CN102071218B

CN102071218B - 小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统及其应用

Info

Publication number: CN102071218B
Application number: CN 201010559545
Authority: CN
Inventors: 步志高; 陈伟业
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2010-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2013-03-06
Anticipated expiration: 2030-11-23
Also published as: CN102071218A

Abstract

本发明涉及一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的反向遗传操作系统及其应用，该系统包含：转录质粒，所述转录质粒能够表达所述小反刍兽疫病毒的基因组全长cDNA序列；一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)，和小反刍兽疫病毒的病毒复制许可的宿主细胞。通过上述反向遗传操作系统，成功救获了重组小反刍兽疫病毒。本研究的PPRV反向遗传操作技术平台的建立为进一步开展PPRV活载体疫苗研制及PPRV病毒相关基础研究提供了极佳的技术平台。

Description

小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统及其应用

技术领域

本发明涉及病毒遗传操作领域，更具体地，本发明涉及一种小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统及其应用。

背景技术

小反刍兽疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一种高度接触性传染性疾病[1])，严重危害山羊、绵羊、和野生小反刍兽[2]等动物，甚至曾经引起水牛发病[3]。

PPRV的致死率为70-80％，在新的OIE分类中，被列为重要经济动物疾病，且疫情必须通报OIE。PPR长期以来一直在非洲、中东、中亚、南亚及东南亚地区危害流行，和我国西部接壤的巴基斯坦[4]、塔吉克斯坦[5]近些年都有流行爆发。2007年PPRV传入我国西部边境地区，导致局部疫情，对我国的畜牧养殖业形成严重威胁。我国山羊和绵羊的饲养量数以亿计，但对于PPR的防控技术和经验不足，病原的研究和技术储备缺乏，给我国的PPRV的防控带来了极大的难度和挑战，迫切需要我们抓紧PPRV疫苗研发、诊断技术、监测、致病机制等研究，其中疫苗研发是重中之重。

PPRV属副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)成员，与牛瘟病毒(Rinderpest virus，RPV)同属，基因组进化与抗原性关系密切，具有共同的中和抗体表位。PPRV为单链负股RNA病毒，由15948个碱基组成，不分节段。病毒粒子内主要含有6种结构蛋白，即核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)和多聚酶大蛋白(L)。病毒囊膜表面的F和H蛋白为PPRV诱导中和抗体形成的主要免疫原，N蛋白不诱导中和抗体，但具有良好的免疫原性，是用于诊断的主要抗原[6-8]。

针对PPR最早使用的疫苗是牛瘟弱毒病毒(Rinderpest Virus，RPV)，虽然能够提供免疫保护，但不能够产生PPRV的中和抗体[9]，后被经Vero细胞传代致弱的PPRV弱毒疫苗株(Nigeria75/1)所替代，后者能够产生较高的PPRV的中和抗体，提供坚强的免疫保护力。

把PPRV免疫保护抗原(H和F蛋白)的基因重组至山羊痘病毒基因组，则构建成PPRV重组山羊痘病毒疫苗[10-13]。以PPRV重组山羊痘病毒免疫山羊，不但能够提供足够的免疫保护抵抗PPRV强毒的攻击[10-13]，而且还可以利用PPRV N蛋白作为抗原，很容易地区分免疫感染和自然感染，不影响血清学监测。本研究室采用我国分离的山羊痘病毒疫苗株，分别构建成了PPRV H和F基因重组山羊痘病毒疫苗，疫苗防山羊痘和PPRV两种疾病，为我国的PPR的防控提供了一种重要的选择[12，13]。但PPRV重组痘病毒疫苗由于采用皮内注射和两次免疫程序[12，13]，劳动强度大，是其一个缺憾。

负链RNA病毒的反向遗传操作技术日益成熟，提供了标记疫苗开发的新途径，如水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)[14-16]、麻疹病毒(measles virus)[17]、狂犬病毒(rabies virus)[18]、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)[19]和新城疫病毒(Newcastledisease virus，NDV)[20]等。弱毒疫苗免疫较痘病毒更方便，因此利用反向遗传操作技术开发PPRV标记弱毒疫苗，是可为中国广大PPRV非流行区PPR的防控提供更多选择，以符合我国不同地区、不同情况的实际生产需要。

但是PPRV的反向遗传操作技术在世界范围内仍然是空白，因此本研究旨在建立PPRV反向遗传操作技术平台，体外拯救PPRV病毒和重组EGFP蛋白的PPRV重组病毒，为进一步开展PPRV载体疫苗和PPRV基础研究提供技术平台。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种小反刍兽疫病毒(PPRV)的反向遗传操作系统或试剂盒，该系统或试剂盒包含：

(1)转录质粒，所述转录质粒能够表达所述小反刍兽疫病毒的基因组全长cDNA序列；

(2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)，和

(3)任选地，小反刍兽疫病毒的病毒复制许可的宿主细胞，优选BHK细胞或Vero细胞。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒包括三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)，优选所述小反刍兽疫病毒是小反刍兽疫病毒弱毒疫苗株Nigeria 75/1。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述转录质粒还同时表达编码外源蛋白的基因，如标记基因，优选编码EGFP蛋白的基因，或者所述外源蛋白是PPRV的免疫保护抗原，如H和F蛋白，或者所述外源蛋白是蓝舌病病毒的VP2、VP5等抗原性蛋白，或其他病原的抗原蛋白。

在一个优选实施方案中，所述的反向遗传操作系统或试剂盒中的所述编码外源蛋白的基因位于所述小反刍兽疫病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间。

在一个优选实施方案中，在编码外源蛋白的基因的基因转录信号终止序列(GE)和编码基质蛋白(M)的基因的基因转录信号起始序列(GS)之间用基因间隔序列CTT隔开，优选在编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间保留完整的间隔序列(101bp)。

在一个优选实施方案中，所述转录质粒是pCI-PPRV、pCI-PPRV/41EGFP或pCI-PPRV/101EGFP。

在一个更优选的实施方案中，其中所述辅助质粒是pCI-N、pCI-P和pCI-L。

本发明的另一个目的是提供一种制备重组小反刍兽疫病毒的方法，其包括以下步骤：

1)使用在上述反向遗传操作系统或试剂盒中所述的转录质粒和辅助质粒共转染小反刍兽疫病毒的病毒复制许可的宿主细胞；和

2)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组小反刍兽疫病毒。

本发明的另一个目的是提供根据以上的方法制备的重组小反刍兽疫病毒，优选为rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP。

本发明还有的另一个目的是提供根据本发明的重组小反刍兽疫病毒在制备预防小反刍兽疫和/或预防其它病原体导致的疾病(插入相应病原体的抗原基因)的疫苗中的应用。

特别是，本发明的重组小反刍兽疫病毒rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP当用作疫苗时可以用于区别小反刍兽疫的自然感染和免疫感染。

具体而言，本研究采用生产实践中广泛应用、免疫效果良好的小反刍兽疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)弱毒疫苗Nigeria 75/1株，构建了PPRV基因组cDNA克隆及表达PPRV N、P和L蛋白的辅助质粒，成功在体外救获了PPRV Nigeria 75/1株病毒(rPPRV/N75/1)；在此基础上进一步构建了表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的重组PPRV基因组cDNA克隆，运用反向遗传操作系统成功救获了两株基因起始(Gene-start，GS)序列和基因终止(Gene-end)序列不同的、表达EGFP重组病毒rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP。重组病毒rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP的生长动力学曲线与亲本株无明显差异；rPPRV/101EGFP的EGFP的表达能力优于rPPRV/41EGFP，约为后者的两倍。动物实验表明，重组病毒能够诱导较高的PPRV中和抗体，所有免疫山羊PPRV中和抗体全部转阳(＞10)，且rPPRV/101EGFP免疫效果较rPPRV/41EGFP更高，与亲本毒无显著性差异。本研究的PPRV反向遗传操作技术平台的建立为进一步开展PPRV活载体疫苗研制及PPRV病毒相关基础研究提供了极佳的技术平台。

利用本发明建立的PPRV的反向遗产操作系统，可以构建表达外源抗原蛋白的重组小反刍兽疫弱毒疫苗，相对于传统小反刍兽疫弱毒疫苗来说，同时预防两种重大的小反刍兽传染性疾病，具有显著的优势。例如表达同样危害养羊业较严重的蓝舌病的VP2蛋白，由于一针两防，既能够节约疫苗的成本，又能够节约劳动力成本，还可以减少因反复操作免疫对羊造成的应激反应。在这方面应用成功的例子是禽流感重组新城疫病毒二价疫苗[21][Ge，J.，G.Deng，Z.Wen，G.Tian，Y.Wang，J.Shi，X.Wang，Y.Li，S.Hu，Y.Jiang，C.Yang，K.Yu，Z.Bu，and H.Chen.2007.Newcastle diseasevirus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and micefrom lethal challenge of homologous and heterologous H5N 1avian influenzaviruses.J Virol 81：150-8.]，可有效预防危害养禽业两种重要传染病，已经免疫100亿羽份，取得重大的社会效益和经济效益。

附图说明

图1.小反刍兽疫病毒基因组cDNA的构建示意图

A.克隆于pCI上的PPRV基因组cDNA克隆构建策略；B和C表示插入EGFP基因的PPRV感染性克隆构建策略，其中B中外源插入的GE、基因间隔三核苷酸序列(CTT)、GS较短，总长为41bp；C中外源插入的GE、基因间隔三核苷酸序列(CTT)、GS较长，总长为101bp；

图2.间接免疫荧光检测救获的病毒。A.绿色荧光模式；B.红色荧光模式，鼠抗PPRV全病毒全病毒高免血清为一抗，TRITC标记的兔抗鼠IgG为二抗；C.红色荧光模式，非免疫鼠阴性血清为一抗，TRITC标记的兔抗鼠IgG为二抗；

图3.重组病毒CPE形成过程及GFP表达。野生型病毒和重组病毒按MOI 0.01感染vero细胞，于感染后3、5、7天观察CPE及GFP的表达。A.可见下光观察CPE；B.绿色荧光显微镜下观察GFP蛋白的表达及CPE；

图4.rPPRV/41GFP和rPPRV/101GFP表达GFP水平的比较；

图5.亲本病毒和重组病毒在Vero细胞上的生长动力学曲线；

图6.pCI-PPRV质粒序列(从5′端到3′端)(SEQ ID No.1)，其中1096-1153为HamRz序列，1154-17101为PPRV/N75/1基因组序列，17102-17192为HdvRz序列；

图7.pCI-PPRV/41EGFP质粒的构建，其中在pCI-PPRV序列中的4558和4559nt之间插入如下序列(从5′端到3′端)(SEQ ID No.2)：

aggagcaagggcaactgagcttgcggccgcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagtttaaacaggctattacaaaaaactt

其中：1-22为GS；23-30为Not I位点；31-39为Kozak序列；40-759为EGFP序列；760-767为Pme I位点；768-783为GE序列；784-786为基因间隔三核苷酸；

图8.pCI-PPRV/101EGFP质粒的构建，其中在pCI-PPRV序列中的4558和4559nt之间插入如下序列(从5′端到3′端)(SEQ ID No.3)：

aggagcaagggcaactgagcttcacagacaaggcggccgcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaagtttaaaccacatcctataatcaacatctcatactcggttgaaaacatcctctcaatcaggctattacaaaaaactt

其中：1-32为GS；33-40为Not I位点；41-49为Kozak序列；50-769为EGFP序列；770-777为Pme I位点；778-843为GE序列；844-846为基因间隔三核苷酸；

图9.pCI-N质粒序列(从5′端到3′端)，其中1069-1077为kozak序列；1078-2655为PPRV N蛋白基因序列；

图10.pCI-P质粒序列(从5′端到3′端)，其中1092-1100为kozak序列；1101-2630为PPRV P蛋白基因序列；和

图11.pCI-L质粒序列(从5′端到3′端)，其中1093-1101为kozak序列；1102-7653为PPRV L蛋白基因序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1小反刍兽疫病毒反向遗传操作系统的构建

1材料与方法

1.1材料

PPRV Nigeria75/1(PPRV/N75/1)疫苗株购自中国兽药监察所；BHK-21细胞(ATCC No.CCL-10)和Vero细胞(ATCC No.CCL-81)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室保存，培养液均为含10％胎牛血清的DMEM；质粒pCI购自Promega，pBluescript和pIRES-EGFP购自Clontech；PrimeSTAR HS DNA聚合酶，T4 DNA连接酶及其它限制性内切酶均购自TaKaRa公司；RNA提取试剂Trizol、鼠源反转录酶(MLV)、胎牛血清、DMEM以及磷酸钙转染试剂盒(Calcium phosphate TransfectionKit)购自Invitrogen；鼠抗PPRV全病毒高免血清由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所人兽共患病研究室制备[12]；红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠二抗购自Sigma公司；荧光倒置显微镜购自Zeiss公司；白色不透明96孔板购自Corning公司；Microplate Fluorescence Reader仪器购自Bio-Tek公司。

1.2PPRV基因组全长cDNA克隆及辅助质粒的构建

PPRV/N75/1疫苗株(基因组序列GenBank accession no.HQ197753)病毒接种Vero细胞收获的病毒液按常规方法提取病毒基因组RNA；整个基因组分为4个末端部分重叠的片段(F1～F4)(图1A)进行RT-PCR扩增(引物见表1)，并全部克隆至pCI载体的Nhe I和Not I之间，获得PPRV基因组全长cDNA克隆pCI-PPRV。其中所有cDNA片段克隆至pBluescriptEcoRV位点并测序。转录质粒pCI-PPRV中CMV-IE启动子和SV40晚期多腺苷酸化信号之间的DNA片段在宿主细胞RNA聚合酶II作用下得到转录，并且由于锤头状核酶序列(hammerhead ribozyme，HamRz)和丁肝病毒核酶序列(hepatovirus ribozyme，HdvRz)的自身催化功能，可以保证转录产物的3’末端和5’末端与克隆的PPRV基因组cDNA片段精确一致。

按照上述方法，分别扩增PPRV的NP、P和L基因的ORF cDNA(引物见表1)，并克隆至pCI质粒的多克隆位点，分别构成表达PPRV N、P和L蛋白的辅助质粒pCI-N、pCI-P和pCI-L。

1.3表达GFP的重组PPRV基因组全长cDNA克隆的构建

pCI-PPRV/41EGFP中外源基因EGFP的基因转录信号起始序列(gene-start，GS)为PPRV cDNA的3406-3427nt，基因转录信号终止序列(gene-end，GE)为3387-3402nt，EGFP基因的GE和M基因的GS之间用基因间隔三核苷酸(intergenic trinucleotide)CTT隔开，额外插入的GS、GE和CTT总长度为41bp(图1B)。

pCI-PPRV/101EGFP中外源基因EGFP的GS为PPRV cDNA的3406-3437nt，GE为3337-3402nt，EGFP基因的GE和M基因的GS之间用基因间隔序列CTT隔开，因此额外插入的GS、GE和CTT总长度为101bp，与和P、M基因之间的间隔序列完全相同(图1C)。

此外上述两个感染性克隆都在GS 3’末端引入NotI位点，在GE 5’末端引入PmeI位点。

载体pCI-PPRV/41EGFP克隆策略如下：

用引物PPRV-41-1-F：

5′-ACGACTCACTATAGGCTAGCCTCGAGAATTCACGCGTG，

PPRV-41-1-R：

5′-GTTTAAACGCGGCCGCAAGCTCAGTTGCCCTTGC，

以pCI-PPRV为模板，扩增PPRV第一段序列，得PCR片段PPRV-41-1；

用引物PPRV-41-2-F：

5′-GCGGCCGCGTTTAAACAGGCTATTACAAAAAACT，

PPRV-41-2-R：

5′-CGCCAGCCCGGATCCTTATCGATTTTACCACAT，

以pCI-PPRV为模板，扩增PPRV第二段序列，得PCR片段PPRV-41-2；

用NheI和BamHI双酶切pCI-PPRV，然后用In-fusion PCR CloningKit(购自Clonetech)将PCR片段PPRV-41-1和PPRV-41-2一同克隆至上述酶切的pCI-PPRV，得到载体pCI-PPRV/41。用引物表1中GFP的引物，以质粒pIRES-EGFP(CloneTech)为模板扩增的EGFP ORF PCR产物，以NotI/PmeI双酶切，克隆在同样双酶切的pCI-PPRV/41上，获得pCI-PPRV/41EGFP(图1B)。

载体pCI-PPRV/101EGFP克隆策略如下。

以引物PPRV-101-1-F：同PPRV-41-1-F，

PPRV-101-1-R：

5′-CTGAGCTTCACAGACAAGCTTGTCTGTGAAGCTCAG；

以pCI-PPRV为模板，扩增PPRV第一段序列，得PCR片段PPRV-101-1；

用引物PPRV-101-2-F：

5′-GCGGCCGCGTTTAAACCACATCCTATAATCAACA，

PPRV-41-2-R：同PPRV-41-2-R，

以pCI-PPRV为模板，扩增PPRV第二段序列，得PCR片段PPRV-101-2；

用NheI和BamHI双酶切pCI-PPRV，然后用In-fusion PCR CloningKit(购自Clonetech)将PCR片段PPRV-101-1和PPRV-101-2一同克隆至上述酶切的pCI-PPRV，得到载体pCI-PPRV/101。用引物表1中GFP的引物，以质粒pIRES-EGFP(CloneTech)为模板扩增的EGFP ORF PCR产物，以NotI/PmeI双酶切，克隆在同样双酶切的pCI-PPRV/101上，获得pCI-PPRV/101EGFP(图1C)。

pCI-PPRV/41EGFP和pCI-PPRV/101EGFP中HamRz与HdvRz之间的序列长度序列符合“6碱基原则”[22，23]。

表1引物设计

1.4病毒的拯救及扩增

BHK-21细胞接种于35mm六孔板中，待生长至50％～80％单层时，采用磷酸钙转染试剂(Invitrogen)将感染性克隆质粒(pCI-PPRV、pCI-PPRV/41EGFP或pCI-PPRV/101EGFP)及辅助质粒、pCI-N、pCI-P和pCI-L分别以5μg、2.5μg、1.25μg和1.25μg的量共转染BHK细胞，5％CO₂、37℃培养，具体操作按试剂盒说明书进行。转染后8～12h，弃去转染混合物，用含10％DMSO的PBS溶液休克细胞2.5min，加入完全DMEM培养液继续于5％CO₂、37℃培养；3天后将细胞刮下来，细胞悬液冻融两次后，取300μL接种于生长过夜、密度约70％的单层Vero细胞，感作1h后加入含5％胎牛血清的DMEM，5％CO₂、37℃培养6-10天，显微镜下观察细胞病变(cytopathic effect，CPE)或荧光；待出现CPE时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。救获的野生型PPRV和表达EGFP的重组病毒分别命名为rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP。

1.5间接免疫荧光检测救获的病毒

Vero细胞接种于24孔板中，待生长至70％～80％单层时，分别按MOI0.1接种wtPPRV/N75/1(即亲本野生型PPRV)、rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP；4天后，PBS洗涤细胞2次，3％多聚甲醛室温固定30min。分别以1∶50倍稀释的鼠抗PPRV全病毒高免血清[12]和相应稀释倍数的非免疫鼠阴性血清为一抗，作用30min。PBST洗涤后加入1∶64倍稀释红色荧光素(TRITC)标记的兔抗鼠IgG为二抗，作用30min，PBST洗涤后用荧光倒置显微镜(Zeiss)观察结果。

2结果

间接免疫荧光检测救获的病毒

为了鉴定救获的病毒，分别将wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP感染Vero细胞，4天后再分别以鼠抗PPRV全病毒高免血清[12，13]和相应稀释倍数的非免疫鼠血清为一抗进行间接免疫荧光染色。结果，在绿色荧光模式下，wtPPRV/N75/1和rPPRV/N75/1显示绿色荧光信号阴性，而rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP均显示绿色荧光信号阳性(图2A)；在红色荧光模式下，鼠抗PPRV全病毒全病毒高免血清检测wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP均显示阳性红色荧光信号(图2B)，而1∶50倍稀释非免疫鼠对照血清显示红色荧光信号阴性(图2C)。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用PPRV/N75/1疫苗株基因组cDNA克隆，成功救获具有感染性的野生型PPRV疫苗株rPPRV/N75/1和表达EGFP的重组病毒rPPRV/41EGFP、rPPRV/101EGFP。

实施例2重组病毒形成CPE特点及GFP表达检测

将实施例1制备的wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP病毒按MOI 0.01接种接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1h后，加入含2％胎牛血清的DMEM培养液，于5％CO₂、37℃培养。在感染后的3、5、7天观察CPE形成和EGFP蛋白的表达。

为了准确比较rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP的EGFP表达能力，将两株病毒按上述方法接种Vero细胞。分别于感染后的3、4、5、6天加入细胞裂解液(0.15mol/L Tris-Cl，PH 8.0，1.5％Triton X-100，每200μl培养液加100μl裂解液)，裂解15min后，取100μl加到白色不透明96孔板(Corning)，设未感染病毒孔为空白对照，用Microplate FluorescenceReader(参数设置为：激发光485nm，吸收光528nm，敏感性50)检测每孔绿色荧光蛋白的相对荧光值(Relative Fluorescence Units)。

如图3A所示，wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1和rPPRV/101EGFP在vero上的CPE形成能力基本没有区别，但rPPRV/41EGFP的CPE形成能力较其它三种病毒弱；rPPRV/41EGFP的CPE形成能力较弱还可以通过EGFP的表达来观察(图3B)，病毒感染后7天时，rPPRV/41EGFP的CPE没有达到100％，且呈现条索状，而rPPRV/101EGFP的CPE基本为100％，基本无条索状现象；此外，rPPRV/101EGFP的荧光强度较rPPRV/41EGFP的弱，表明rPPRV/101EGFP的表达EGFP水平较高(图3B)。

为了证实rPPRV/101GFP的GFP表达水平确实高于rPPRV/41GFP，分别将rPPRV/41GFP和rPPRV/101GFP感染vero，于不同时间裂解细胞，检测GFP蛋白的相对荧光值。结果如图4所示，rPPRV/101GFP的GFP表达水平在5d时为rPPRV/41GFP的两倍，表明rPPRV/101GFP更适合作为载体表达外源基因。

实施例3重组病毒与亲本病毒株在Vero细胞上的生长动力学特性比较

将wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1、rPPRV/41GFP和rPPRV/101GFP分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70％～80％单层Vero细胞，37℃感作1小时后，加入含2％胎牛血清的DMEM完全培养液，于5％CO₂、37℃培养。分别于感染后3、4、5、6、7和8天收获病毒，冻融2次后，病毒做10倍梯度稀释，在Vero细胞上于96孔板中滴定TCID₅₀(半数组织感染量)，感染后第14天于荧光倒置显微镜下观察CPE或荧光，计算TCID₅₀，评价各病毒在Vero细胞上的生长动力学特点。

wtPPRV/N75/1、rPPRV/N75/1、rPPRV/41GFP和rPPRV/101GFP在Vero细胞上的动力学生长曲线如图5所示，各株病毒的动力学生长曲线相似，表明外源基因的插入对于病毒的生长基本没有影响。

实施例4动物免疫试验

wtPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP按每只1000TCID₅₀的剂量各免疫山羊(成都麻羊)4只，分别于免疫后的2周、4周和6周采血分离血清并检测PPRV中和抗体效价。PPRV的中和抗体效价检测方法按O.I.E.推荐方法进行(World Organisation for Animal Health.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals，2004)，其中血清样品倍比稀释为1/10、1/20、1/40、1/80、1/160、1/320，每孔加入100TCID₅₀剂量的wtPPRV/N75/1病毒，在接毒后14天观察病变，并计算PPRV中和抗体效价。

为了验证重组PPRV病毒的免疫原性是否发生改变，将wtPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP按10³TCID₅₀/只的剂量免疫山羊，PPRV的中和抗体效价如表2所示，三个毒株的所有免疫羊的PPRV中和抗体效价在免疫2周后都转阳性(＞10)，表明rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP能够诱导充分的PPRV中和抗体。同时，与wtPPRV/N75/1的效价比较，rPPRV/41EGFP免疫组有3只羊(5、6、7号)的效价较低(＜160)，而rPPRV/101EGFP免疫组仅有1只羊(10号)的效价较低(＜160)。用GraphPad Prism软件进行2way ANOVA分析，rPPRV/41GFP与wtPPRV/N75/1的差异显著(P＜0.05)，而rPPRV/101EGFP与wtPPRV/N75/1的差异不显著(P＞0.05)，说明rPPRV/101EGFP免疫效力高于rPPRV/41EGFP。

表2免疫后PPRV中和抗体效价检测

^*把wtPPRV/N75/1和rPPRV/41EGFP诱导的PPRV中和抗体效价用GraphPad Prism软件进行2way ANOVA分析，P＜0.05，表明两个毒株之间诱导PPRV中和抗体水平差异显著。

^**对wtPPRV/N75/1和rPPRV/101EGFP的PPRV中和抗体效价进行如上分析，P＞0.05，表明两个毒株之间诱导PPRV中和抗体的差异不显著。

^#Mock为注射PBS的对照组。

在构建表达外源基因GFP的时候，本研究设计了两种GE/GS的表达方案，结果表明rPPRV/101EGFP采用P基因和M基因之间完整的间隔序列(共101bp)作为GE/CTT/GS，较rPPRV/41EGFP采用截短的GE/CTT/GS(共41bp)表达GFP的效率更高，同时前者在动物免疫试验中诱导的中和抗体水平也更高一些。因此前者的构建策略更适合用于构建重组PPRV表达外源蛋白。

本研究利用PPRV/N75/1疫苗株的cDNA克隆，在世界范围内首次成功建立PPRV反向遗传操作技术平台。在此基础上，构建了表达EGFP的PPRV/N75/1疫苗株的cDNA克隆，并拯救出表达EGFP的PPRV。拯救的各株病毒(rPPRV/N75/1、rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP)在vero细胞上的生长动力学特性相似，且rPPRV/41EGFP和rPPRV/101EGFP都能够稳定高水平表达EGFP，表明PPRV可以作为活病毒载体表达外源蛋白。动物免疫试验表明，rPPRV/101EGFP相对于wtPPRV/N75/1疫苗的免疫原性没有显著性差异，能够诱导足够高的PPRV中和抗体。利用反向遗传技术，构建的表达禽流感病毒HA基因的NDV重组病毒，已经成为中国禽流感防控疫苗体系中的重要一员[21]。鉴于PPR是一种世界范围内对养羊业危害巨大的病毒病，PPRV可作为一种构建新疫苗的优良载体，从而防控两种甚至两种以上对养羊业危害巨大的病毒病，并将会产生巨大的经济和社会效益。

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Claims

1.一种小反刍兽疫病毒的反向遗传操作系统，该系统包含：

(1)转录质粒，所述转录质粒能够转录所述小反刍兽疫病毒的基因组全长cDNA序列；和

(2)一个或多个辅助质粒，所述辅助质粒能够表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)，

其中所述转录质粒还同时转录编码外源蛋白的基因，所述编码外源蛋白的基因位于所述小反刍兽疫病毒的编码磷蛋白(P)的基因和编码基质蛋白(M)的基因之间，

其中在编码外源蛋白的基因的基因转录信号终止序列(GE)为额外插入的编码天然PPRV磷蛋白(P)的GE，编码外源蛋白基因的基因转录信号起始序列(GS)为额外插入的编码天然PPRV基质蛋白(M)的GS，此外额外插入了基因间隔序列CTT以隔开外源蛋白基因和M基因，插入的GE、CTT、GS三者全长为101bp。

2.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，所述系统还包含小反刍兽疫病毒的病毒复制许可的宿主细胞。

3.根据权利要求2所述的反向遗传操作系统，所述宿主细胞是BHK细胞或Vero细胞。

4.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其包括三个辅助质粒，所述三个辅助质粒分别表达所述小反刍兽疫病毒的核蛋白(N)、磷蛋白(P)、和多聚酶大蛋白(L)。

5.根据权利要求4所述的反向遗传操作系统，其中所述小反刍兽疫病毒是小反刍兽疫病毒弱毒疫苗株Nigeria 75/1。

6.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其中所述编码外源蛋白的基因是标记基因。

7.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其中所述外源蛋白是小反刍兽疫病毒的抗原性蛋白。

8.根据权利要求1所述的反向遗传操作系统，其中所述外源蛋白是蓝舌病病毒的VP2或VP5抗原性蛋白。

9.根据权利要求6所述的反向遗传操作系统，其中所述标记基因是编码EGFP蛋白的基因。

10.根据权利要求7所述的反向遗传操作系统，其中所述外源蛋白是融合蛋白(F)或血凝素蛋白(H)。

11.根据权利要求1-10任一项所述的反向遗传操作系统，其中所述转录质粒是pCI-PPRV/101EGFP，所述pCI-PPRV/101EGFP是在SEQ ID No.1所示的pCI-PPRV序列中的4558和4559nt之间从5′端到3′端插入SEQ IDNo.3而构建的。

12.根据权利要求1-10任一项所述的反向遗传操作系统，其中所述辅助质粒分别是核苷酸序列如图9所示的pCI-N、核苷酸序列如图10所示的pCI-P和核苷酸序列如图11所示的pCI-L。

13.一种制备重组小反刍兽疫病毒的方法，其包括以下步骤：

1)使用在权利要求1-12任一项的反向遗传操作系统中所述的转录质粒和辅助质粒共转染小反刍兽疫病毒的病毒复制许可的宿主细胞；和

2)从转染细胞的细胞悬液中拯救重组小反刍兽疫病毒。

14.根据权利要求13的方法制备的重组小反刍兽疫病毒，其为rPPRV/101EGFP，其中在权利要求13所述的方法中使用权利要求9所述的反向遗传操作系统。

15.根据权利要求14的重组小反刍兽疫病毒在制备预防小反刍兽疫的疫苗中的应用。