CN106011087A - S1基因和tm-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用 - Google Patents

S1基因和tm-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种S1基因和TM‑1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因和TM‑1基因，将获得的目的基因克隆到穿梭载体pDC315‑MCS‑EGFP中，利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315‑S1‑TM‑1‑EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得含有S1基因和TM‑1基因的重组腺病毒pBH‑S1‑TM‑1‑EGFP；本发明用于免疫鸡以预防鸡传染性支气管炎和慢性呼吸道病，将此重组腺病毒免疫鸡后，鸡的抗体水平得到显著提高，且对鸡产生有效的保护作用。

Description

S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用
技术领域
本发明属于基因生物工程领域，涉及构建重组腺病毒的方法，具体说，是一种利用IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎(Avian infectious bronchitis,IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus,IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性、传染性呼吸道疾病，是世界禽类的主要呼吸道传染性疾病之一。鸡慢性呼吸道病(Chronic respiratory disease,CRD)是由鸡毒支原体(Mycoplasma Gallisepticum,MG)感染引起的接触性、慢性呼吸道传染病。CRD主要引起产蛋鸡产蛋量下降，蛋的品质降低，饲料转化率降低，常给养鸡业带来巨大的经济损失。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制上述两种疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法及重组腺病毒和应用，将IBV的主要的免疫保护性基因(S1基因)和MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，通过免疫攻毒保护试验检测其免疫保护效果，评价研制的预防IB和CRD的二联基因工程活载体疫苗。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
1)从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI：EU817497.1和TM-1基因序列GI：S65869.1；
所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：以S1-F SEQ ID NO.1和S1-R SEQID NO.2为引物，以IBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；以TM-1-FSEQ ID NO.3和TM-1-R SEQ ID NO.4为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；
2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP；
3)将重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP。
所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。
所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防IB和CRD中的应用。
本发明的有益效果是：分别将IBV和MG的免疫保护性基因S1基因和TM-1基因与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP，籍此研制同时预防IB和CRD两种传染病的二联基因工程活载体疫苗。通过对免疫鸡的两种抗体水平检测和免疫攻毒试验，评价了重组腺病毒的免疫效果。研究结果表明，免疫重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP的雏鸡，21日龄后两种抗体均可达到有效抗体水平(OD405＞0.49)，且可产生与市场弱毒疫苗的免疫保护作用相当，甚至更优。本发明研制出一种预防IB和CRD的二联基因工程活载体疫苗。
附图说明
图1是S1基因RT-PCR/PCR扩增结果(M:DL2502 DNA分子质量标准；1:S1基因RT-PCR产物；2:pMD-S1质粒PCR产物)。
图2是TM-1基因PCR扩增结果(M:DL2003 DNA分子质量标准；1:TM-1基因PCR产物；2:pMD-TM-1质粒PCR产物)。
图3是pDC315-S1-TM-1-EGFP质粒双酶切结果(M:DL2502 DNA分子质量标准；1:pDC315-S1-TM-1-EGFP经EcoR I和Nhe I的双酶切产物；2:pDC315-S1-TM-1-EGFP经Sal I和Xmal I的双酶切产物)。
图4是腺病毒在HEK293细胞中的重组与包装(A：正常HEK293细胞图；B：正常HEK293细胞荧光显微镜下图；C:转染HEK293细胞后CPE图；D:转染HEK293后CPE荧光图)。
图5是重组腺病毒感染HEK293细胞(×100)(A：正常HEK293细胞图；B：荧光显微镜下正常HEK293细胞图；C：重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP感染HEK293细胞图；D：重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP感染HEK293细胞荧光图)。
图6是重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP的S1基因的PCR扩增结果(M:DL2502 DNA分子质量标准；1:S1基因RT-PCR产物)。
图7是重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP的TM-1基因的PCR扩增结果(M:DL2003 DNA分子质量标准；1:TM-1基因RT-PCR产物)。
图8是Western Blot检测在重组腺病毒感染HEK293细胞后S1蛋白和TM-1蛋白的表达情况。
图9是ELISA检测鸡免疫IB疫苗后的抗体水平情况。从14日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著；自28日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与IBV弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平差异极显著。
图10是ELISA检测鸡免疫MG疫苗后的抗体水平情况。从14日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平显著性差异；自从21日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著；免疫pBH-S1-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与MG弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平始终无显著性差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明：
鸡传染性支气管炎(IB)和鸡慢性呼吸道病(CRD)是严重威胁养鸡业的鸡的重要的呼吸道传染病。目前市场上的疫苗以弱毒苗和灭活苗为主，虽然它们在一定程度上可以预防和控制上述疫病，但其各自都存在着一定的缺陷。基因工程苗同时具备弱毒苗和灭活苗的优势，又能克服二者不足；此外，二联苗还可以减少对动物免疫接种时的应激并节约成本，达到一苗多防的目的。腺病毒载体相比其他载体具有明显的优势，国内外均有很多以腺病毒为载体制备疫苗的报道，目前腺病毒载体系统已经相当成熟。对IBV和MG的研究也已相当清晰，有报道利用其它活载体研制IB或CRD的基因工程疫苗，且免疫攻毒试验证实对鸡有一定的保护作用，因此，本发明利用鸡传染性支气管炎病毒的S1基因和鸡毒支原体TM-1基因构建重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP，籍此研制预防IB和CRD两种传染病的二联基因工程活载体疫苗。
本发明S1基因和鸡MG TM-1基因构建重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP的方法，包括以下步骤：
1)IBV S1和MG TM-1基因片段的扩增与T-A克隆；
2)构建重组穿梭质粒pDC315-TM-1-S1-GFP；
3)在HEK293细胞中重组和包装病毒pBH-S1-TM-1-EGFP。
具体包括步骤如下：
1)从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI：EU817497.1和TM-1基因序列GI：S65869.1；
所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：以S1-F SEQ ID NO.1和S1-R SEQID NO.2为引物，以IBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；以TM-1-FSEQ ID NO.3和TM-1-R SEQ ID NO.4为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；
2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP；
3)将重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP。
如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。
如所述的IBV S1基因和MG TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防IB和CRD中的应用。
也就是说：分别从IBV H52株和MG S6株中扩增出目的基因；将目的基因经T-A克隆至pMD19-T载体上；经酶切及测序鉴定后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP连接；利用脂质体转染法将重组腺病毒穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染HEK293细胞，经PCR、Western blot鉴定重组腺病毒；重组腺病毒纯化后，经TCID50方法测定重组腺病毒的滴度；将重组腺病毒和市场弱毒疫苗分别免疫鸡，ELISA检测免疫鸡抗体，免疫攻毒检测免疫鸡的发病率和死亡率，评价研制二联疫苗免疫鸡的效果。
下面结合具体实例对本发明作进一步详细说明：
1材料与方法
1.1 S1基因和TM-1基因的扩增
接种IBV H52株于9日龄鸡胚，收集的鸡胚尿囊液，利用Trizol法提取病毒RNA。根据GenBank中IBV H52的S1基因序列(EU817497.1)设计引物，进行RT-PCR扩增目的基因片段。收集接种到PPLO液体培养基中的MG S6株菌体，利用饱和酚-氯仿抽提法提取MG DNA；根据GenBank中MG TM-1基因序列(S65869.1)设计引物，进行PCR扩增目的片段。S1基因引物和TM-1基因引物见表1(划线部分为酶切位点，斜体部分为Kozak序列，加粗部分为6×His)，S1基因的PCR反应体系见表2，TM-1基因的PCR反应体系见表3。
表1扩增S1和TM-1基因片段的引物序列
表2 S1基因PCR反应体系
注：反应程序为：94℃，预变性5min；{94℃，变性30s；62℃，退火40s；72℃，延伸1min}共32个循环，72℃延伸10min。
表3 TM-1基因PCR反应体系
注：反应程序为：94℃，预变性5min；{94℃，变性30s；55℃，退火35s；72℃，延伸1min}共30个循环，72℃延伸10min。
1.2重组穿梭腺病毒载体的构建
将获得的S1基因和TM-1基因先后与穿梭载体pDC315-MCS-EGFP用相应的酶进行双酶切(酶切反应体系见表5、表6)，再将其用T4连接酶16℃连接12h(反应体系见表7)。经菌液PCR、酶切及测序鉴定，筛选出正确的重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP。
表5酶切反应体系
表6酶切反应体系
表7 T4连接酶连接体系
1.3腺病毒的重组与包装
取脂质体12.0μL，并将其与2μg腺病毒穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP和4μg腺病毒大骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre混匀，共转染HEK293细胞，使其在HEK293细胞中重组与包装14d左右，收集CPE细胞，反复冻融并收集病毒，冻存-80℃。
将收集的重组腺病毒接种到正常的HEK293细胞，观察细胞病变情况及荧光显微镜观察细胞荧光情况。通过提取病毒基因组试剂盒提取重组腺病毒的DNA，并进行PCR检测目的基因；收集重组腺病毒感染48h后的HEK293细胞，然后通过western blot检测S1蛋白和TM-1蛋白的表达情况。
1.4重组腺病毒滴度的测定
利用腺病毒纯化试剂盒，将重组腺病毒纯化，再根据TCID50法检测重组腺病毒的滴度。
1.5 ELISA检测免疫鸡的抗体水平
选取SPF鸡120只，随机分组6组，20只/组；分别设置pBH-S1-TM-1-EGFP(a)组、pBH-S1-TM-1-EGFP(b)组、IB弱毒疫苗组、MG弱毒疫苗组、pBH-EGFP(对照1)组和pBH-EGFP(对照2)组。7日龄进行首免，21日龄二免，点眼免疫接种106TCID50/mL，期间，每7天进行一次翅下静脉采集血并分离血清。利用ELISA试剂盒检测免疫鸡不同时间的抗体水平。
1.6免疫保护试验
分别对pBH-S1-TM-1-EGFP(a)组、IB弱毒疫苗组、pBH-EGFP(对照1)组进行接种强毒IBV；分别对pBH-S1-TM-1-EGFP(b)组、MG弱毒疫苗组、pBH-EGFP(对照2)组进行接种强毒MG；统计鸡的发病率与死亡率。
2结果与分析
2.1 S1基因和TM-1基因的RT-PCR与PCR扩增结果
利用根据GenBank中S1基因序列设计的S1基因引物对提取IBV的RNA进行RT-PCR扩增，经测序，获得大小为1650bp左右的预期片段；T-A克隆获得PMD-S1质粒，同样利用设计的S1基因引物进行PCR扩增，经测序，获得大小为1650bp左右的预期目的片段(见图1)。
利用根据GenBank中TM-1基因序列设计的TM-1基因引物对提取MG的DNA进行PCR扩增，经测序，获得大小为804bp左右的预期片段；T-A克隆获得PMD-TM-1质粒，同样利用设计的TM-1基因引物进行PCR扩增，经测序，获得大小为804bp左右的预期目的片段(见图2)。
2.2扩增的S1基因与TM-1基因测序结果分析
将测序后的S1基因和TM-1基因的核苷酸序列分别与GenBank中S1基因核苷酸序列(EU817497.1)和TM-1基因核苷酸序列(S65869.1)进行Blast对比分析，S1基因序列的同源性达98％，TM-1基因序列的同源性达100％，且均无碱基缺失和插入。
2.3腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP双酶切结果
利用设计的限制性内切酶EcoR I和Nhe I对腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP进行双酶切鉴定，经测序，获得大小为1650bp左右的预期片段；同样，利用设计的限制性内切酶Sal I和Xmal I对腺病毒重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP进行双酶切鉴定，经测序，获得大小为804bp左右的预期片段(见图3)。
2.4腺病毒骨架和穿梭质粒共转染HEK293细胞结果
利用脂质体将腺病毒大骨架分别与重组穿梭质粒共转染HEK293细胞，经过14d左右培养后，对HEK293细胞进行观察，细胞逐渐出现肿大、变圆，呈葡萄串状，脱离细胞培养皿等细胞病变，在荧光显微镜下经过蓝光激发，可看到细胞呈现绿色荧光，证明分别包装出重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP(见图4)。
2.5包装完成的重组腺病毒感染HEK293细胞结果
将包装完成的原代(P0代)重组腺病毒分别感染正常HEK293细胞，出现细胞肿大、变圆，呈葡萄串状，脱离细胞培养皿等细胞病变，在荧光显微镜下通过蓝光激发，可看到细胞呈现绿色荧光；未感染细胞状态正常，且在荧光显微镜下观察不到细胞及绿色荧光(见图5)。
2.3重组病毒的目的基因检测
对包装好的重组腺病毒提取DNA，分别利用设计的S1基因和TM-1基因引物进行PCR扩增，并对目的基因序列进行测序分析，结果显示：分别在1650bp左右和804bp左右处出现与预期片段大小一致的目的条带(见图6、图7)。
2.6 Western blot检测S1蛋白和TM-1蛋白表达的结果
Western Blot结果显示：重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP在约90KDa处出现特异性条带，与预期S1蛋白分子质量大小相当；pBH-S1-TM-1-EGFP在约29KDa处出现特异性条带，与预期TM-1蛋白分子质量大小相当；pBH-S1-TM-1-EGFP和pBH-EGFP在约43KDa处均出现特异性条带，与预期内参β-actin蛋白分子质量大小相当(见图8)。
2.7重组病毒的滴度测定结果
对纯化浓缩后的重组腺病毒作倍比稀释后感染HEK293细胞，感染7d后，根据KaBer法进行计算阳性孔比率，测定其滴度为1010.875TCID50/mL。
2.8 ELISA检测结果
根据ELISA试剂盒说明书，利用分离的血清检测其抗体OD405。
从14日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和IBV弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著；自28日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与IBV弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平差异极显著。(见图9)。
从14日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平有显著性差异；自从21日龄开始，免疫pBH-S1-TM-1-EGFP和MG弱毒疫苗的鸡抗体水平分别与免疫pBH-EGFP的对照组鸡抗体水平差异极显著；免疫pBH-S1-TM-1-EGFP的鸡抗体水平与MG弱毒疫苗免疫的鸡抗体水平始终无显著性差异(图10)。
从21日龄开始两种抗体均可达到有效抗体水平(OD＞0.49)(见图9、图10)。
2.9免疫保护结果
攻毒试验结果显示：IBV强毒攻毒后，pBH-S1-TM-1-EGFP免疫组保护率为90％，弱毒IBV疫苗组保护率为85％(见表8)；强毒MG攻毒后，pBH-S1-TM-1-EGFP免疫组保护率为80％，弱毒MG疫苗组保护率为85％(见表9)。
表8强毒IBV攻毒鸡的免疫保护结果
表9强毒MG攻毒鸡的免疫保护结果
3结论
3.1从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因和TM-1基因，并分别成功连接到pMD19-T载体上，分别获得pMD-S1和pMD-TM-1克隆质粒。
3.2成功获得重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP。
3.3成功获得重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP；且重组腺病毒能够很好的表达S1蛋白和TM-1蛋白。
3.4收获的重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP滴度为：1010.875TCID50/mL，符合后续动物试验的所需的滴度要求。
3.5构建的重组腺病毒免疫鸡的抗体水平及免疫效果与弱毒疫苗相当，甚至更优。
本发明的创新之处在于，首次将IBV的主要的免疫保护性基因(S1基因)和MG的膜外蛋白基因(TM-1基因)与腺病毒载体系统高效稳定表达外源基因的特性结合起来，构建出能够表达上述基因的重组腺病毒，分别检测免疫鸡后机体内产生的两种抗体水平，并通过免疫攻毒保护试验检测了其免疫保护效果，成功研制了预防IB和CRD的二联基因工程活载体疫苗。
以上所述的实施例仅用于说明本发明的技术思想及特点，其目的在于使本领域内的技术人员能够理解本发明的内容并据以实施，不能仅以本实施例来限定本发明的专利范围，即凡本发明所揭示的精神所作的同等变化或修饰，仍落在本发明的专利范围内。

Claims (3)

1.一种S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)从IBV H52株和MG S6株中分别扩增出S1基因序列GI：EU817497.1和TM-1基因序列GI：S65869.1；
所述的S1基因和TM-1基因的扩增包括：以S1-F SEQ ID NO.1和S1-R SEQID NO.2为引物，以IBV的RNA为模板，RT-PCR扩增获得S1基因；以TM-1-FSEQ ID NO.3和TM-1-R SEQ ID NO.4为引物，以MG的DNA为模板，PCR扩增获得TM-1基因；
2)分别将S1基因和TM-1基因亚克隆到腺病毒穿梭载体质粒pDC315-MCS-EGFP上，获得重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP；
3)将重组穿梭质粒pDC315-S1-TM-1-EGFP与腺病毒大骨架质粒pBHGloxE1,3Cre共转染HEK293细胞，重组并包装获得重组腺病毒pBH-S1-TM-1-EGFP。
2.如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒。
3.如权利要求1所述的S1基因和TM-1基因重组腺病毒的构建方法制备的重组腺病毒在预防鸡传染性支气管炎和鸡慢性呼吸道病中的应用。
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