CN107603958A

CN107603958A - 融合表达TM‑1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

Info

Publication number: CN107603958A
Application number: CN201710908015.1A
Authority: CN
Inventors: 金天明; 李小慧; 张东超; 高珂珂; 林静; 李昕; 孟佳丽; 尚翠玲; 赵瑞利
Original assignee: Tianjin Agricultural University
Current assignee: Tianjin Agricultural University
Priority date: 2017-09-29
Filing date: 2017-09-29
Publication date: 2018-01-19

Abstract

本发明公开了一种融合表达TM‑1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，将鸡毒支原体TM‑1基因和鸡传染性喉气管炎gD基因克隆至穿梭载体pDC₃₁₅‑EGFP中，将构建成功的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3cre同时转染HEK293细胞，使两者在293细胞系中通过Cre/loxP重组酶系统实现同源重组，包装获得含有上述目的基因的重组腺病毒pBH‑TM‑1‑gD，扩增后获得高滴度的重组腺病毒；评价融合表达TM‑1基因和gD基因在腺病毒介导下对鸡毒支原体感染和鸡传染性喉气管炎病毒两种接触性呼吸道传染病的联合作用效果及相关机制。

Description

融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

技术领域

本发明涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。

背景技术

随着养殖业规模化和集约化的迅速发展，鸡慢性呼吸道病和鸡传染性喉气管炎已经成为严重威胁养鸡业的重要呼吸道传染病之一。鸡毒支原体感染引起鸡慢性呼吸道传染病，一旦感染很难清除，并且易继发鸡传染性喉气管炎、鸡传染性支气管炎、大肠杆菌等疾病；鸡传染性喉气管炎病毒感染后引起的鸡急性呼吸道疾病，无特效药。上述疾病的疫苗预防仍然是最有效的预防措施。目前，市售的弱毒疫苗和灭活疫苗可以在一定程度上控制和预防这两种疫病，但均存在一定缺陷。鸡毒支原体灭活疫苗无法阻止新毒株攻击，减毒疫苗易毒力返强，容易产生变异新毒株；鸡传染性喉气管炎减毒活疫苗易返祖，灭活疫苗效果较差。因此，临床上亟需一种新的研究策略来防治鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎的感染，应对以上问题。

目前，随着基因疗法的日益兴起，基因工程苗具备弱毒疫苗和灭活疫苗的优势，同时又能克服其不足，另外，基因工程二联苗可同时降低两种禽类呼吸道疾病的发病率，也可减低鸡毒支原体感染后继发鸡传染性喉气管炎病毒的几率，减少继发感染的发生，实现“一次免疫，预防两种疾病”目的。已成为应对鸡毒支原体、鸡传染性喉气管炎病毒感染或两者同时感染等一系列问题的研究重点和热点。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。将TM-1蛋白对鸡毒支原体感染的保护性、gD糖蛋白的对鸡传染性喉气管炎病毒感染过程中诱导高水平保护性抗体的特性和第三代腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以融合表达TM-1基因和gD基因的重组腺病毒，对腺病毒介导下TM-1蛋白、gD蛋白以及融合蛋白对鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎病毒感染的保护性研究。为进一步利用重组腺病毒研制鸡毒支原体病和鸡传染性喉气管炎两种禽类接触性呼吸道传染病二联基因工程活载体疫苗提供理论和实验基础。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，，包括以下步骤：

1)使用PCR法、双酶切及测序鉴定含有目的基因TM-1基因和gD基因的克隆载体；

所述的PCR法鉴定目的基因包括：以TM-1-F SEQ ID NO.1和TM-1-R SEQ ID NO.2为引物，以重组克隆载体pDC-TM-1质粒为模版，鉴定TM-1基因序列；以gD-F SEQ ID NO.3和gD-R SEQ ID NO.4为引物，以重组克隆载体pDC-gD为模版，鉴定gD基因序列；并且扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；

据GenBank中MG TM-1基因序列GI:S65869.1 SEQ ID NO.5设计引物：

TM-1-F：5′-GCGTCGACGCCACC ATGAATAAGAAAAGAATC-3′Sal I SEQ ID NO.1

TM-1-R：5′-CCCCGGG ATGGTGATGGTGATATGAACCGTTCTTCTTGCAT -3′ Xma I SEQ IDNO.2

根据GenBank中ILTV gD基因序列GI:EU817497.1 SEQ ID NO.6设计引物：

gD-F：5′-GGTCGAC GCCACC ATGCACCGTCCTCATCTCAGACG-3′ Sal I SEQ ID NO.3

gD-R：5′-CCCCGGGATGGTGATGGTGATGATGGCTACGCGCGCATTTACG-3′ Xma I SEQ IDNO.4下划线为限制性酶切位点，倾斜字体为Kozak序列，加粗字母为6×His序列；

3)将获得的目的基因分别克隆到pDC₃₁₅-EGFP穿梭载体中，将构建成功的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3cre经脂质体介导同时转染HEK293细胞，使在293细胞系中通过Cre/loxP重组酶系统实现同源重组，包装获得含有上述目的基因的重组腺病毒pBH-TM-1-gD。

上述融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

上述融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备防治鸡毒支原体引起的鸡慢性呼吸道病和鸡传染性喉气管炎病毒引起鸡急性呼吸道疾病的生物制品中的应用。

本发明的有益效果是：将保守性高，变异率低且免疫原性较好的鸡毒支原体TM-1基因和鸡传染性喉气管炎gD基因和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，构建出可以融合表达上述基因的重组腺病毒，检验在腺病毒介导下TM-1基因和gD 基因对鸡毒支原体感染和鸡传染性喉气管炎病毒引起的两种禽类接触性呼吸道传染病联合防治作用。为评价融合表达TM-1蛋白和gD蛋白的重组腺病毒在禽类呼吸道传染病中的作用。

附图说明

图1是目的基因TM-1基因和gD基因的RCR鉴定结果图(M:DL-2502 DNA分子质量标准；1：TM-1基因PCR扩增产物；2：gD基因PCR扩增产物)。

图2克隆载体pMD-TM-1和pMD-gD的双酶切鉴定结果图(M.DL2502 DNA分子质量标准；1.pMD-TM-1经Sal I和Xma I的双酶切产物；2.pMD-gD经EcoR I和Xma I的双酶切产物)。

图3是腺病毒穿梭载体的双酶切鉴定扩增结果图(M：DL-2502 DNA分子质量标准；1.pDC315-TM-1经Sal I和Xma I双酶切产物；2.pDC315-TM-1经Sal I和Xma I双酶切产物)。

图4是双基因腺病毒穿梭载体双酶切鉴定结果图(M.DL2502DNA分子质量标准；1.pDC315-TM-1-gD经EcoR I、Xma I和Sal I三酶切产物；2.pDC315-TM-1-gD经EcoR I 和SalI双酶切产物)。

图5是转染48h后荧光显微镜可观察到绿色荧光图(即P0代腺病毒结果；A.pBH-EGFP 转染293细胞48h荧光图(10×)；B.pBH-TM-1转染293细胞后48h荧光图(10×)；C.pBH-gD 转染293细胞后48h荧光图(10×)；D.pBH-TM-1-gD转染293细胞后48h荧光图(10×))。

图6是获得P4代双基因重组腺病毒荧光图(A.P4代pBH-EGFP转染293细胞48h荧光图(10×)；B.P4代pBH-TM-1-gD转染293细胞后48h荧光图(10×))。

图7是双基因重组腺病毒感染HEK293细胞后经RT-PCR检测目的基因的结果图(M.DL2501 DNA分子质量标准；1.pBH-TM-1-gD gD基因RT-PCR结果；2.pBH-TM-1-gD TM-1 基因RT-PCR结果)。

图8是Western blotting检测重组腺病毒感染HEK293细胞后各目的蛋白的表达情况图。

图9是免疫鸡体重变化图。

图10是28d时试验鸡脾脏指数图。

图11是不同免疫组抗体变化图(A.不同免疫组TM-1抗体水平；B.不同免疫组gD抗体水平)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：

随着分子生物学、免疫学、病理学及相关学科的发展，基因治疗现已成为疾病防治研究的热点。目前，腺病毒(adenovirus,Ad)载体疗法是基因治疗中最有前景的基因转移方法之一，它能有效的将外源基因传递到各种靶细胞或组织中，载体的构建和操作简单，宿主范围广，感染性强，可经不同途径进入不同组织，还能感染分化后的非分裂期细胞。

鸡慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease；CRD)是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum；MG)引起的鸡的一种以呼吸道临床症状为主的慢性、接触性传染病。该病的主要临床症状为咳嗽、流鼻液、呼吸啰音和张口呼吸。该病发展缓慢，病程较长，成年鸡多为隐形感染，可长期在鸡群中存在和蔓延。TM-1蛋白是一种溶血素膜蛋白，与MG 粘附宿主细胞相关，是诱导机体产生保护性免疫的主要抗原之一，保守性高，变异率低。 TM-1基因核苷酸序列比对结果显示，不同MG分离株的基因同源性达94％以上。基于该蛋白制备的亚单位疫苗对免疫鸡群的保护率可达到80％。说明该蛋白可以产生较强的免疫保护能力以抵抗MG强毒株的攻击。

鸡传染性喉气管炎(Infectious Laryngotracheitis,ILT)是由传染性喉气管炎病毒(Infectious Laryngotracheitis Virus,ILTV)引起的鸡的一种急性呼吸道传染病。该病的主要特征为呼吸困难、咳嗽，咳出含有血液的渗出物，喉部和气管黏膜肿胀、出血，严重者溃疡、糜烂。该病传播快，死亡率较高。gD基因位于ILTV基因组US区，高度保守，其编码的gD糖蛋白位于病毒粒子表面，是ILTV复制和诱导宿主产生免疫应答反应的主要保护性抗原。研究表明：与gB蛋白和gC蛋白相比较，gD蛋白可以诱发机体产生更高水平、且更为持久的细胞免疫和体液免疫。

因此，选择上述两个基因构建重组腺病毒，利用腺病毒载体的高效表达活性，实现目的蛋白对两种禽类呼吸道传染病的协同作用。

本发明构建融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的方法，包括以下步骤：

1)含有目的基因克隆载体pMD-TM-1和pMD-gD的鉴定；

2)融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒穿梭载体的构建；

3)融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的包装与鉴定；

4)重组腺病毒对鸡免疫保护评价。

具体包括步骤如下：

1)使用PCR法、双酶切及测序鉴定含有目的基因TM-1基因和gD基因的克隆载体

据GenBank中MG TM-1基因序列(S65869.1)设计引物：TM-1-F：5′-GCGTCGACGCCACCATGAATAAGAAAAGAATC-3′(Sal I)；TM-1-R：5′-CCCCGGGATGGTGATGGTGATATGAACCGTTCTTCTTGCAT-3′(Xma I)。根据GenBank中ILTV gD基因序列(EU817497.1)设计引物：gD-F：5′ -GGTCGAC GCCACC ATGCACCGTCCTCATCTCAGACG-3′ (SalI)；gD-R：5′ -CCCCGGGATGGTGATGGTGATGATGGCTACGCGCGCATTTACG-3′(Xma I)。下划线为限制性酶切位点，倾斜字体为Kozak序列，加粗字母为6×His序列。

2)将获得的目的基因分别克隆到pDC₃₁₅-EGFP穿梭载体中，将构建成功的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3cre经脂质体介导同时转染HEK293细胞，使在293细胞系中通过Cre/loxP重组酶系统实现同源重组，包装获得含有上述目的基因的重组腺病毒pBH-TM-1-gD；

所述的构建融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的方法制备的重组腺病毒。

所述融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备防治鸡毒支原体引起的鸡慢性呼吸道病和鸡传染性喉气管炎病毒引起鸡急性呼吸道疾病的生物制品中的应用。

也就是说：双酶切克隆载体pMD-TM-1和pMD-gD，胶回收纯化后；将获得的目的基因克隆到pDC315-EGFP穿梭载体中，分别将构建成功的重组穿梭载体pDC315-TM-1、pDC315-gD、pDC315-TM-1-gD与骨架质粒通过LipoFiter^TM脂质体共转染293细胞，使其在cre/loxp重组酶作用下实现同源重组，构建了包含上述目的基因的重组腺病毒质粒 pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD；包装获得重组腺病毒；应用荧光显微检测、RT-PCR、 Westernblotting对重组腺病毒在HEK293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术检测重组腺病毒感染HEK293细胞后的形态变化；RT-PCR方法检测目的基因的表达情况；通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白并通过BCA法测定蛋白浓度后Western blotting方法检测目的蛋白表达量，使用Vivapure AdenoPACK^TM法纯化病毒粒子并测定其滴度；将获得的高滴度重组腺病毒通过肌肉注射免疫SPF雏鸡，通过与常规疫苗免疫效果的比较，评价在腺病毒载体介导下融合表达TM-1基因和gD基因对鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎病毒感染的免疫效果。

下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：

1材料与方法

1.1克隆载体pMD-TM-1、pMD-gD的鉴定

采用PCR、双酶切及测序鉴定含有目的基因TM-1基因和gD基因的克隆质粒，获得含质粒pMD-TM-1、pMD-gD的DH5α阳性菌。

PCR(反应体系见表1)，引物序列见下表3。

表1 PCR反应体系

注：反应程序：95℃，预变性5min；{94℃，1min；55℃/65℃，50s；72℃， 1min}30个循环，72℃延伸10min。4℃保存备用。

表2双酶切反应体系

表3扩增目的片段的引物

下划线为限制性酶切位点，倾斜字体为Kozak序列，加粗字母为6×His序列。

1.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

回收经EcoR I、Xma I双酶切作用后的纯化产物TM-1基因片段及载体pDC₃₁₅-EGFP。使用T4连接酶将双酶切获得的TM-1目的基因与pDC₃₁₅-EGFP相连，16℃连接过夜。连接反应体系为10×T₄DNA Ligase Buffer 2.0μL，载体片段2.5μL，目的片段10.0μL， T4DNALigase 0.5μL。经氨苄抗性筛选，菌液PCR、酶切及测序鉴定，构建pDC₃₁₅-TM-1 重组穿梭质粒。

回收经EcoR I、Xma I双酶切作用后纯化产物gD基因片段及载体pDC₃₁₅-EGFP。使用T4连接酶将双酶切获得的TM-1目的基因与pDC₃₁₅-EGFP相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建pDC₃₁₅-gD重组穿梭质粒。

回收经EcoR I、Sal I双酶切作用后纯化产物gD基因片段及载体pDC₃₁₅-TM-1。将双酶切获得的目的基因与pDC₃₁₅-TM-1相连，16℃连接过夜。连接反应及后续鉴定参照上述，构建含有双基因的pDC₃₁₅-TM-1-gD重组穿梭质粒。

1.3重组腺病毒质粒的构建、包装及鉴定

无内毒素法分别抽提重组穿梭载体pDC₃₁₅-TM-1、pDC₃₁₅-gD、pDC₃₁₅-TM-1-gD和大骨架 pBHGlox(delta)E1,3Cre，测定浓度后，取线性化1μg穿梭载体与2μg骨架质粒通过脂质体法共转染HEK293细胞，包装后获得重组腺病毒，命名为pBH-TM-1、pAd-gD、 pAd-TM-1-gD和pBH-EGFP。利用荧光显微检测、RT-PCR、Western blotting对重组腺病毒在HEK293细胞中表达情况进行鉴定；通过荧光显微技术检测重组腺病毒感染HEK293 细胞后的形态变化；RT-PCR方法检测目的基因的表达情况；通过组织活性蛋白提取试剂盒提取细胞内表达蛋白并通过BCA法测定蛋白浓度，,Western blotting方法检测目的蛋白表达量，使用Vivapure AdenoPACK^TM法纯化病毒粒子,TCID₅₀法进行病毒滴度测定。

1.4重组腺病毒免疫效果评价

为评价融合表达TM-1蛋白和gD蛋白的重组腺病毒在禽类呼吸道传染病中的作用。

将获得的高滴度重组腺病毒通过肌肉注射免疫SPF雏鸡，通过与常规疫苗免疫效果的比较，评价在腺病毒载体介导下融合表达TM-1基因和gD基因对鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎病毒感染的免疫效果。

本研究以7日龄SPF雏鸡为研究对象，随机分为七组分别为对照组、pBH-TM-1免疫组、pBH-gD免疫组、pBH-TM-1-gD免疫组、pBH-EGFP免疫组、常规MG疫苗组和常规ILTV 疫苗组。将构建成功的高滴度重组腺病毒采用右腿腿部肌肉注射方式进行免疫。免疫剂量为10⁹PFU/dose，间隔7d加强免疫1次，观察鸡只状态，并于免疫后7d、14d、21d、 28d采血，称量体重，间接ELISA方法测定血清抗体的水平；第28d处死，检测胸腺指数(胸腺重/体重(w/w)。

2结果与分析

2.1pMD-TM-1和pMD-gD克隆载体的鉴定

采用PCR方法、Sal I和Xma I双酶切法鉴定克隆载体，分别获得810bp、1330bp 的目的产物，与预期大小一致，PCR扩增结果见图1，双酶切鉴定结果见图2。

测序结果与GeneBank中的数据进行Blast分析，表明TM-1基因和gD基因序列同源性均为98％以上。通过DNAMAN软件对该同源序列做进一步分析。

2.2亚克隆穿梭腺病毒载体的构建

分别对pMD-TM-1、pMD-gD和腺病毒穿梭质粒pDC315-EGFP进行双酶切，胶回收目的片段，以T4DNA连接酶连接，得到亚克隆质粒pDC315-TM-1和pDC315-gD；以T4DNA连接酶连接酶切回收纯化的gD基因片段和双酶切回收的pDC315-TM-1目的片段，得到亚克隆双基因重组穿梭质粒pDC315-TM-1-gD。对以上亚克隆质粒进行双酶切鉴定，分别得到 810bp、1330bp的目的片段，表明穿梭载体的亚克隆成功(见图3、图4)。

2.3重组腺病毒的构建、包装和扩增

分别将构建成功的重组穿梭载体pDC315-TM-1、pDC315-gD、pDC315-TM-1-gD与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3cre通过LipoFiterTM脂质体共转染HEK293细胞，24h后换成含低溶点琼脂的培养基，48h观察绿色荧光蛋白的表达，观察细胞病变(CPE)：细胞肿胀变大、变圆，呈葡萄串状，从底壁脱落。当出现完全CPE时(约13-15d)，挑取单个空斑，感染生长状态良好的HEK293细胞，待CPE大量出现时，收集细胞及培养液，-80℃/37℃ 反复冻融3次，离心收集细胞上清，获得P1代腺病毒。同样方法重复3次，直至获得P4 代病毒。

在荧光显微镜下可见重组腺病毒感染细胞出现绿色荧光，而未感染组细胞未见变化 (见图5、图6)。RT-PCR产物的电泳结果显示，810bp、1330bp处分别出现特异性扩增条带(见图7)。Western blotting结果显示，含有目的基因的重组腺病毒感染细胞后均检测到相应的目的蛋白条带：其中TM-1蛋白为30kDa，gD蛋白为49kDa，融合蛋白TM-1-gD 蛋白大小约为79kDa，Ad-EGFP无相应蛋白表达，与预期结果相符(见图8)。

收集P4代重组腺病毒感染后的细胞及细胞培养液，经Vivapure AdenoPACK^TM法浓缩纯化后的病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID₅₀)测定重组腺病毒的病毒滴度，按照KarBer法计算出重组腺病毒pBH-EGFP、pBH-TM-1、pBH-gD和pBH-TM-1-gD的滴度分别为10¹⁰TCID₅₀/mL、10^10.125TCID₅₀/mL、10^9.75TCID₅₀/mL、10^10.25TCID₅₀/mL，符合下一步实验所需滴度要求。

2.4重组腺病毒免疫效果效果

为评价所构建重组腺病毒在禽类呼吸道疾病基因防治中的作用，本研究以7日龄SPF 雏鸡为研究对象，将获得的高滴度重组腺病毒通过肌肉注射免疫SFP雏鸡，通过与常规疫苗免疫效果的比较，评价在腺病毒载体介导下融合表达TM-1基因和gD基因对鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎病毒感染的免疫效果。

分别于免疫前、免疫后每7d测定体重，观察试验鸡免疫后的体重变化；数据统计结果如下(见图9)，由图可以看出：与对照毒相比较，无论是重组腺病毒还是市售疫苗组都会使得鸡体重有所降低，但趋势基本一致。

于免疫后28天，处死部分试验鸡，测定其胸腺指数(w/w)(图10)。由图可得：3 次免疫之后，与对照组相比，pBH-EGFP组试验鸡胸腺指数显著升高(p<0.05)；重组腺病毒组pBH-TM-1、pBH-TM-1-gD胸腺指数极显著高于对照组和pBH-EGFP组(p<0.01)；重组腺病毒组鸡只的胸腺指数高于市售疫苗组。结果表明重组腺病毒免疫后对机体的细胞免疫影响大于市售疫苗组。

分别于免疫后7d、14d、21d、28d采血，间接ELISA方法分别测定血清抗体的水平，结果如下(图11)。由图11可以看出：第一次免疫7d后，机体的抗体水平未有显著升高；二次加强免疫后，与对照组和pBH-EGFP组相比，重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-TM-1-gD 组抗体水平极显著提高(p<0.01)，MG疫苗组的抗体水平有了显著提高(p<0.05)，三组之间无明显差异；三次免疫后，重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-TM-1-gD组、MG疫苗组抗体水平极显著提高(p<0.01)，其中，MG疫苗组诱导TM-1抗体水平最高，极显著高于 pBH-TM-1-gD组。由图11可以看出：重组腺病毒pBH-gD、pBH-TM-1-gD组和ILTV疫苗组诱导抗体趋势相近，不同的是三次免疫后，重组腺病毒pBH-gD诱导的gD抗体水平显著高于pBH-TM-1-gD组和ILTV疫苗组(p<0.05)，pBH-TM-1-gD和ILTV疫苗诱导抗体水平出差异不显著。

3结论

3.1成功构建重组穿梭质粒pDC315-TM-1、pDC315-gD和pDC315-TM-1-gD，Blast分析结果表明：TM-1基因和gD基因序列同源性均为98％以上。通过DNAMAN软件对该同源序列做进一步分析。

3.2将目的基因片段TM-1和gD分别亚克隆至穿梭载体pDC315-EGFP中，得到穿梭载体pDC315-TM-1和pDC315-gD。以pDC315-TM-1为载体，将目的基因gD亚克隆至 pDC315-TM-1得到重组穿梭载体pDC315-TM-1-gD。

3.3重组穿梭载体pDC315-TM-1、pDC315-gD、pDC315-TM-1-gD与骨架质粒 pBHGlox(delta)E1,3cre通过LipoFiterTM脂质体共转染HEK293细胞，在cre/loxp重组酶作用下实现同源重组后，得到构建成功的重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD 和pBH-EGFP；经RT-PCR证实重组腺病毒质粒成功导入HEK293细胞中；经Western blotting 可检测到融合蛋白TM-1-gD蛋白的表达，表明构建成功的重组腺病毒具有良好的感染性；经VivapureAdenoPACK^TM法浓缩纯化后的病毒，以50％组织培养感染剂量法(TCID₅₀)测定重组腺病毒的病毒滴度，按照KarBer法计算出重组腺病毒pBH-EGFP、pBH-TM-1、pBH-gD 和pBH-TM-1-gD的滴度分别为10¹⁰TCID₅₀/mL、10^10.125TCID₅₀/mL、10^9.75TCID₅₀/mL、 10^10.25TCID₅₀/mL，符合下一步实验所需滴度要求。

3.4从免疫后鸡体重增长趋势、胸腺指数、血清抗体水平三方面初步探讨重组腺病毒 pBH-TM-1、pBH-gD、pBH-TM-1-gD的免疫水平。免疫后鸡体重变化结果显示：与对照组相比，免疫后重组腺病毒组和疫苗组试验鸡体重有一定程度的降低，降低不显著，体重整体增长趋势与对照组一致；脾脏指数变化结果显示：重组腺病毒组与疫苗组免疫对机体的细胞免疫可能存在一定程度的影响；间接ELISA结果显示重组腺病毒pBH-TM-1、pBH-gD抗体水平与对照组相比差异不显著，融合表达TM-1-gD蛋白的双基因重组腺病毒 pBH-TM-1-gD诱导MG抗体水平则极显著低于常规疫苗组(p<0.01)，但其诱导的ILTV抗体水平与常规疫苗组差异不显著；重组腺病毒pBH-TM-1免疫后，其脾脏指数和ELISA结果与MG感染引起机体细胞免疫为主的免疫反应。双基因重组腺病毒pBH-TM-1-gD免疫后能够诱导较高的ILTV特异性抗体和MG特异性抗体，也可初步说明融合表达TM-1-gD蛋白后的，TM-1蛋白和gD蛋白的免疫原性较强，因而可以做出“融合基因可正常折叠”的推断，这也为进一步探究融合蛋白结构提供试验支持。为后续免疫保护性研究提供理论依据，也为研制鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎两种鸡呼吸道传染病的二联基因工程活载体疫苗奠定基础。

本发明将获得的高滴度重组腺病毒通过肌肉注射免疫SPF雏鸡，通过与常规疫苗免疫效果的比较，评价在腺病毒载体介导下融合表达TM-1基因和gD基因对鸡毒支原体和鸡传染性喉气管炎病毒感染的免疫效果。以7日龄SPF雏鸡为研究对象初步评价了表达融合蛋白的重组腺病毒的免疫效果，研究结果显示重组腺病毒免疫后可在一定程度上提高免疫鸡只的体液免疫和细胞免疫水平。本发明最终研制出一种能够同时防治鸡毒支原体引起的鸡慢性呼吸道病和鸡传染性喉气管炎病毒引起鸡急性呼吸道的广谱疫苗。

本发明的创新之处在于，首次将高保守性、低变异率且免疫原性强的鸡毒支原体TM-1基因和gD基因和腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的优势结合起来，成功构建出融合表达上述基因的重组腺病毒pBH-TM-1-gD。通过检测重组腺病毒在体外HEK293细胞中的复制、转录和外源基因的表达，以及初步探讨双基因重组腺病毒免疫效果等，综合评价了重组腺病毒对由鸡毒支原体引起的慢性呼吸道疾病和鸡传染性喉气管炎病毒引起的急性呼吸道疾病的防治作用，阐明了重组腺病毒在体外细胞中的表达规律及介导外源蛋白对禽类呼吸道疾病防治的生物学效应，证明了构建的重组腺病毒介导外源蛋白对可引起鸡体内的免疫保护及基因治疗禽类呼吸道疾病的临床应用前景。

以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

序列表

<110> 天津农学院

<120> 融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用

<141> 2017-09-29

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 1

gcgtcgacgc caccatgaat aagaaaagaa tc 32

<210> 2

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 2

ccccgggatg gtgatggtga tatgaaccgt tcttcttgca t 41

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 3

ggtcgacgcc accatgcacc gtcctcatct cagacg 36

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 4

ccccgggatg gtgatggtga tgatggctac gcgcgcattt acg 43

<210> 5

<211> 801

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 5

atgaataaga aaagaatcat cttaaagact attagtttgt taggtacaac atcctttctt 60

agcattggga tttctagctg tatgtctatt actaaaaaag acgcaaaccc aaataatggc 120

caaacccaat tacaagcagc gcgaatggag ttaactgatc taatcaatgc taaagcaagg 180

acattagctt cactacaaga ctatgctaag attgaagcta gtttatcatc tgcttatagt 240

gaagctgaaa cagttaacaa taaccttaat gcaacactag aacaactaaa aatggctaaa 300

actaatttag aatcagccat caaccaagct aatacggata aaacgacttt tgataatgaa 360

catccaaatt tagttgaagc atacaaagca ctaaaaacca ctttagaaca acgtgctact 420

aaccttgaag gtttagcttc aactgcttat aatcagattc gtaataattt agtggatcta 480

tacaataatg ctagtagttt aataactaaa acactagatc cactaaatgg gggaatgctt 540

ttagattcta atgagattac tacagttaat cggaatatta ataatacgtt atcaactatt 600

aatgaacaaa agactaatgc tgatgcatta tctaatagtt ttattaaaaa agtgattcaa 660

aataatgaac aaagttttgt agggactttt acaaacgcta atgttcaacc ttcaaactac 720

agttttgttg cttttagtgc tgatgtaaca cccgtcaatt ataaatatgc aagaagaacg 780

gttcatcatc accatcacca t 801

<210> 6

<211> 1320

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial aequence)

<400> 6

atgcaccgtc ctcatctcag acggcactcg cgttactacg cgaaaggaga ggtgcttaac 60

aaacacatgg attgcggtgg aaaacggtgc tgctcaggcg cagctgtatt cactcttttc 120

tggacttgtg tcaggattat gcgggagcat atctgctttg tacgcaacgc tatggaccgc 180

catttatttt tgaggaatgc tttttggact atcgtactgc tttcttcctt cgctagccag 240

agcaccgccg ccgtcacgta cgactacatt ttaggccgtc gcgcgctcga cgcgctaacc 300

ataccggcgg ttggcccgta taacagatac ctcactaggg tatcaagagg ctgcgacgtt 360

gtcgagctca acccgatttc taacgtggac gacatgatat cggcggccaa agaaaaagag 420

aaggggggcc ctttcgaggc ctccgtcgtc tggttctacg tgattaaggg cgacgacggc 480

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cttgtatcgc gaaatggcgc gggactgact atattctccc ccactgctgc gctctctggc 660

caatacttgc tgaccctgaa aatcgggaga tttgcgcaaa cagctctcgt aactctagaa 720

gttaacgatc gctgtttaaa gatcgggtcg cagcttaact ttttaccgtc gaaatgctgg 780

acaacagaac agtatcagac tggatttcaa ggcgaacacc tttatccgat cgcagacacc 840

aatacacgac acgcggacga cgtatatcgg ggatacgaag atattctgca gcgctggaat 900

aatttgctga ggaaaaagaa tcctagcgcg ccagaccctc gtccagatag cgtcccgcaa 960

gaaattcccg ctgtaaccaa gaaagcggaa gggcgcaccc cggacgcaga aagcagcgaa 1020

aagaaggccc ctccagaaga ctcggaggac gacatgcagg cagaggcttc tggagaaaat 1080

cctgccgccc tccccgaaga cgacgaagtc cccgaggaca ccgagcacga tgatccaaac 1140

tcggatcctg actattacaa tgacatgccc gccgtgatcc cggtggagga gactactaaa 1200

agttctaatg ccgtctccat gcccatattc gcggcgttcg tagcctgcgc ggtcgcgctc 1260

gtggggctac tggtttggag catcgtaaaa tgcgcgcgta gccatcatca ccatcaccat 1320

Claims

1.一种融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述的PCR法鉴定目的基因包括：以TM-1-F SEQ ID NO.1和TM-1-R SEQ ID NO.2为引物，以重组克隆载体pDC-TM-1质粒为模版，鉴定TM-1基因序列；以gD-F SEQ ID NO.3和gD-RSEQ ID NO.4为引物，以重组克隆载体pDC-gD为模版，鉴定gD基因序列；并且扩增两端为不同限制性酶切位点的SAL-2基因序列；

据GenBank中MG TM-1基因序列GI:S65869.1 SEQ ID NO.5设计引物：

TM-1-F：5′-GCGTCGACGCCACC ATGAATAAGAAAAGAATC-3′Sal I SEQ ID NO.1

TM-1-R：5′-CCCCGGG ATGGTGATGGTGATATGAACCGTTCTTCTTGCAT-3′Xma I SEQ ID NO.2

根据GenBank中ILTV gD基因序列GI:EU817497.1 SEQ ID NO.6设计引物：

gD-F：5′-GGTCGAC GCCACC ATGCACCGTCCTCATCTCAGACG-3′Sal I SEQ ID NO.3

gD-R：5′-CCCCGGGATGGTGATGGTGATGATGGCTACGCGCGCATTTACG-3′Xma I SEQ ID NO.4下划线为限制性酶切位点，倾斜字体为Kozak序列，加粗字母为6×His序列；

2)将获得的目的基因分别克隆到pDC315-EGFP穿梭载体中，将构建成功的穿梭载体与腺病毒骨架载体pBHGlox(delta)E1,3cre经脂质体介导同时转染HEK293细胞，使在293细胞系中通过Cre/loxP重组酶系统实现同源重组，包装获得含有上述目的基因的重组腺病毒pBH-TM-1-gD。

2.如权利要求1所述融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。

3.如权利要求1所述融合表达TM-1基因和gD基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在制备防治鸡毒支原体引起的鸡慢性呼吸道病和鸡传染性喉气管炎病毒引起鸡急性呼吸道疾病的生物制品中的应用。