在一方面，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含所述溶瘤病毒、所述DNA和/或所述细胞。

在一方面，本公开提供了一种所述溶瘤病毒、所述DNA、所述细胞和/或所述组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途。

在本公开的一些优选实施方案中，所述肿瘤和/或癌症选自黑色素瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌和宫颈癌。

在本公开的一些优选实施方案中，所述药物可一次或多次给药。

在本公开的一些优选实施方案中，所述药物可局部或全身给药。

本文的实施方案提供了以适于体内药物施用的生物相容形式向受试者施用组合物。“适于体内给药的生物相容形式”是指待施用的活性剂(例如，实施方案的药剂)的形式，其中活性剂的治疗效果超过任何毒性作用。治疗有效量的治疗组合物的施用定义为在实现期望结果必需的剂量和时间段上有效的量。例如，化合物的治疗活性量可以随诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。

在一个实施方案中，化合物(例如，实施方案的活的减毒病毒)可以以方便的方式施用，例如，皮下、静脉内、通过口服施用、吸入、皮内、透皮应用、阴道内应用、局部施用、鼻内或直肠施用。根据施用途径，活性化合物可以包含在保护性缓冲液(例如清蛋白和海藻糖、泊洛沙姆407/海藻糖/清蛋白(FTA))中。在一个实施方案中，组合物可以口服施用。在另一个实施方案中，组合物可以静脉内施用。在一个实施方案中，组合物可以鼻内施用，例如吸入。在另一个实施方案中，组合物可以使用无针系统(例如

)或其他皮内施用系统皮内施用。

在某些实施方案中，活的减毒溶瘤病毒(例如，委内瑞拉马脑炎溶瘤病毒可以以稳定配制剂(例如清蛋白和海藻糖；FTA，或用于稳定活的减毒病毒的其他配制剂)施用于儿童或年轻人。如本文所用，“药学可接受载体”还可以包括稀释剂，例如盐水和水性缓冲溶液。可能有必要将活的减毒病毒配制剂与防止其失活的材料组合或将化合物与防止其失活的材料共施用。在某些实施方案中，活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒的一种或多种配制剂可以以初始剂量，接着在加强剂中对受试者皮下或皮内施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散剂。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂，以防止微生物的生长或其他稳定化配方(例如，用于稳定化活的减毒马脑炎病毒或其他稳定配制剂)。

适于可注射使用的药物组合物可以通过本领域已知的手段施用。例如，可以使用无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在一些实施方案中，组合物可以是无菌的并且可以是流体以易于可注射性。药学可接受载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，通过在分散体的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过添加各种抗细菌剂或抗真菌剂或其他试剂来实现微生物的预防。

在一些实施方案中，在配制时，溶液可以以与剂量配制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。根据这些实施方案，配制剂可以容易地以多种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型。

在某些实施方案中，单剂或多剂减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)配制剂也可以施用于受试者。在一些实施方案中，可以用单剂配制剂治疗受试者。在其他实施方案中，可以用至少两剂活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒配制剂治疗受试者。在某些实施方案中，受试者可以在第0天施用减毒委内瑞拉马脑炎病毒组合物，并在第一剂的约3个月内施用加强剂量。在某些实施方案中，受试者是从未暴露于委内瑞拉马脑炎病毒的未免疫受试者(血清阴性)。在其他实施方案中，受试者可以先前暴露于委内瑞拉马脑炎病毒和/或委内瑞拉马脑炎病毒感染(血清阳性)。根据这些实施方案，血清阴性受试者可以在第0天进行治疗，然后在第一剂的6个月内、5个R内、4个月内、3个月内或更小接受加强剂，以便对委内瑞拉马脑炎病毒产生增强的免疫应答。在某些实施方案中，儿童可以是约2岁至约17岁龄的儿童。在其他实施方案中，儿童是2岁至17岁龄。

在另一个实施方案中，鼻用溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂可以用于将活的减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒配制剂递送至受试者。某些配制剂可以包含赋形剂，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可以用载体制备药物组合物，所述载体保护活性成分免于从体内快速消除，例如定时释放配制剂或涂层材料。此类载体可以包括受控释放配制剂，例如但不限于微包囊的递送系统和可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚乳酸和已知的其它物质。

在某些实施方案中，活的减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)的剂量范围可以是最初施用的约10²至约10⁶PFU，并且任选地，然后是根据需要在30天内或之后长达12个月的至少第二次施用。

在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在一剂或多剂中施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物可以以单剂或两剂或更多在预先确定的时间段内，包括但不限于约6个月内、约120天内、约90天内、约80天内、约70天内、约60天内、约50天内、约40天内、约30天内、约20天内、约10天内、约5天内或更小，或者在同一天在几小时或几分钟内施用于受试者或者在相同或不同解剖位置中同时施用。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在彼此的约90天内、在彼此的约60天内、在彼此的约30天内、以及在彼此的小于约30天内施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以皮下或皮内施用于受试者。在两个或更多个解剖部位中的施用可以包括施用的任何组合，包括在两个或更多个解剖部位中通过相同模式或者通过包括两个分开的解剖部位的两种不同模式。根据这些实施方案，两个或更多个解剖部位可以包括身体的不同肢体或不同区域。在某些实施方案中，可以在第0天在相同或多个解剖学位置中将两剂疫苗组合物连续导入受试者，例如以提供保护而免于所有马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)血清型(例如，交叉保护)。在其他实施方案中，药物组合物可以包括活的委内瑞拉马脑炎溶瘤病毒与针对其他马脑炎病毒(例如，东部马脑炎病毒、西部马脑炎病毒)的其他免疫原性试剂的组合。在某些实施方案中，本文公开的针对委内瑞拉马脑炎病毒的疫苗可以用于减少其他相关的病毒感染，例如东部马脑炎病毒感染。

在一些实施方案中，可以使用本文中公开的药物组合物来增加受试者中靶配制剂的免疫应答，其通过在接受此类针对马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒的药物组合物的儿童或年轻人中组合针对马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒的免疫原性组合物与加强CD8+T细胞应答或针对委内瑞拉马脑炎病毒的其他免疫应答的试剂进行。

通过局部应用的含有治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂的乳膏、凝胶、冲洗液等完成局部施用。通过应用能够使丝氨酸蛋白酶抑制剂穿透皮肤并进入血流的乳膏、冲洗液、凝胶等完成经皮施用。另外，渗透泵可以用于施用。必要的剂量将随着所治疗的具体状况、施用方法和分子从身体清除的速率而变化。

其他实施方案涉及减少活的减毒病毒失活的方法，包括但不限于组合一种或多种活的减毒病毒与能够减少活的减毒病毒(例如马脑炎病毒)失活的组合物。这些组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂；一种或多种糖或多元醇试剂；和任选地一种或多种EO-PO嵌段共聚物，其中所述组合物可以减少失活或稳定化活的减毒病毒。

在某些实施方案中，本文涵盖的组合物可以部分或完全脱水或水合。在其他实施方案中，涵盖用于本文的药物或非药物组合物的稳定蛋白质试剂可包括但不限于乳清蛋白、人血清清蛋白、重组人血清清蛋白(rHSA)、牛血清清蛋白(BSA)、其他血清清蛋白或清蛋白基因家族成员。糖或多元醇试剂可以包括但不限于单糖、二糖、糖醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、laminaribose、木二糖、甘露二糖、乳糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、棉子糖、淀粉酶、环糊精、壳聚糖或纤维素。在某些实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂，例如烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(EO-PO嵌段共聚物)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、烷基多聚葡萄糖苷(例如蔗糖单硬脂酸酯，月桂基二葡糖苷或单月桂酸山梨糖醇酯(sorbitanmonolaureate)、辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(鲸蜡醇或油醇(olelylalcohol))或椰油酰胺(cocamides)(椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA)。

在其他实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于泊洛沙姆407(例如Pluronic

)、替换泊洛沙姆407或除泊洛沙姆407之外的泊洛沙姆335、338或238、或与

具有类似特性的其他EO-PO嵌段共聚物。

在一些实施方案中，疫苗组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂，其为血清清蛋白；一种或多种海藻糖糖类；和一种或多种表面活性剂聚合物试剂，例如EO-PO嵌段共聚物、泊洛沙姆407或更具体地，Pluronic

在其他实施方案中，用于稳定化活病毒的配制剂可以包含一种或多种活马脑炎病毒、一种或多种碳水化合物试剂和一种或多种氨基酸或其盐、酯或酰胺衍生物。在其他实施方案中，本文使用的配制剂稳定化活的减毒马脑炎病毒用于商业用途。在一些实施方案中，组合物还包含缓冲剂。根据这些实施方案，缓冲液可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。根据这些实施方案，缓冲剂可以包括氯化钠(NaCl)、磷酸一钠和/或磷酸二钠(Na₂HPO₄)、氯化钾(KCl)和磷酸钾(KH₂PO₄)中的至少一种。在一些实施方案中，组合物的缓冲剂可以包含浓度25mM至200mM的氯化钠。在其他实施方案中，本文公开的组合物可以包含尿素和/或MSG其他合适的试剂。

在一些实施方案中，活的减毒马脑炎病毒如委内瑞拉马脑炎病毒可以在配制剂中稳定化，所述配制剂包含但不限于浓度0.1％至0.2％(w/v)的重组HSA；和/或浓度约4.0％至约6.0％(w/v)的蔗糖；和/或浓度约2％至4％(w/v)的甘露醇浓度；和/或浓度约8.0mM至约22.0mM的丙氨酸；和/或浓度约1.0mM至约5.0mM的甲硫氨酸；和/或浓度约8.0mM至12.0mM的MSG；和/或浓度约0.1％至约0.3％(w/v)的尿素。在某些实施方案中，组合物可以包含重组HSA、海藻糖、甘露醇、丙氨酸、甲硫氨酸、MSG和尿素。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包含浓度约0.1％至约0.2％(w/v)的HSA；浓度约4％至约6％(w/v)的海藻糖；浓度约2％至约4％(w/v)的甘露醇；其中丙氨酸浓度为8mM至22mM；其中甲硫氨酸浓度为1mM至5mM；其中MSG浓度为8mM至12mM；其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。用于稳定化活的减毒病毒的某些配制剂可以包含但不限于重组HSA、蔗糖、丙氨酸和尿素。根据这些实施方案，HSA浓度可为约0.1％至约0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4％至约6％(w/v)；丙氨酸浓度可以为约8.0mM至约22mM；并且尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、蔗糖、甲硫氨酸和尿素。重组HSA浓度可以为约0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；甲硫氨酸浓度可以为约1.0mM至约5.0mM；尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化配制剂可以包含重组HSA、蔗糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度可以为0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为4％至6％(w/v)；精氨酸浓度可以为10mM至50mM；尿素浓度可以为0.1％至0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、海藻糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度为约0.1％至0.2％(w/v)；海藻糖浓度为约4％至6％(w/v)；精氨酸浓度为约10mM至50mM；尿素浓度为约0.1％至0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包括重组HSA、海藻糖、MSG和尿素。根据这些实施方案，重组HSA浓度可以为约0.1％至约0.2％(w/v)；海藻糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；其中MSG浓度为8mM至12mM；并且其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。

本文的一些实施方案涉及用于运输或其他原因的部分或完全脱水的活的减毒病毒组合物。根据这些实施方案，组合物可以是20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；或90％或更多脱水的。根据这些实施方案，在将药学可接受组合物施用受试者之前，病毒疫苗组合物可以脱水并在任何已知的稳定化组合物中再水合。

本文的实施方案提供了以适于体内药物施用的生物相容形式向受试者施用组合物。“适于体内给药的生物相容形式”是指待施用的活性剂(例如，实施方案的药剂)的形式，其中活性剂的治疗效果超过任何毒性作用。治疗有效量的治疗组合物的施用定义为在实现期望结果必需的剂量和时间段上有效的量。例如，化合物的治疗活性量可以随诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及抗体在个体中引发期望响应的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。

在一个实施方案中，化合物(例如，实施方案的活的减毒病毒)可以以方便的方式施用，例如，皮下、静脉内、通过口服施用、吸入、皮内、透皮应用、阴道内应用、局部施用、鼻内或直肠施用。根据施用途径，活性化合物可以包含在保护性缓冲液(例如清蛋白和海藻糖、泊洛沙姆407/海藻糖/清蛋白(FTA))中。在一个实施方案中，组合物可以口服施用。在另一个实施方案中，组合物可以静脉内施用。在一个实施方案中，组合物可以鼻内施用，例如吸入。在另一个实施方案中，组合物可以使用无针系统(例如

)或其他皮内施用系统皮内施用。

在某些实施方案中，活的减毒病毒疫苗(例如，委内瑞拉马脑炎病毒疫苗可以以稳定配制剂(例如清蛋白和海藻糖；FTA，或用于稳定活的减毒病毒的其他配制剂)施用于儿童或年轻人。如本文所用，“药学可接受载体”还可以包括稀释剂，例如盐水和水性缓冲溶液。可能有必要将活的减毒病毒配制剂与防止其失活的材料组合或将化合物与防止其失活的材料共施用。在某些实施方案中，活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒的一种或多种配制剂可以以初始剂量，接着在加强剂中对受试者皮下或皮内施用。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中以及在油中制备分散剂。在通常的储存和使用条件下，这些制剂可以含有防腐剂，以防止微生物的生长或其他稳定化配方(例如，用于稳定化活的减毒马脑炎病毒或其他稳定配制剂)。

适于可注射使用的药物组合物可以通过本领域已知的手段施用。例如，可以使用无菌水溶液(在水溶性的情况下)或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在一些实施方案中，组合物可以是无菌的并且可以是流体以易于可注射性。药学可接受载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。例如，可以通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，通过在分散体的情况下维持需要的粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过添加各种抗细菌剂或抗真菌剂或其他试剂来实现微生物的预防。

在一些实施方案中，在配制时，溶液可以以与剂量配制剂相容的方式并以治疗有效的量施用。根据这些实施方案，配制剂可以容易地以多种剂型施用，例如上述可注射溶液的类型。

在某些实施方案中，单剂或多剂减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)配制剂也可以施用于受试者。在一些实施方案中，可以用单剂配制剂治疗受试者。在其他实施方案中，可以用至少两剂活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒配制剂治疗受试者。在某些实施方案中，受试者可以在第0天施用减毒委内瑞拉马脑炎病毒组合物，并在第一剂的约3个月内施用加强剂量。在某些实施方案中，受试者是从未暴露于委内瑞拉马脑炎病毒的未免疫受试者(血清阴性)。在其他实施方案中，受试者可以先前暴露于委内瑞拉马脑炎病毒和/或委内瑞拉马脑炎病毒感染(血清阳性)。根据这些实施方案，血清阴性受试者可以在第0天进行治疗，然后在第一剂的6个月内、5个月内、4个月内、3个月内或更小接受加强剂，以便对委内瑞拉马脑炎病毒产生增强的免疫应答。在某些实施方案中，儿童可以是约2岁至约17岁龄的儿童。在其他实施方案中，儿童是2岁至17岁龄。

在另一个实施方案中，鼻用溶液或喷雾剂、气溶胶或吸入剂可以用于将活的减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒配制剂递送至受试者。某些配制剂可以包含赋形剂，例如，药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。

可以用载体制备药物组合物，所述载体保护活性成分免于从体内快速消除，例如定时释放配制剂或涂层材料。此类载体可以包括受控释放配制剂，例如但不限于微包囊的递送系统和可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚乳酸和已知的其它物质。

在某些实施方案中，活的减毒马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)的剂量范围可以是最初施用的约10²至约10⁶PFU，并且任选地，然后是根据需要在30天内或之后长达12个月的至少第二次施用。

在某些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在一剂或多剂中施用于受试者。在一些实施方案中，本文公开的免疫原性组合物可以以单剂或两剂或更多在预先确定的时间段内，包括但不限于约6个月内、约120天内、约90天内、约80天内、约70天内、约60天内、约50天内、约40天内、约30天内、约20天内、约10天内、约5天内或更小，或者在同一天在几小时或几分钟内施用于受试者或者在相同或不同解剖位置中同时施用。在一些实施方案中，本文公开的药物组合物可以在彼此的约90天内、在彼此的约60天内、在彼此的约30天内、以及在彼此的小于约30天内施用。在一些实施方案中，本文公开的组合物可以皮下或皮内施用于受试者。在两个或更多个解剖部位中的施用可以包括施用的任何组合，包括在两个或更多个解剖部位中通过相同模式或者通过包括两个分开的解剖部位的两种不同模式。根据这些实施方案，两个或更多个解剖部位可以包括身体的不同肢体或不同区域。在某些实施方案中，可以在第0天在相同或多个解剖学位置中将两剂疫苗组合物连续导入受试者，例如以提供保护而免于所有马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)血清型(例如，交叉保护)。在其他实施方案中，药物组合物可以包括活的减毒委内瑞拉马脑炎病毒与针对其他马脑炎病毒(例如，委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒)的其他免疫原性试剂的组合。在某些实施方案中，本文公开的针对委内瑞拉马脑炎病毒的疫苗可以用于减少其他相关的病毒感染，例如东部马脑炎病毒感染。

在一些实施方案中，可以使用本文中公开的药物组合物来增加受试者中靶配制剂的免疫应答，其通过在接受此类针对马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒的药物组合物的儿童或年轻人中组合针对马脑炎病毒(例如委内瑞拉马脑炎病毒)病毒的免疫原性组合物与加强CD8+T细胞应答或针对委内瑞拉马脑炎病毒的其他免疫应答的试剂进行。

通过局部应用的含有治疗有效量的丝氨酸蛋白酶抑制剂的乳膏、凝胶、冲洗液等完成局部施用。通过应用能够使丝氨酸蛋白酶抑制剂穿透皮肤并进入血流的乳膏、冲洗液、凝胶等完成经皮施用。另外，渗透泵可以用于施用。必要的剂量将随着所治疗的具体状况、施用方法和分子从身体清除的速率而变化。

其他实施方案涉及减少活的减毒病毒失活的方法，包括但不限于组合一种或多种活的减毒病毒与能够减少活的减毒病毒(例如马脑炎病毒)失活的组合物。这些组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂；一种或多种糖或多元醇试剂；和任选地一种或多种EO-PO嵌段共聚物，其中所述组合物可以减少失活或稳定化活的减毒病毒。

在某些实施方案中，本文涵盖的组合物可以部分或完全脱水或水合。在其他实施方案中，涵盖用于本文的药物或非药物组合物的稳定蛋白质试剂可包括但不限于乳清蛋白、人血清清蛋白、重组人血清清蛋白(rHSA)、牛血清清蛋白(BSA)、其他血清清蛋白或清蛋白基因家族成员。糖或多元醇试剂可以包括但不限于单糖、二糖、糖醇、海藻糖、蔗糖、麦芽糖、异麦芽糖、纤维二糖、龙胆二糖、laminaribose、木二糖、甘露二糖、乳糖、果糖、山梨糖醇、甘露醇、乳糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、棉子糖、淀粉酶、环糊精、壳聚糖或纤维素。在某些实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于非离子表面活性剂，例如烷基聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(EO-PO嵌段共聚物)、聚(乙烯基吡咯烷酮)、烷基多聚葡萄糖苷(例如蔗糖单硬脂酸酯，月桂基二葡糖苷或单月桂酸山梨糖醇酯(sorbitanmonolaureate)、辛基葡糖苷和癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(鲸蜡醇或油醇(olelylalcohol))或椰油酰胺(cocamides)(椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA和椰油酰胺TEA)。

在其他实施方案中，表面活性剂可以包括但不限于泊洛沙姆407(例如Pluronic

)、替换泊洛沙姆407或除泊洛沙姆407之外的泊洛沙姆335、338或238、或与

具有类似特性的其他EO-PO嵌段共聚物。

在一些实施方案中，疫苗组合物可以包括但不限于一种或多种蛋白质试剂，其为血清清蛋白；一种或多种海藻糖糖类；和一种或多种表面活性剂聚合物试剂，例如EO-PO嵌段共聚物、泊洛沙姆407或更具体地，Pluronic

在其他实施方案中，用于稳定化活病毒的配制剂可以包含一种或多种活马脑炎病毒、一种或多种碳水化合物试剂和一种或多种氨基酸或其盐、酯或酰胺衍生物。在其他实施方案中，本文使用的配制剂稳定化活的减毒马脑炎病毒用于商业用途。在一些实施方案中，组合物还包含缓冲剂。根据这些实施方案，缓冲液可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐水(PBS)。根据这些实施方案，缓冲剂可以包括氯化钠(NaCl)、磷酸一钠和/或磷酸二钠(Na2HPO4)、氯化钾(KCl)和磷酸钾(KH₂PO₄)中的至少一种。在一些实施方案中，组合物的缓冲剂可以包含浓度25mM至200mM的氯化钠。在其他实施方案中，本文公开的组合物可以包含尿素和/或MSG其他合适的试剂。

在一些实施方案中，活的减毒马脑炎病毒如委内瑞拉马脑炎病毒可以在配制剂中稳定化，所述配制剂包含但不限于浓度0.1％至0.2％(w/v)的重组HSA；和/或浓度约4.0％至约6.0％(w/v)的蔗糖；和/或浓度约2％至4％(w/v)的甘露醇浓度；和/或浓度约8.0mM至约22.0mM的丙氨酸；和/或浓度约1.0mM至约5.0mM的甲硫氨酸；和/或浓度约8.0mM至12.0mM的MSG；和/或浓度约0.1％至约0.3％(w/v)的尿素。在某些实施方案中，组合物可以包含重组HSA、海藻糖、甘露醇、丙氨酸、甲硫氨酸、MSG和尿素。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包含浓度约0.1％至约0.2％(w/v)的HSA；浓度约4％至约6％(w/v)的海藻糖；浓度约2％至约4％(w/v)的甘露醇；其中丙氨酸浓度为8mM至22mM；其中甲硫氨酸浓度为1mM至5mM；其中MSG浓度为8mM至12mM；其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。用于稳定化活的减毒病毒的某些配制剂可以包含但不限于重组HSA、蔗糖、丙氨酸和尿素。根据这些实施方案，HSA浓度可为约0.1％至约0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4％至约6％(w/v)；丙氨酸浓度可以为约8.0mM至约22mM；并且尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、蔗糖、甲硫氨酸和尿素。重组HSA浓度可以为约0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；甲硫氨酸浓度可以为约1.0mM至约5.0mM；尿素浓度可以为约0.1％至约0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化配制剂可以包含重组HSA、蔗糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度可以为0.1％至0.2％(w/v)；蔗糖浓度可以为4％至6％(w/v)；精氨酸浓度可以为10mM至50mM；尿素浓度可以为0.1％至0.3％(w/v)。其他稳定化配制剂可以包括重组HSA、海藻糖、精氨酸和尿素，其中重组HSA浓度为约0.1％至0.2％(w/v)；海藻糖浓度为约4％至6％(w/v)；精氨酸浓度为约10mM至50mM；尿素浓度为约0.1％至0.3％(w/v)。在其他实施方案中，稳定化组合物可以包括重组HSA、海藻糖、MSG和尿素。根据这些实施方案，重组HSA浓度可以为约0.1％至约0.2％(w/v)；海藻糖浓度可以为约4.0％至约6.0％(w/v)；其中MSG浓度为8mM至12mM；并且其中尿素浓度为0.1％至0.3％(w/v)。

本文的一些实施方案涉及用于运输或其他原因的部分或完全脱水的活的减毒病毒组合物。根据这些实施方案，组合物可以是20％或更多；30％或更多；40％或更多；50％或更多；60％或更多；70％或更多；80％或更多；或90％或更多脱水的。根据这些实施方案，在将药学可接受组合物施用受试者之前，病毒疫苗组合物可以脱水并在任何已知的稳定化组合物中再水合。

衣壳蛋白是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)的主要结构蛋白，可与病毒RNA结合后进一步与细胞膜结合完成病毒的出芽。且其还具有蛋白酶活性，可以在翻译过程中将其自身从多聚蛋白中的结构多肤上切割下来。作为VEEV的主要毒力因子，衣壳蛋白在宿主细胞内可抑制宿主基因转录并阻止哺乳动物细胞中的核输入。

本公开在委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)减毒活疫苗TC-83的基础上构建了缺失衣壳蛋白的感染性克隆。本公开实验证实，本公开的溶瘤病毒对8种肿瘤细胞系(包括Huh7(人肝癌上皮样细胞)、A549(人肺上皮细胞癌)、SKOV3(人卵巢上皮腺癌细胞)、4T1(小鼠乳腺上皮癌细胞)、HELA(人宫颈上皮腺癌细胞)、B16F1(小鼠黑色素瘤细胞)、A375(人皮肤上皮黑色素瘤)、A2058(人皮肤/淋巴结黑色素瘤))具备细胞杀伤活性。并且，本公开利用小鼠黑色素瘤荷瘤模型和人黑色素瘤裸鼠荷瘤模型，验证了本公开的溶瘤病毒以病毒剂量为1×10⁷PFU时在动物体内具有溶瘤作用，证实了本公开的溶瘤病毒具有良好的肿瘤靶向性以及抗肿瘤效果。本公开实验还证实，VEEV-delC病毒变体(包括仅有结构蛋白突变的变体、仅有非结构蛋白突变的变体以及具有结构蛋白突变和非结构蛋白突变的变体)具有很好的产毒能力，效果优于原始VEEV-delC病毒。

本公开与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1.本公开拯救缺失衣壳蛋白基因(Capsid基因)的委内瑞拉马脑炎病毒所采用的反向遗传学技术，具有先进成熟、方便简捷、定位可控等优点。

2.本公开拯救的缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒VEEV-dleC可用细胞培养的方法来大量扩增，获取方式比较简单。

3.本公开提供的VEEV-dleC病毒是一种减毒病毒，并且通过30代传代后，结构蛋白基因测序依然缺失衣壳蛋白基因。表明VEEV-dleC病毒具有很好的遗传稳定性，回复为野生型病毒的可能性很低，提高了该病毒作为溶瘤病毒的安全性。VEEV-delC病毒的蚀斑较VEEV-TC83(VEEV-wt)的小。

4.本公开提供的VEEV-dleC减毒病毒在体外多种细胞中充分证实其作为溶瘤病毒的作用。

5.本公开提供的VEEV-dleC减毒病毒在Nude小鼠和C57BL/6小鼠黑色素瘤模型中证实具有显著的溶瘤作用。

6.本公开提供的VEEV-dleC感染性克隆可以作为一种表达载体，在此基础上构建的eGFP-VEEV-dleCmut报告病毒感染性克隆可以方便快捷的用于将eGFP报告基因替换成其他外源基因的表达。

综上所述，本公开的缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒VEEV-dleC，可以作为一种安全有效的溶瘤病毒，具有良好的应用前景和十分重要的理论意义和现实意义。

实施例

本部分中所涉及的PCR，酶切，连接，转化，RNA的提取，RT-PCR等实验方法，如无特殊说明，均采用本领域的常规方法。以下列举的仅是本公开的若干个具体实施例。显然，本公开不限于以下实施例，还可以有许多变形。因此本领域的技术人员在本公开公开内容的基础上做的修改或改进，均应属于本公开要求保护的范围。

实施例1：缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)疫苗株TC-83感染性克隆的构建及病毒的拯救

本实施例通过探索缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)疫苗株TC-83构建感染性克隆。

1.缺失衣壳蛋白全部基因(VEEV-delC)感染性克隆的构建

根据VEEV-TC83序列(GenBank accession no.DQ322637.1)，合成2条引物，其序列如表1中P3-nsp4+E3-F1和P4-E1-R1所示。

表1.缺失衣壳蛋白基因的VEEV疫苗株感染性克隆构建所用引物

P3-nsp4+E3-F1	catcgatggcgcgccaccatgtcactagtgaccaccatgtg(SEQ ID NO 2)
		P4-E1-R1	caatagagtgttctcccac(SEQ ID NO 3)

VEEV-delC片段以VEEV-TC83为模版，以P3-nsp4+E3-F1和P4-E1-R1为引物，用PrimeSTARMAX酶(购于Takara公司)进行PCR扩增，回收PCR产物。

以上扩增的PCR反应体系均为：98℃2min，98℃20s，55℃10s，68℃15s，68℃10min，30个循环。

回收后的片段分别用ASCI和SnaBI进行双酶切，与用相同酶处理的全长感染性克隆VEEV-TC83连接后，获得重组质粒，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞HB101，筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取重组质粒，将经过DNA测序鉴定为正确的重组质粒命名为感染性克隆质粒VEEV-delC。VEEV-delC和缺失衣壳蛋白全部基因，和VEEV-TC83对比的结构图见图1A。VEEV-delC的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。

2.质粒的线性化和酚氯仿抽提

用NotI酶切10μg质粒VEEV-delC，37℃酶切两小时，经0.8％琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切完全后，向酶切产物中加入100μl饱和酚(购自国药集团化学试剂公司)，振荡混匀，17000g离心5min，吸取上清于新的离心管中，并向原离心管中加入100μl无菌水振荡混匀，17000g离心5min；吸取上清与上一步所得上清合并(总体积约200μl)，加入200μl氯仿(购自国药集团化学试剂公司)混匀，17000g离心5min；吸取上清于无RNAase的离心管中(约150～200μl)，加入十分之一体积的pH5.2，3mol/l醋酸钠(购自国药集团化学试剂公司)和2.5倍体积无水乙醇(购自国药集团化学试剂公司)混匀，-20℃放置30min，17000g离心5min；吸弃上清，加入1ml70％乙醇洗涤，17000g离心5min，吸弃上清，获得酚氯仿抽提的线性化产物；室温放置15min，最后加入11μl无RNAase的水溶解，使用Thermo Scientific NanoDrop2000测定DNA的浓度，使用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量，于-20℃保存备用。

3.体外转录得到重组VEEV-delC的RNA

取1μg上述步骤2酚氯仿抽提的线性化产物作为模板，使用体外转录试剂盒T7mMESSAGE mMACHINE kit(购自美国Ambion公司)，按照试剂盒说明书得到重组VEEV-delC的RNA。用Thermo Scientific NanoDrop 2000测定RNA的浓度，使用0.8％新鲜制备的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量，于-80℃保存备用。

4.病毒拯救重组VEEV-delC

(1)实验组：转染VEEV-delC RNA组；

(2)对照组：无VEEV-delC RNA的培养基组；

将步骤3体外转录得到的重组VEEV-delC的RNA使用脂质体转染的方法转染于BHK-21细胞。于转染前一天，接种2×10⁵个BHK-21细胞于35mm细胞培养皿中，每皿放置三个10mm×10mm盖玻片，使细胞在转染当天达到约80％；转染时，先弃培养皿中培养基，用1mlOpti-MEM洗一次，再加1mlOpti-MEM(使细胞处于浸润状态)；于1.5mlEP管中加入1mlOpti-MEM，加4ulDMRIE-C(DMRIE-C用前先混匀)先上下颠倒混匀，再分别加入1μg体外转录得到的重组VEEV-delC的RNA(对照组不加RNA)，上下颠倒混匀；迅速弃培养皿中Opti-MEM，将混匀物加入皿中(动作要轻，勿对着细胞吹打)；于37℃二氧化碳培养箱中培养4h后，弃培养物，再各加2mL含2％FBS的DMEM培养基。显微镜下观察实验组和对照组的细胞状态，并分别于转染后24、48、72h取一个玻片用5％丙酮固定液(购于国药集团化学试剂公司)对细胞进行固定，室温固定15分钟，PBS洗三遍后，于4℃保存，并于细胞病变明显时收集病毒上清，得到VEEV-delC病毒的P0代病毒，于-80℃保存。

5.间接免疫荧光(IFA)检测重组VEEV-delC的病毒蛋白表达

于室温环境下将上述步骤4中4℃保存的玻片孵育一抗，抗体为1∶250倍稀释的兔源的VEEVnsp1蛋白多克隆抗体。室温孵育一抗1～2h，PBS冲洗10遍后，于室温避光孵育二抗，抗体为1∶125倍稀释的偶联异硫氰酸荧光素(FITC)羊抗鼠抗体。二抗孵育1h后，PBS冲洗10遍，取出载玻片，做好标记，每个标记处，点一小点95％甘油，将盖玻片有细胞面朝下，置于甘油滴上，于荧光显微镜下使用200×放大倍数进行观察(图1B)。

结果显示重组的VEEV-delC随着转染后培养时间的延长，阳性细胞数目逐渐增加，表明VEEV-delC成功拯救出具有感染性的病毒颗粒。

6.IFA检测拯救得到的重组VEEV-delC病毒的感染情况：

将上述步骤4中收集的VEEV-delC病毒分A、B、C三株感染BHK-21细胞后96h进行IFA检测(图1C)，方法同前。结果表明重组的VEEV-delC可以产生具有感染性的病毒颗粒，但感染效率较低。

实施例2：VEEV-delC病毒的特点

本公开提供的VEEV-delC病毒具有遗传稳定性。

2.1.传代10代以上的VEEV-delC病毒质粒条带的比较

将实施例1拯救得到的VEEV-delC病毒(P0代)感染BHK-21细胞，5天后收集细胞上清(P1代)，每代平行传三株病毒，重复进行10次此步骤，获得P10代病毒。将P10代病毒分为三株，称为A株(VEEV-delC-A-P10)、B株(VEEV-delC-B-P10)和C株(VEEV-delC-B-P10)。将P10代病毒继续传代，获得B株P11代(VEEV-delC-B-P11)、A株P12代(VEEV-delC-A-P12)和C株P13代(VEEV-delC-C-P13)。将P0、P10-P13代收集的细胞提取RNA，于-80℃保存备用。用PrimeScript One Step RT-PCR Kit进行RT-PCR检测，引物为2201F：5’-ggcaaacctctggcagcagacgatg-3’(SEQ ID NO 4)和505-R：5’-gatgcttgtagcagctgat-3’(SEQ ID NO 5)。B株P10代(VEEV-delC-B-P10)和P11代(VEEV-delC-B-P11)、A株P12代(VEEV-delC-A-P12)和C株P13代(VEEV-delC-C-P13)的RT-PCR结果表明P10代的3株RT-PCR得到的目的带大小和VEEV-delC质粒PCR条带一致，均比VEEV-TC83的RT-PCR得到的目的带小(图2A)，说明通过10代以上传代后，VEEV-delC病毒的编码衣壳蛋白的基因(Capsid基因)仍然是缺失的。

2.2.取P10代收集的上清VEEV-delC病毒液进行蚀斑形态检测

在24孔细胞培养板的各孔中分别接种1×10⁵个BHK-21细胞，待细胞汇合度达到90％时，弃孔中的培养基，加入100μl用含2％FBS的DMEM培养基10倍比稀释的P10代收集的病毒，37℃吸附1h，每15分钟充分晃动一次。吸附完毕后将各个孔的病毒液吸弃，加入含有2％FBS的DMEM培养基和2％甲基纤维素的覆盖物，于37℃、5％CO₂的培养箱中培养3天，待蚀斑形成后用含有1％结晶紫和3.7％甲醛的染色液染色，室温处理30min后，取出孔中的染色液，并用流水冲洗孔底，烘干后即可计数换算成病毒滴度，同时观察蚀斑形态(图2B)。从图2B中可见，P10代的病毒蚀斑大小无明显差异，较为均一，VEEV-delC病毒的蚀斑较VEEV-TC83(VEEV-wt)的小。可见，VEEV-delC病毒较其野生型病毒的毒力降低。

2.3.将P13代A、B和C三株病毒按感染复数MOI为0.1的病毒剂量于BHK-21细胞中进行生长曲线比较

于35mm细胞培养皿中接种2×10⁵个BHK-21细胞，在37℃，5％CO₂培养条件下，待汇合度达到60％时，按照感染复数MOI为0.1，分别向每个皿中加入400μl稀释后的VEEV-delCA、B和C三株病毒，37℃、5％CO₂培养箱中吸附2h后，弃病毒液，每孔中加入2ml含2％胎牛血清的DMEM培养基，于37℃，5％CO₂培养条件下培养，分别于感染后每12h收400μl病毒上清并补加400μl含2％胎牛血清的DMEM培养基，收集的病毒作为A、B和C三株VEEV-delC病毒相同感染复数下不同时间点的病毒样，于-80℃保存。按照上述蚀斑实验方法测定不同时间点收集的病毒滴度，绘制生长曲线(图2C)。结果表明，A和C株VEEV-delC病毒生长较好，生长趋势相似，滴度可达到10⁶PFU/ml，B株复制不好。

进一步的将3株病毒在BHK-21细胞上进行传代至P20代，为了检测病毒复制的快慢，将C株P20代病毒上清感染BHK-21细胞和VERO细胞上检测其生长曲线。检测方法同实施例2.3。结果显示，P20代C株病毒在BHK-21细胞和VERO细胞上都能良好扩增，且其滴度都能达到10⁶-10⁷PFU/ml(图2D)。接着将病毒在BHK-21细胞上进行传代至P20代，且将P30代C株病毒在BHK-21细胞上按MOI＝0.1和0.01接毒后检测其生长情况，发现病毒能很好的在BHK-21细胞上复制，且其滴度都能达到10⁶-10⁷PFU/ml(图2E)。

实施例3：VEEV-delC病毒对体外肿瘤细胞的溶瘤作用

本实施例通过将实施例1制备的VEEV-delC病毒以固定MOI的剂量感染肿瘤细胞后，明场观察VEEV-delC对肿瘤细胞的杀伤作用(图3A)，并用CCK8检测不同剂量VEEV-delC对肿瘤细胞的杀伤来确定病毒的体外溶瘤效果(图3B)。其中：

3.1.明场观察VEEV-delC对肿瘤细胞的溶瘤作用

对照组(Mock)：不加病毒的培养基培养的肿瘤细胞组

实验组：加VEEV-delC病毒的培养基培养的肿瘤细胞组

分别将8种肿瘤细胞Huh7、A549、SKOV3、B16F1、4T1、HELA、A375、A2058按照8×10⁴个细胞/孔接种于12孔细胞培养板中，采用加有10％血清(FBS)的DMEM或1640培养基，在37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。细胞贴壁生长后将培养基换成2％FBS的DMEM培养基，并以MOI＝10的VEEV-delC病毒的剂量，在感染72小时后明场观察肿瘤细胞的死亡情况。

结果显示在检测的8种肿瘤细胞中VEEV-delC都能明显诱导肿瘤细胞的死亡或生长显著抑制(图3A)。以上结果初步表明了VEEV-delC在体外实验中具有广谱的溶瘤效果。

3.2.CCK8检测不同剂量VEEV-delC对肿瘤细胞的溶瘤作用

为进一步定量验证VEEV-delC的体外溶瘤作用，利用CCK8检测试剂盒检测不同MOI剂量感染后病毒对肿瘤细胞的溶瘤作用。

对照组(Mock)：不加病毒的培养基培养的肿瘤细胞组

实验组：加VEEV-delC病毒的培养基培养的肿瘤细胞组

测试方法为：分别将肿瘤细胞Huh7、A549、SKOV3、B16F1、4T1、HELA、A375、A2058按照4000个细胞/孔接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁生长后按照MOI分别为：0、0.001、0.01、0.1、1、10的剂量感染VEEV-delC，每组5个复孔。72小时后，利用CCK8检测试剂盒检测细胞活性。CCK8加入细胞后可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物，通过酶标仪检测波长450处读取的OD值间接反映活细胞数量，OD值的高低与细胞增殖情况成正比，与细胞毒性成反比。各组数据以无细胞与病毒的等体积DMEM培养基加CCK8为空白组，以未加病毒(MOI＝0)为对照组，计算公式＝(加病毒组-空白组)/(对照组-空白组)×100。结果通过GraphPadPrism7软件计算出平均值和标准差。结果绘制不同感染剂量VEEV-delC对各肿瘤细胞及正常细胞的细胞活性检测结果图。

结果如图3B所示，VEEV-delC对检测的8种肿瘤细胞具有明显的杀伤作用。且进一步观察不同MOI的作用发现，VEEV-delC对肿瘤细胞的杀伤呈明显的病毒感染剂量依赖性，随着病毒感染剂量的增加肿瘤细胞的死亡明显增加。此结果进一步确定了VEEV-delC在体外实验中具有显著且广谱的溶瘤效果。

实施例4：VEEV-delC病毒对体内小鼠黑色素瘤的溶瘤作用

本实施例研究VEEV-delC给毒后在体内对小鼠黑色素瘤的溶瘤作用。通过C57小鼠上鼠黑色素瘤细胞B16F1模型检测给毒一次及多次给毒的治疗效果及安全性来说明VEEV-delC的体内溶瘤作用。

4.1.VEEV-delC病毒单次给药对小鼠体内肿瘤细胞的溶瘤作用

单次给毒实施过程如下：选择6-8周龄C57小鼠，皮下接种2×10⁵个鼠黑色素瘤细胞B16F1，至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成两组，一组给予每只1×10⁷PFUVEEV-delC，一组给予等体积2％FBSDMEM，直接注射于瘤体上进行治疗，每3天测量肿瘤体积及小鼠体重，15天后处死小鼠，收集肿瘤组织，并对其称重。肿瘤体积计算公式为(长×宽2)/2。实验过程如图4A所示。单次给VEEV-delC对B16F1小鼠黑色素瘤治疗效果如图4B-4F所示，肿瘤形态结果显示VEEV-delC单次给毒对部分小鼠B16F1肿瘤有治疗作用，部分小鼠治疗效果不明显(图4B)。同样，肿瘤重量(图4C)和体积大小(图4D)结果也说明VEEV-delC一定程度上抑制了肿瘤的生长。且如图4E所示，在VEEV-delC治疗后并不影响小鼠体重变化。进一步通过蚀斑检测组织病毒滴度，结果显示在检测的肿瘤组织、脑组织及脾组织和血清中均未检测到病毒(图4F)。

4.2.VEEV-delC病毒多次给药对小鼠体内肿瘤细胞的溶瘤作用

为了进一步提高VEEV-delC的治疗效果，尝试了多次给毒的策略，具体实施过程与一次给毒的差异在于多次给毒为每3天给毒一次，给毒4次即给毒15天后处死小鼠。实验过程如图5A所示。多次给VEEV-delC对B16F1小鼠黑色素瘤治疗结果如图5B-5F所示，肿瘤形态结果显示VEEV-delC多次给毒对小鼠B16F1肿瘤有显著治疗作用(图5B)。同样，肿瘤重量(图5C)和体积大小(图5D)结果也说明VEEV-delC明显抑制了肿瘤的生长。且如图5E所示，在VEEV-delC多次给毒治疗后并不影响小鼠体重变化。进一步通过蚀斑检测组织病毒滴度，结果显示在检测的肿瘤组织、脑组织及脾组织和血清中均未检测到病毒(图5F)。

以上体内B16F1小鼠荷瘤模型的实验结果说明，VEEV-delC能明显抑制C57小鼠上黑色素瘤的生长，且对小鼠体重没有影响，在小鼠各组织器官中也未检测到病毒的存在。

实施例5：VEEV-delC病毒对小鼠体内人黑色素瘤的溶瘤作用

本实施例研究VEEV-delC单次和多次给毒后VEEV-delC对人黑色素瘤的溶瘤作用。给毒方式分为单次给毒及多次给毒，具体实施方法如下：

选择4-5周龄NudeBab/c小鼠，皮下接种1×10⁷个人黑色素瘤细胞A375，至能触摸到移植瘤时，将小鼠分成三组，一组单次给予每只1×10⁷PFU VEEV-delC，一组每三天给予每只1×10⁷PFU VEEV-delC治疗，给毒四次，一组给予等体积2％FBS DMEM，直接注射于瘤体上进行治疗，并测量肿瘤体积及小鼠体重，处死小鼠后，收集肿瘤组织，并对其称重。结果发现，VEEV-delC多次给毒对人黑色素瘤肿瘤A375有显著抑制作用，单次给毒有一定治疗效果，但不如多次给毒有用(图6A)。同样，肿瘤重量(图6B)和体积大小(图6C)结果也说明VEEV-delC多次给毒明显抑制了A375肿瘤的生长。且如图6D所示，在VEEV-delC给毒治疗后都不影响小鼠体重变化。进一步通过蚀斑检测组织病毒滴度，结果显示在检测的肿瘤组织、脑组织及脾组织和血清中均未检测到病毒(图6E)。

以上体内裸鼠A375荷瘤模型的实验结果表明，VEEV-delC对人黑色素瘤也有显著的抑制作用，且对小鼠体重没有影响，在小鼠各组织器官中也未检测到病毒的存在。

实施例6：VEEV-delC病毒的变体

本实施例研究VEEV-delC病毒的变体及其功能。

6.1.P30代VEEV-delC病毒适应性突变

提取传代得到的P30代病毒的RNA，于-80℃保存备用。用PrimeScript One StepRT-PCR Kit进行RT-PCR检测，分别用VEEV-P1F/R、VEEV-P2F/R、VEEV-P3F/R和VEEV-P4F/R引物对扩增4条目的片段，引物序列如图表2所示，将得到的片段进行测序。

表2.适应性突变检测及适应性突变引入所用引物

VEEV-P1F	atgggcggcgcatgagagaagcccagacc(SEQ ID NO 6)
		VEEV-P1R	cttgccactcctctatcgtggcagtg(SEQ ID NO 7)
VEEV-P2F	ggcaacgaaataatgacggcagc(SEQ ID NO 8)
		VEEV-P2R	gcaccgtttgccttactgatttttg(SEQ ID NO 9)
VEEV-P3F	gaatagggtgatcactagagagg(SEQ ID NO 10)
		VEEV-P3R	tgccagcaagaatgggacatgcag(SEQ ID NO 11)
VEEV-P4F	cgtgacacctcctgatgggactagc(SEQ ID NO 12)
		VEEV-P4R	cggatgcggccgcgctcttcctttttttttttttt(SEQ ID NO 13)

与VEEV-delC的基因序列比对，发现传代后病毒出现的适应性突变位点如图7A所示。

6.2.VEEV-delC病毒突变体的产毒情况

进一步的将测序得到的突变位点通过点突变的方式引入VEEV-delC感染性克隆中，得到仅有结构蛋白突变的VEEV-delC-Emut的VEEV-delC-E病毒突变体，仅有非结构蛋白突变的VEEV-delC-nspmut的VEEV-delC-nsp病毒变体，以及包括全部突变位点的VEEV-delC-mut的VEEV-delC-ALL病毒变体。VEEV-delC-E病毒变体包括E1变体和E2变体，其中，E1变体在结构蛋白上具有N360Y突变(编码核酸由aat突变为tat，对应于SEQ ID NO 1第10255位核苷酸存在a到t突变)和I387F突变(编码核酸由att突变为ttt，对应于SEQ ID NO 1第10336位核苷酸存在a到t突变)；E2变体具有D234N突变(编码核酸由gat突变为aat，对应于SEQ ID NO 1第8840位核苷酸存在g到a突变)和I296T突变(编码核酸由tca突变为cca，对应于sEQ ID NO 1第8627位核苷酸存在t到c突变)。VEEV-delC-nsp病毒变体包括nsp2变体、nsp3变体和nsp4变体，其中，nsp2变体具有K281E突变(编码核酸由aaa突变为gaa，对应于SEQ ID NO 1第2490位核苷酸存在a到g突变)和P484L突变(编码核酸由ccg突变为ctg，对应于SEQ ID NO 1第3100位核苷酸存在c到t突变)；nsp3变体具有S260T突变(编码核酸由tca突变为aca，对应于SEQ ID NO 1第4809位核苷酸存在t到a突变)；nsp4变体具有T587A突变(编码核酸由act突变为gct，对应于SEQ ID NO 1第7461位核苷酸存在a到g突变)。图7B和7C中，VEEV-delC-ALL病毒变体具有上述所有突变；VEEV-delC-nsp病毒变体含全部非结构蛋白突变；VEEV-delC-E病毒变体含全部结构蛋白突变。

将引入适应性突变后的克隆转染BHK-21细胞后通过IFA检测病毒的产毒情况。结果发现，无论是单独引入结构蛋白突变或单独引入非结构蛋白突变或引入全部突变都能很好的产毒，且三者的产毒情况都优于原始VEEV-delC(图7B)。

6.3.VEEV-delC病毒变体的生长曲线

引入适应性突变后P0代病毒按MOI＝0.01感染后检测其在BHK-21中的生长曲线，具体方法如实施例2.3所示，结果表明三种适应性突变引入病毒都能很好的复制，且单独引入结构蛋白的突变与引入所有突变的病毒复制趋势一致(图7C)。

实施例7：携带外源基因的VEEV-delC病毒

本实施例研究携带外源基因的缺失衣壳蛋白基因的委内瑞拉马脑炎病毒疫苗株感染性克隆VEEV-delC。

7.1.eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆构建

将eGFP作为外源基因插入模型探究外源基因插入策略，构建插入外源基因eGFP的eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆。其构建方法如下：

将将实施例6构建的VEEV-delC-mut和实验室已有克隆eGFP-pCAGGS用NotI和PacI进行双酶切，连接后获得重组质粒，将所述重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞HB101，筛选阳性克隆；从阳性克隆中提取重组质粒，将经过DNA测序鉴定为正确的重组质粒命名为eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆。eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆示意图见图8A。

7.2.eGFP-VEEV-delC报告病毒拯救

上述eGFP-VEEV-delC-mut报告病毒感染性克隆按照实施例1中的方法线性化、酚氯仿抽提、体外转录RNA、转染BHK-21细胞，拯救获得eGFP-VEEV-delC报告病毒，通过在荧光显微镜下观察eGFP的表达情况，发现eGFP可以在BHK-21细胞上稳定表达(图8B)。

7.3.eGFP-VEEV-delC报告病毒生长曲线

eGFP-VEEV-delC-mut病毒按感染复数MOI为0.001于BHK-21细

胞中进行生长曲线比较：按照实施例2.3所述生长曲线测定过程检测MOI＝0.001感染BHK-21细胞后eGFP-VEEV-delC-mut病毒的生长趋势，结果表明，eGFP-VEEV-delC-mut在BHK-21中生长趋势与VEEV-delC-mut一致，且病毒滴度在感染后48小时达到峰值。

序列表

<110> 中国科学院武汉病毒研究所

<120> 一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒及其用途

<130> MTI21177

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 14512

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggcggcg catgagagaa gcccagacca attacctacc caaaatggag aaagttcacg 60

ttgacatcga ggaagacagc ccattcctca gagctttgca gcggagcttc ccgcagtttg 120

aggtagaagc caagcaggtc actgataatg accatgctaa tgccagagcg ttttcgcatc 180

tggcttcaaa actgatcgaa acggaggtgg acccatccga cacgatcctt gacattggaa 240

gtgcgcccgc ccgcagaatg tattctaagc acaagtatca ttgtatctgt ccgatgagat 300

gtgcggaaga tccggacaga ttgtataagt atgcaactaa gctgaagaaa aactgtaagg 360

aaataactga taaggaattg gacaagaaaa tgaaggagct cgccgccgtc atgagcgacc 420

ctgacctgga aactgagact atgtgcctcc acgacgacga gtcgtgtcgc tacgaagggc 480

aagtcgctgt ttaccaggat gtatacgcgg ttgacggacc gacaagtctc tatcaccaag 540

ccaataaggg agttagagtc gcctactgga taggctttga caccacccct tttatgttta 600

agaacttggc tggagcatat ccatcatact ctaccaactg ggccgacgaa accgtgttaa 660

cggctcgtaa cataggccta tgcagctctg acgttatgga gcggtcacgt agagggatgt 720

ccattcttag aaagaagtat ttgaaaccat ccaacaatgt tctattctct gttggctcga 780

ccatctacca cgagaagagg gacttactga ggagctggca cctgccgtct gtatttcact 840

tacgtggcaa gcaaaattac acatgtcggt gtgagactat agttagttgc gacgggtacg 900

tcgttaaaag aatagctatc agtccaggcc tgtatgggaa gccttcaggc tatgctgcta 960

cgatgcaccg cgagggattc ttgtgctgca aagtgacaga cacattgaac ggggagaggg 1020

tctcttttcc cgtgtgcacg tatgtgccag ctacattgtg tgaccaaatg actggcatac 1080

tggcaacaga tgtcagtgcg gacgacgcgc aaaaactgct ggttgggctc aaccagcgta 1140

tagtcgtcaa cggtcgcacc cagagaaaca ccaataccat gaaaaattac cttttgcccg 1200

tagtggccca ggcatttgct aggtgggcaa aggaatataa ggaagatcaa gaagatgaaa 1260

ggccactagg actacgagat agacagttag tcatggggtg ttgttgggct tttagaaggc 1320

acaagataac atctatttat aagcgcccgg atacccaaac catcatcaaa gtgaacagcg 1380

atttccactc attcgtgctg cccaggatag gcagtaacac attggagatc gggctgagaa 1440

caagaatcag gaaaatgtta gaggagcaca aggagccgtc acctctcatt accgccgagg 1500

acgtacaaga agctaagtgc gcagccgatg aggctaagga ggtgcgtgaa gccgaggagt 1560

tgcgcgcagc tctaccacct ttggcagctg atgttgagga gcccactctg gaagccgatg 1620

tcgacttgat gttacaagag gctggggccg gctcagtgga gacacctcgt ggcttgataa 1680

aggttaccag ctacgctggc gaggacaaga tcggctctta cgctgtgctt tctccgcagg 1740

ctgtactcaa gagtgaaaaa ttatcttgca tccaccctct cgctgaacaa gtcatagtga 1800

taacacactc tggccgaaaa gggcgttatg ccgtggaacc ataccatggt aaagtagtgg 1860

tgccagaggg acatgcaata cccgtccagg actttcaagc tctgagtgaa agtgccacca 1920

ttgtgtacaa cgaacgtgag ttcgtaaaca ggtacctgca ccatattgcc acacatggag 1980

gagcgctgaa cactgatgaa gaatattaca aaactgtcaa gcccagcgag cacgacggcg 2040

aatacctgta cgacatcgac aggaaacagt gcgtcaagaa agaactagtc actgggctag 2100

ggctcacagg cgagctggtg gatcctccct tccatgaatt cgcctacgag agtctgagaa 2160

cacgaccagc cgctccttac caagtaccaa ccataggggt gtatggcgtg ccaggatcag 2220

gcaagtctgg catcattaaa agcgcagtca ccaaaaaaga tctagtggtg agcgccaaga 2280

aagaaaactg tgcagaaatt ataagggacg tcaagaaaat gaaagggctg gacgtcaatg 2340

ccagaactgt ggactcagtg ctcttgaatg gatgcaaaca ccccgtagag accctgtata 2400

ttgacgaagc ttttgcttgt catgcaggta ctctcagagc gctcatagcc attataagac 2460

ctaaaaaggc agtgctctgc ggggatccca aacagtgcgg tttttttaac atgatgtgcc 2520

tgaaagtgca ttttaaccac gagatttgca cacaagtctt ccacaaaagc atctctcgcc 2580

gttgcactaa atctgtgact tcggtcgtct caaccttgtt ttacgacaaa aaaatgagaa 2640

cgacgaatcc gaaagagact aagattgtga ttgacactac cggcagtacc aaacctaagc 2700

aggacgatct cattctcact tgtttcagag ggtgggtgaa gcagttgcaa atagattaca 2760

aaggcaacga aataatgacg gcagctgcct ctcaagggct gacccgtaaa ggtgtgtatg 2820

ccgttcggta caaggtgaat gaaaatcctc tgtacgcacc cacctcagaa catgtgaacg 2880

tcctactgac ccgcacggag gaccgcatcg tgtggaaaac actagccggc gacccatgga 2940

taaaaacact gactgccaag taccctggga atttcactgc cacgatagag gagtggcaag 3000

cagagcatga tgccatcatg aggcacatct tggagagacc ggaccctacc gacgtcttcc 3060

agaataaggc aaacgtgtgt tgggccaagg ctttagtgcc ggtgctgaag accgctggca 3120

tagacatgac cactgaacaa tggaacactg tggattattt tgaaacggac aaagctcact 3180

cagcagagat agtattgaac caactatgcg tgaggttctt tggactcgat ctggactccg 3240

gtctattttc tgcacccact gttccgttat ccattaggaa taatcactgg gataactccc 3300

cgtcgcctaa catgtacggg ctgaataaag aagtggtccg tcagctctct cgcaggtacc 3360

cacaactgcc tcgggcagtt gccactggaa gagtctatga catgaacact ggtacactgc 3420

gcaattatga tccgcgcata aacctagtac ctgtaaacag aagactgcct catgctttag 3480

tcctccacca taatgaacac ccacagagtg acttttcttc attcgtcagc aaattgaagg 3540

gcagaactgt cctggtggtc ggggaaaagt tgtccgtccc aggcaaaatg gttgactggt 3600

tgtcagaccg gcctgaggct accttcagag ctcggctgga tttaggcatc ccaggtgatg 3660

tgcccaaata tgacataata tttgttaatg tgaggacccc atataaatac catcactatc 3720

agcagtgtga agaccatgcc attaagctta gcatgttgac caagaaagct tgtctgcatc 3780

tgaatcccgg cggaacctgt gtcagcatag gttatggtta cgctgacagg gccagcgaaa 3840

gcatcattgg tgctatagcg cggcagttca agttttcccg ggtatgcaaa ccgaaatcct 3900

cacttgaaga gacggaagtt ctgtttgtat tcattgggta cgatcgcaag gcccgtacgc 3960

acaatcctta caagctttca tcaaccttga ccaacattta tacaggttcc agactccacg 4020

aagccggatg tgcaccctca tatcatgtgg tgcgagggga tattgccacg gccaccgaag 4080

gagtgattat aaatgctgct aacagcaaag gacaacctgg cggaggggtg tgcggagcgc 4140

tgtataagaa gttcccggaa agcttcgatt tacagccgat cgaagtagga aaagcgcgac 4200

tggtcaaagg tgcagctaaa catatcattc atgccgtagg accaaacttc aacaaagttt 4260

cggaggttga aggtgacaaa cagttggcag aggcttatga gtccatcgct aagattgtca 4320

acgataacaa ttacaagtca gtagcgattc cactgttgtc caccggcatc ttttccggga 4380

acaaagatcg actaacccaa tcattgaacc atttgctgac agctttagac accactgatg 4440

cagatgtagc catatactgc agggacaaga aatgggaaat gactctcaag gaagcagtgg 4500

ctaggagaga agcagtggag gagatatgca tatccgacga ctcttcagtg acagaacctg 4560

atgcagagct ggtgagggtg catccgaaga gttctttggc tggaaggaag ggctacagca 4620

caagcgatgg caaaactttc tcatatttgg aagggaccaa gtttcaccag gcggccaagg 4680

atatagcaga aattaatgcc atgtggcccg ttgcaacgga ggccaatgag caggtatgca 4740

tgtatatcct cggagaaagc atgagcagta ttaggtcgaa atgccccgtc gaagagtcgg 4800

aagcctcctc accacctagc acgctgcctt gcttgtgcat ccatgccatg actccagaaa 4860

gagtacagcg cctaaaagcc tcacgtccag aacaaattac tgtgtgctca tcctttccat 4920

tgccgaagta tagaatcact ggtgtgcaga agatccaatg ctcccagcct atattgttct 4980

caccgaaagt gcctgcgtat attcatccaa ggaagtatct cgtggaaaca ccaccggtag 5040

acgagactcc ggagccatcg gcagagaacc aatccacaga ggggacacct gaacaaccac 5100

cacttataac cgaggatgag accaggacta gaacgcctga gccgatcatc atcgaagagg 5160

aagaagagga tagcataagt ttgctgtcag atggcccgac ccaccaggtg ctgcaagtcg 5220

aggcagacat tcacgggccg ccctctgtat ctagctcatc ctggtccatt cctcatgcat 5280

ccgactttga tgtggacagt ttatccatac ttgacaccct ggagggagct agcgtgacca 5340

gcggggcaac gtcagccgag actaactctt acttcgcaaa gagtatggag tttctggcgc 5400

gaccggtgcc tgcgcctcga acagtattca ggaaccctcc acatcccgct ccgcgcacaa 5460

gaacaccgtc acttgcaccc agcagggcct gctcgagaac cagcctagtt tccaccccgc 5520

caggcgtgaa tagggtgatc actagagagg agctcgaggc gcttaccccg tcacgcactc 5580

ctagcaggtc ggtctcgaga accagcctgg tctccaaccc gccaggcgta aatagggtga 5640

ttacaagaga ggagtttgag gcgttcgtag cacaacaaca atgacggttt gatgcgggtg 5700

catacatctt ttcctccgac accggtcaag ggcatttaca acaaaaatca gtaaggcaaa 5760

cggtgctatc cgaagtggtg ttggagagga ccgaattgga gatttcgtat gccccgcgcc 5820

tcgaccaaga aaaagaagaa ttactacgca agaaattaca gttaaatccc acacctgcta 5880

acagaagcag ataccagtcc aggaaggtgg agaacatgaa agccataaca gctagacgta 5940

ttctgcaagg cctagggcat tatttgaagg cagaaggaaa agtggagtgc taccgaaccc 6000

tgcatcctgt tcctttgtat tcatctagtg tgaaccgtgc cttctcaagc cccaaggtcg 6060

cagtggaagc ctgtaacgcc atgttgaaag agaactttcc gactgtggct tcttactgta 6120

ttattccaga gtacgatgcc tatttggaca tggttgacgg agcttcatgc tgcttagaca 6180

ctgccagttt ttgccctgca aagctgcgca gctttccaaa gaaacactcc tatttggaac 6240

ccacaatacg atcggcagtg ccttcagcga tccagaacac gctccagaac gtcctggcag 6300

ctgccacaaa aagaaattgc aatgtcacgc aaatgagaga attgcccgta ttggattcgg 6360

cggcctttaa tgtggaatgc ttcaagaaat atgcgtgtaa taatgaatat tgggaaacgt 6420

ttaaagaaaa ccccatcagg cttactgaag aaaacgtggt aaattacatt accaaattaa 6480

aaggaccaaa agctgctgct ctttttgcga agacacataa tttgaatatg ttgcaggaca 6540

taccaatgga caggtttgta atggacttaa agagagacgt gaaagtgact ccaggaacaa 6600

aacatactga agaacggccc aaggtacagg tgatccaggc tgccgatccg ctagcaacag 6660

cgtatctgtg cggaatccac cgagagctgg ttaggagatt aaatgcggtc ctgcttccga 6720

acattcatac actgtttgat atgtcggctg aagactttga cgctattata gccgagcact 6780

tccagcctgg ggattgtgtt ctggaaactg acatcgcgtc gtttgataaa agtgaggacg 6840

acgccatggc tctgaccgcg ttaatgattc tggaagactt aggtgtggac gcagagctgt 6900

tgacgctgat tgaggcggct ttcggcgaaa tttcatcaat acatttgccc actaaaacta 6960

aatttaaatt cggagccatg atgaaatctg gaatgttcct cacactgttt gtgaacacag 7020

tcattaacat tgtaatcgca agcagagtgt tgagagaacg gctaaccgga tcaccatgtg 7080

cagcattcat tggagatgac aatatcgtga aaggagtcaa atcggacaaa ttaatggcag 7140

acaggtgcgc cacctggttg aatatggaag tcaagattat agatgctgtg gtgggcgaga 7200

aagcgcccta tttctgtgga gggtttattt tgtgtgactc cgtgaccggc acagcgtgcc 7260

gtgtggcaga ccccctaaaa aggctgttta agcttggcaa acctctggca gcagacgatg 7320

aacatgatga tgacaggaga agggcattgc atgaagagtc aacacgctgg aaccgagtgg 7380

gtattctttc agagctgtgc aaggcagtag aatcaaggta tgaaaccgta ggaacttcca 7440

tcatagttat ggccatgact actctagcta gcagtgttaa atcattcagc tacctgagag 7500

gggcccctat aactctctac ggctaacctg aatggactac gacatcgatg gcgcgccacc 7560

atgtcactag tgaccaccat gtgtctgctc gccaatgtga cgttcccatg tgctcaacca 7620

ccaatttgct acgacagaaa accagcagag actttggcca tgctcagcgt taacgttgac 7680

aacccgggct acgatgagct gctggaagca gctgttaagt gccccggaag gaaaaggaga 7740

tccaccgagg agctgtttaa tgagtataag ctaacgcgcc cttacatggc cagatgcatc 7800

agatgtgcag ttgggagctg ccatagtcca atagcaatcg aggcagtaaa gagcgacggg 7860

cacgacggtt atgttagact tcagacttcc tcgcagtatg gcctggattc ctccggcaac 7920

ttaaagggca ggaccatgcg gtatgacatg cacgggacca ttaaagagat accactacat 7980

caagtgtcac tctatacatc tcgcccgtgt cacattgtgg atgggcacgg ttatttcctg 8040

cttgccaggt gcccggcagg ggactccatc accatggaat ttaagaaaga ttccgtcaga 8100

cactcctgct cggtgccgta tgaagtgaaa tttaatcctg taggcagaga actctatact 8160

catcccccag aacacggagt agagcaagcg tgccaagtct acgcacatga tgcacagaac 8220

agaggagctt atgtcgagat gcacctcccg ggctcagaag tggacagcag tttggtttcc 8280

ttgagcggca gttcagtcac cgtgacacct cctgatggga ctagcgccct ggtggaatgc 8340

gagtgtggcg gcacaaagat ctccgagacc atcaacaaga caaaacagtt cagccagtgc 8400

acaaagaagg agcagtgcag agcatatcgg ctgcagaacg ataagtgggt gtataattct 8460

gacaaactgc ccaaagcagc gggagccacc ttaaaaggaa aactgcatgt cccattcttg 8520

ctggcagacg gcaaatgcac cgtgcctcta gcaccagaac ctatgataac cttcggtttc 8580

agatcagtgt cactgaaact gcaccctaag aatcccacat atctaatcac ccgccaactt 8640

gctgatgagc ctcactacac gcacgagctc atatctgaac cagctgttag gaattttacc 8700

gtcaccgaaa aagggtggga gtttgtatgg ggaaaccacc cgccgaaaag gttttgggca 8760

caggaaacag cacccggaaa tccacatggg ctaccgcacg aggtgataac tcattattac 8820

cacagatacc ctatgtccac catcctgggt ttgtcaattt gtgccgccat tgcaaccgtt 8880

tccgttgcag cgtctacctg gctgttttgc agatctagag ttgcgtgcct aactccttac 8940

cggctaacac ctaacgctag gataccattt tgtctggctg tgctttgctg cgcccgcact 9000

gcccgggccg agaccacctg ggagtccttg gatcacctat ggaacaataa ccaacagatg 9060

ttctggattc aattgctgat ccctctggcc gccttgatcg tagtgactcg cctgctcagg 9120

tgcgtgtgct gtgtcgtgcc ttttttagtc atggccggcg ccgcaggcgc cggcgcctac 9180

gagcacgcga ccacgatgcc gagccaagcg ggaatctcgt ataacactat agtcaacaga 9240

gcaggctacg caccactccc tatcagcata acaccaacaa agatcaagct gatacctaca 9300

gtgaacttgg agtacgtcac ctgccactac aaaacaggaa tggattcacc agccatcaaa 9360

tgctgcggat ctcaggaatg cactccaact tacaggcctg atgaacagtg caaagtcttc 9420

acaggggttt acccgttcat gtggggtggt gcatattgct tttgcgacac tgagaacacc 9480

caagtcagca aggcctacgt aatgaaatct gacgactgcc ttgcggatca tgctgaagca 9540

tataaagcgc acacagcctc agtgcaggcg ttcctcaaca tcacagtggg agaacactct 9600

attgtgacta ccgtgtatgt gaatggagaa actcctgtga atttcaatgg ggtcaaaata 9660

actgcaggtc cgctttccac agcttggaca ccctttgatc gcaaaatcgt gcagtatgcc 9720

ggggagatct ataattatga ttttcctgag tatggggcag gacaaccagg agcatttgga 9780

gatatacaat ccagaacagt ctcaagctct gatctgtatg ccaataccaa cctagtgctg 9840

cagagaccca aagcaggagc gatccacgtg ccatacactc aggcaccttc gggttttgag 9900

caatggaaga aagataaagc tccatcattg aaatttaccg cccctttcgg atgcgaaata 9960

tatacaaacc ccattcgcgc cgaaaactgt gctgtagggt caattccatt agcctttgac 10020

attcccgacg ccttgttcac cagggtgtca gaaacaccga cactttcagc ggccgaatgc 10080

actcttaacg agtgcgtgta ttcttccgac tttggtggga tcgccacggt caagtactcg 10140

gccagcaagt caggcaagtg cgcagtccat gtgccatcag ggactgctac cctaaaagaa 10200

gcagcagtcg agctaaccga gcaagggtcg gcgactatcc atttctcgac cgcaaatatc 10260

cacccggagt tcaggctcca aatatgcaca tcatatgtta cgtgcaaagg tgattgtcac 10320

cccccgaaag accatattgt gacacaccct cagtatcacg cccaaacatt tacagccgcg 10380

gtgtcaaaaa ccgcgtggac gtggttaaca tccctgctgg gaggatcagc cgtaattatt 10440

ataattggct tggtgctggc tactattgtg gccatgtacg tgctgaccaa ccagaaacat 10500

aattgataat taattaagta accgatacag cagcaattgg caagctgctt acatagaact 10560

cgcggcgatt ggcatgccgc tttaaaattt ttattttatt ttttcttttc ttttccgaat 10620

cggattttgt ttttaatatt tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 10680

aaaaaaaaaa aaggaagagc gcggccgcat ccggcgttca gcctgtgcca cagccgacag 10740

gatggtgacc accatttgcc ccatatcacc gtcggtactg atcccgtcgt caataaaccg 10800

aaccgctaca ccctgagcat caaactcttt tatcagttgg atcatgtcgg cggtgtcgcg 10860

gccaagacgg tcgagcttct tcaccagaat gacatcacct tcctccacct tcatcctcag 10920

caaatccagc ccttcccgat ctgttgaact gccggatgcc ttgtcggtaa agatgcggtt 10980

agcttttacc cctgcatctt tgagcgctga ggtctgcctc gtgaagaagg tgttgctgac 11040

tcataccagg cctgaatcgc cccatcatcc agccagaaag tgagggagcc acggttgatg 11100

agagctttgt tgtaggtgga ccagttggtg attttgaact tttgctttgc cacggaacgg 11160

tctgcgttgt cgggaagatg cgtgatctga tccttcaact cagcaaaagt tcgatttatt 11220

caacaaagcc gccgtcccgt caagtcagcg taatgctctg ccagtgttac aaccaattaa 11280

ccaattctga ttagaaaaac tcatcgagca tcaaatgaaa ctgcaattta ttcatatcag 11340

gattatcaat accatatttt tgaaaaagcc gtttctgtaa tgaaggagaa aactcaccga 11400

ggcagttcca taggatggca agatcctggt atcggtctgc gattccgact cgtccaacat 11460

caatacaacc tattaatttc ccctcgtcaa aaataaggtt atcaagtgag aaatcaccat 11520

gagtgacgac tgaatccggt gagaatggca aaagcttatg catttctttc cagacttgtt 11580

caacaggcca gccattacgc tcgtcatcaa aatcactcgc atcaaccaaa ccgttattca 11640

ttcgtgattg cgcctgagcg agacgaaata cgcgatcgct gttaaaagga caattacaaa 11700

caggaatcga atgcaaccgg cgcaggaaca ctgccagcgc atcaacaata ttttcacctg 11760

aatcaggata ttcttctaat acctggaatg ctgttttccc ggggatcgca gtggtgagta 11820

accatgcatc atcaggagta cggataaaat gcttgatggt cggaagaggc ataaattccg 11880

tcagccagtt tagtctgacc atctcatctg taacatcatt ggcaacgcta cctttgccat 11940

gtttcagaaa caactctggc gcatcgggct tcccatacaa tcgatagatt gtcgcacctg 12000

attgcccgac attatcgcga gcccatttat acccatataa atcagcatcc atgttggaat 12060

ttaatcgcgg cctcgagcaa gacgtttccc gttgaatatg gctcataaca ccccttgtat 12120

tactgtttat gtaagcagac agttttattg ttcatgatga tatattttta tcttgtgcaa 12180

tgtaacatca gagattttga gacacaacgt ggctttgttg aataaatcga acttttgctg 12240

agttgaagga tcagatcacg catcttcccg acaacgcaga ccgttccgtg gcaaagcaaa 12300

agttcaaaat caccaactgg tccacctaca acaaagctct catcaaccgt ggctccctca 12360

ctttctggct ggatgatggg gcgattcagg cctggtatga gtcagcaaca ccttcttcac 12420

gaggcagacc tcagcgctag cggagtgtat actggcttac tatgttggca ctgatgaggg 12480

tgtcagtgaa gtgcttcatg tggcaggaga aaaaaggctg caccggtgcg tcagcagaat 12540

atgtgataca ggatatattc cgcttcctcg ctcactgact cgctacgctc ggtcgttcga 12600

ctgcggcgag cggaaatggc ttacgaacgg ggcggagatt tcctggaaga tgccaggaag 12660

atacttaaca gggaagtgag agggccgcgg caaagccgtt tttccatagg ctccgccccc 12720

ctgacaagca tcacgaaatc tgacgctcaa atcagtggtg gcgaaacccg acaggactat 12780

aaagatacca ggcgtttccc cctggcggct ccctcgtgcg ctctcctgtt cctgcctttc 12840

ggtttaccgg tgtcattccg ctgttatggc cgcgtttgtc tcattccacg cctgacactc 12900

agttccgggt aggcagttcg ctccaagctg gactgtatgc acgaaccccc cgttcagtcc 12960

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggaaag acatgcaaaa 13020

gcaccactgg cagcagccac tggtaattga tttagaggag ttagtcttga agtcatgcgc 13080

cggttaaggc taaactgaaa ggacaagttt tggtgactgc gctcctccaa gccagttacc 13140

tcggttcaaa gagttggtag ctcagagaac cttcgaaaaa ccgccctgca aggcggtttt 13200

ttcgttttca gagcaagaga ttacgcgcag accaaaacga tctcaagaag atcatcttat 13260

taaggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 13320

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 13380

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacag ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat 13440

ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac 13500

tacgatacgg gagggcttac catctggccc cagtgctgca atgataccgc gagacccacg 13560

ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag 13620

tggtcctgca actttatccg cctccatcca gtctattaat tgttgccggg aagctagagt 13680

aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa cgttgttgcc attgctgcag gcatcgtggt 13740

gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt 13800

tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt 13860

cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact catggttatg gcagcactgc ataattctct 13920

tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt 13980

ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg ctcttgcccg gcgtcaacac gggataatac 14040

cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa 14100

actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa 14160

ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca 14220

aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct 14280

ttttcaatat tattgaagca tttatcaggg ttattgtctc atgagcggat acatatttga 14340

atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca tttccccgaa aagtgccacc 14400

tgacgtctaa gaaaccatta ttatcatgac attaacctat aaaaataggc gtatcacgag 14460

gccctttcgt cttcaagaat ttctagagga tccctaatac gactcactat ag 14512

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catcgatggc gcgccaccat gtcactagtg accaccatgt g 41

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

caatagagtg ttctcccac 19

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggcaaacctc tggcagcaga cgatg 25

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gatgcttgta gcagctgat 19

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgggcggcg catgagagaa gcccagacc 29

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cttgccactc ctctatcgtg gcagtg 26

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggcaacgaaa taatgacggc agc 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcaccgtttg ccttactgat ttttg 25

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaatagggtg atcactagag agg 23

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgccagcaag aatgggacat gcag 24

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtgacacct cctgatggga ctagc 25

<210> 13

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cggatgcggc cgcgctcttc cttttttttt ttttt 35

Claims (10)

1.一种基于马脑炎病毒的溶瘤病毒，所述溶瘤病毒为具有功能失活的衣壳蛋白基因的马脑炎病毒。

2.权利要求1所述的溶瘤病毒，其中，通过缺失、取代或插入使所述衣壳蛋白基因的功能失活；

优选地，通过缺失至少一部分所述衣壳蛋白基因使其功能失活；

更优选地，通过缺失全部所述衣壳蛋白基因使其功能失活。

3.权利要求1或2所述的溶瘤病毒，其中，所述马脑炎病毒选自委内瑞拉马脑炎病毒、东部马脑炎病毒和西部马脑炎病毒；

优选地，所述马脑炎病毒是委内瑞拉马脑炎病毒(VEEV)；

优选地，所述溶瘤病毒是基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒；优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒包含与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有80％或以上同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的核苷酸序列，更优选具有98％或99％以上同一性的核苷酸序列；优选地，所述溶瘤病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；优选地，所述溶瘤病毒在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列存在选自以下突变中的一种或多种突变：第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变和第7461位存在a到g突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒的核苷酸序列在SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中存在第2490位存在a到t突变、第3100位存在c到t突变、第4809位存在t到a突变、第7461位存在a到g突变、第8440位存在g到a突变、第8627位存在t到c突变、第10255位存在a到t突变和10336位存在a到t突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的蛋白具有选自以下的一种或多种的突变：

E1蛋白具有N360Y突变；

E1蛋白具有I387F突变；

E2蛋白具有D234N突变；

E2蛋白具有I296T突变；

nsp2蛋白具有K281E突变；

nsp2蛋白具有P484L突变；

nsp3蛋白具有S260T突变；

nsp4蛋白具有T587A突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E2蛋白具有D234N和I296T突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp2蛋白具有K281E和P484L突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp3蛋白具有S260T突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp4蛋白具有T587A突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变，E2蛋白具有D234N和I296T突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的nsp2蛋白具有K281E和P484L突变，nsp3蛋白具有S260T突变，nsp4蛋白具有T587A突变；

优选地，所述基于委内瑞拉马脑炎病毒的溶瘤病毒编码的E1蛋白具有N360Y和I387F突变，E2蛋白具有D234N和I296T突变，nsp2蛋白具有K281E和P484L突变，nsp3蛋白具有S260T突变，nsp4蛋白具有T587A突变。

4.根据权利要求1-3任一项所述的溶瘤病毒，其中，所述溶瘤病毒还至少包含编码至少一个外源基因的序列；

优选地，所述外源基因是治疗性基因；

优选地，所述治疗基因是免疫刺激性基因或自杀基因；

优选地，所述免疫刺激基因编码免疫刺激蛋白；优选地，所述免疫刺激蛋白选自细胞因子、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子(TNF)、集落刺激因子、暴露于APC(抗原呈递细胞)的蛋白、生长因子、I类或II类主要组织相容性复合物(MHC)组分、细胞凋亡诱导物或抑制物、细胞生长抑制剂、免疫毒素和免疫检查点抑制剂的免疫逃逸机制的阻滞物；

优选地，所述细胞因子是白细胞介素，更优选地，所述细胞因子选自IL-2、IL-6、IL-12、IL-15和IL-24；

优选地，所述趋化因子选自CXCL10、CXCL9和CXCL11；

优选地，所述干扰素选自IFNγ和IFNα；

优选地，所述集落刺激因子选自GM-CSF、G-CSF和M-CSF；

优选地，所述APC(抗原呈递细胞)的蛋白选自B7.1和B7.2；

优选地，所述生长因子选自转化生长因子TGF、成纤维细胞生长因子FGF和血管内皮生长因子VEGF；

优选地，所述细胞凋亡诱导物或抑制物选自Bax、Bcl2和BcIX；

优选地，所述细胞生长抑制剂选自p21、p16和Rb；

优选地，所述自杀基因选自胸苷激酶(TK)、胸苷酸激酶、胞嘧啶脱氨酶(CDase)和尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRTase)。

5.一种DNA，所述DNA可被转录而产生权利要求1-4任一项所述的溶瘤病毒；

优选地，所述DNA是马脑炎病毒减毒株的感染性克隆，优选地，所述感染性克隆是质粒。

6.一种细胞，所述细胞包含权利要求1-4所述的溶瘤病毒或权利要求5所述DNA。

7.一种组合物，所述组合物包含权利要求1-4所述的溶瘤病毒、权利要求5所述DNA和/或权利要求6所述的细胞。

8.权利要求1-4所述的溶瘤病毒、权利要求5所述DNA、权利要求6所述的细胞和/或权利要求7所述的组合物在制备用于治疗肿瘤和/或癌症的药物中的用途；

优选地，所述肿瘤和/或癌症选自黑色素瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌和宫颈癌。

9.如权利要求7或8所述的用途，所述药物可一次或多次给药。

10.如权利要求7-9任一项所述的用途，所述药物可局部或全身给药。

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