CN111518776A - 一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法 - Google Patents
一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。所述疫苗株以致弱疫苗SAD‑B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸，在致弱疫苗SAD‑B19的基因组的G基因和L基因之间插入鼠源OX40L基因。本发明所述重组狂犬病病毒安全性高，具备作为疫苗株的安全低毒、长期有效的特点，可以作为狂犬病疫苗的候选株；与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株即实验中的母本株LBNSE相比，所述重组狂犬病病毒能够迅速诱导产生显著高的中和抗体水平，并长达56天。
Description
技术领域
本发明涉及一种重组狂犬病病毒疫苗株及其制备方法，属于动物疫苗技术领域。
背景技术
狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染宿主中枢神经系统造成的一种烈性人畜共患传染病。宿主一旦发病，死亡率接近100％，目前尚无有效的治疗手段。近些年，我国平均每年约有3000人左右死于狂犬病，位居传染病死亡人数前三位，多数是由于被动物咬伤或者抓伤而被感染。数据显示，70％以上犬的免疫覆盖率可以有效控制人间狂犬病，因此，动物的免疫预防成为遏制人类狂犬病最为有效的措施。当前用于动物狂犬病免疫的疫苗主要为安全的灭活疫苗，但价格昂贵，并需多次免疫才能获得良好的保护，阻碍了其在我国的广泛应用。并且此类疫苗对于流浪动物及野生动物的免疫接种很难实现。而在我国，街头的流浪狗、猫等动物为当前狂犬病的主要传染源，将流浪动物进行有效的免疫是狂犬病防控的关键。因此，当前狂犬病毒研究的主要目标之一是发展低毒、可简化免疫程序及长期有效的狂犬病疫苗。
重组狂犬病病毒疫苗是一种利用反向遗传技术对狂犬病毒进行改造，有目的性地改变病毒的基因组结构，从而改变病毒的生物学特性，以增加安全性和免疫原性。欧美许多国家已经将重组狂犬病病毒疫苗应用于野生动物的狂犬病防控。1994年Schnell等第一次运用反向遗传技术成功的改造并拯救出狂犬病毒SAD B19株，目前应用的重组狂犬病病毒疫苗包括SAD B19株、RC-HL等。随后基于以这些病毒为母本，通过反向遗传学系统基础上构建了表达各种细胞因子，如GM-CSF、OX40L和Flt3L，缺失相关结构蛋白，如缺失M基因、P基因或G基因的重组病毒疫苗、过表达相关结构蛋白等重组病毒疫苗株。但这些疫苗均存在许多不足，其中很重要的不足有：①不能在早期就产生显著高水平的中和抗体；②中和抗体滴度不能维持长期有效的水平。例如，LBNSE-Flt3L在第21天时才能产生显著高水平的中和抗体滴度，至免疫后5周抗体水平与亲本毒株无差异。因此，发展低毒、单剂量及有效的狂犬病疫苗对狂犬病的控制具有重要意义。
OX40L是重要的协同刺激分子，参与机体免疫应答和多种疾病调控策略的重要环节。目前，国内外鲜有OX40L在疫苗诱导的免疫反应中调控滤泡内生发中心免疫途径的研究报道。通过细胞因子增强体液免疫反应对高效的狂犬病疫苗的研发具有重大意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株重组狂犬病病毒疫苗株，该病毒疫苗可以促进狂犬病毒免疫原性，诱导滤泡性T辅助细胞、生发中心B细胞和浆细胞的产生，增强机体的体液免疫反应。
本发明所述组狂犬病病毒疫苗株以之前报道的狂犬病疫苗株LBNSE为母本，将鼠源OX40L基因插入到LBNSE毒株基因组中，通过反向遗传操作技术拯救出能够表达鼠OX40L基因的重组狂犬病毒LBNSE-OX40L，该病毒株具有较高的病毒滴度，安全性高，并且在免疫后7天能迅速产生显著高水平的中和抗体，并维持机体体液免疫反应长达56天。
本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：
本发明所述重组狂犬病病毒疫苗株，以致弱疫苗SAD-B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突变为谷氨酸(GAA)，在致弱疫苗SAD-B19的基因组的G基因和L基因之间插入核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的鼠源OX40L基因。
本发明的另一目的在于提供所述重组狂犬病病毒疫苗株的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)以致弱疫苗SAD-B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸(AAT)突变为丝氨酸(TCC)，将333位的精氨酸(AGA)突变为谷氨酸(GAA)，极大减弱了病毒的致病性。
(2)将致弱疫苗SAD-B19毒株基因组中G和L基因之间的假基因敲除，并嵌入两个酶切位点BsiWI和NheI，作为插入外源基因的位点，用反转录PCR扩增得到鼠源OX40L基因，将扩增的鼠OX40L基因经测序验证正确后插入到LBNSE毒株基因组的G基因和L基因之间，构建出表达鼠OX40L基因的重组病毒，重组病毒命名为LBNSE-OX40L，基因序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明所述LBNSE毒株来源于用于欧洲野生动物免疫用的致弱疫苗株SAD-B19。
本发明中的鼠OX40L基因的克隆是通过狂犬病毒感染小鼠，提取大脑组织RNA，然后用反转录PCR扩增得到鼠源OX40L基因；将扩增的鼠OX40L基因经测序验证正确后插入到LBNSE毒株基因组的G基因和L基因之间，构建出表达鼠OX40L基因的感染性克隆LBNSE-OX40L。
将LBNSE-OX40L感染性克隆与表达狂犬病毒N、P、G和L四个蛋白的辅助质粒共同转染BSR细胞后，并将转染细胞7天后所获得的上清感染BSR细胞，以抗RABV N蛋白的荧光抗体检测是否拯救成功；提取病毒感染细胞的RNA，通过RT-PCR检测确定所扩增的片段为OX40L基因。
本发明中的重组病毒LBNSE-OX40L在BSR细胞及NA细胞上的生长曲线与LBNSE病毒相似，表明外源基因鼠OX40L的插入并没有显著影响到病毒的生长和增殖；另外，重组病毒LBNSE-OX40L在NA和BSR细胞上的滴度均可以达到108FFU/ml，满足多种免疫途径滴度的要求。
以亲本病毒组LBNSE为对照，将重组病毒LBNSE-OX40L脑内途径感染免疫功能完全小鼠(6周龄ICR小鼠)和免疫功能不完全小鼠(3-5日龄ICR乳鼠)，在观察的21天内，成年小鼠未表现出任何发病症状，并且体重未有显著变化；LBNSE-OX40L所感染的3-5日龄乳鼠的存活率稍高于亲本病毒组LBNSE，表明该重组病毒安全性高。
重组病毒LBNSE-OX40L肌肉免疫一次便可以诱导产生较多数量的滤泡性T辅助细胞、生发中心B细胞和浆细胞，可以迅速产生中和抗体，并在较长时间内保持高水平的中和抗体。母本毒株LBNSE在免疫后第21天时中和抗体升至顶峰，并逐步下降；而重组病毒LBNSE-OX40L在免疫后28天抗体水平达到顶峰，并在56天内仍然维持显著高中和水平抗体。
本发明中重组病毒LBNSE-OX40L具有良好的复制性，安全性，并且通过鼠OX40L基因的插入增强了免疫原性，能迅速产生显著高水平的中和抗体，维持机体的长久体液免疫反应，显著优于LBNSE病毒(欧洲用于野生动物免疫的疫苗株)，因此，重组病毒LBNSE-OX40L可以作为狂犬病疫苗的候选株。
本发明的有益效果：
本发明公开一种高效的重组狂犬病病毒疫苗株，它是以SAD-B19为母本毒株，将所述母本毒株G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸、333位的精氨酸突变为谷氨酸，并且在所述母本毒株的基因组G基因和L基因之间被插入鼠OX40L基因，该重组病毒具有良好的复制性，安全性，通过插入鼠OX40L基因增强了狂犬病毒的免疫原性，促进机体的体液免疫反应，迅速升高并维持长久的中和抗体水平，是一种优良的狂犬病疫苗候选株。
附图说明
图1是在狂犬病毒疫苗株LBNSE基因组中插入鼠源OX40L基因的构建示意图。
图2是拯救出的重组狂犬病病毒LBNSE-OX40L的免疫荧光实验检测结果。
图3是鼠OX40L基因插入到狂犬病病毒的基因组鉴定电泳图。
图4是重组病毒LBNSE-OX40L在不同细胞系上的生长曲线示意图。
图5是各重组病毒不同MOI感染BSR细胞后上清中OX40L的表达情况。
图6是各重组病毒细胞活性比较情况。
图7是重组病毒LBNSE-OX40L对成年小鼠脑内攻毒后的体重变化曲线。
图8是重组病毒LBNSE-OX40L对乳鼠脑内攻毒后的存活率。
图9是重组病毒LBNSE-OX40L在小鼠体内诱导滤泡性T辅助细胞产生的试验结果。
图10是重组病毒LBNSE-OX40L在小鼠体内诱导生发中心B细胞产生的试验结果。
图11是重组病毒LBNSE-OX40L在小鼠体内诱导浆细胞产生的试验结果。
图12是重组病毒LBNSE-OX40L免疫后的抗体滴度检测结果。A：中和抗体滴度；B：IgG抗体亚类水平。
图13是免疫21天后以狂犬病毒强毒株CVS-24脑内攻毒检测重组病毒LBNSE-OX40L的保护率结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明，需要说明的是，本发明的实施例仅限于对本发明进行说明，而没有限制作用；实施例中所涉及的有关试验方法和其它各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
实施例1
重组病毒LBNSE-OX40L的设计、拯救、鉴定及免疫效力初步评价
1材料和方法
1.1材料
1.1.1病毒
LBNSE毒株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室提供，该病毒的具体信息和构建方法可参考有关文献(WenY,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabiesvirus expressing dendritic cell-activating molecules enhances the innate andadaptive immune response to vaccination.JVirol 85:1634-1.)。
1.1.2质粒
用于拯救LBNSE毒株的感染性克隆pLBNSE的构建策略及具体方法可参考有关文献(Wen Y,Wang H,Wu H,Yang F,Tripp RA,et al.(2011)Rabies virus expressingdendritic cell-activating molecules enhances the innate and adaptive immuneresponse to vaccination.JVirol 85:1634-1.)。
1.1.3细胞和单克隆抗体
BSR克隆细胞系来源于BHK-21细胞系，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液；鼠神经瘤NA细胞，生长于含10％FBS的RMPI 1640培养液；异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体购自Fujirebio公司。
1.1.4实验动物
6周龄的ICR小鼠，6周龄的Balb/c小鼠，购于湖北省疾病预防控制中心。
1.1.5主要试剂
质粒提取试剂盒、Superfect转染试剂盒均购于QIAGEN公司，各种限制性内切酶购于New England Biolab，AMV Reverse Transcriptase XL及PrimerSTAR HS PCR购自TAKARA公司。
1.2引物的设计与合成
用于扩增鼠OX40L基因及RT-PCR检测鼠OX40L基因的引物见表1，由昆明擎科公司合成。
表1
注：鼠OX40L扩增/检测上游引物序列中的下划线部分为BsiWI限制性内切酶位点，下游引物序列划线部分为NheI限制性内切酶位点。
1.3狂犬病毒感染小鼠，提取大脑组织RNA及鼠OX40L基因的扩增
①以狂犬病毒B2c肌肉途径感染Balb/c小鼠。
②感染7天后，收集鼠脑组织，提取RNA，用AMV Reverse Transcriptase XL进行反转录后用TAKARA PrimerSTAR HS PCR扩增鼠源OX40L。
1.4重组病毒LBNSE-OX40L的拯救
转染前一天将BSR细胞接种于六孔板，使细胞于第二天使用时达到80％的覆盖度，按照转染试剂Superfect(QIAGEN公司)的产品说明说进行操作，将2ug的全长感染性克隆，0.5ugN辅助质粒，0.25ug P辅助质粒，0.15ug G辅助质粒以及0.1ug L辅助质粒共同转染BSR细胞，转染后的细胞放入37℃培养箱，CO2浓度为5％，孵育4小时，然后将上清倒掉，用含10％FBS的DMEM培养基洗一次，再加入新鲜培养基培养4天，把上清液转移到BSR单层细胞上，在34℃含5％CO2的培养箱培养3天，收集上清，-80℃分装保存。
1.5拯救病毒的鉴定
1.5.1免疫荧光检测
将拯救的病毒与BSR细胞于96孔细胞板共培养48小时后，将上清弃掉，用预冷的80％丙酮于4℃固定30分钟，然后用PBS洗2遍，将异硫氰酸荧光素标记的狂犬病毒核蛋白单克隆抗体进行1:70稀释，每孔加入50ul，放入37℃孵育1小时后用PBS洗三遍，在荧光显微镜进行观察。
1.5.2反转录(RT)PCR检测鼠OX40L
将拯救的病毒与BSR细胞共培养48小时后，将细胞刮下提取总RNA，RT-PCR进行检测。
1.6病毒滴定
在96孔细胞培养板中加入90μl DMEM培养基；取10μl冰浴的病毒样品10倍系列稀释(每个样品有四个重复)，然后每孔加入终浓度为1×104个/ml BSR细胞稀释液；轻混匀，放入37℃5％的CO2培养箱中48小时；弃去病毒培养基，每孔100μl PBS洗3次，加入每孔50μl冷丙酮常温固定15分钟，每孔100μl的PBS洗3次；加入1:150稀释的异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)荧光标记的抗狂犬病毒(Rabies virus,RABV)的N蛋白的抗体每孔50μl，抗体染色后，通过荧光显微镜观察并记录抗原阳性区域(Antigen-positive foci)。根据Reed-muench法进行病毒毒力的计算并记录为FFU/ml(Fluorescentfocus units per milliliter)。
1.7重组病毒LBNSE-OX40L在BSR和NA细胞上的生长特性
1.7.1BSR与NA细胞接种于96孔板，将各重组病毒以感染复数为0.01(MOI＝0.01)分别感染，并收集感染后第1天，第2天，第3天，第4天及第5天取50μl的上清液，进行病毒滴定，记录病毒在不同时间点的滴度，并绘制出多步生长曲线。
1.7.2细胞接种于96孔板中(1×104细胞/孔)，将LBNSE-OX40L和亲本毒株LBNSE分别以MOI＝0.01感染细胞；以细胞活性检测试剂盒，检测重组病毒对感染细胞是否有副作用。
1.8动物实验
1.8.1重组病毒LBNSE-OX40L致病性实验
以ICR小鼠为模型，选取106FFU/ml的体积内病毒所能达到的最高滴度，将重组病毒LBNSE-OX40L和母本毒LBNSE以及DMEM对6周龄雌性小鼠进行脑内途径感染，攻毒部位为右侧眼角与耳屏连线中间处，观察记录2w内小鼠的临床症状、死亡及体重变化；将LBNSE和LBNSE-OX40L以100FFU(体积为10μl)脑内途径感染5日龄乳鼠；记录实验小鼠3周内存活率，检测重组病毒对免疫不完全小鼠的致病性影响。比较LBNSE-OX40L和LBNSE的致病性差异。
1.8.2重组病毒LBNSE-OX40L中和抗体水平实验
将6-8周龄的ICR小鼠，每组12只，分别用1ml无菌注射器将含有1×106FFU的LBNSE毒株和1×106FFU的重组病毒株LBNSE-OX40L进行肌肉途径免疫，并分别于免疫后每周进行采血测定中和抗体水平，连续采集9周。
1.8.3特异性抗体亚类的检测
将蔗糖密度梯度离心纯化后的LBNSE使用抗原包被液稀释至蛋白质含量为500ng/孔，4℃过夜包被96孔ELISA板，弃去未结合的蛋白，200μl/孔的PBST洗涤3次，每次5分钟；加入含5％脱脂奶粉的PBST，37℃封闭2小时，封闭结束后，200μl/孔的PBST洗涤3次，每次5分钟；使用PBST将血清按1:30稀释，100μl/孔，于37℃孵育2小时，孵育后用200μl/孔的PBST洗涤3次，每次5分钟；用5％脱脂奶粉-PBST将生物素标记的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM进行稀释，100μl/孔，37℃孵育45分钟，孵育后，200μl/孔的PBST洗涤3次，每次5分钟；加入100μl/孔TMB底物溶液，37℃孵育30分钟；加入50μl/孔的2M H2SO4终止反应。于ELISA检测仪上，450nm处，检测各孔OD值。
1.8.4重组病毒LBNSE-OX40L保护率实验
于免疫21天时以50L D50 CVS-24脑内途径攻毒ICR小鼠，观察21天，检测LBNSE-OX40L的保护率。
2.实验结果
2.1感染性克隆LBNSE-OX40L的构建及拯救病毒检测
LBNSE毒株是在SAD-B19的基础上在G基因194位和333位进行突变，并且将G和L基因之间的假基因敲除，加入两个酶切位点BsiWI和NheI。重组病毒LBNSE-OX40L是在LBNSE病毒的基础上，将鼠OX40L基因扩增并测序正确后插入到G基因和L基因之间(如图1所示)，利用反向遗传技术拯救病毒，拯救的病毒用免疫荧光实验进行检测，如图2所示，可以看到绿色的荧光灶，即为拯救出的重组狂犬病病毒LBNSE-OX40L，而细胞阴性对照则观察不到荧光灶。另外，为了检测鼠OX40L基因是否已插入到拯救的病毒中，将拯救的病毒感染BSR细胞后，提前RNA进行反转录PCR检测，上游引物设计在鼠OX40L基因插入的位点BsiWI上游，下游引物设计在另一插入位点NheI的下游，具体引物序列见表1；检测结果如图3所示，第1泳道为LBNSE毒株可以扩增到225bp的目的条带，而第2泳道的LBNSE-OX40L可以看到597bp的目的条带，将琼脂糖回收的597bp的片段进行测序，确定其为OX40L基因。
2.2病毒的体外生长特性
2.2.1多步生长曲线
为进一步鉴定重组病毒的体外表型特征，以低感染复数(MOI＝0.01)分别在BSR细胞(图4A)和NA细胞(图4B)上测定重组病毒的多步生长曲线。如图所示，亲本病毒LBNSE和重组病毒LBNSE-OX40L均在感染后第4天病毒滴度升至最高，通过显著性分析发现两重组病毒在两种细胞中5天内的滴度与亲本病毒无显著差异，这说明重组病毒的生长特性并不因外源基因OX40L的插入而受到影响。
2.2.2各重组病毒表达OX40L的情况
通过ELISA试剂盒检测各重组病毒不同MOI感染BSR细胞后上清中OX40L的表达情况(图5)。如图所示，LBNSE-OX40L能够以剂量依赖的形式高表达OX40L，即随着感染复数的递增，而LBNSE感染的细胞上清中未检测到OX40L的显著表达。
2.2.3 OX40L的表达对感染细胞活性的影响
应用细胞毒性检测试剂盒对病毒感染后的BSR细胞进行活性检测(图6)。发现LBNSE-OX40L所感染细胞的活性与亲本病毒无显著差异，说明OX40L的过表达对感染细胞没有副作用。
2.3重组病毒致病性情况检测
将重组病毒LBNSE-OX40L、LBNSE毒株以及DMEM脑内注射6周龄的ICR小鼠和5日龄ICR乳鼠，观察3周，如图7所示，成年小鼠观察期间并未出现任何发病症状，体重未发生明显变化，说明重组病毒对成年小鼠无致病性，安全性高。如图8所示，LBNSE-OX40L组的乳鼠的存活率稍高于LBNSE。以上结果表明，LBNSE-OX40L更具安全性。
2.4重组病毒诱导滤泡性T辅助细胞的产生
以免疫体积为100μl的1×106FFU的LBNSE、LBNSE-OX40L或DMEM对6周龄的BALB/c雌鼠进行双后肢肌肉免疫，并在免疫后7天和14天收集小鼠腹股沟淋巴结，制成单细胞悬液后，添加流式抗体染色后检测分析滤泡性T辅助细胞的数量。如图9所示，发现免疫后7天和14天均能诱导滤泡性T辅助细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.5重组病毒诱导生发中心B细胞的产生
以1×106FFU的LBNSE、LBNSE-OX40L或DMEM以肌肉途径免疫BALB/c小鼠，并于免疫后7d和14d用流式抗体对小鼠的腹股沟淋巴结中单个细胞进行生发中心B细胞群分析，确定生发中心B细胞的增殖变化；如图10所示，发现免疫后7天和14天能够诱导生发中心B细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.6重组病毒诱导浆细胞的产生
在以1×106FFU的LBNSE-OX40L和LBNSE后肢肌肉免疫小鼠后的7天及14天，我们用流式抗体分析小鼠的骨髓细胞中浆细胞亚群占所收集的骨髓细胞的比例。如图11所示，发现免疫后7天和14天，能诱导浆细胞的产生，从而促进机体的体液免疫反应。
2.7重组病毒肌肉免疫效果评价
2.7.1中和抗体和狂犬病毒特异性抗体亚类的水平
在小鼠模型中以免疫体积为100ul的1×106FFU的LBNSE、LBNSE-OX40L或DMEM对6周龄的ICR雌鼠进行双后肢肌肉免疫，并在预定的时间点眼眶静脉采血，收集血清样品，连续测定免疫后血清中的中和抗体含量。如图12A所示，重组病毒LBNSE-OX40L诱导的中和抗体水平要显著高于LBNSE毒株，由于OX40L对滤泡性T辅助细胞、生发中心B细胞和浆细胞产生的影响，LBNSE-OX40L在免疫后28天中和抗体水平最高，可以达到42.36IU/ml，而LBNSE毒株的中和抗体水平在第21天最高，也只有19.54IU/ml。LBNSE-OX40L能够诱导显著高水平的中和抗体长达56天。
如图12B的狂犬病毒特异性抗体亚类的含量检测结果显示，与中和抗体滴度的趋势一致，LBNSE-OX40L所免疫的小鼠能产生较高水平的特异性的IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM。
2.7.2过表达OX40L对狂犬病疫苗保护效力的影响
如图13所示，在免疫21天时以50LD50 CVS-24脑内途径攻毒ICR小鼠，LBNSE-OX40L具有良好的保护率。
总之，本发明中的重组狂犬病病毒LBNSE-OX40L安全性高，在免疫效果上，与欧洲用于野生动物免疫的疫苗株即实验中的母本株LBNSE相比，LBNSE-OX40L能够迅速诱导产生显著高的中和抗体水平，并长达56天。因此，本发明重组病毒LBNSE-OX40L具备了作为疫苗株的安全低毒、长期有效的特点，可以作为狂犬病疫苗的候选株。
序列表
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atggaagggg aaggggttca acccctggat gagaatctgg aaaacggatc aaggccaaga 60
ttcaagtgga agaagacgct aaggctggtg gtctctggga tcaagggagc agggatgctt 120
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aagaatgagt atcaaactat ggaggtgcag aacaattcgg ttgtcatcaa gtgtgatggg 300
ctttatatca tctacctgaa gggctccttt ttccaggagg tcaagattga ccttcatttc 360
cgggaggatc ataatcccat ctctattcca atgctgaacg atggtcgaag gattgtcttc 420
actgtggtgg cctctttggc tttcaaagat aaagtttacc tgactgtaaa tgctcctgat 480
actctctgcg aacacctcca gataaatgat ggggagctga ttgttgtcca gctaacgcct 540
ggatactgtg ctcctgaagg atcttaccac agcactgtga accaagtacc actgtga 597
<210> 1
<211> 12173
<212> DNA
<213> 重组狂犬病病毒疫苗(LBNSE-OX40L)
<400> 1
acgcttaaca accagatcaa agaaaaaaca gacattgtca attgcaaagc aaaaatgtaa 60
cacccctaca atggatgccg acaagattgt attcaaagtc aataatcagg tggtctcttt 120
gaagcctgag attatcgtgg atcaatatga gtacaagtac cctgccatca aagatttgaa 180
aaagccctgt ataaccctag gaaaggctcc cgatttaaat aaagcataca agtcagtttt 240
gtcaggcatg agcgccgcca aacttaatcc tgacgatgta tgttcctatt tggcagcggc 300
aatgcagttt tttgagggga catgtccgga agactggacc agctatggaa ttgtgattgc 360
acgaaaagga gataagatca ccccaggttc tctggtggag ataaaacgta ctgatgtaga 420
agggaattgg gctctgacag gaggcatgga actgacaaga gaccccactg tccctgagca 480
tgcgtcctta gtcggtcttc tcttgagtct gtataggttg agcaaaatat ccgggcaaaa 540
cactggtaac tataagacaa acattgcaga caggatagag cagatttttg agacagcccc 600
ttttgttaaa atcgtggaac accatactct aatgacaact cacaaaatgt gtgctaattg 660
gagtactata ccaaacttca gatttttggc cggaacctat gacatgtttt tctcccggat 720
tgagcatcta tattcagcaa tcagagtggg cacagttgtc actgcttatg aagactgttc 780
aggactggta tcatttactg ggttcataaa acaaatcaat ctcaccgcta gagaggcaat 840
actatatttc ttccacaaga actttgagga agagataaga agaatgtttg agccagggca 900
ggagacagct gttcctcact cttatttcat ccacttccgt tcactaggct tgagtgggaa 960
atctccttat tcatcaaatg ctgttggtca cgtgttcaat ctcattcact ttgtaggatg 1020
ctatatgggt caagtcagat ccctaaatgc aacggttatt gctgcatgtg ctcctcatga 1080
aatgtctgtt ctagggggct atctgggaga ggaattcttc gggaaaggga catttgaaag 1140
aagattcttc agagatgaga aagaacttca agaatacgag gcggctgaac tgacaaagac 1200
tgacgtagca ctggcagatg atggaactgt caactctgac gacgaggact acttttcagg 1260
tgaaaccaga agtccggagg ctgtttatac tcgaatcatg atgaatggag gtcgactaaa 1320
gagatctcac atacggagat atgtctcagt cagttccaat catcaagccc gtccaaactc 1380
attcgccgag tttctaaaca agacatattc gagtgactca taagaagttg aataacaaaa 1440
tgccggaaat ctacggattg tgtatatcca tcatgaaaaa aactaacacc cctcctttcg 1500
aaccatccca aacatgagca agatctttgt caatcctagt gctattagag ccggtctggc 1560
cgatcttgag atggctgaag aaactgttga tctgatcaat agaaatatcg aagacaatca 1620
ggctcatctc caaggggaac ccatagaggt ggacaatctc cctgaggata tggggcgact 1680
tcacctggat gatggaaaat cgcccaacca tggtgagata gccaaggtgg gagaaggcaa 1740
gtatcgagag gactttcaga tggatgaagg agaggatcct agcttcctgt tccagtcata 1800
cctggaaaat gttggagtcc aaatagtcag acaaatgagg tcaggagaga gatttctcaa 1860
gatatggtca cagaccgtag aagagattat atcctatgtc gcggtcaact ttcccaaccc 1920
tccaggaaag tcttcagagg ataaatcaac ccagactact ggccgagagc tcaagaagga 1980
gacaacaccc actccttctc agagagaaag ccaatcatcg aaagccagga tggcggctca 2040
aattgcttct ggccctccag cccttgaatg gtcggctacc aatgaagagg atgatctatc 2100
agtggaggct gagatcgctc accagattgc agaaagtttc tccaaaaaat ataagtttcc 2160
ctctcgatcc tcagggatac tcttgtataa ttttgagcaa ttgaaaatga accttgatga 2220
tatagttaaa gaggcaaaaa atgtaccagg tgtgacccgt ttagcccatg acgggtccaa 2280
actcccccta agatgtgtac tgggatgggt cgctttggcc aactctaaga aattccagtt 2340
gttagtcgaa tccgacaagc tgagtaaaat catgcaagat gacttgaatc gctatacatc 2400
ttgctaaccg aacctctccc ctcagtccct ctagacaata aaatccgaga tgtcccaaag 2460
tcaacatgaa aaaaacaggc aacaccactg ataaaatgaa cctcctacgt aagatagtga 2520
aaaaccgcag ggacgaggac actcaaaaat cctctcccgc gtcagcccct ctggatgacg 2580
atgacttgtg gcttccaccc cctgaatacg tcccgctgaa agaacttaca ggcaagaaga 2640
acatgaggaa cttttgtatc aacggaaggg ttaaagtgtg tagcccgaat ggttactcgt 2700
tcaggatcct gcggcacatt ctgaaatcat tcgacgagat atattctggg aatcatagga 2760
tgatcgggtt agtcaaagtg gttattggac tggctttgtc aggatctcca gtccctgagg 2820
gcctgaactg ggtatacaaa ttgaggagaa cctttatctt ccagtgggct gattccaggg 2880
gccctcttga aggggaggag ttggaatact ctcaggagat cacttgggat gatgatactg 2940
agttcgtcgg attgcaaata agagtgattg caaaacagtg tcatatccag ggcagagtct 3000
ggtgtatcaa catgaacccg agagcatgtc aactatggtc tgacatgtct cttcagacac 3060
aaaggtccga agaggacaaa gattcctctc tgcttctaga ataatcagat tatatcccgc 3120
aaatttatca cttgtttacc tctggaggag agaacatatg ggctcaactc caacccttgg 3180
gagcaatata acaaaaaaca tgttatggtg ccattaaacc gctgcatttc atcaaagtca 3240
agttgattac ctttacattt tgatcctctt ggatgtgaaa aaaactatta acatccctca 3300
aaagactcaa ggaaagatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc 3360
attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc 3420
gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac 3480
caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt 3540
gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg 3600
ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc 3660
cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta 3720
ccctgactac cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc 3780
tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag 3840
cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac 3900
catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta cctccagtag 3960
agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata 4020
taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat 4080
ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa 4140
gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt 4200
ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt 4260
gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac 4320
catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg aaacttggaa 4380
tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa 4440
cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat 4500
gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt 4560
gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt 4620
tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa 4680
ctgggggaag tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt 4740
cctgatgaca tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg 4800
gacagggagg gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc 4860
acacaagagt gggggtgaga ccagactgta aggactggcc gtcctttcaa cgatccaagt 4920
ccatgaaaaa aactaacacc cctcccgtac gaacatggaa ggggaagggg ttcaacccct 4980
ggatgagaat ctggaaaacg gatcaaggcc aagattcaag tggaagaaga cgctaaggct 5040
ggtggtctct gggatcaagg gagcagggat gcttctgtgc ttcatctatg tctgcctgca 5100
actctcttcc tctccggcaa aggaccctcc aatccaaaga ctcagaggag cagttaccag 5160
atgtgaggat gggcaactat tcatcagctc atacaagaat gagtatcaaa ctatggaggt 5220
gcagaacaat tcggttgtca tcaagtgtga tgggctttat atcatctacc tgaagggctc 5280
ctttttccag gaggtcaaga ttgaccttca tttccgggag gatcataatc ccatctctat 5340
tccaatgctg aacgatggtc gaaggattgt cttcactgtg gtggcctctt tggctttcaa 5400
agataaagtt tacctgactg taaatgctcc tgatactctc tgcgaacacc tccagataaa 5460
tgatggggag ctgattgttg tccagctaac gcctggatac tgtgctcctg aaggatctta 5520
ccacagcact gtgaaccaag taccactgtg actagctagc ttataaagtg ctgggtcatc 5580
taagcttttc agtcgagaaa aaaacattag atcagaagaa caactggcaa cacttctcaa 5640
cctgagactt acttcaagat gctcgatcct ggagaggtct atgatgaccc tattgaccca 5700
atcgagttag aggctgaacc cagaggaacc cccattgtcc ccaacatctt gaggaactct 5760
gactacaatc tcaactctcc tttgatagaa gatcctgcta gactaatgtt agaatggtta 5820
aaaacaggga atagacctta tcggatgact ctaacagaca attgctccag gtctttcaga 5880
gttttgaaag attatttcaa gaaggtagat ttgggttctc tcaaggtggg cggaatggct 5940
gcacagtcaa tgatttctct ctggttatat ggtgcccact ctgaatccaa caggagccgg 6000
agatgtataa cagacttggc ccatttctat tccaagtcgt cccccataga gaagctgttg 6060
aatctcacgc taggaaatag agggctgaga atccccccag agggagtgtt aagttgcctt 6120
gagagggttg attatgataa tgcatttgga aggtatcttg ccaacacgta ttcctcttac 6180
ttgttcttcc atgtaatcac cttatacatg aacgccctag actgggatga agaaaagacc 6240
atcctagcat tatggaaaga tttaacctca gtggacatcg ggaaggactt ggtaaagttc 6300
aaagaccaaa tatggggact gctgatcgtg acaaaggact ttgtttactc ccaaagttcc 6360
aattgtcttt ttgacagaaa ctacacactt atgctaaaag atcttttctt gtctcgcttc 6420
aactccttaa tggtcttgct ctctccccca gagccccgat actcagatga cttgatatct 6480
caactatgcc agctgtacat tgctggggat caagtcttgt ctatgtgtgg aaactccggc 6540
tatgaagtca tcaaaatatt ggagccatat gtcgtgaata gtttagtcca gagagcagaa 6600
aagtttaggc ctctcattca ttccttggga gactttcctg tatttataaa agacaaggta 6660
agtcaacttg aagagacgtt cggtccctgt gcaagaaggt tctttagggc tctggatcaa 6720
ttcgacaaca tacatgactt ggtttttgtg tttggctgtt acaggcattg ggggcaccca 6780
tatatagatt atcgaaaggg tctgtcaaaa ctatatgatc aggttcacct taaaaaaatg 6840
atagataagt cctaccagga gtgcttagca agcgacctag ccaggaggat ccttagatgg 6900
ggttttgata agtactccaa gtggtatctg gattcaagat tcctagcccg agaccacccc 6960
ttgactcctt atatcaaaac ccaaacatgg ccacccaaac atattgtaga cttggtgggg 7020
gatacatggc acaagctccc gatcacgcag atctttgaga ttcctgaatc aatggatccg 7080
tcagaaatat tggatgacaa atcacattct ttcaccagaa cgagactagc ttcttggctg 7140
tcagaaaacc gaggggggcc tgttcctagc gaaaaagtta ttatcacggc cctgtctaag 7200
ccgcctgtca atccccgaga gtttctgagg tctatagacc tcggaggatt gccagatgaa 7260
gacttgataa ttggcctcaa gccaaaggaa cgggaattga agattgaagg tcgattcttt 7320
gctctaatgt catggaatct aagattgtat tttgtcatca ctgaaaaact cttggccaac 7380
tacatcttgc cactttttga cgcgctgact atgacagaca acctgaacaa ggtgtttaaa 7440
aagctgatcg acagggtcac cgggcaaggg cttttggact attcaagggt cacatatgca 7500
tttcacctgg actatgaaaa gtggaacaac catcaaagat tagagtcaac agaggatgta 7560
ttttctgtcc tagatcaagt gtttggattg aagagagtgt tttctagaac acacgagttt 7620
tttcaaaagg cctggatcta ttattcagac agatcagacc tcatcgggtt acgggaggat 7680
caaatatact gcttagatgc gtccaacggc ccaacctgtt ggaatggcca ggatggcggg 7740
ctagaaggct tacggcagaa gggctggagt ctagtcagct tattgatgat agatagagaa 7800
tctcaaatca ggaacacaag aaccaaaata ctagctcaag gagacaacca ggttttatgt 7860
ccgacataca tgttgtcgcc agggctatct caagaggggc tcctctatga attggagaga 7920
atatcaagga atgcactttc gatatacaga gccgtcgagg aaggggcatc taagctaggg 7980
ctgatcatca agaaagaaga gaccatgtgt agttatgact tcctcatcta tggaaaaacc 8040
cctttgttta gaggtaacat attggtgcct gagtccaaaa gatgggccag agtctcttgc 8100
gtctctaatg accaaatagt caacctcgcc aatataatgt cgacagtgtc caccaatgcg 8160
ctaacagtgg cacaacactc tcaatctttg atcaaaccga tgagggattt tctgctcatg 8220
tcagtacagg cagtctttca ctacctgcta tttagcccaa tcttaaaggg aagagtttac 8280
aagattctga gcgctgaagg ggagagcttt ctcctagcca tgtcaaggat aatctatcta 8340
gatccttctt tgggagggat atctggaatg tccctcggaa gattccatat acgacagttc 8400
tcagaccctg tctctgaagg gttatccttc tggagagaga tctggttaag ctcccaagag 8460
tcctggattc acgcgttgtg tcaagaggct ggaaacccag atcttggaga gagaacactc 8520
gagagcttca ctcgccttct agaagatccg accaccttaa atatcagagg aggggccagt 8580
cctaccattc tactcaagga tgcaatcaga aaggctttat atgacgaggt ggacaaggtg 8640
gaaaattcag agtttcgaga ggcaatcctg ttgtccaaga cccatagaga taattttata 8700
ctcttcttaa tatctgttga gcctctgttt cctcgatttc tcagtgagct attcagttcg 8760
tcttttttgg gaatccccga gtcaatcatt ggattgatac aaaactcccg aacgataaga 8820
aggcagttta gaaagagtct ctcaaaaact ttagaagaat ccttctacaa ctcagagatc 8880
cacgggatta gtcggatgac ccagacacct cagagggttg ggggggtgtg gccttgctct 8940
tcagagaggg cagatctact tagggagatc tcttggggaa gaaaagtggt aggcacgaca 9000
gttcctcacc cttctgagat gttgggatta cttcccaagt cctctatttc ttgcacttgt 9060
ggagcaacag gaggaggcaa tcctagagtt tctgtatcag tactcccgtc ctttgatcag 9120
tcattttttt cacgaggccc cctaaaggga tacttgggct cgtccacctc tatgtcgacc 9180
cagctattcc atgcatggga aaaagtcact aatgttcatg tggtgaagag agctctatcg 9240
ttaaaagaat ctataaactg gttcattact agagattcca acttggctca agctctaatt 9300
aggaacatta tgtctctgac aggccctgat ttccctctag aggaggcccc tgtcttcaaa 9360
aggacggggt cagccttgca taggttcaag tctgccagat acagcgaagg agggtattct 9420
tctgtctgcc cgaacctcct ctctcatatt tctgttagta cagacaccat gtctgatttg 9480
acccaagacg ggaagaacta cgatttcatg ttccagccat tgatgcttta tgcacagaca 9540
tggacatcag agctggtaca gagagacaca aggctaagag actctacgtt tcattggcac 9600
ctccgatgca acaggtgtgt gagacccatt gacgacgtga ccctggagac ctctcagatc 9660
ttcgagtttc cggatgtgtc gaaaagaata tccagaatgg tttctggggc tgtgcctcac 9720
ttccagaggc ttcccgatat ccgtctgaga ccaggagatt ttgaatctct aagcggtaga 9780
gaaaagtctc accatatcgg atcagctcag gggctcttat actcaatctt agtggcaatt 9840
cacgactcag gatacaatga tggaaccatc ttccctgtca acatatacgg caaggtttcc 9900
cctagagact atttgagagg gctcgcaagg ggagtattga taggatcctc gatttgcttc 9960
ttgacaagaa tgacaaatat caatattaat agacctcttg aattggtctc aggggtaatc 10020
tcatatattc tcctgaggct agataaccat ccctccttgt acataatgct cagagaaccg 10080
tctcttagag gagagatatt ttctatccct cagaaaatcc ccgccgctta tccaaccact 10140
atgaaagaag gcaacagatc aatcttgtgt tatctccaac atgtgctacg ctatgagcga 10200
gagataatca cggcgtctcc agagaatgac tggctatgga tcttttcaga ctttagaagt 10260
gccaaaatga cgtacctatc cctcattact taccagtctc atcttctact ccagagggtt 10320
gagagaaacc tatctaagag tatgagagat aacctgcgac aattgagttc tttgatgagg 10380
caggtgctgg gcgggcacgg agaagatacc ttagagtcag acgacaacat tcaacgactg 10440
ctaaaagact ctttacgaag gacaagatgg gtggatcaag aggtgcgcca tgcagctaga 10500
accatgactg gagattacag ccccaacaag aaggtgtccc gtaaggtagg atgttcagaa 10560
tgggtctgct ctgctcaaca ggttgcagtc tctacctcag caaacccggc ccctgtctcg 10620
gagcttgaca taagggccct ctctaagagg ttccagaacc ctttgatctc gggcttgaga 10680
gtggttcagt gggcaaccgg tgctcattat aagcttaagc ctattctaga tgatctcaat 10740
gttttcccat ctctctgcct tgtagttggg gacgggtcag gggggatatc aagggcagtc 10800
ctcaacatgt ttccagatgc caagcttgtg ttcaacagtc ttttagaggt gaatgacctg 10860
atggcttccg gaacacatcc actgcctcct tcagcaatca tgaggggagg aaatgatatc 10920
gtctccagag tgatagatct tgactcaatc tgggaaaaac cgtccgactt gagaaacttg 10980
gcaacctgga aatacttcca gtcagtccaa aagcaggtca acatgtccta tgacctcatt 11040
atttgcgatg cagaagttac tgacattgca tctatcaacc ggatcaccct gttaatgtcc 11100
gattttgcat tgtctataga tggaccactc tatttggtct tcaaaactta tgggactatg 11160
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gggtttatca cccaagtaac ttcgtctttt tcatctgagc tctacctccg attctccaaa 11280
cgagggaagt ttttcagaga tgctgagtac ttgacctctt ccacccttcg agaaatgagc 11340
cttgtgttat tcaattgtag cagccccaag agtgagatgc agagagctcg ttccttgaac 11400
tatcaggatc ttgtgagagg atttcctgaa gaaatcatat caaatcctta caatgagatg 11460
atcataactc tgattgacag tgatgtagaa tcttttctag tccacaagat ggttgatgat 11520
cttgagttac agaggggaac tctgtctaaa gtggctatca ttatagccat catgatagtt 11580
ttctccaaca gagtcttcaa cgtttccaaa cccctaactg acccctcgtt ctatccaccg 11640
tctgatccca aaatcctgag gcacttcaac atatgttgca gtactatgat gtatctatct 11700
actgctttag gtgacgtccc tagcttcgca agacttcacg acctgtataa cagacctata 11760
acttattact tcagaaagca agtcattcga gggaacgttt atctatcttg gagttggtcc 11820
aacgacacct cagtgttcaa aagggtagcc tgtaattcta gcctgagtct gtcatctcac 11880
tggatcaggt tgatttacaa gatagtgaag actaccagac tcgttggcag catcaaggat 11940
ctatccagag aagtggaaag acaccttcat aggtacaaca ggtggatcac cctagaggat 12000
atcagatcta gatcatccct actagactac agttgcctgt gaaccggata ctcctggaag 12060
cctgcccatg ctaagactct tgtgtgatgt atcttgaaaa aaacaagatc ctaaatctga 12120
acctttggtt gtttgattgt ttttctcatt tttgttgttt atttgttaag cgt 12173
Claims (2)
1.一种重组狂犬病病毒疫苗株，其特征在于：所述疫苗株以致弱疫苗SAD-B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸，在致弱疫苗SAD-B19的基因组的G基因和L基因之间插入核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的鼠源OX40L基因。
2.权利要求1所述重组狂犬病病毒疫苗株的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)以致弱疫苗SAD-B19为母体毒株，将所述毒株的G蛋白上194位的天冬氨酸突变为丝氨酸，将333位的精氨酸突变为谷氨酸；
(2)将致弱疫苗SAD-B19毒株基因组中G和L基因之间的假基因敲除，并嵌入两个酶切位点BsiWI和NheI，用反转录PCR扩增得到鼠源OX40L基因，将扩增的鼠OX40L基因经测序验证正确后插入到LBNSE毒株基因组的G基因和L基因之间，构建出表达鼠OX40L基因的重组狂犬病病毒疫苗株。
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2020
- 2020-04-16 CN CN202010301982.3A patent/CN111518776A/zh active Pending
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