具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明,本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的,并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
主要实验材料和来源
1.质粒、细胞
用于本发明实验中的7个辅助质粒为本实验室保存,含有蓝舌病病毒BTV-1SZ97/1完整基因的10个质粒(B1-B10)为本实验室保存。BSR细胞为本实验保存,BHK-21细胞为本实验室保存。
7个辅助质粒的信息如下表所示:
辅助质粒基因编码蛋白及功能表
2.主要试剂和药品
胎牛血清(FBS)购自EXCEL公司、DMEM及OPTI-MEM购自GIBCOL公司;转染试剂lipofectamine3000购自NEB公司,抗VP7单克隆抗体为本实验保存,抗小鼠IgG FITC标记酶标抗体购自Sigma公司,质粒大提试剂盒购自Bimake公司,2x Phanta Master Mix DNA聚合酶和质粒小提试剂盒购自Vazyme公司,RNA纯化试剂盒购自Qiagen公司,S1核酶购自TaKaRa公司。
实施例1:7个辅助质粒的构建
辅助质粒引物设计
以蓝舌病毒VP1、VP3、VP4、NS1、VP7、NS2和VP6基因开放阅读框为模板设计引物,并在VP1、VP3、VP4和NS2上下游引物分别引入Sma I和Not I酶切位点,在VP6、VP7和NS1上下游引物分别引入EcoR I和Sal I酶切位点(表1)。
表1辅助质粒构建引物
7个辅助质粒的构建
以本实验室保存的血清1型蓝舌病毒VP1、VP3、VP4、NS1、VP7、NS2和VP6基因质粒为模板,用上述所设计引物克隆对应基因,PCR反应体系为:去离子水22uL,对应上下游引物各1uL,对应质粒模板1uL,PrimeSTAR 2x promix聚合酶25uL。PCR反应条件如表2所示。
表2辅助质粒构建对应基因PCR反应条件
PCR反应结束后,用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化,然后用Sma I与Not I对VP1、VP3、VP4和NS2进行酶切,用EcoR I与Sal I对VP6、VP7和NS1进行酶切。并对pCI-neo载体分别进行对应的酶切处理。常规方法链接转化,对转化菌提取质粒进行酶切鉴定(图1),并进行序列测定。将序列测定正确的质粒分别命名为质粒A1(pCI-VP1)、A2(pCI-VP3)、A3(pCI-VP4)、A4(pCI-VP6)、A5(pCI-VP7)、A6(pCI-NS1)和A7(pCI-NS2)。
实施例2:血清1型蓝舌病病毒10个基因节段的克隆
1.引物设计
根据含有血清1型蓝舌病病毒基因的B1-B10质粒对应的序列设计克隆蓝舌病病毒10个基因节段的PCR引物(如下表3所示)该引物保证了PCR产物含有完整的BTV各个节段基因,即5’端第一核苷酸位于T7启动子的“+1”位,3’端为病毒基因的最后一个核苷酸,见表3:
表3:蓝舌病病毒10个基因节段克隆用引物序列
以B5质粒为模板设计拯救病毒鉴定引物,所设计的引物如表4所示:
表4:蓝舌病病毒鉴定用引物
引物名称 |
引物序列(5’-3’) |
Ls5-JD-F |
GATTACGCAAATGCCACGAGA |
Ls5-JD-R |
CACTCTGCCTTTGTATCCAGT |
2、血清1型蓝舌病病毒BTV10个节段PCR的反应体系:
PCR的体系:
为了获得更多的纯化PCR产物,每个节段进行5个PCR反应。按表5的反应条件进行克隆。
表5:PCR反应条件
3、PCR反应产物的鉴定
将每个片段的5个PCR产物混合,取200ul用于纯化,剩余PCR产物进行电泳鉴定,电泳条件:
琼脂糖凝胶浓度:1%
电泳电压:160V
电泳时间:30分钟
上样量:5uL
电泳结果如图2所示。
4、血清1型蓝舌病病毒10个节段PCR产物的纯化
(1)向200ul BTV10个节段PCR产物中分别加入700uL Buffer RLT,混匀。
(2)再分别向每个PCR产物混合液中加入500ul无水乙醇,用移液器吹打混匀。
(3)分别将蓝舌病病毒10个节段混合液700ul加入纯化柱中,12000xg离心15seconds,弃去离心后收集管中的液体。将剩余PCR产物加入到纯化柱中,同样方法离心,去滤液。
(4)向纯化柱中加入500ul Buffer RPE,12000xg离心15seconds,弃收集管中的液体。
(5)再向纯化柱中加入500ul Buffer RPE,12000xg离心2min,弃收集管中的液体。
(6)将纯化柱放入新的收集管中,12000xg离心1min,以确保去除纯化柱中残留的液体。
(7)向纯化柱中加入50ul RNase-free water,将纯化柱放入1.5mL离心管中,12000xg离心1min。
纯化后的酶切产物经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并测定浓度后,于-20℃冻存以备下一步使用。
5、蓝舌病病毒的拯救
准备BSR细胞,将BSR细胞铺板6孔板,待细胞生长至单层后,转染辅助质粒,具体方法如下:
将待转染孔用无菌PBS洗涤三次,弃去洗涤液,每孔加入2mL OPTI-MEM。然后准备转染液,取2支1.5mL无菌离心管,每个离心管内加入250uL OPTI-MEM,分别标记为溶液1和溶液2。在溶液1中加入15uL LipofectamineTM 3000Reagent,混匀备用,在溶液2中加入辅助质粒共计3.2ug,然后加入P3000TM Reagent 6.4uL,混匀备用。将溶液1和溶液2混匀,室温静置15分钟,然后按每孔250uL的量将转染液加入待转染孔,将6孔板放入37℃继续培养20小时。
辅助质粒转染20小时后,进行基因组PCR产物转染,具体方法如下:
取出转染辅助质粒的6孔板,将转染孔内培养液弃去,PBS洗涤3次,然后每孔加入2mL OPTI-MEM,备用。取2支1.5mL离心管,每管加入250uL OPTI-MEM,分别标记为溶液1和溶液2。在溶液1中加入15uL LipofectamineTM 3000 Reagent,混匀备用,在溶液2中加入辅助质粒共计8ug,然后加入P3000TM Reagent 16uL,混匀备用。将溶液1和溶液2混匀,室温静置15分钟,然后按每孔250uL的量将转染液加入待转染孔,将6孔板放入37℃继续培养。20小时以后将转染孔培养液换成含有1%FBS的培养液,每日观察细胞病变,在转染后4天若无可见病变,可将转染孔细胞传代两次,即有可见病变出现。
待细胞出现病变后,收获病毒,具体方法如下:将出现细胞病变的细胞冻融1次,然后将待有细胞碎片的培养液收集即为病毒液。
6、拯救病毒的鉴定
6.1拯救病毒的IFA鉴定:
将拯救病毒接种BHK-21细胞,待细胞出现病变后,进行IFA鉴定,具体方法如下:将6孔板取出,弃去病变孔上清,用PBST洗涤细胞3次,每次2mL,每孔加入1mL 4%多聚甲醛固定液,放入4℃冰箱放置30分钟。取出6孔板,弃去固定液,于病变孔加入1mL透膜液(含有0.1%Tripton-100的PBST),放入4℃透膜处理30分钟。取出6孔板,弃去透膜液,PBST洗涤5次,每次2mL。每孔加入2000倍稀释的4H7抗体,放入37℃孵育1小时。取出6孔板,PBST洗涤5次,每孔加入128倍稀释的山羊抗小鼠FITC标记酶标抗体,每孔500uL,放入37℃孵育1小时。取出6孔板,PBST洗涤5次,放入荧光显微镜下观察,结果如图3。
6.2拯救病毒的PCR鉴定:
将拯救病毒接种BHK-21细胞,待细胞病变出现后,用Qiagen公司组织细胞RNA提取试剂盒提取细胞总RNA,所提取的总RNA以Ls5-JD-F/Ls5-JD-R为引物进行反转录,具体方法如下:
取细胞总RNA 3uL,Ls5-JD-F/Ls5-JD-R各1uL,混匀,放入PCR仪内,95℃处理5分钟,4℃处理5分钟。取出PCR管,依次加入以下试剂:去RNase水5.5uL,5x反转录Buffer 4uL,RNase Inhibitor 0.5uL,AMV 1uL,混匀,放入PCR仪,25℃10分钟,42℃60分钟,70℃5分钟,4℃5分钟。即获得反转录产物。
重组病毒的PCR鉴定:
PCR反应体系为:
将以上体系混匀,按下述表6程序进行PCR扩增:
表6:重组病毒的PCR反应条件
PCR结束后,对产物进行电泳鉴定,结果如图5,表明成功拯救重组病毒。6.3拯救病毒基因组电泳鉴定:
将拯救病毒接种BHK-21细胞,待细胞病变出现后,用TRIzolTM Ls
Reagen提取感染细胞总RNA,具体方法参照说明书进行,简言之:将细胞冻融一次,将残留在细胞瓶底的细胞悬起,5000g离心5分钟,收集细胞沉淀,用细胞上清定容至250uL并转移至新的1.5mL离心管,加入750uL TRIzolTM Ls Reagent混匀,室温放置5分钟,加入200uL三氯甲烷,剧烈摇晃混匀,室温静置15分钟,4℃下12000g离心15分钟,取最上层无色液相至新的无RNase离心管,加入500uL异丙醇,轻混混匀后室温静置10分钟,4℃下12000g离心10分钟,弃去上清,用1mL 75%乙醇重悬沉淀,5000g离心5分钟,弃去上清,室温干燥RNA5分钟,用适量无RNase水溶解RNA。用S1核酸酶对TRIzol法提取的总RNA进行消化,具体方法如下:
S1核酸酶酶切体系:
将以上体系混合均匀,放入37℃温箱消化1小时。消化结束后,取10uL酶切产物用2%琼脂糖凝胶常规方法电泳,电泳电压160V。电泳结果显示蓝舌病10个基因节段呈典型的“331”分布(图5)
通过本发明的两步细胞内转染法,能够快速准确的拯救BTV病毒,所述病毒进一步用于制备疫苗以及蓝舌病机制的研究。
序 列 表
<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心)
<120>基于辅助质粒和PCR产物的蓝舌病病毒反向遗传拯救方法及其应用
<160>10
<170>PatentIn Version 2.1
<210>1
<211>3975
<212>DNA
<213>蓝舌病病毒亚群(Bluetingue virus)
<400> 1
CGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAgttaaaatgcaatggtcgcaatcaccgtgcaaggtgcacagctcatcaagcgagtggtcgaacgcttttatccagggatagcatttaatatagatgaaggagcatgttatatatataagttttctgatcatatacgacgcataaggatgaaacatggaacgaaatatcgacggcaggcggaagagattatgcgcaatataagcttgaggaaagagcgattgtatgggataccagtattagatgaggttgagtggaagtatgtgtttgatggtcaaacgttccaaagttacgcttttgaggtgtacgtgaactcaattttgccgtggagtgaacttgatccggaggaagagttcttacgtaattatagagtttcaagggagatgactgaagtggaaaaatttatcgaattccgtgctaaaaacgagatgcaaatatacggagatatacccattaaggtatggtgttgtttcatcaatgaactgagtgcggaattaaaacatattcccttagggatgcaagttatggctgactttgtaaaccgtttcgattcaccattccatcaggggaatagagatttatcaaatcttgaagattttcaagttgcatacactacgccgcttttgtttgaaatgtgttgcatggaatcaattttagaattcaatatcaaaatgcgtatgcgtgaagaagatatctcggcgctggaattcggtgatatgaaagttgatccggttggactattgcgtgagtttttcattctgtgcttaccacacccaaagaagattaacaacgttctaagagcaccatactcttggtttgtaaagatgtggggcgtcggagctgatccgatcgttgttttacaatctacggcaggcgatgacaggaattcaaaggatgtgttttatgacaagtttcgaaccgagccaaatcgatacaaagccctatttcggtcatcgttttataacgaatcaagacgaatgaatgaggagaagattctagaggcagtgaagtattcgcaaaaattgggctcgcacgaacgtagattacctctttttgagaaaatgttaaagacggtttatactacaccattttatccacataagagctcgaatatgatactagcgtcctttctattaagtattcaaactattactggatatggcagggcgtgggtgaagaacgtgagtactgagttcgataaacagctgaagccgaacccgagcaatctagttcaggatgtttcggatttaacgcgggaattctttaaacaagcatatgttgaagcaaaagaacgtagagaagagatcgttaaacctgaggatttatatacatcgatgttgcgattagcgagaaatacaagttcaggtttttcaaccgagatttatgtaaaaaagagatttggtccaagactaagggataaagatttgatcaagatcaattcaaggattaaggctttagttattttcactaaaggacatactgttttcactgatgaagaacttcataaaaaatataatagtgtagaactataccaaactaagggttcaagagatgtaccgattaaggctacgagaacgatatattcaatcaatctttcagtgttggtaccgcagttaattgttactttacccttgaatgaatatttttctagggttggcgggataaccagtccggattataagaagatcggaggaaaagtaattgtcggagatttggaggccacggggtcgcgcgtgatggatgctgctgattgctttcgtaactctgcagaccgcgatatattcacaattgcaatcgactatagtgaatatgatacacacctaacgcgacataattttcgaaccggtatgctccaaggaatcagagaagccatggccccctatagggatttgcgatatgaaggttatacgttggagcaaatcatagattttggatatggagaggggagagtagcgaatacgttgtggaatggaaagcgaagactgtttaaaactacatttgatgcgtatatacgattagacgagagcgagcgagacaaaggtagtttcaaagtccccaaaggagtgcttccagtatcgagtattgatgtcgcgaaccgaatcgcggttgacaaaggattcgatacgcttatcgcggcaacggatggaagcgatttggctctgatcgacacgcacctttccggcgagaattcgactctcatcgctaactcgatgcacaacatggctattgggaccttgatacaacgagaagttgggaaggagcagccagggattcttactttcttatcggagcaatacgtgggagatgacacactgttttacacaaagctacacactacagatactaaggtttttgataaagtggcggcttcaatttttaatacagtggcgaagtgtggacatgaagcttcacctagtaagacaatgatgacgccatattctgtggagaagacccaaacgcatgcaaagcagggctgttacgtaccgcaagatcgtatgatgattatctcatcagaaaggaggaaggatatcgaggatgtgcaggggtacgtgcgttcgcaagtgcaaacgatgataacgaaggtgagcagaggattttgtcatgatttggcgcagctaatattaatgcttaagactactttcatcggtgcgtggaaaatgaagcgaactattaaggaagatgcgatgtatcgcgacagaaagtttgattcgaacgatgaggatgggtttacgttgatacagattcgaaatcccttagcattatatgtccctataggctggaatgggtacggcgcgcatccggcagctcttaatatcgttatgacggaagagatgtatgttgattcgatcatgatctcaaaactggatgaaatcatggcgccgataaggaggattgtgcatgacattccaccgtgttggaatgagactcagggagacaagcgcggattgattagtgcaactaaaatgagtttcttttcgaagatggctaggcctgctgtccaagccgctttaagcgatccgcagataatgaatctagttgaagagcttccacttggggagttttcacctggacgtatctcgagaaccatgatgcatagtgctcttctgaaggaatcaagcgctaggacgttgttatccagtggttacgaactagaatatcagaaggctttgaatagttggatcgcacaagtttcgatgcgtttgggagaggagtcaggagtaatatcaacatcttatgcgaaactctttgacgtatacttcgaaggtgagttagacggcgcaccctatatgtttccagaccagaacttatctccgcagttctatatacagaagatgatgattggcccacgagttagttcacgagtgcggaattcttatgtagatcggattgatgtgatattgagaaaggatgtcgttatgcgcggctttatcactgccaataccattctgaacgtaattgagaaactgggaactaatcactcagtgggagatttagtcacagtttttacgcttatgaacatcgagacacgtgtggccgaagagctagctgaatatatgacttcagaaaagatacgatttgacgcgttgaagcttctaaagaaaggaatcgctggcgacgaatttactatgtcgttgaacgttgctacacaggattttattgacacttacctcgcctatccctatcagttgacgaaaacggaagtcgacgccatatcgttgtattgcacgcagatggttatgctacgcgcggcgctcgggttaccaaagaagaagatgaagatcgttgtaactgatgatgcaaagaaaagatacaagatacgtttgcagaggtttagaacgcacgtacctaaaattaaagttcttaagaagttgattgatccaaatagaatgacagttagaaatcttgaaaaccaattcgtttgagagcacgcgccgcattacacTTAC 3975
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<212>DNA
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