CN108642019A - 一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株，它是在母本狂犬病口服疫苗毒株的基因组G基因和L基因之间插入布鲁菌外膜蛋白U‑OMP19基因，通过反向遗传操作系统拯救出可以表达U‑OMP19基因的重组狂犬病口服免疫毒株，所述布鲁菌外膜蛋白U‑OMP19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明通过U‑OMP19基因的插入增强了毒株的免疫原性，提高了耐酸和耐蛋白酶消化的能力，在口服免疫后可以诱导高水平的中和抗体。

Description

一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法
技术领域
本发明属于动物疫苗技术领域，涉及重组狂犬病口服疫苗毒株，尤其是一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株，本发明还涉及该毒株的制备方法。
背景技术
狂犬病是最古老的传染病之一，是由狂犬病毒(Rabies virus，RV)引起的一种人畜共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病，一旦发病，病死率几乎达100％。据世界卫生组织报告，全世界每年有约55000人死于狂犬病，其中绝大多数分布在非洲和亚洲。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，多数是由于被动物咬伤而被感染。疫苗免疫是预防和控制狂犬病的最有效途径，当前广泛应用的狂犬病疫苗主要是原代细胞培养疫苗和传代细胞纯化疫苗等灭活疫苗，这些疫苗虽然免疫效果较好，但价格昂贵，而且主要采用的免疫方式为肌注免疫，这样对于一些流浪动物及野生动物的免疫接种则很难实现。在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前主要的传染源，因此，将流浪的动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。
口服免疫是一种公认的易于实施的免疫方式，欧美许多国家已经将口服疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。目前应用的口服疫苗主要有SAD-B19(Schneider LG,Cox JH,Muller WW etal.Current oral rabies vaccination in Europe:an interimbalance.Rev Infect Dis 1988,10Suppl 4:S654-659.Wandeler AI,Capt S,Kappeler Aetal.Oral immunization of wildlife against rabies:concept and first fieldexperiments.Rev Infect Dis.1988,10Suppl 4:S649-653.)、VR-G(Kieny MP,Lathe R,Drillien R etal.Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinantvaccinia virus.Nature.1984,312:163-166.Brochier B,Kieny MP,Costy Fetal.Large-scale eradication of rabies using recombinant vaccinia-rabiesvaccine.Nature.1991,354:520-522.Fearneyhough MG,Wilson PJ,Clark KAetal.Results of an oral rabies vaccination program for coyotes.J Am Vet MedAssoc.1998,212:498-502.Hanlon CA,Niezgoda M,Hamir AN etal.First NorthAmerican field release of a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus.JWildl Dis.1998,34:228-239)，和SAG-2(Flamand A,Coulon P,Lafay F etal.Avirulentmutants of rabies virus and their use as live vaccine.Trends Microbiol.1993,1:317-320.Cliquet F,Robardet E,Must K etal.Eliminating rabies in Estonia.PLoSNegl Trop Dis.2012,6:e1535.Cliquet F,Aubert M.Elimination of terrestrialrabies in Western European countries.Dev Biol(Basel).2004,119:185-204.Niin E,Barrat J,Kristian M etal.First oral vaccination of wildlife against rabies inEstonia.Dev Biol(Basel).2006,125:145-147.)等。但这些口服疫苗均存在许多不足，例如，SAD虽然在欧美一些国家消灭了狂犬病在狐狸中的传播，但有研究表明SAD 对小鼠及本土动物具有致病性(Winkler WG,Shaddock JH,Williams LW.Oral rabies vaccine:evaluation of its infectivity in three species of rodents.Am JEpidemiol.1976,104:294-298.)。SAG-2为从SAD株发展而来，是在SAD株中突变2个氨基酸位点而使其致病性大大降低，但SAG-2所产生的中和抗体水平较低(Hanlon CA,NiezgodaM,Morrill P etal.Oral efficacy of an attenuated rabies virus vaccine inskunks and raccoons.J Wildl Dis.2002,38:420-427.)。VR-G为痘病毒表达狂犬病G蛋白的重组毒株，虽然VR-G帮助欧美许多国家阻止了狂犬病在浣熊和狐狸等野生动物中的传播，但有研究表明，VR-G暴露给人可导致严重的皮肤炎症发应和全身的痘病毒感染(MempelM,Isa G,Klugbauer N etal.Laboratory acquired infection with recombinantvaccinia virus containing an immunomodulating construct.J InvestDermatol.2003,120:356-358.Rupprecht CE,Blass L,Smith K etal.Human infectiondue to recombinant vaccinia-rabies glycoprotein virus.N Engl J Med.2001,345:582-586.Centers for Disease C,Prevention.Human vaccinia infection aftercontact with a raccoon rabies vaccine bait-Pennsylvania,2009.MMWR Morb MortalWkly Rep.2009,58:1204-1207.)。
此外，当前的狂犬病口服疫苗的免疫起始部位多为口腔，不能引起胃肠道的免疫反应(Orciari LA,Niezgoda M,Hanlon CA etal.Rapid clearance of SAG-2rabiesvirus from dogs after oral vaccination.Vaccine.2001Aug 14；19(31):4511-8.ZhouM,Zhang G,Ren G etal.Recombinant rabies viruses expressing GM-CSF orflagellin are effective vaccines for both intramuscular and oralimmunizations.PLoS One.2013May 20；8(5):e63384.Zhou M,Wang L,Zhou Setal.Recombinant rabies virus expressing dog GM-CSF is an efficacious oralrabies vaccine for dogs.Oncotarget.2015Nov 17；6(36):38504-16.)。因此，研发一种安全有效价格便宜且可以增强胃肠道免疫反应的狂犬病口服疫苗将对狂犬病的防控起到重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一株重组狂犬病口服疫苗毒株，该疫苗株不仅具有较高的复制滴度，较低的致病性，较好的免疫原性，而且口服免疫后可以降低胃肠道酸性环境和蛋白酶对病毒的降解，从而提高其在胃肠道的抗原递呈，诱导产生高水的中和抗体。
本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
所用的母本毒株LBNSE来源于用于欧洲野生动物口服免疫用的疫苗株SAD-B19，但在SAD-B19毒株的G蛋白上将194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突变为谷氨酸(GAA)，从而大大减弱了病毒的致病性(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activatingmolecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.JVirol 85:1634-1.Rasalingam P,Rossiter JP,Mebatsion T,Jackson AC.Comparativepathogenesis of the SAD-L16 strain of rabies virus and a mutant modifying thedynein light chain binding site of the rabies virus phosphoprotein in youngmice.Virus Res.2005,111:55-60.Conzelmann KK,Cox JH,Schneider LG,ThielHJ.Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuatedrabies virus SAD B19.Virology.1990,175:485-499.)。另外，还将基因组中G基因和L基因之间的假基因敲出，在G基因和L基因之间加入两个酶切位点BsiWI和NheI作为插入外源基因的位点。
合成U-OMP19基因后插入到LBNSE母本毒株基因组的G基因和L基因之间，构建出表达U-OMP19的感染性克隆LBNSE-U-OMP19。
SEQ ID NO：1是母本毒株SAD-B19的基因核苷酸序列；SEQ ID NO：2是U-OMP19基因核苷酸序列；SEQ ID NO：3是本发明重组狂犬病口服疫苗毒株LBNSE-U-OMP19的基因核苷酸序列。
感染性克隆LBNSE-U-OMP19与分别表达狂犬病毒N、P、G和L四个蛋白的辅助质粒共同转染BSR细胞后，经免疫荧光证明拯救了可以表达U-OMP19的重组狂犬病病毒。为了验证是否U-OMP19已经插入到狂犬病毒基因组中，将拯救的病毒LBNSE-U-OMP19感染BSR细胞，然后提取病毒RNA，用反转录PCR进行验证，证明了U-OMP19已插入到狂犬病毒基因组中。
本发明中的重组病毒LBNSE-U-OMP19在BSR细胞及NA细胞上的生长曲线与母本病毒LBNSE相似，表明外源基因U-OMP19的插入并没有影响到病毒的生长和增殖。另外，重组病毒LBNSE-U-OMP19在BSR和NA细胞上的滴度分别可以达到108.25FFU/ml和107.75FFU/ml，达到了口服免疫滴度的要求。
将重组病毒LBNSE-U-OMP19以最高剂量脑内接种小鼠，小鼠未出现任何发病症状，表明该重组病毒无致病性，安全性高。
将表达U-OMP19的重组狂犬病毒LBNSE-U-OMP19口服免疫可以诱导较高水平的中和抗体，显著高于母本毒株LBNSE。
为了研究LBNSE-U-OMP19是否具有较强的耐酸和耐蛋白酶消化作用，我们利用灌胃方式直接将病毒送入胃肠道中，并检测其以此种极端方式免疫后的效果，结果表明LBNSE-U-OMP19灌胃免疫小鼠后可以使4只小鼠产生高水平的抗体，而LBNSE灌胃后只有3只小鼠产生了低水平的中和抗体，二者存在显著差异，这表明U-OMP19的表达具有一定的抗酸抗胃肠蛋白酶消化的能力。
此外，很多研究表明U-OMP19可以作为布鲁氏菌病的亚单位疫苗，因此，本发明中的LBNSE-U-OMP19也具有开发为狂犬病、布鲁氏菌病二价疫苗的潜力。
总之，本发明提供的重组狂犬病口服疫苗毒株具有良好的复制性，安全性，并且通过U-OMP19的插入增强了免疫原性，提高了耐酸和耐蛋白酶消化的作用，在口服免疫后可以诱导高水平的中和抗体，显著优于母本病毒LBNSE，因此，LBNSE-U-OMP19可以作为狂犬病口服疫苗的候选株，也同时具有开发为狂犬病、布鲁氏菌病二价疫苗的潜力。
附图说明
图1重组病毒LBNSE-U-OMP19的感染性克隆构建策略示意图。
图2重组病毒LBNSE-U-OMP19的免疫荧光检测结果。
图3重组病毒LBNSE-U-OMP19的反转录PCR检测结果。
图4重组病毒LBNSE-U-OMP19在不同细胞系上的生长曲线。
图5重组病毒LBNSE-U-OMP19脑内感染小鼠后的体重变化(致病性)曲线。
图6重组病毒LBNSE-U-OMP19口服免疫ICR小鼠后的中和抗体滴度。
图7重组病毒LBNSE-U-OMP19口服免疫攻毒后的保护率。
图8重组病毒LBNSE-U-OMP19灌胃免疫后的中和抗体滴度。
图9重组病毒LBNSE-U-OMP19灌胃免疫后的中和抗体滴度高于0.5IU/ml的比较分析。
图10重组病毒LBNSE-U-OMP19灌胃免疫攻毒后的保护率。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明。
实施例1重组病毒LBNSE-U-OMP19的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒
母本毒株LBNSE由华中农业大学农业微生物国家重点实验室保存，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activating molecules enhances theinnate and adaptive immune response to vaccination.J Virol 85:1634-1.)。
1.1.2质粒
用于拯救母本毒株LBNSE的感染性克隆pLBNSE的构建策略及具体方法可参考有关文献(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.J Virol 85:1634-1.)。
1.1.3细胞和单克隆抗体
BSR细胞(BHK-21细胞的一个克隆细胞系)，生长于含10％胎牛血清(Fetal bovineserum,FBS)(Gibco,Grand Island,NY)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium,DMEM)(Mediatech,Herndon,VA)培养液。鼠神经瘤细胞(Mouse neuroblastoma cells,NA)，生长于含10％FBS的RMPI 1640培养液(Mediatech)。异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujirebio(Melvin,PA)公司。
1.1.4实验动物
6-8周龄的ICR小鼠、Balb/c小鼠，购于华中农业大学实验动物中心。
1.1.5主要试剂
胶回收试剂盒、质粒小提和大提试剂盒、RNeasy mini-kit RNA提取试剂盒及Superfect转染试剂盒均购于QIAGEN公司，各种限制性内切酶购于New England Biolabs,Beverly,MA公司。SuperscriptTM RT-PCR试剂盒购于Invitrogen公司。
1.2引物的设计与合成
用于扩增U-OMP19的引物见表1，由上海金斯瑞公司合成
注：斜体加粗部分为限制性内切酶位点序列：U-OMP19扩增上游引物加粗斜体序列为BsiWI，下游引物加粗斜体序列为NheI。
1.3重组病毒LBNSE-U-OMP19的拯救
参照实验室以前构建好的系统进行拯救，参见相关文献(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressing dendritic cell-activatingmolecules enhances the innate and adaptive immune response to vaccination.JVirol 85:1634-1.)。具体如下：转染前一天将BSR细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80％的覆盖度，按照转染试剂Superfect(QIAGEN公司)的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ugN辅助质粒，0.25ug P辅助质粒，0.15ug G辅助质粒以及0.1ugL辅助质粒共同转染BSR细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，CO2浓度为5％，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10％FBS的DMEM培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养4天，把上清液转移到BSR单层细胞上，在34℃含5％CO2的培养箱培养3天，收集上清，分装保存-80℃。
1.4拯救病毒的鉴定
1.4.1免疫荧光检测
将拯救的病毒与BSR细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80％丙酮于4℃固定30分钟，然后用PBS洗2遍，将异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体(购于Fujirebio公司)进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用PBS洗三遍，在荧光显微镜(Leica DMIRES)进行观察。
1.4.2反转录(RT)PCR检测
将拯救的病毒与BSR细胞共培养48小时后，将细胞刮下提取总RNA，按照SuperscriptTM RT-PCR试剂盒说明(购于Invitrogen公司)进行操作。
1.5病毒滴定
取96孔细胞培养板，以4行×9列为一个样品区，每板两个分区，将每个孔内加入90μl的含10％FBS的RPMI 1640细胞培养液，每个样品设4个重复，将10μl的病毒原液加入到96孔细胞板的第一列，充分混合后吸取10μl混合液到第二列，充分混匀，再吸出10ul混合液到下一列，依次连续进行10倍的倍比稀释，至第9列孔后弃掉10μl的混合液。每孔加入5×104的NA细胞后于37℃，5％CO2感作48h，然后弃细胞上清液，用80％冷丙酮(80％Ice-coldacetone)固定感染细胞。以抗狂犬病毒N蛋白荧光抗体(FITC-conjugated anti-RV Nantibodies)染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域(Antigen-positivefoci)。根据Reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为FFU/ml(Fluorescent focusunits per milliliter)。
1.6重组病毒LBNSE-U-OMP19在BSR和NA细胞上的生长特性
将病毒以感染复数为0.01(MOI＝0.01)分别感染BSR与NA细胞，分别在感染后第1天，第2天，第3天，第4天及第5天取50μl的上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘制出生长曲线。
1.7动物实验
1.7.1重组病毒LBNSE-U-OMP19致病性实验
将6-8周龄的ICR小鼠，每组10只，分别用40μl的DMEM或者1×107FFU的重组病毒LBNSE，以脑内注射(i.c.)的方式进行感染，观察每天观察两次，记录小鼠的临床发病及死亡情况。
1.7.2LBNSE-U-OMP19口服和灌胃免疫后中和抗体测定实验
将ICR小鼠分为6组，每组10只，用107FFU的LBNSE、LBNSE-U-OMP19分别进行口服和灌胃免疫，同时用相同剂量的DMEM作为阴性对照，每周定期采血，持续5周，使用荧光抗体中和病毒试验(FAVN)测定狂犬病毒中和抗体滴度。
1.7.3LBNSE-U-OMP19口服和灌胃免疫后保护率实验
将ICR小鼠分为6组，每组10只，分别用100μl的DMEM、1×107FFU的LBNSE、1×107FFU的LBNSE-U-OMP19以口服和灌胃两种方式进行免疫。在免疫后的第5周，脑内注射50×MICLD50的强毒株CVS-24进行攻毒，并在攻毒后记录小鼠的临床症状及死亡数量。
2.实验结果
2.1感染性克隆LBNSE-U-OMP19的构建及拯救病毒检测
如图1所示，重组病毒LBNSE-U-OMP19是在母本病毒LBNSE的基础上，将U-OMP19基因扩增并测序正确后插入到G基因和L基因之间，利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图2左图所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒LBNSE-U-OMP19，而细胞对照(图2右图)则观察不到荧光灶。另外，为了检测U-OMP19是否已插入到拯救的病毒中，将拯救的病毒感染BSR细胞后，提取RNA进行反转录PCR检测，上游引物设计在U-OMP19插入的位点BsiWI上游，下游引物设计在另一插入位点NheI的下游，具体引物序列见表1。如图3所示，可以看到1016bp的目的条带，说明U-OMP19已经插入到狂犬病病毒的基因组。
2.2病毒的体外生长特性
为了研究U-OMP19的插入是否影响狂犬病毒自身的复制及增殖，将母本病毒LBNSE和LBNSE-U-OMP19同时感染BSR和NA细胞，并且于不同时间点测定其病毒的滴度，绘制出病毒的生长曲线。如图4，可以观察到重组病毒LBNSE-U-OMP19和母本病毒LBNSE具有相似的生长曲线，这表明外源基因U-OMP19的插入并未影响病毒的复制和增殖，并且最高滴度与母本病毒也相差不大。重组病毒LBNSE-U-OMP19在BSR细胞和NA细胞上达到的最高滴度分别为1×108.25FFU/ml和1×107.75FFU/ml，均在感染后第4天达到滴度最高值。
2.3重组病毒致病性
重组病毒LBNSE-U-OMP19脑内注射6-8周龄的ICR小鼠中，观察3周，期间并未出现任何发病症状，且其体重变化要明显好于母本株LBNSE，表明其对小鼠无致病性，且可以在一定程度降低病毒致病性，安全性高(图5)。
2.4重组病毒口服免疫效果评价
将重组病毒LBNSE-U-OMP19和母本毒株LBNSE(欧洲用于野生动物免疫疫苗株)口服免疫6-8周龄ICR小鼠，分别于免疫后2周，3周，4周，5周进行采血测定中和抗体滴度。诱导高的中和抗体水平是预防狂犬病的有效手段，因此中和抗体的测定作为狂犬病疫苗效果评价的方法。如图6所示，重组病毒LBNSE-U-OMP19诱导的中和抗体水平要显著高于母本毒株LBNSE，在免疫后第3周中和抗体水平最高，可以达到6.98IU/ml，母本毒株LBNSE的中和抗体水平在第3周最高，也只有1.15IU/ml。值得一提的是，在免疫后第2周时，LBNSE诱导的中和抗体水平平均只有0.4IU/ml，低于狂犬病免疫保护最低要求滴度0.5IU/ml，而LBNSE-U-OMP19则可以诱导平均4.0IU/ml中和抗体。在免疫后第5周我们进行了攻毒实验，如图7所示，结果表明LBNSE-U-OMP19免疫的小鼠保护率为90％，而母亲病毒LBNSE免疫小鼠保护率仅为56％，表明U-OMP19的表达可以显著提高口服免疫保护率。
为了进一步验证LBNSE-U-OMP19的耐胃肠酸性环境和蛋白酶降解的能力，我们采取直接灌胃免疫的方式，使病毒直接进入胃肠道。如图8所示，LBNSE-U-OMP19灌胃免疫小鼠产生的中和抗体滴度要高于LBNSE灌胃免疫的小鼠。此外，如图9所示，LBNSE-U-OMP19灌胃免疫后有4只小鼠的滴度高于0.5IU/ml(最高平均滴度为5.4IU/ml)，而LBNSE灌胃小鼠产生的中和抗体滴度高于0.5IU/ml的只有3只，且最高平均滴度为1.6IU/ml，显著低于LBNSE-U-OMP19灌胃免疫组。在免疫后第5周进行攻毒实验，如图10所示，LBNSE-U-OMP19灌胃免疫组的保护率为60％，高于LBNSE灌胃免疫组的40％，这表明U-OMP19的表达具有一定的抗胃肠道环境和蛋白酶消化的作用。
总之，本发明中的重组狂犬病口服疫苗毒株LBNSE-U-OMP19对小鼠无致病性且一定程度降低病毒致病性，安全性高，在口服免疫效果上，与母本株LBNSE相比，LBNSE-U-OMP19可以诱导产生显著高的中和抗体水平，最高可以达到.986IU/ml。同时，通过灌胃免疫表明LBNSE-U-OMP19还具有一定的耐胃肠道酸性环境和蛋白酶降解的能力，提高了胃肠道的免疫反应，从而提高了免疫保护率。因此，本发明重组病毒LBNSE-U-OMP19具备了作为疫苗株的高效、低毒的特点，可以作为一种耐胃肠道酸性环境和蛋白酶降解的狂犬病口服疫苗的候选株。
本发明的保护范围不局限于实施例，例如，实施例中采用LBNSE为母本毒株，该毒株与其它狂犬病口服疫苗相比具有致病性低等优点，当然也可以采用其它的狂犬病口服疫苗毒株为母本，同样也能实现本发明增强免疫原性，提高耐酸和耐蛋白酶消化能力等目的。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 11928
<212> DNA
<213> 狂犬病病毒SAD-B19株(Rabies virus)
<400> 1
acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120
gaagcctgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180
aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240
gtcaggcatg agcgccgcca aacttaatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300
aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa ttgtgattgc 360
acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420
agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480
tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540
cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600
ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660
gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720
tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780
aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840
actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900
ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960
atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020
ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080
aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140
aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200
tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttttcagg 1260
tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320
gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380
attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440
tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500
aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560
cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620
ggctcatctc caaggggaac ccatagaggt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680
tcacctggat gatggaaaat cgcccaacca tggtgagata gccaaggtgg gagaaggcaa 1740
gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800
cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860
gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920
tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980
gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040
aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggctacc aatgaagagg atgatctatc 2100
agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160
ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220
tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280
actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340
gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400
ttgctaaccg aacctctccc ctcagtccct ctagacaata aaatccgaga tgtcccaaag 2460
tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa cctcctacgt aagatagtga 2520
aaaaccgcag ggacgaggac actcaaaaat cctctcccgc gtcagcccct ctggatgacg 2580
atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca ggcaagaaga 2640
acatgaggaa cttttgtatc aacggaaggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700
tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760
tgatcgggtt agtcaaagtg gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820
gcctgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880
gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940
agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagagtct 3000
ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060
aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120
aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180
gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240
agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300
aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360
attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc 3420
gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480
caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt 3540
gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600
ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660
cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720
ccctgactac cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780
tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840
cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900
catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag 3960
agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020
taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080
ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa 4140
gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200
ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260
gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320
catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa 4380
tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440
cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500
gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560
gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620
tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680
ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740
cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800
gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860
acacaagagt gggggtgaga ccagactgta aggactggcc gtcctttcaa cgatccaagt 4920
cctgaagatc acctcccctt ggggggttct ttttgaaaaa cctgggttca atagtcctcc 4980
ttgaactcca tgcaactggg tagattcaag agtcatgaga ttttcattaa tcctctcagt 5040
tgatcaagca agatcatgtc gattctcata ataggggaga tcttctagca gtttcagtga 5100
ctaacggtac tttcattctc caggaactga caccaacagt tgtagacaaa ccacggggtg 5160
tctcgggtga ctctgtgctt gggcacagac aaaggtcatg gtgtgttcca tgatagcgga 5220
ctcaggatga gttaattgag agaggcagtc ttcctcccgt gaaggacata agcagtagct 5280
cacaatcatc tcgcgtctca gcaaagtgtg cataattata aagtgctggg tcatctaagc 5340
ttttcagtcg agaaaaaaac attagatcag aagaacaact ggcaacactt ctcaacctga 5400
gacttacttc aagatgctcg atcctggaga ggtctatgat gaccctattg acccaatcga 5460
gttagaggct gaacccagag gaacccccat tgtccccaac atcttgagga actctgacta 5520
caatctcaac tctcctttga tagaagatcc tgctagacta atgttagaat ggttaaaaac 5580
agggaataga ccttatcgga tgactctaac agacaattgc tccaggtctt tcagagtttt 5640
gaaagattat ttcaagaagg tagatttggg ttctctcaag gtgggcggaa tggctgcaca 5700
gtcaatgatt tctctctggt tatatggtgc ccactctgaa tccaacagga gccggagatg 5760
tataacagac ttggcccatt tctattccaa gtcgtccccc atagagaagc tgttgaatct 5820
cacgctagga aatagagggc tgagaatccc cccagaggga gtgttaagtt gccttgagag 5880
ggttgattat gataatgcat ttggaaggta tcttgccaac acgtattcct cttacttgtt 5940
cttccatgta atcaccttat acatgaacgc cctagactgg gatgaagaaa agaccatcct 6000
agcattatgg aaagatttaa cctcagtgga catcgggaag gacttggtaa agttcaaaga 6060
ccaaatatgg ggactgctga tcgtgacaaa ggactttgtt tactcccaaa gttccaattg 6120
tctttttgac agaaactaca cacttatgct aaaagatctt ttcttgtctc gcttcaactc 6180
cttaatggtc ttgctctctc ccccagagcc ccgatactca gatgacttga tatctcaact 6240
atgccagctg tacattgctg gggatcaagt cttgtctatg tgtggaaact ccggctatga 6300
agtcatcaaa atattggagc catatgtcgt gaatagttta gtccagagag cagaaaagtt 6360
taggcctctc attcattcct tgggagactt tcctgtattt ataaaagaca aggtaagtca 6420
acttgaagag acgttcggtc cctgtgcaag aaggttcttt agggctctgg atcaattcga 6480
caacatacat gacttggttt ttgtgtttgg ctgttacagg cattgggggc acccatatat 6540
agattatcga aagggtctgt caaaactata tgatcaggtt caccttaaaa aaatgataga 6600
taagtcctac caggagtgct tagcaagcga cctagccagg aggatcctta gatggggttt 6660
tgataagtac tccaagtggt atctggattc aagattccta gcccgagacc accccttgac 6720
tccttatatc aaaacccaaa catggccacc caaacatatt gtagacttgg tgggggatac 6780
atggcacaag ctcccgatca cgcagatctt tgagattcct gaatcaatgg atccgtcaga 6840
aatattggat gacaaatcac attctttcac cagaacgaga ctagcttctt ggctgtcaga 6900
aaaccgaggg gggcctgttc ctagcgaaaa agttattatc acggccctgt ctaagccgcc 6960
tgtcaatccc cgagagtttc tgaggtctat agacctcgga ggattgccag atgaagactt 7020
gataattggc ctcaagccaa aggaacggga attgaagatt gaaggtcgat tctttgctct 7080
aatgtcatgg aatctaagat tgtattttgt catcactgaa aaactcttgg ccaactacat 7140
cttgccactt tttgacgcgc tgactatgac agacaacctg aacaaggtgt ttaaaaagct 7200
gatcgacagg gtcaccgggc aagggctttt ggactattca agggtcacat atgcatttca 7260
cctggactat gaaaagtgga acaaccatca aagattagag tcaacagagg atgtattttc 7320
tgtcctagat caagtgtttg gattgaagag agtgttttct agaacacacg agttttttca 7380
aaaggcctgg atctattatt cagacagatc agacctcatc gggttacggg aggatcaaat 7440
atactgctta gatgcgtcca acggcccaac ctgttggaat ggccaggatg gcgggctaga 7500
aggcttacgg cagaagggct ggagtctagt cagcttattg atgatagata gagaatctca 7560
aatcaggaac acaagaacca aaatactagc tcaaggagac aaccaggttt tatgtccgac 7620
atacatgttg tcgccagggc tatctcaaga ggggctcctc tatgaattgg agagaatatc 7680
aaggaatgca ctttcgatat acagagccgt cgaggaaggg gcatctaagc tagggctgat 7740
catcaagaaa gaagagacca tgtgtagtta tgacttcctc atctatggaa aaaccccttt 7800
gtttagaggt aacatattgg tgcctgagtc caaaagatgg gccagagtct cttgcgtctc 7860
taatgaccaa atagtcaacc tcgccaatat aatgtcgaca gtgtccacca atgcgctaac 7920
agtggcacaa cactctcaat ctttgatcaa accgatgagg gattttctgc tcatgtcagt 7980
acaggcagtc tttcactacc tgctatttag cccaatctta aagggaagag tttacaagat 8040
tctgagcgct gaaggggaga gctttctcct agccatgtca aggataatct atctagatcc 8100
ttctttggga gggatatctg gaatgtccct cggaagattc catatacgac agttctcaga 8160
ccctgtctct gaagggttat ccttctggag agagatctgg ttaagctccc aagagtcctg 8220
gattcacgcg ttgtgtcaag aggctggaaa cccagatctt ggagagagaa cactcgagag 8280
cttcactcgc cttctagaag atccgaccac cttaaatatc agaggagggg ccagtcctac 8340
cattctactc aaggatgcaa tcagaaaggc tttatatgac gaggtggaca aggtggaaaa 8400
ttcagagttt cgagaggcaa tcctgttgtc caagacccat agagataatt ttatactctt 8460
cttaatatct gttgagcctc tgtttcctcg atttctcagt gagctattca gttcgtcttt 8520
tttgggaatc cccgagtcaa tcattggatt gatacaaaac tcccgaacga taagaaggca 8580
gtttagaaag agtctctcaa aaactttaga agaatccttc tacaactcag agatccacgg 8640
gattagtcgg atgacccaga cacctcagag ggttgggggg gtgtggcctt gctcttcaga 8700
gagggcagat ctacttaggg agatctcttg gggaagaaaa gtggtaggca cgacagttcc 8760
tcacccttct gagatgttgg gattacttcc caagtcctct atttcttgca cttgtggagc 8820
aacaggagga ggcaatccta gagtttctgt atcagtactc ccgtcctttg atcagtcatt 8880
tttttcacga ggccccctaa agggatactt gggctcgtcc acctctatgt cgacccagct 8940
attccatgca tgggaaaaag tcactaatgt tcatgtggtg aagagagctc tatcgttaaa 9000
agaatctata aactggttca ttactagaga ttccaacttg gctcaagctc taattaggaa 9060
cattatgtct ctgacaggcc ctgatttccc tctagaggag gcccctgtct tcaaaaggac 9120
ggggtcagcc ttgcataggt tcaagtctgc cagatacagc gaaggagggt attcttctgt 9180
ctgcccgaac ctcctctctc atatttctgt tagtacagac accatgtctg atttgaccca 9240
agacgggaag aactacgatt tcatgttcca gccattgatg ctttatgcac agacatggac 9300
atcagagctg gtacagagag acacaaggct aagagactct acgtttcatt ggcacctccg 9360
atgcaacagg tgtgtgagac ccattgacga cgtgaccctg gagacctctc agatcttcga 9420
gtttccggat gtgtcgaaaa gaatatccag aatggtttct ggggctgtgc ctcacttcca 9480
gaggcttccc gatatccgtc tgagaccagg agattttgaa tctctaagcg gtagagaaaa 9540
gtctcaccat atcggatcag ctcaggggct cttatactca atcttagtgg caattcacga 9600
ctcaggatac aatgatggaa ccatcttccc tgtcaacata tacggcaagg tttcccctag 9660
agactatttg agagggctcg caaggggagt attgatagga tcctcgattt gcttcttgac 9720
aagaatgaca aatatcaata ttaatagacc tcttgaattg gtctcagggg taatctcata 9780
tattctcctg aggctagata accatccctc cttgtacata atgctcagag aaccgtctct 9840
tagaggagag atattttcta tccctcagaa aatccccgcc gcttatccaa ccactatgaa 9900
agaaggcaac agatcaatct tgtgttatct ccaacatgtg ctacgctatg agcgagagat 9960
aatcacggcg tctccagaga atgactggct atggatcttt tcagacttta gaagtgccaa 10020
aatgacgtac ctatccctca ttacttacca gtctcatctt ctactccaga gggttgagag 10080
aaacctatct aagagtatga gagataacct gcgacaattg agttctttga tgaggcaggt 10140
gctgggcggg cacggagaag ataccttaga gtcagacgac aacattcaac gactgctaaa 10200
agactcttta cgaaggacaa gatgggtgga tcaagaggtg cgccatgcag ctagaaccat 10260
gactggagat tacagcccca acaagaaggt gtcccgtaag gtaggatgtt cagaatgggt 10320
ctgctctgct caacaggttg cagtctctac ctcagcaaac ccggcccctg tctcggagct 10380
tgacataagg gccctctcta agaggttcca gaaccctttg atctcgggct tgagagtggt 10440
tcagtgggca accggtgctc attataagct taagcctatt ctagatgatc tcaatgtttt 10500
cccatctctc tgccttgtag ttggggacgg gtcagggggg atatcaaggg cagtcctcaa 10560
catgtttcca gatgccaagc ttgtgttcaa cagtctttta gaggtgaatg acctgatggc 10620
ttccggaaca catccactgc ctccttcagc aatcatgagg ggaggaaatg atatcgtctc 10680
cagagtgata gatcttgact caatctggga aaaaccgtcc gacttgagaa acttggcaac 10740
ctggaaatac ttccagtcag tccaaaagca ggtcaacatg tcctatgacc tcattatttg 10800
cgatgcagaa gttactgaca ttgcatctat caaccggatc accctgttaa tgtccgattt 10860
tgcattgtct atagatggac cactctattt ggtcttcaaa acttatggga ctatgctagt 10920
aaatccaaac tacaaggcta ttcaacacct gtcaagagcg ttcccctcgg tcacagggtt 10980
tatcacccaa gtaacttcgt ctttttcatc tgagctctac ctccgattct ccaaacgagg 11040
gaagtttttc agagatgctg agtacttgac ctcttccacc cttcgagaaa tgagccttgt 11100
gttattcaat tgtagcagcc ccaagagtga gatgcagaga gctcgttcct tgaactatca 11160
ggatcttgtg agaggatttc ctgaagaaat catatcaaat ccttacaatg agatgatcat 11220
aactctgatt gacagtgatg tagaatcttt tctagtccac aagatggttg atgatcttga 11280
gttacagagg ggaactctgt ctaaagtggc tatcattata gccatcatga tagttttctc 11340
caacagagtc ttcaacgttt ccaaacccct aactgacccc tcgttctatc caccgtctga 11400
tcccaaaatc ctgaggcact tcaacatatg ttgcagtact atgatgtatc tatctactgc 11460
tttaggtgac gtccctagct tcgcaagact tcacgacctg tataacagac ctataactta 11520
ttacttcaga aagcaagtca ttcgagggaa cgtttatcta tcttggagtt ggtccaacga 11580
cacctcagtg ttcaaaaggg tagcctgtaa ttctagcctg agtctgtcat ctcactggat 11640
caggttgatt tacaagatag tgaagactac cagactcgtt ggcagcatca aggatctatc 11700
cagagaagtg gaaagacacc ttcataggta caacaggtgg atcaccctag aggatatcag 11760
atctagatca tccctactag actacagttg cctgtgaacc ggatactcct ggaagcctgc 11820
ccatgctaag actcttgtgt gatgtatctt gaaaaaaaca agatcctaaa tctgaacctt 11880
tggttgtttg attgtttttc tcatttttgt tgtttatttg ttaagcgt 11928
<210> 2
<211> 474
<212> DNA
<213> U-OMP19
<400> 2
atgcagagct cccggcttgg taatctcgat aatgtttcgc ctccgccgcc gcctgcaccg 60
gtcaatgctg ttccggcagg cacggtgcag aaaggcaatc ttgattctcc cacacaattc 120
cccaatgcgc cctccacgga tatgagcgcg caatccggca cacaggtcgc aagcctgccg 180
cctgcatccg caccggacct gacgcccggc gccgtggctg gcgtctggaa cgcctcgctt 240
ggtggtcaga gctgcaagat cgcgacgccg cagaccaaat atggccaggg ctatcgcgca 300
ggcccgctgc gctgccccgg tgaactggct aatcttgcct cctgggccgt caatggcaag 360
caactcgtcc tttacgatgc gaacggcggt acggttgcct cgctctattc ttcaggacag 420
ggccgcttcg atggccagac caccggcggg caggccgtga cgctgtcgcg ctga 474
<210> 3
<211> 12050
<212> DNA
<213> 重组狂犬病病毒LBNSE-U-OMP19株(Rabies virus)
<400> 3
acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120
gaagcctgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180
aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240
gtcaggcatg agcgccgcca aacttaatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300
aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa ttgtgattgc 360
acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420
agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480
tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540
cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600
ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660
gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720
tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780
aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840
actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900
ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960
atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020
ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080
aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140
aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200
tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttttcagg 1260
tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320
gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380
attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440
tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500
aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560
cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620
ggctcatctc caaggggaac ccatagaggt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680
tcacctggat gatggaaaat cgcccaacca tggtgagata gccaaggtgg gagaaggcaa 1740
gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800
cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860
gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920
tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980
gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040
aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggctacc aatgaagagg atgatctatc 2100
agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160
ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220
tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280
actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340
gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400
ttgctaaccg aacctctccc ctcagtccct ctagacaata aaatccgaga tgtcccaaag 2460
tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa cctcctacgt aagatagtga 2520
aaaaccgcag ggacgaggac actcaaaaat cctctcccgc gtcagcccct ctggatgacg 2580
atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca ggcaagaaga 2640
acatgaggaa cttttgtatc aacggaaggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700
tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760
tgatcgggtt agtcaaagtg gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820
gcctgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880
gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940
agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagagtct 3000
ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060
aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120
aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180
gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240
agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300
aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360
attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc 3420
gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480
caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt 3540
gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600
ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660
cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720
ccctgactac cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780
tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840
cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900
catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta cctccagtag 3960
agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020
taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080
ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa 4140
gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200
ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260
gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320
catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg aaacttggaa 4380
tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440
cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500
gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560
gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620
tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680
ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740
cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800
gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860
acacaagagt gggggtgaga ccagactgta aggactggcc gtcctttcaa cgatccaagt 4920
ccatgaaaaa aactaacacc cctcccgtac gaacatgcag agctcccggc ttggtaatct 4980
cgataatgtt tcgcctccgc cgccgcctgc accggtcaat gctgttccgg caggcacggt 5040
gcagaaaggc aatcttgatt ctcccacaca attccccaat gcgccctcca cggatatgag 5100
cgcgcaatcc ggcacacagg tcgcaagcct gccgcctgca tccgcaccgg acctgacgcc 5160
cggcgccgtg gctggcgtct ggaacgcctc gcttggtggt cagagctgca agatcgcgac 5220
gccgcagacc aaatatggcc agggctatcg cgcaggcccg ctgcgctgcc ccggtgaact 5280
ggctaatctt gcctcctggg ccgtcaatgg caagcaactc gtcctttacg atgcgaacgg 5340
cggtacggtt gcctcgctct attcttcagg acagggccgc ttcgatggcc agaccaccgg 5400
cgggcaggcc gtgacgctgt cgcgctgact agctagctta taaagtgctg ggtcatctaa 5460
gcttttcagt cgagaaaaaa acattagatc agaagaacaa ctggcaacac ttctcaacct 5520
gagacttact tcaagatgct cgatcctgga gaggtctatg atgaccctat tgacccaatc 5580
gagttagagg ctgaacccag aggaaccccc attgtcccca acatcttgag gaactctgac 5640
tacaatctca actctccttt gatagaagat cctgctagac taatgttaga atggttaaaa 5700
acagggaata gaccttatcg gatgactcta acagacaatt gctccaggtc tttcagagtt 5760
ttgaaagatt atttcaagaa ggtagatttg ggttctctca aggtgggcgg aatggctgca 5820
cagtcaatga tttctctctg gttatatggt gcccactctg aatccaacag gagccggaga 5880
tgtataacag acttggccca tttctattcc aagtcgtccc ccatagagaa gctgttgaat 5940
ctcacgctag gaaatagagg gctgagaatc cccccagagg gagtgttaag ttgccttgag 6000
agggttgatt atgataatgc atttggaagg tatcttgcca acacgtattc ctcttacttg 6060
ttcttccatg taatcacctt atacatgaac gccctagact gggatgaaga aaagaccatc 6120
ctagcattat ggaaagattt aacctcagtg gacatcggga aggacttggt aaagttcaaa 6180
gaccaaatat ggggactgct gatcgtgaca aaggactttg tttactccca aagttccaat 6240
tgtctttttg acagaaacta cacacttatg ctaaaagatc ttttcttgtc tcgcttcaac 6300
tccttaatgg tcttgctctc tcccccagag ccccgatact cagatgactt gatatctcaa 6360
ctatgccagc tgtacattgc tggggatcaa gtcttgtcta tgtgtggaaa ctccggctat 6420
gaagtcatca aaatattgga gccatatgtc gtgaatagtt tagtccagag agcagaaaag 6480
tttaggcctc tcattcattc cttgggagac tttcctgtat ttataaaaga caaggtaagt 6540
caacttgaag agacgttcgg tccctgtgca agaaggttct ttagggctct ggatcaattc 6600
gacaacatac atgacttggt ttttgtgttt ggctgttaca ggcattgggg gcacccatat 6660
atagattatc gaaagggtct gtcaaaacta tatgatcagg ttcaccttaa aaaaatgata 6720
gataagtcct accaggagtg cttagcaagc gacctagcca ggaggatcct tagatggggt 6780
tttgataagt actccaagtg gtatctggat tcaagattcc tagcccgaga ccaccccttg 6840
actccttata tcaaaaccca aacatggcca cccaaacata ttgtagactt ggtgggggat 6900
acatggcaca agctcccgat cacgcagatc tttgagattc ctgaatcaat ggatccgtca 6960
gaaatattgg atgacaaatc acattctttc accagaacga gactagcttc ttggctgtca 7020
gaaaaccgag gggggcctgt tcctagcgaa aaagttatta tcacggccct gtctaagccg 7080
cctgtcaatc cccgagagtt tctgaggtct atagacctcg gaggattgcc agatgaagac 7140
ttgataattg gcctcaagcc aaaggaacgg gaattgaaga ttgaaggtcg attctttgct 7200
ctaatgtcat ggaatctaag attgtatttt gtcatcactg aaaaactctt ggccaactac 7260
atcttgccac tttttgacgc gctgactatg acagacaacc tgaacaaggt gtttaaaaag 7320
ctgatcgaca gggtcaccgg gcaagggctt ttggactatt caagggtcac atatgcattt 7380
cacctggact atgaaaagtg gaacaaccat caaagattag agtcaacaga ggatgtattt 7440
tctgtcctag atcaagtgtt tggattgaag agagtgtttt ctagaacaca cgagtttttt 7500
caaaaggcct ggatctatta ttcagacaga tcagacctca tcgggttacg ggaggatcaa 7560
atatactgct tagatgcgtc caacggccca acctgttgga atggccagga tggcgggcta 7620
gaaggcttac ggcagaaggg ctggagtcta gtcagcttat tgatgataga tagagaatct 7680
caaatcagga acacaagaac caaaatacta gctcaaggag acaaccaggt tttatgtccg 7740
acatacatgt tgtcgccagg gctatctcaa gaggggctcc tctatgaatt ggagagaata 7800
tcaaggaatg cactttcgat atacagagcc gtcgaggaag gggcatctaa gctagggctg 7860
atcatcaaga aagaagagac catgtgtagt tatgacttcc tcatctatgg aaaaacccct 7920
ttgtttagag gtaacatatt ggtgcctgag tccaaaagat gggccagagt ctcttgcgtc 7980
tctaatgacc aaatagtcaa cctcgccaat ataatgtcga cagtgtccac caatgcgcta 8040
acagtggcac aacactctca atctttgatc aaaccgatga gggattttct gctcatgtca 8100
gtacaggcag tctttcacta cctgctattt agcccaatct taaagggaag agtttacaag 8160
attctgagcg ctgaagggga gagctttctc ctagccatgt caaggataat ctatctagat 8220
ccttctttgg gagggatatc tggaatgtcc ctcggaagat tccatatacg acagttctca 8280
gaccctgtct ctgaagggtt atccttctgg agagagatct ggttaagctc ccaagagtcc 8340
tggattcacg cgttgtgtca agaggctgga aacccagatc ttggagagag aacactcgag 8400
agcttcactc gccttctaga agatccgacc accttaaata tcagaggagg ggccagtcct 8460
accattctac tcaaggatgc aatcagaaag gctttatatg acgaggtgga caaggtggaa 8520
aattcagagt ttcgagaggc aatcctgttg tccaagaccc atagagataa ttttatactc 8580
ttcttaatat ctgttgagcc tctgtttcct cgatttctca gtgagctatt cagttcgtct 8640
tttttgggaa tccccgagtc aatcattgga ttgatacaaa actcccgaac gataagaagg 8700
cagtttagaa agagtctctc aaaaacttta gaagaatcct tctacaactc agagatccac 8760
gggattagtc ggatgaccca gacacctcag agggttgggg gggtgtggcc ttgctcttca 8820
gagagggcag atctacttag ggagatctct tggggaagaa aagtggtagg cacgacagtt 8880
cctcaccctt ctgagatgtt gggattactt cccaagtcct ctatttcttg cacttgtgga 8940
gcaacaggag gaggcaatcc tagagtttct gtatcagtac tcccgtcctt tgatcagtca 9000
tttttttcac gaggccccct aaagggatac ttgggctcgt ccacctctat gtcgacccag 9060
ctattccatg catgggaaaa agtcactaat gttcatgtgg tgaagagagc tctatcgtta 9120
aaagaatcta taaactggtt cattactaga gattccaact tggctcaagc tctaattagg 9180
aacattatgt ctctgacagg ccctgatttc cctctagagg aggcccctgt cttcaaaagg 9240
acggggtcag ccttgcatag gttcaagtct gccagataca gcgaaggagg gtattcttct 9300
gtctgcccga acctcctctc tcatatttct gttagtacag acaccatgtc tgatttgacc 9360
caagacggga agaactacga tttcatgttc cagccattga tgctttatgc acagacatgg 9420
acatcagagc tggtacagag agacacaagg ctaagagact ctacgtttca ttggcacctc 9480
cgatgcaaca ggtgtgtgag acccattgac gacgtgaccc tggagacctc tcagatcttc 9540
gagtttccgg atgtgtcgaa aagaatatcc agaatggttt ctggggctgt gcctcacttc 9600
cagaggcttc ccgatatccg tctgagacca ggagattttg aatctctaag cggtagagaa 9660
aagtctcacc atatcggatc agctcagggg ctcttatact caatcttagt ggcaattcac 9720
gactcaggat acaatgatgg aaccatcttc cctgtcaaca tatacggcaa ggtttcccct 9780
agagactatt tgagagggct cgcaagggga gtattgatag gatcctcgat ttgcttcttg 9840
acaagaatga caaatatcaa tattaataga cctcttgaat tggtctcagg ggtaatctca 9900
tatattctcc tgaggctaga taaccatccc tccttgtaca taatgctcag agaaccgtct 9960
cttagaggag agatattttc tatccctcag aaaatccccg ccgcttatcc aaccactatg 10020
aaagaaggca acagatcaat cttgtgttat ctccaacatg tgctacgcta tgagcgagag 10080
ataatcacgg cgtctccaga gaatgactgg ctatggatct tttcagactt tagaagtgcc 10140
aaaatgacgt acctatccct cattacttac cagtctcatc ttctactcca gagggttgag 10200
agaaacctat ctaagagtat gagagataac ctgcgacaat tgagttcttt gatgaggcag 10260
gtgctgggcg ggcacggaga agatacctta gagtcagacg acaacattca acgactgcta 10320
aaagactctt tacgaaggac aagatgggtg gatcaagagg tgcgccatgc agctagaacc 10380
atgactggag attacagccc caacaagaag gtgtcccgta aggtaggatg ttcagaatgg 10440
gtctgctctg ctcaacaggt tgcagtctct acctcagcaa acccggcccc tgtctcggag 10500
cttgacataa gggccctctc taagaggttc cagaaccctt tgatctcggg cttgagagtg 10560
gttcagtggg caaccggtgc tcattataag cttaagccta ttctagatga tctcaatgtt 10620
ttcccatctc tctgccttgt agttggggac gggtcagggg ggatatcaag ggcagtcctc 10680
aacatgtttc cagatgccaa gcttgtgttc aacagtcttt tagaggtgaa tgacctgatg 10740
gcttccggaa cacatccact gcctccttca gcaatcatga ggggaggaaa tgatatcgtc 10800
tccagagtga tagatcttga ctcaatctgg gaaaaaccgt ccgacttgag aaacttggca 10860
acctggaaat acttccagtc agtccaaaag caggtcaaca tgtcctatga cctcattatt 10920
tgcgatgcag aagttactga cattgcatct atcaaccgga tcaccctgtt aatgtccgat 10980
tttgcattgt ctatagatgg accactctat ttggtcttca aaacttatgg gactatgcta 11040
gtaaatccaa actacaaggc tattcaacac ctgtcaagag cgttcccctc ggtcacaggg 11100
tttatcaccc aagtaacttc gtctttttca tctgagctct acctccgatt ctccaaacga 11160
gggaagtttt tcagagatgc tgagtacttg acctcttcca cccttcgaga aatgagcctt 11220
gtgttattca attgtagcag ccccaagagt gagatgcaga gagctcgttc cttgaactat 11280
caggatcttg tgagaggatt tcctgaagaa atcatatcaa atccttacaa tgagatgatc 11340
ataactctga ttgacagtga tgtagaatct tttctagtcc acaagatggt tgatgatctt 11400
gagttacaga ggggaactct gtctaaagtg gctatcatta tagccatcat gatagttttc 11460
tccaacagag tcttcaacgt ttccaaaccc ctaactgacc cctcgttcta tccaccgtct 11520
gatcccaaaa tcctgaggca cttcaacata tgttgcagta ctatgatgta tctatctact 11580
gctttaggtg acgtccctag cttcgcaaga cttcacgacc tgtataacag acctataact 11640
tattacttca gaaagcaagt cattcgaggg aacgtttatc tatcttggag ttggtccaac 11700
gacacctcag tgttcaaaag ggtagcctgt aattctagcc tgagtctgtc atctcactgg 11760
atcaggttga tttacaagat agtgaagact accagactcg ttggcagcat caaggatcta 11820
tccagagaag tggaaagaca ccttcatagg tacaacaggt ggatcaccct agaggatatc 11880
agatctagat catccctact agactacagt tgcctgtgaa ccggatactc ctggaagcct 11940
gcccatgcta agactcttgt gtgatgtatc ttgaaaaaaa caagatccta aatctgaacc 12000
tttggttgtt tgattgtttt tctcattttt gttgtttatt tgttaagcgt 12050

Claims (3)

1.一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株，其特征在于：它是在母本狂犬病口服疫苗毒株的基因组G基因和L基因之间插入布鲁菌外膜蛋白U-OMP19基因，通过反向遗传操作系统拯救出可以表达U-OMP19基因的重组狂犬病口服免疫毒株，所述布鲁菌外膜蛋白U-OMP19基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.如权利要求1所述耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株，其特征在于：所述母本狂犬病口服疫苗毒株是LBNSE毒株，所述LBNSE毒株是将SAD-B19毒株G蛋白上的194位天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸，从而减弱了SAD-B19毒株的致病性。
3.权利要求2所述耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将SAD-B19毒株G蛋白上的194位天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸，从而减弱了SAD-B19毒株的致病性，得到LBNSE毒株；
2)将LBNSE毒株基因组中G基因和L基因之间的假基因敲除，在G基因和L基因之间加入两个酶切位点，将布鲁菌外膜蛋白U-OMP19基因插入到G基因和L基因之间，并通过反向遗传操作系统拯救出表达U-OMP19基因的重组狂犬病口服疫苗毒株。
CN201810476184.7A 2018-05-17 2018-05-17 一种耐胃肠道降解的重组狂犬病口服疫苗毒株及其制备方法 Pending CN108642019A (zh)

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