CN103328004B - 感染性戊型肝炎病毒基因型3的重组体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及来自慢性感染患者的HEV毒株的发现。所述病毒通常在多种细胞培养物中生长不佳。因此，本发明提供了基于所述病毒的细胞培养物、载体和疫苗组合物。本发明部分涉及对HEV基因型3病毒的新毒株的鉴定。HEV的毒株Kernow‑C1(基因型3)，分离自一名慢性感染患者，用于鉴定允许感染的人、猪和鹿的细胞系。所述Kernow‑C1毒株在人肝癌细胞中生长的适应情况选择了包含人核糖体蛋白基因的174个核糖核苷酸(58个氨基酸)的插入和另外的突变的罕见病毒重组体。

Description

感染性戊型肝炎病毒基因型3的重组体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年11月1日提交的美国临时申请第61/554,323号和于2011年1月10日提交的美国临时申请第61/431,377号的权益，所述申请各自在此通过引用并入本文用于所有目的。

对作为ASCII文本文件提交的序列表的参考

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发明背景

由于在发展中国家引起急性肝炎的流行病和散发性病例，戊型肝炎病毒臭名昭著：实例包括，1956年新德里爆发期间出现了29300名病例以及在达尔富尔的国内难民营(Internally Displaced Persons Camp)6个月内报道了2621名病例，其中如已报道的(1)，孕妇具有26-31％的最高死亡率(2)。HEV是发展中国家成年人急性肝炎的最重要或第二重要的原因。但与近期的教条相反，该病毒并不局限于发展中国家，并且随着对感染传播潜能的认识以及针对该病毒进行的测试，散发性病例在工业化国家中正在越来越多的得到确认。

从历史上看，戊型肝炎被描述为经肠传播的，不会发展为慢性病的自身限制性肝炎(3)。然而，最近在欧洲鉴定出首例慢性戊型肝炎，并且慢性病自此被证明发生在免疫功能低下的实体器官移植接受者和HIV感染个体中(4,5,6,7)。虽然戊型肝炎感染通常会导致轻度至中度的疾病，但偶尔在急性病例中，在慢性感染患者以及尤其在患有慢性肝病或怀孕的那些患者中，引起暴发性肝功能衰竭(1,2,4,5,6,7,8)。此外，戊型肝炎一直被误诊为药物诱导的肝损伤，从而使药物试验或治疗方案复杂化(9)。自1983年发现以来，已记录的HEV传播几乎无一例外地与被污染的水联系在一起；在摄入未煮熟的鹿肉后，HEV感染的发现突然改变了(10,11)。戊型肝炎目前被认为不仅是发展中国家的水源性疾病，而且是工业化国家涌现的食源性疾病(11,12)。

HEV为具有7.2kb的基因组大小的小的非包膜、单链RNA病毒(3)。HEV的7.2kb基因组是具有三个重叠的阅读框(ORF)的单链的正义RNA。约前5kb用作ORF1多蛋白的mRNA；所述多蛋白是否经蛋白水解加工仍是未知的。ORF1包含编码甲基转移酶/尿苷转移酶、NTP酶/解旋酶、RNA依赖的RNA聚合酶和泛素化活性的区域。此外，ORF1编码Y区和X，或未知功能的大区以及位于ORF中间附近的高变区(HVR)。HVR的长度和序列在毒株和基因型之间不同：其耐受小的缺失，但复制水平在细胞培养物中严重被揭制。ORF2和ORF3从单一的双顺反子亚基因组RNA翻译，以分别产生660个氨基酸的衣壳蛋白和113-114个氨基酸的蛋白。所述ORF3蛋白对病毒颗粒从培养细胞中的有效释放是重要的，并为猕猴感染所必需的。

至目前为止，已识别了感染人的四种HEV基因型(17)。基因型1和2感染只在人中被鉴定，而基因型3和4的病毒已从除人之外的猪、鹿、猫鼬、牛和兔中分离出来(18)。基因型3和4在猪中广泛存在，并且未煮熟的猪肉可为动物源性人感染的主要来源(12，18)。然而，跨物种传播还未被广泛研究并且很可能存在另外的人畜共患性储库。

HEV感染长期被认为是持续2-7周的急性感染，并且不会发展成慢性病。然而，最近，慢性HEV感染已在免疫抑制的器官移植患者或艾滋病患者中被鉴定出来。更出乎意料的是，这些慢性病患者者中的一些已发展出神经系统症状并从脑脊液中分离出HEV。这些慢性病例已被鉴定为基因型3感染。

HEV通常在体内复制至低滴度，其极难在培养的细胞中生长，并且大部分病毒的生命周期是未知的。Okamoto及其同事们最近使基因型3和基因型4毒株适合在两种人细胞系，即A549肺细胞和PLC/PRF/5肝癌细胞中复制至高滴度(19,20)。

远未了解戊型肝炎的流行病学，特别是人畜共患方面需要进一步研究。因此，有必要开发可在细胞培养物中复制的HEV基因型毒株。另外，有开发HEV疫苗，例如，用于基因型3毒株的疫苗的必要。

本发明部分涉及分离自慢性感染患者的基因型3病毒的发现(5)，其适合在人肝癌细胞中生长，并用于鉴定允许HEV感染的一组人、猪和鹿细胞培养物。本发明另外涉及所述适应病毒的特征以鉴定提供在细胞培养物中复制能力的序列变化。

发明简述

如以上所解释的，直至最近，戊型肝炎很少在工业化国家中被鉴定出来。戊型肝炎如今逐渐在整个西欧、一些东欧国家和日本被报道：这些病例大部分是由基因型3所致，该基因型在猪中是特有的，并且这些病例被认为是经动物传染获得的。然而，未能很好地了解传播途径。将感染人的HEV分为非动物源性(1型，2型)基因型和动物源性(3型，4型)基因型。HEV的细胞培养是低效且受限的，因此迄今为止，HEV仅在人细胞系中培养。

本发明部分涉及对HEV基因型3病毒的新毒株的鉴定。HEV的Kernow-C1毒株(基因型3)，其分离自慢性感染患者，用于鉴定允许感染的人、猪和鹿的细胞系。所述Kernow-C1毒株对在人肝癌细胞中生长的适应情况选择了包含人核糖体蛋白基因的174个核糖核苷酸(58个氨基酸)的插入和其它突变的罕见病毒重组体。在本发明的上下文中，在论述实施例部分中所述的实验中鉴定的174个核糖核苷酸的插入方面，Kernow病毒基因组中的插入片段包含171个核糖核苷酸，其本身仅编码57个氨基酸。然而，由于其插入密码子内的核糖核苷酸之间，其插入导致了58个新的氨基酸。因此，在此该插入被称作具有174个核糖核苷酸并编码58个氨基酸。

因此，在一些实施方案中，本发明涉及cDNA克隆以开发将所需序列插入HEV而不会灭活该病毒的载体平台。在一些实施方案中，本发明提供了基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株及其细胞培养适应的子代。在一些实施方案中，本发明提供了包含本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的野生型毒株序列的载体。在一些实施方案中，本发明提供了如本文所述的复制型基因型3戊型肝炎病毒、或来源于如本文所述的复制型基因型3戊型肝炎病毒的嵌合病毒或减毒病毒、以及例如可用于研究戊型肝炎的人畜传播和用于HEV疫苗和免疫原性组合物的开发的细胞培养系统的感染性cDNA克隆。

在一些实施方案中，本发明涉及HEV疫苗，其包含来自本文所述的基因型3戊型肝炎病毒的序列及其减毒病毒衍生物。

在一方面，本发明涉及感染性戊型肝炎病毒(HEV)cDNA克隆，其中所述cDNA克隆与SEQ ID NO:l有至少95％的序列一致性，并且如参考SEQ ID NO:5的HEV核苷酸序列所确定的在ORFl中包含插入片段。在一些实施方案中，所述HEV cDNA克隆包含SEQ ID NO:l的核酸序列。在一些实施方案中，所述HEV cDNA克隆在ORFl序列中有插入片段，该插入片段编码长度为20-100个氨基酸的符合读框的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段编码长度为30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQ ID NO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQ ID NO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些实施方案中，所述插入片段包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段在HEV的ORF1-编码区内的位置，其中所述插入片段的第一氨基酸序列相对于SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为氨基酸750。

在另一方面，本发明涉及包含戊型肝炎病毒(HEV)核酸序列的感染性cDNA克隆，其中所述克隆在编码ORF1的高变区的核酸序列区域中包含插入片段。在一些实施方案中，所述HEV cDNA克隆在ORF1序列中有插入片段，其中所述插入片段编码长度为20-100个氨基酸的符合读框的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段编码长度为30、35、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60个氨基酸的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQ ID NO:9有至少50％的一致性，或至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或至少85％的一致性。在一些实施方案中，所述ORF1中的插入片段与SEQ ID NO:9有至少90％的一致性，或至少95％、至少96％、至少97％或至少98％的一致性。在一些实施方案中，所述插入片段包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入片段在ORF1的高变区中，例如所述插入片段正好在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于第750位，如参考SEQ ID NO:6所确定的。在一些实施方案中，所述感染性cDNA克隆为基因型3HEV。在一些实施方案中，所述cDNA克隆为基因型1HEV。在一些实施方案中，所述感染性cDNA克隆为基因型2或基因型4克隆。

在又一方面，本发明涉及包含细胞的细胞培养系统，所述细胞包含例如如之前两段中所述的、本发明的感染性cDNA克隆中任一种cDNA克隆的RNA转录物。

在另一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将来自本发明的cDNA克隆，例如上述cDNA克隆的RNA转录物引入细胞系(例如人细胞系或猪细胞系)中，并得到由所述cDNA克隆产生的病毒。

在又一方面，本发明提供了由如本文所述的感染性HEV克隆产生的病毒以及包含此类病毒的药物组合物。

在一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将包含与启动子可操作地连接的编码具有SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示序列的ORF2的异源核酸序列的表达盒引入宿主细胞中；并得到ORF2蛋白。

在又一方面，本发明涉及产生疫苗的方法，所述方法包括将获自基因型3HEV的感染性cDNA克隆的RNA引入细胞系中，其中所述HEV克隆相对于SEQ ID NO:5所示的HEV核酸序列，在编码ORF1高变区的核酸序列区域中包含长度为至少10个氨基酸的插入片段；并且其中所述RNA不能产生ORF3。在一些实施方案中，所述细胞系为猪细胞系或人细胞系。

本发明还涉及得到在细胞培养物中具有复制能力的HEV毒株的方法，所述方法包括从慢性感染患者中获得病毒；感染培养中的细胞系，连续传代所述病毒，例如至少3代、至少4代、至少5代、至少6代或更多代；以及选择在细胞培养物中复制的来自慢性感染患者的突变体。

在一些实施方案中，本发明涉及利用产生自复制性HEV cDNA克隆的RNA转录物的HEV病毒作为评价目标产品的HEV病毒状况的指示物。在一些实施方案中，此类方法包括将如本文所述的已知量HEV病毒加入待分析材料，例如血液、水、食品中；将所述材料进行去除病毒的过程，例如过滤、加热等；以及在病毒去除过程之后确定材料样品中存在的所加HEV病毒的量。残留HEV病毒的量指示病毒去除过程的功效。

附图简述

图1.Kernow-C1病毒在人肝癌细胞中生长的适应情况。

将大约等量的粪便中的病毒(方框)或在HepG2/C3A细胞中连续传代6次的病毒(圆圈)以低MOI接种于HepG2/C3A细胞上，并通过HepG2/C3A细胞上的空斑形成测定和RT-PCR来分别定量释放到培养基中的感染性病毒(图A)和总病毒(图B)。所有收获的样品和保留的接种物的空斑测定一式三份，根据代码同时进行：直接比较表明粪便接种物，其产生少得多的病毒，实际上比传代接种物包含的感染性病毒多5倍。注意FFU和RNA尺度上的差异。误差棒为标准偏差。

图2.人细胞和猪细胞上戊型肝炎病毒的滴度比较。将每种病毒的连续稀释物一式三份接种到8孔腔室玻片中的人HepG2/C3A细胞(实心柱)或LLC-PK1猪细胞(空心柱)上。三天后，对玻片编码，对ORF2蛋白进行免疫染色，手动计数终点空斑。不破坏代码直至对所有样品计数。学生t检验p值为0.006-0.016。

图3.鹿细胞中ORF2的差异化翻译。(A)将鹿细胞用所示毒株感染，3天后进行免疫染色并将含ORF2蛋白(实线)、ORF3蛋白(虚线)以及两种蛋白(阴影线)的所有细胞计数。(B)将鹿细胞和S10-3人细胞用表达双顺反子mRNA的CMV质粒转染，所述双顺反子mRNA包含Sar-55(CMV-Sar)序列、Kernow-Cl(CMV-Kernow)序列或其中前29个核苷酸序列被Kernow-Cl的前29个核苷酸序列替代的Sar-55序列(CMV-MT29)。两天后，通过FACS对ORF2或ORF3蛋白免疫染色的细胞进行定量并依照染色细胞百分比计算ORF2与ORF3之比(如上所示)。

图4.人序列插入至Kernow-Cl的高变区。人核糖体基因S17序列与通过从在HepG2/C3A细胞中传代6次的病毒中扩增的RT-PCR产物的直接测序获得的序列的比较。插入片段侧翼的HEV序列用下划线标示。(A)核苷酸:HEV(SEQ ID NO:11)、S17(SEQ ID NO:12)；(B)氨基酸HEV(SEQ ID NO:13)、S17(SEQ ID NO:14)。

图5.S10-3细胞用连续的质粒构建体转染。所示限制性片段用从第6代病毒准种中扩增的相应片段取代。新的构建体用作下一次取代的本底并重复该程序直至所有的p1被p6序列取代。在同一实验中对所有的质粒进行转录、转染和对ORF2蛋白的免疫染色：在转染后3天收获三份样品并通过流式细胞术测试。给出相邻样本的学生t检验P值。P<0.05被认为是显著的。误差棒表示标准偏。

图6.X区域中氨基酸882,904和965回复突变降低了转染水平。将S10-3细胞用缺少CCA和X区域突变的5'ORFl质粒、包含CCA和X区域突变的ORFl/CCA质粒、p6和包含CCA但无X区域突变的回复突变质粒来转染。转染后6天对三份样品的细胞进行免疫染色并通过流式细胞术来分析。给出P值并且误差棒表示标准偏差。

图7.从P6去除S17序列消除了大部分点突变的适应作用。将S10-3细胞用带或不带S17序列的p1和p6质粒转染。在转染后第4天将三份样品用流式细胞术进行分析。P值均<0.0001除了pl/S17对比p6delS17。误差棒表示标准偏差

图8.在S17插入片段存在下来自ORF2的荧光色素酶的表达是大量且延长的。在缺失S17插入片段或X基因区突变的p6基因组中，ORF2病毒的衣壳蛋白用gaussia荧光色素酶取代。在转染S10-3细胞后，每24小时完全更换培养基。图A由带S17插入片段的基因组(实心柱)或不带S17插入片段的基因组(阴影柱)产生的荧光色素酶单位的比值在每个时间点之上的括号中示出，误差棒为标准偏差。图B从由缺失三种X基因突变的两个独立的cDNA克隆编码的基因组的平均荧光色素酶产生(点柱和交叉阴影的柱)比p6/luc基因组的平均荧光色素酶产生(实心柱)下降了1/2.3-1/5.1。比值每个时间点之上的括号中示出。

图9.S17插入片段中的同义突变对转染效率几乎无影响。将保守氨基序列的突变引入S17插入片段中的54/58密码子(突变体#1)或41/58密码子(突变体#2)的第三个碱基中并将RNA转录物转染至S10-3细胞中。转染的效率通过转染后5天三份样品的流式细胞术来确定。

图10.编码不同HVR的p6基因组转录物的转染效率的比较情况。将三份样品在转染后第5天或第6天接受流式细胞术。误差棒表示标准偏差并且方括号内表示学生t检验P值。编码58个氨基酸的S17插入片段的174nt缺失或用以下替代，A：来自第1代的114nt的GTP酶或绿色荧光蛋白(GFP)的3’端174nt。#1和#2为两个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.0003。B：编码GFP的前58个氨基酸的5’174nt，#1-3＝3个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.001。C：S17插入片段的5’、中间或3’87nt的一半。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.0002。D：117nt的S19核糖体蛋白基因插入片段。#1和#2为两个独立的克隆。P6对比任何其它基因组的P值＝<0.001并且3种GFP克隆之间的P值＝>0.27。

图11.由p6编码的基因组或病毒可在猪LLC-PK1细胞中复制并感染猪LLC-PK1细胞。A：用缺少或包含S17插入片段的p6的转录物转染的猪细胞，在转染后第5天通过流式细胞术进行测定。B：从转染HepG2/C3A细胞的培养基中收获的p6病毒的三份样品在编码下在HepG2/C3A细胞(空心柱)和LLP-C1细胞(点柱)上进行平行滴定。

图12.S17插入片段对S10-3和BHK-21细胞的Sar55转染的作用。S10-3(A)和BHK-21(B)细胞的转染效率通过流式细胞术来监测。

图13.ORF3蛋白的缺失并不抑制HepG2/C3A培养物中细胞对细胞的传播。HepG2/C3A细胞用来自p6或p6/ORF3无效质粒的转录物电穿孔，与天然的HepG2/C3A细胞混合并在37℃下培养。在4天的每一天收获三份样品，用甲醇固定并储存于-80℃直至通过流式细胞术分析。误差棒表示标准偏差。两种病毒的第5天的值P＝0.74表示每种构建体转染的细胞数目相似。

发明详述

定义

本文所用术语“戊型肝炎病毒”(“HEV”)是指病毒、病毒类型或病毒类别。HEV归于肝炎病毒属并为带有含三个开放阅读框(ORF)和5'和3'顺式作用元件的基因组大小为7.2kb的正义单链RNA二十面体病毒。ORF1编码甲基转移酶、蛋白酶、解旋酶和复制酶；ORF2编码衣壳蛋白和ORF3编码未定义功能的蛋白。单个已知血清型有四种主要的基因型。

在本发明中，带有HEV病毒的“慢性感染”患者有至少六个月的感染。所述感染的持续时间可例如通过测量患者中HEV序列的水平，通常通过测量血清或粪便样品中病毒RNA的水平来测量。

如本文所用的，就本发明HEV变体而言的“感染性”是指HEV在培养物中复制的能力。在本发明的上下文中，cDNA克隆被认为是“感染性克隆”或“复制型cDNA克隆”，因为其编码能够感染细胞并在细胞中复制的病毒RNA基因组。在典型的实施方案中，在体外利用噬菌体聚合酶从cDNA克隆合成病毒RNA基因组，并接着将所述RNA引入细胞中。在本发明中，“感染性”还指在细胞系中复制的能力。例如，当转染细胞系，例如人或猪的肝细胞系或肾细胞系如HepG2肝癌细胞系或LLC-PK1肾猪细胞系时，相比于用未修饰成包含赋予复制能力的插入片段的基因型所获得的转染子数量，得到更大数量的转染子，例如多至少10％、至少20％、至少50％、至少75％或至少100％或者更大数量的转染子。在典型的实施方案中，评价ORF2的水平以确定转染子的更大数量。在一些实施方案中，评价感染性病毒的数量(病毒产生的峰值)以确定本发明的HEV变体复制的能力。众所周知的测定，例如，空斑测定可用作感染性病毒数目的测量手段。本文所用的“复制型”HEV毒株为“感染性”HEV毒株；并且“感染性”HEV毒株应理解为“复制型”HEV毒株。测量ORF2产生的方法为本领域所熟知。例如，可应用流式细胞术或荧光显微术。如本领域所理解的，尽管肝细胞和肾细胞可常用于评价本发明的变体在培养物中复制的能力，但还可使用其它细胞，例如MRC 5肺细胞。

当结合例如细胞或核酸、蛋白或载体使用时，术语“重组”意指所述细胞、核酸、蛋白或载体已通过异源核酸或异源蛋白的引入或天然核酸或蛋白的改变来修饰，或者意指所述细胞来源于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中不存在的基因或者表达以其它方式异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。本文术语“重组核酸”意指，一般而言原本在体外通过例如使用聚合酶和核酸内切酶进行核酸的操作以在自然中通常不存在的形式形成的核酸。以这种方式，实现不同序列的可操作连接。因此线性形式的分离的核酸，或者通过连接通常不连接的DNA分子在体外形成的表达载体，两者均被认为是用于本发明目的的重组。应理解的是一旦作出重组核酸并重新引入宿主细胞或生物体中，其将非重组地复制，即利用宿主细胞的体内细胞机制而非体外的操纵；然而，一旦重组产生此类核酸，虽然随后非重组地复制，其仍被视为用于本发明目的的重组。同样，“重组蛋白”为利用重组技术，即通过如上所述重组核酸的表达制备的蛋白。

当涉及蛋白或肽时，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或与抗体“特异性(或选择性)免疫反应”是指其中抗体与目标蛋白结合的结合反应。在本发明的上下文中，抗体通常结合抗原例如本发明的HEV多肽，其亲和力比其对其它抗原的亲和力高至少10倍。

本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白”指氨基酸残基的聚合体。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体，以及天然存在的氨基酸聚合体、包含修饰残基的天然存在的氨基酸聚合体和非天然存在的氨基酸聚合体。

术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及功能与天然存在的氨基酸相似的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸以及之后被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，例如，与氢结合的碳、羧基、氨基和R基，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫亚砜、甲硫甲基亚砜。此类类似物可具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指这样的化合物，该化合物具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构，但类似于天然存在的氨基酸发挥功能。

氨基酸在本文可通过由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的其通常已知的三字母符号或单字母符号来指代。同样地，核苷酸可通过公认的单字母代码来指代。

术语“保守型取代”参考蛋白或肽使用以反映基本不改变分子活性(特异性或结合亲和力)的氨基酸取代。典型的保守型氨基酸取代是指将一种氨基酸取代为具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的另一种氨基酸。以下六组各自包含彼此可进行典型保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。

术语“核酸”是指单链或双链的形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合体。除非特别限制，否则所述术语包括含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述天然核苷酸具有与参考核酸相似的结合特性并以与天然存在的核苷酸相似的方式代谢。除非另外说明，否则特定的核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子的取代)和互补序列以及明确表示的序列。

术语“分离的”或“基本纯化的”意指基本不含其他细胞组分的化学组合物。此类组合物可在均质状态，尽管其可在干溶液或水溶液中。纯度和均一性通常利用分析化学的技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法或质谱来确定。制剂中存在的主要种类的蛋白为基本上纯化的。一般而言，基本上纯化或分离的蛋白应包含制剂中存在的所有大分子物质的80％以上。在一些实施方案中，纯化蛋白以代表存在的所有大分子物质的90％以上、95％以上或纯化至基本均质，其中通过常规技术没有检测到其它大分子物质种类。

在两条或更多条核酸或多肽序列的情形下，术语“一致的”或百分比“一致性”是指当在比较窗，或利用以下序列比较算法之一或通过手动比对和目测检查所测的指定区域内进行最大一致性比较和比对时，相同的或具有指定百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，在指定区域内至少60％一致性、任选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％或至少99％一致性)的两条或更多条序列或子序列。可选地，百分比一致性可以是60％到100％的任一整数。这些定义也指核酸序列的互补物。

通过在比较窗内比较两条最佳的对比序列来确定“序列一致性的百分比”，其中在所述比较窗中多核苷酸序列或多肽序列的部分与用于两条序列最佳对比的参考序列(其不包含添加或缺失)相比，可包含添加或缺失(即空位)。所述百分比通过以下来计算：确定两条序列中存在的相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数并将结果乘以100以产生序列一致性的百分比。

本文所用“比较窗”包括参考任何一段连续位置数的区段，其中在两条序列最佳对比后，序列可与连续位置数相同的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域内公知的。

适合确定序列一致性百分比和序列相似性的算法的实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在Altschulet al.(Nuc.Acids Res.25:3389-402,1977)和Altschul et al.(J.Mol.Biol.215:403-10,1990)中描述。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)为公众获取(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。该算法包括，首先通过鉴定查询序列中长度W的短字符来鉴定高得分序列对(HSP)，其当与数据库序列中相同长度的字符对比时，匹配或满足某正值阈值得分T。T被称为邻近字符得分阈值(Altschul et al.,见以上)。这些最初的邻近字符命中作为开始搜索以找到包含它们的更长的HSP的种子。所述字符命中沿每条序列双向延伸，直到累积比对得分增加。对于核苷酸序列，利用参数M(一对匹配残基得分；永远>0)和N(不匹配残基罚分；永远<0)计算累积得分。对于氨基酸序列，利用评分矩阵以计算累积得分。出现以下情况时，每个方向中的字符命中延伸停止累积比对得分从其最大得到的值下降数量X；由于一个或多个负得分残基对比的累积，累积得分达到0或0以下；或达到任一序列的末端时。所述BLAST算法参数W、T、和X决定了比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省值：字长(W)11、期望(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下缺省值：字长3和期望(E)10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff andHenikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915,1989)算法(B)50、期望(E)10、M＝5、N＝-4和双链的比较。出于本申请的目的，一致性百分比通常用设置为缺省参数的BLAST2算法来确定。

当用于给定氨基酸或多核苷酸序列的位置的上下文中时，“相应的”、“参考”、“对比”或“相对于”当给定氨基酸序列或多核苷酸序列与参考序列对比时，是指目标指定序列的残基位置。例如，当指HEV ORF1编码序列的高变区中插入片段的位置时，所述目标序列与HEV ORF1参考序列比对并与所述参考序列对比以确定ORF1的插入点。

除非另外说明，否则术语“一(a)”或“一(an)”通常意指“一个或多个”。

引言

本发明部分基于基因型3HEV毒株中序列突变的发现，该突变赋予了在细胞培养物的不同细胞类型中复制的能力。本发明因而提供了编码HEV基因型3蛋白的核酸序列或HEV基因型3蛋白的具有生物学功能的片段、诊断和治疗试剂，以及使用如本文所述的HEV克隆例如用于制备疫苗的方法。

在一方面，本发明涉及编码戊型肝炎病毒基因型3Kernow毒株及其变体的复制型变体的全长核苷酸序列的核酸，特别是cDNA。

在另外的方面，本发明涉及通过将符合读框的核酸序列插入戊型肝炎病毒核酸序列编码ORF1的区域(例如，ORF1的高变区)中，修饰戊型肝炎病毒毒株以增加所述毒株在细胞培养物中复制的能力。

本发明利用重组遗传学领域的常规技术，涉及合成编码目标多肽的多核苷酸和在表达系统中表达这些多核苷酸。一般而言，下述的重组DNA技术中的命名和实验室程序为本领域熟知且常用的那些。公开本发明中使用的通用方法的基础文献包括：Sambrook&Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(分子克隆,实验室手册)(第3版,2001)；Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(基因转移和表达：实验室手册)(1990)；以及Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)(Ausubelet al,编辑,1994-2009以及更新的内容,Wiley Interscience)。

复制型HEV毒株

本发明涉及能在细胞培养物中复制的HEV cDNA。在一个实施方案中，具有在细胞培养物中复制的能力的本发明的HEV cDNA，与具有SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性。在一些实施方案中，本发明的HEV cDNA编码与SEQID NO:2所示的ORF1序列有至少85％、通常为至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％一致性或更大一致性的HEV ORF1。在一些实施方案中，具有复制能力的依照本发明的全长克隆与具有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的cDNA克隆有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的一致性或更大的一致性，并且相对于SEQ ID NO:6在ORF1的高变区(其在SEQ ID NO:6中通过下划线表示)中包含插入片段。在一些实施方案中，插入片段起始于氨基酸750，如参考SEQ IDNO:6确定的。在一些实施方案中，插入片段编码长度为约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、约100或约200个氨基酸或更多的氨基酸序列。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为50-65个氨基酸。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70个氨基酸。在一些实施方案中，插入氨基酸序列长度为至少40、45、50或55个氨基酸。在一些实施方案中，插入片段长度为58个氨基酸。在一些实施方案中，插入片段具有SEQ ID NO:9所示的序列。在一些实施方案中，编码插入片段的核苷酸插入片段的大小为ORF1，长度为约60个核苷酸至约300个核苷酸。

在一些实施方案中，本发明的复制型HEV克隆相对于SEQ ID NO:5在编码ORF2的区域中有突变。在一些实施方案中，本发明的复制型HEV克隆相对于SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列，在编码ORF1高变区的区域中具有插入片段并且相对于SEQ ID NO:5在编码ORF2的区域中具有其它突变。

在其它实施方案中，本发明的复制型克隆具有一个或多个核苷酸的改变，其编码相对于SEQ ID NO:6的ORF1中的13个氨基酸位置和/或相对于SEQ ID NO:8的ORF2的2个氨基酸位置。在一些实施方案中，复制型克隆具有如本文所述的插入片段和一个或更多个另外的突变，其编码选自表4所示位置的氨基酸位置，所述位置相对于原始病毒在p6Kernow病毒中被突变。

在一些实施方案中，本发明的复制型HEV cDNA在ORF1中，通常在ORF1的高变区中包含插入片段。复制型HEV cDNA可为任何基因型。在一些实施方案中，HEV基因型1毒株在ORF1中包含插入片段。在一些实施方案中，HEV基因型3毒株在ORF1中包含插入片段。在一些实施方案中，HEV基因型2毒株或基因型4毒株在ORF1中包含插入片段。包含插入片段的依照本发明的HEV cDNA相对于不包含插入片段的cDNA，具有提高的在细胞培养物中复制的能力。在一些实施方案中，插入片段在ORF1的高变区中。在一些实施方案中，插入在第749位之后，使得插入氨基酸序列起始于ORF1蛋白序列的第750位，如参考SEQ ID NO:6确定的。在一些实施方案中，插入片段编码核糖体RNA蛋白的序列。插入片段例如可与SEQ ID NO:9有至少75％、80％、85％、90％或95％或更大的一致性。

在一些实施方案中，ORF1中的插入片段由SEQ ID NO:10所示序列的下划线部分编码。

复制型HEV cDNA可利用本领域熟知的技术来构建。例如，全长cDNA克隆可从通过RT-PCR产生的cDNA片段来装配。然后，此类cDNA克隆可被转录以得到用于转染至细胞中的RNA。

如上所示，本发明包括作为实例如SEQ ID NO:l所提供的参考cDNA序列的变体，其保留了在培养中的多种细胞系中复制的能力。此外，如本领域所理解的，由于遗传密码的简并性，应理解的是可作出核苷酸的许多选择，其将提供能够指导HEV开放阅读框产生的DNA序列。

由本发明的HEV cDNA编码的多肽

在另外的方面，本发明提供了由本发明的复制型HEV cDNA克隆编码的多肽以及利用本发明的复制型HEV cDNA克隆产生此类多肽的方法。在一些实施方案中，此类多肽可完全或部分纯化自通过转染了本发明的核酸序列的细胞产生的戊型肝炎病毒。在另一个实施方案中，一种或多种多肽从本发明的核酸序列的片段重组产生。而在另一个实施方案中，多肽是化学合成的。本发明的多肽，特别是结构性多肽，可作为疫苗开发中的免疫原或作为用于检测生物样品中HEV存在的诊断测定的开发中的抗原。

在一些实施方案中，本发明提供具有以下序列的多肽或片段：SEQ ID NO:2或SEQID NO:6所示的ORF1氨基酸序列；SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8所示的ORF2氨基酸序列；或SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7所示的ORF3氨基酸序列；或以上的片段或变体。在一些实施方案中，本发明的多肽与SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:8的ORF2蛋白有至少90％、95％或100％或更高一致性的序列。在一些实施方案中，本发明的多肽具有这样的序列，该序列与SEQ IDNO:4或SEQ ID NO:8的ORF2蛋白的片段有至少95％、通常至少96％、97％、98％或99％或更高的氨基酸序列一致性，其中所述片段长度为至少200、至少300、至少400、至少500或至少600个氨基酸。在一些实施方案中，本发明的多肽具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:6的ORF1蛋白的片段至少85％、至少90％、至少95％、通常至少96％、97％、98％、99％或更高一致性的序列，其中所述片段长度为至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少700、至少1000或至少1500个氨基酸。在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。

本发明的多肽可用于，例如诊断和预后目的。例如，在一些实施方案中，本发明的多肽可用作免疫原以刺激抗体的产生。

载体和宿主细胞

本发明的复制型病毒可培养于多种宿主细胞中。例如，在一些实施方案中，RNA获自本发明的复制型cDNA克隆并被引入细胞系，例如人、猪、或啮齿类的肝细胞系中。在一些实施方案中，细胞系可为肝细胞系或肾细胞系，但还可应用其它的细胞系，例如肺细胞系。在一些实施方案中，复制型cDNA克隆可被引入原代细胞培养物中，例如肝细胞的原代培养物中。接着RNA产生感染性病毒。在一些实施方案中，可培养原代肝细胞，然后用HEV感染，或肝细胞培养物可来源于被感染动物的肝脏。此外，本领域技术人员已知的各种永生化方法可用于获得来源于肝细胞培养物的细胞系。例如，可将原代肝细胞培养物与多种细胞融合以保持稳定性。

本发明的cDNA克隆的感染性可用多种测定来评价。例如，在一些实施方案中，一旦将获自cDNA克隆的RNA引入细胞中，便可评价蛋白例如ORF2的表达。在可选的实施方案中，可评价通过cDNA的初始RNA拷贝的引入而起始的病毒复制期间产生的RNA转录物。

在典型的实施方案中，本发明的HEV克隆的复制能力通过确定用HEV克隆获得的转染子的数量来评价(即，利用cDNA克隆的RNA拷贝获得)。当在细胞系例如HepG2或其它细胞系中测定时，在ORF1中有插入片段的本发明的各种cDNA克隆被认为是，相对于缺少所述插入片段的相同cDNA克隆副本具有至少10％以上、通常至少20％以上或至少30％、40％、50％、80％或100％或更大数量的表达ORF2的转录子的复制型cDNA克隆。在本发明的上下文中，“复制型”cDNA克隆通常并非被直接引入细胞系中，而是用于体外转录。从转录获得的RNA被引入细胞系中。本领域技术人员理解的是还可测量检测ORF2水平的备选终点，例如病毒颗粒的产生峰值。

在一个实施方案中，可将人细胞在体外培养并用本发明的核酸转染。然后可评价人细胞以确定该细胞是否显示出HEV感染的任何迹象。此类迹象包括在细胞中检测出病毒抗原，例如通过本领域通常已知的免疫荧光程序；通过蛋白印迹检测病毒多肽；以及经由诸如RT-PCR的方法检测细胞内新转录出的病毒RNA。经此类测试后，活的、感染性病毒颗粒的存在情况还可通过将细胞培养基或细胞裂解液注射至健康、易感的动物中，随后用HEV感染的症状的表现来显示。

在一些实施方案中，本发明的感染性核酸可引入宿主动物，例如猪中，例如以评价HEV克隆的毒力。通过感染性核酸序列的转染产生的病毒的毒力表型可通过本领域已知的方法，例如通过肝酶水平(谷丙转氨酶(ALT)或异柠檬酸脱氢酶(ICD))的测量或通过肝活检的组织病理学来评价。

在一个实施方案中，可将编码本发明多肽的核酸并入用于在宿主细胞中表达的表达盒中。表达系统为本领域熟知并且包括例如细菌如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。表达载体包括基于病毒的载体和质粒载体。在一些实施方案中，HEV多肽和肽在人宿主细胞中表达。

在其它实施方案中，本发明还涉及由来自不同毒株的HEV序列组成的“嵌合核酸序列”。因此，在一个实施方案中，嵌合核酸序列可具有来自本发明的感染性克隆的序列，例如来自如本文所述的复制型cDNA克隆的编码ORF1的多核苷酸，以及诸如来自另一种HEV毒株的编码ORF2的多核苷酸的序列。此类嵌合序列可通过标准技术产生。

在一些实施方案中，可缺失感染性核酸序列中所包含的基因或5'或3'非翻译区的全部或部分。然后，可将此类序列转染至带突变序列的宿主细胞(动物或细胞培养物)中。病毒复制可利用已知方法，例如RT-PCR来测量。在一些实施方案中，进行HEV基因的中心部分的缺失，例如以保留存在于HEV多蛋白内的蛋白之间并参与合适的多蛋白加工的切割位点边界。

在一些实施方案中，设计本发明的核酸序列以具有用于在细胞培养系统，例如哺乳动物细胞培养系统中表达的优化密码子。例如，可根据宿主使用的特定密码子的频率选择密码子，以增加特定原核宿主或真核宿主中出现的肽/多肽表达的速度。在一些实施方案中，选择密码子以产生具有所需性质例如更长半衰期的RNA转录物。

在一个实施方案中，将转染了本发明核酸序列的动物细胞(例如人细胞)在体外培养，并通过将抗病毒活性的候选抗病毒剂(化学物质、肽等)加入培养基中用候选试剂处理该细胞。接着经过足够的时间用于发生感染，之后通过本领域技术人员已知的方法对比未处理的对照细胞来确定病毒复制的存在与否。此类方法包括但不限于在细胞中检测病毒抗原，例如通过本领域熟知的免疫荧光程序；使用病毒多肽特异的抗体通过蛋白印迹检测病毒多肽；通过RT-PCR检测细胞内新转录出的病毒RNA；以及通过将细胞培养基或细胞裂解液注射至健康、易感的动物中用随后的HEV感染症状的表现来检测活的、感染性病毒颗粒的存在情况。对照细胞(仅用核酸序列处理)得到的结果与处理细胞(核酸序列和抗病毒剂)得到的结果的比较表明，若有的话，候选抗病毒剂的抗病毒活性的程度。当然，本领域技术人员很容易理解的是，此类细胞可在暴露于本发明的核酸序列之前或之后用候选抗病毒剂处理以确定所述试剂针对病毒感染和复制的哪一阶段或那些阶段是有效的。

复制型病毒的分离

本发明还提供了利用慢性感染HEV患者作为病毒的另外来源获得复制型病毒的方法。在典型的方法中，病毒分离自患者，通常为粪便样品，并用于感染细胞系，例如肝癌细胞系。病毒连续传代以使病毒适应细胞培养物的方法为本领域熟知。例如，病毒可利用以下方案来传代。得到粪便样品并匀浆以产生悬浮液，将悬浮液通过离心来澄清并使用澄清的悬浮液(或者病毒可通过超速离心进一步纯化，之后可将其稀释于所选的培养基中)。将粪便悬浮液或血清的等分试样覆盖到小培养平皿或烧瓶中排干的单层细胞(例如，HepG2/C3A)上并孵育(例如，在约34.5℃的温度下在CO₂培养箱中持续5小时)。吸干接种物并加入细胞培养基。在相同温度下继续孵育。将培养基除去，每周更换一次或两次培养基，并对所收集的培养基进行能感染HepG2/C3A或另一种所需细胞系如LLC-PK细胞的病毒量的滴定。当培养基中的病毒滴度已上升至足够高的水平(例如，1000个空斑形成单位/mL)，将等分试样移出并用于接种另一烧瓶或平皿的细胞(例如，HepG2细胞)并重复该程序，例如5次，直至培养基中的病毒达到所需滴度。

为了获得cDNA克隆，提取培养基等分试样中的病毒RNA，并反转录成cDNA，其通过PCR扩增，通常作为重叠片段，并克隆。将T7聚合酶启动子并入到基因组的5'端并将唯一的限制性位点作为PCR引物的一部分并入到3'端。将cDNA片段用合适的限制性酶消化并连接到一起以产生全长病毒基因组cDNA。将cDNA在大肠杆菌中扩增、纯化并在唯一的限制性位点线性化。将线性化的cDNA用T7聚合酶在体外转录。该RNA随后可用于转染细胞并产生复制型病毒基因组、病毒蛋白和感染性病毒颗粒。

本领域技术人员理解的是这些方案有许多变化。以上概述的用于连续传代和cDNA克隆的方案是方案的实例而并不意图限制所应用的方案。

本发明的HEV cDNA、病毒和蛋白的用途

利用本发明的cDNA克隆产生的戊型肝炎病毒可通过本领域技术人员已知的方法从转染的细胞中纯化或部分纯化。在优选的实施方案中，病毒在其用作本发明的药物组合物和疫苗中的免疫原之前是部分纯化的。

因此本发明涉及产生自本发明的HEV核酸序列的戊型肝炎病毒的用途。例如，相对于SEQ ID NO:5在ORF1中有插入片段的HEV 3型毒株(例如具有SEQ ID NO:1所示序列的HEV3型或其变体)，用作活疫苗或被杀死的疫苗(例如福尔马林灭活的)中的免疫原以预防哺乳动物的戊型肝炎。在一些实施方案中，HEV 3型毒株病毒有不可使用的ORF3。在此类实施方案中，ORF3可通过突变或缺失失活。

本发明还涉及重组HEV蛋白作为诊断试剂和疫苗的用途。作为免疫原起作用的疫苗，可为细胞、来自转染了重组表达载体的细胞的细胞裂解液或包含所表达蛋白的培养物上清液。或者，免疫原为部分或基本纯化的重组蛋白。

在一个实施方案中，疫苗利用直接的基因转移来给予。这可经由给予包含本发明核酸序列的真核表达载体来实现。在一些实施方案中，核酸序列为编码感染性戊型肝炎病毒的复制型cDNA。如本领域所理解的，产生自本发明的感染性HEV cDNA克隆的cDNA或优选RNA，可用于转染哺乳动物，例如，如实施例中所述的通过直接注射至哺乳动物的肝脏组织中。在一些实施方案中，免疫原为SEQ ID NO：l或SEQ ID NO：5的多核苷酸或其变体。适于在体内产生高效率基因转移的表达载体包括逆转录病毒、腺病毒和牛痘病毒载体。表达载体可通过多种方法给予，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内和口服。

在一些实施方案中，直接的基因转移可经由肌内注射例如，包含能够指导HEV蛋白的宿主生物体合成的核酸序列的基于质粒的真核表达载体来完成。此类方法之前已用于体内产生乙型肝炎表面抗原并导致对该表面抗原的抗体应答(Davis,H.L.et al.(1993)Human molecular Genetics(人类分子遗传学),2:1847-1851；还参见Davis et al.(1993)Human Gene Therapy(人类基因治疗),4:151-159和733-740)。

本发明还涉及本发明的HEV核酸序列例如，SEQ ID NO：l或SEQ ID NO：5或其变体经由通过感染性核酸序列的转染产生的病毒在体外或体内传代用于产生减毒的病毒毒株的用途。

在一些实施方案中，产生自本发明的核酸序列或其片段的多肽(例如由ORF2编码的衣壳多肽)，可用作例如免疫原。在一个实施方案中，本发明的多肽可利用本领域已知的方法通过从本发明的核酸序列或其分离的片段合成来重组产生，并从转染的细胞中纯化或部分纯化。在可选的实施方案中，多肽可纯化或部分纯化自经由本发明的核酸序列对宿主细胞的转染所产生的病毒颗粒。

当用作免疫原时，本发明的核酸序列、或产生自所述核酸序列的多肽或病毒，优选在用作本发明的药物组合物和疫苗中的免疫原前是部分纯化的。当用作疫苗时，所述核酸序列；以及所述核酸序列的多肽和病毒产物，可单独给予或在合适的稀释剂(包括水、盐水或普通缓冲介质)中给予。依照本发明的疫苗可通过包括皮内、肌内、皮下或其任意组合的多种途径给予动物，例如哺乳动物，特别是人。

用于预防和治疗目的而给予的物质的合适量应视所选的途径和给予的免疫原(核酸、病毒、多肽)而不同。本领域技术人员应理解，用于任何具体的治疗方案而待给予的量可很容易地确定而无需过多的实验。本发明的疫苗可给予一次或周期性给予直至血液中出现针对HEV的合适滴度的抗体。对于核酸免疫原，用于预防目的的核酸序列的合适量可为约100μg-约5-10mg，通常为约500μg-约2mg。对于多肽，用于预防目的的合适量可为100ng-100μg。当使用病毒作为免疫原时，给药量可为约10²-约10⁶的感染剂量。此类给予优选在任何HEV感染迹象之前进行。

无论用于动物还是人，本发明的制剂包含如上所述的免疫原，连同一种或多种药学上可接受的载体和任选的其它治疗成分。从与制剂中的其它成分相容的意义上来说，载体必须为“可接受的”，并且载体对药物组合物的接受者是无害的。制剂可方便地以单位剂量形式存在并且可通过制药领域熟知的任何方法来制备。

疫苗制剂包含活性成分以及构成一种或多种辅助成分的载体。适用于静脉内、肌内、皮下或腹腔内给予的制剂方便地包含HEV核酸、多肽或病毒的无菌水溶液，该溶液与接受者的血液是等渗的。此类制剂可通过以下来方便地制备：将固体活性成分溶解于包含生理上相容的物质(例如氯化钠，甘氨酸等)的水中，使其具有与生理条件相容的缓冲pH以产生水溶液，并使所述溶液无菌。这些制剂可存在单位剂量或多剂量容器，例如密封的玻璃管或小管中。

对于固体组合物，可使用常规的无毒固体载体，其包括例如，药物级的甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。对于口服给药，药学上可接受的无毒组合物通过并入任何常用的赋形剂，例如前面列出的那些载体来形成，一般为10-95％的活性成分并且，在一些实施方案中，例如，为25％-75％的浓度。

对于气雾剂给药，多肽或核酸以精粉形式连同表面活性剂和推进剂一起提供。显然，表面活性剂必须是无毒的，并且优选可溶于推进剂中。此类试剂的代表为包含6-22个碳原子的脂肪酸的酯或偏酯，例如己酸、辛酸、月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、油硬脂酸(olesteric acid)和油酸以及脂肪族多元醇或其环酐。可采用混合酯，例如混合或天然的甘油酯。还可包含载体，如需要的话，与例如用于鼻腔递送的卵磷脂一起。

组合物可包含载体、赋形剂或佐剂。佐剂包括例如，氢氧化铝、脂质A、灭活细菌、多糖、矿物油、弗氏不完全佐剂、弗氏完全佐剂、磷酸铝、铁、锌、钙盐、酰化酪氨酸、酰化糖、CpG寡核苷酸、多糖的阳离子衍生物、多糖的阴离子衍生物、聚磷腈和生物可降解微球、TLR激动剂、单磷酸脂质A、MF59、水包油乳剂AS03和AS04、ISCOM以及quil A。

用于本发明的合适的制剂参见Remington:The Science and Practice ofPharmacy(雷明登：药学的理论与实践),第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins,2005。

当本发明的核酸、病毒和多肽被用作疫苗或接种物时，它们通常作为物理上分散的单位存在，其适合作为动物，例如哺乳动物，优选人的单一剂量，其中每单位包含经计算联合所需的稀释剂产生期望的免疫原性效果的预定量的活性物质。所述疫苗或接种物的剂量给予至少一次。为了增加抗体水平，可在初始剂量之后的某时给予一次或多次加强剂量。例如，通常在初次接种后约2周-约6个月的某时常给予一次或多次加强剂剂量。随后的剂量可按指示给予。对该用途有效的疫苗量和给药日程取决于多种因素，包括病人的健康状况、年龄、体重、给药途径等。

在一个实施方案中，表达的本发明中的重组蛋白可在用于诊断或预后哺乳动物，例如，人、黑猩猩、其它灵长类动物、猪等的戊型肝炎的免疫测定中使用。在一个实施方案中，免疫测定用于诊断人的戊型肝炎病毒感染。

基本上可使用能检测HEV多肽与生物样品中的抗体或其片段的相互作用的任何测定。生物样品包括血液、血清、组织、尿样和活检样品。一种或多种多肽可被连接至固体基质，例如珠子、ELISA板、试纸(dipstick)或微阵列。

生物样品中抗体的存在与否可利用本领域技术人员已知的检测抗原抗体复合物的方法来确定。此类方法包括将抗原抗体复合物与能结合至抗原抗体复合物而非单独的抗体或抗原的可检测的标记部分接触。

本发明的核酸序列、病毒和多肽还可出于治疗的目的而给予，其中如通过公知的诊断措施所显示的，哺乳动物，例如人已被感染。

当本发明的核酸序列、病毒或多肽用于此类治疗目的时，所适用的很多标准与其用作疫苗时一样，除了接种发生在感染后。因此，当本发明的核酸序列、病毒或多肽用作感染治疗中的治疗剂时，该治疗剂包含含有足够量的所述核酸序列、病毒或多肽以在待治疗生物体中引发治疗上有效的反应的药物组合物。待给予的药物组合物的量可视其中包含的免疫原(核酸、多肽、病毒)和给药途径而不同。

在一些实施方案中，可将抗-HEV抗体给予个体。因此，可将可与本发明的HEV蛋白反应的抗体单独或联合另一种抗病毒剂被动给予感染了HEV的宿主以提高抗病毒药物的免疫应答和/或有效性。

筛选测定

本发明还涉及本发明的cDNA序列和多肽在筛选针对HEV的抗病毒活性的潜在的抗病毒剂中的用途。此类筛选方法为本领域技术人员已知。一般而言，在多种浓度测试抗病毒剂对在支持病毒复制的细胞培养系统中阻止病毒复制的影响，并接着测试其在动物模型系统中对感染性或病毒致病性的抑制(和低水平的毒性)。

在又一个实施方案中，本发明的核酸序列可用于鉴定对HEV的细胞培养物适应至关重要的序列并因此，可用于鉴定能够支持HEV复制的细胞系。

在另一方面，本发明涉及用编码HEV的多核苷酸筛选分子或化合物的文库以鉴定其中能特异性结合HEV多核苷酸序列的至少一种分子或化合物的方法。此类方法包括：a)在允许特异性结合的条件下将本发明的编码HEV的多核苷酸与分子或化合物的文库结合；和b)检测特异性结合，从而鉴定能特异性结合编码HEV的多核苷酸的分子或化合物，其中所述文库选自DNA分子、RNA分子、人工染色体构建体、PNA、肽和蛋白。

在评价病毒清除过程中的用途

在一些实施方案中，产生自本发明的感染性cDNA克隆的病毒，例如，在如本文所述的ORF1的高变区中具有编码SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列的插入片段的HEV 3型病毒，可用于评价去除或灭活可存在于产品中的病毒(例如HEV病毒)的病毒处理过程的功效。在一些实施方案中，产品为水；动物食用的饲料(其如本文使用，包括液体)，例如人食用的食品；或血液。在此类实施方案中，将利用本发明的复制型cDNA克隆产生的已知量的HEV 3型病毒引入待分析的材料，例如，水、食物、或血液中；将材料进行用于去除和/或灭活病毒的过程例如，过滤、热处理、辐照等中；以及在病毒去除和/或灭活过程之后确定残留在材料中的所加HEV 3型病毒的量。残留的HEV 3型病毒的水平表示了病毒处理过程的功效。

进行病毒处理程序的产品中残留的HEV 3型病毒的水平可使用本领域已知的任何方法例如，使用免疫测定或PCR测定来确定。在一些实施方案中，残留的HEV 3型病毒的水平利用定量PCR来评价。例如，残留的HEV 3型病毒的水平可利用特异性针对本发明的复制型克隆中存在的ORFl插入片段的引物和/或探针来确定。在一些实施方案中，用于评价病毒处理程序的功效的病毒可包含引入所述病毒基因组的另外的核苷酸序列或氨基酸序列以用作鉴定加入目标材料的HEV 3型病毒的标记物。

实施例

实施例1.来自10种不同物种的细胞的基因型3的感染

尽管某些基因型3和4的毒株已知能感染猪和/或鹿以及人，但没有适合用于探索寄主范围参数的病毒-细胞培养系统。在努力开发此类系统的过程中，将HEV的基因型3Kernow-Cl毒株从感染了HEV的HIV-1患者的粪便中半纯化出来(5)。当收集其粪便时，该名患者已慢性感染HEV两年并发现包含约10¹⁰个病毒基因组/克。将该病毒接种于5种人细胞系和1种恒河猴细胞系上，并在7天后，将细胞用ORF2衣壳蛋白和ORF3蛋白的抗体来染色用于免疫荧光显微术：因为这些病毒蛋白从亚基因组RNA中翻译，它们的存在表明已发生了病毒RNA的合成。在全部6种培养物中均发现感染的空斑但HepG2/C3A人肝癌细胞中的空斑数量比人Huh7.5或PLC/PRF/5肝癌细胞、A549肺癌细胞、Caco-2肠细胞或恒河猴肾细胞高7.5倍以上，这表明HepG2/C3A细胞许可度最高。

将半纯化的病毒在HepG2/C3A细胞中在总共7个月中连续传代6次。而粪便中的病毒在HepG2/C3A细胞上形成的空斑比A549或PLC/PRF/5细胞分别多80和90倍，到第4代，所述病毒在HepG2/C3A细胞比其在其他两种细胞系上产生的空斑多400和500倍。在HepG2/C3A细胞上的生长曲线比较了由粪便病毒和第6代病毒的感染性病毒和毒粒RNA的产生，这证实了粪便病毒的连续传代已产生能够在HepG2/C3A细胞中更有效地生长的病毒(对于FFU p＝0.008并且对于RNA p＝0.013)(图1)。在第14天，粪便病毒已释放了89FFU和1.3x10⁶GE的RNA/100μL培养基，从而产生1FFU/15,083GE的特定感染性；在第14天第6代病毒释放了3203FFU和46.1x10⁶GE的RNA/100μL，从而产生1FFU/14,399GE的特定感染性。类似的使粪便病毒适合在A549细胞或PLC/PRF/5细胞上生长的尝试均未成功。

还测试了粪便病毒感染从ATCC获得的多种非灵长类动物细胞的能力。基因型3病毒已分离自猪和鹿以及含有许多ORF2和ORF3染色空斑的三种猪肾细胞系的每一种，而鹿细胞系有中等数量(数据未显示)。值得注意的是，如免疫荧光所确定的，牛、小鼠、鸡、猫、狗、兔的细胞培养物每一种还包含少量染有ORF2蛋白和ORF3蛋白两者的细胞(数据未显示)。

基因型1和3在人、猪和鹿细胞上的滴度

为了重新审视基因型1的宿主范围限制的问题，将基因型1(Sar-55，Akluj)和基因型3(US-2、Kernow-Cl粪便、第6代Kernow-Cl)获得的最高滴度的储存液的连续稀释液接种在HepG2/C3A、LLC-PK1猪细胞和鹿细胞上，并在3天后对培养物的ORF2蛋白和ORF3蛋白进行免疫染色。最后1个或2个阳性稀释液的ORF2阳性空斑的数量用于计算感染滴度(图2)。如预期的，基因型1毒株感染HepG2/C3A细胞，但出乎意料的是，其还感染LLC-PK1细胞，虽然效率较低(对于Sar-55 p＝0.016，而对于Akluj p＝0.009)。相比之下，基因型3毒株感染LLC-PK1细胞比其感染HepG2/C3A细胞更有效(对于粪便p＝0.006，对于第6代p＝0.010，对于US-2p＝0.008)。尽管第6代病毒适应生长于HepG2/C3A细胞中，但它相比人细胞仍感染更多的猪细胞。在多次实验中得到类似的结果(对于US-2而言有一个例外)，尽管病毒的滴度以及因而的比值随实验而不同(表3)。由于这种变化，在用于对比的每次测定中包括至少一种基因型1和一种基因型3毒株是必要的(表3)。

第6代病毒的滴度相对于粪便Kernow-Cl病毒的滴度较低反映了细胞培养的病毒的较低特异的感染性。然而图1中培养的病毒在HepG2/C3A细胞上具有约1FFU/15000GE的特异感染性，粪便中的Kernow-Cl病毒在这些相同的细胞上具有1FFU/450GE的特异感染性。

鹿细胞的感染更复杂。在该实验中US-2并未感染鹿细胞，但其他毒株每一种均感染鹿细胞，滴度比LLC-PK1细胞上低至1/8-1/11。有趣的是，ORF2蛋白和ORF3蛋白的双染色表明基因型1毒株而非基因型3毒株为ORF2衣壳蛋白产生缺陷的。对每孔中所有染色的鹿细胞进行计数：包含基因型1ORF3蛋白的细胞中2/3没有检测到ORF2蛋白，而包含基因型3ORF3蛋白的每个细胞都包含ORF2蛋白(图3A)。该不平衡在感染了基因型1，Sar-55的人细胞中未见到：ORF3蛋白随机评分阳性的73个细胞中，只有1个细胞缺少可检测的ORF2蛋白。由于ORF2和ORF3的翻译从相同的双顺反子mRNA上紧密间隔开的甲硫氨酸密码子起始(16)，该结果表明在感染了基因型1毒株而非感染了基因型3毒株的鹿细胞中在损失ORF2蛋白合成的情况下翻译偏向于ORF3蛋白合成的的起始。

鹿细胞中病毒蛋白的产生没有强烈到足以允许FACS分析。因此，对转染了由CMV启动子驱动的mRNA的细胞进行FACS分析以确定起始偏向。野生型Sar-55、野生型Kernow-Cl和前29个核苷酸突变为Kernow-Cl的前29个核苷酸的Sar-55的双顺反子mRNA在S10-3人肝癌细胞和鹿细胞中瞬时表达。ORF2蛋白和ORF3蛋白单独染色的培养物的FACS分析证明了，突变体CMV-MT29(p＝0.024)和CMV-Kernow(p＝0.052)比CMV-Sar(p＝0.003)产生了明显更多的ORF3蛋白(相对于ORF2蛋白)(图3B)。由于CMV-Sar和CMV-MT29仅有这29个核苷酸不同，由该突变体相对增加的ORF2产生表明鹿细胞中Sar-55 ORF2衣壳蛋白的翻译减少了。事实上，当将相同的29个核苷酸突变引入感染性全长Sar-55克隆(pSK-E2-MT29)中并将其与野生型Sar-55转录物转染至鹿细胞，并在5天后通过免疫显微术对ORF2蛋白和ORF3蛋白的产生评分时，含平均比值的ORF3/ORF2的细胞从野生型的3.68降低为突变体的0.4(p＝0.004)，从而确定翻译起始位点处的29个核苷酸基因型3序列足以增加鹿细胞中Sar-55的ORF2的产生(表1)。相比之下，单独转染了野生型克隆或突变体克隆的人S10-3细胞获得了含有相似比值的ORF3/ORF2的细胞(表2)。

实施例2.HepG2/C3A适应性病毒和宿主-细胞重组

确定粪便病毒和第六代病毒的RT-PCR共有序列。第6代病毒与粪便病毒差别在于16个氨基酸的差异(ORF1中的10个、ORF2中的5个和ORF3中的1个)以及ORF1的高变区(HVR)中58个氨基酸的符合读框的插入片段(22)(表4)。Blast搜索鉴定所述插入序列属于物种间高度保守的核糖体S17e超家族。170个核苷酸中的167个以及57个氨基酸中的53个与人核糖体蛋白S17(GenBank DQ896701.2)中的那些相同(图4)，相比之下在猪S17蛋白(AY5500731.1)中171个核苷酸仅155个是相同的。用配对的HEV和插入序列引物的RT-PCR检测原始粪便悬浮液中带有插入片段的病毒基因组，表明在患者或之前的宿主中已发生了双重组事件。值得注意的是粪便中重组基因组是较少的种类，因为它们通过从粪便中或感染后70天的培养基中的第一代病毒中的RT-PCR产物的直接测序没有检测到。用HEV特异性引物从粪便中扩增整个HVR、克隆并测序。在测序的120个克隆中，无一包含所述插入片段。

在试图确定插入序列或其大小是否相关的过程中，将插入序列以正向、反向或反向互补方向符合读框的克隆到Sar-55感染性克隆的高变区中，并将在体外转录的基因组转染至S10-3细胞中。野生型基因组以及带有正向插入片段的那些基因组是无差别的并且比可计数的细胞产生更多的病毒阳性的细胞；相比之下，如免疫荧光显微镜确定的，通过包含转染了含有反向和反向互补插入片段的基因组的细胞的孔分别仅包含16和12个病毒阳性的细胞(数据未显示)。

实施例3.复制型克隆的制备

感染了HEV的HIV-1患者的半纯化粪便中存在的Kernow-Cl病毒基因组的完整核苷酸序列，用Superscript II反转录酶(Life Technologies)、PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA)、2步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)以及最初使用来源于猪戊型肝炎病毒，毒株3的全长cDNA克隆的引物(Meng et.al)，通过RT-PCR来确定。基于新得到的序列设计随后的引物。5’端的序列通过5'RACE试剂盒(Life Technologies)来确定。

对于全长cDNA克隆[K I]的构建，用TRIZOL LS试剂(Life Technologies)从释放至已接种了半纯化的粪便病毒的HepG2细胞的培养基中的第1代病毒提取Kernow-Cl病毒RNA。Kernow-Cl基因组用Superscript II反转录酶(Life Technologies)、HerculaseHotStart Taq(Stratagene)和PrimeStar HS DNA聚合酶(TAKARA)来扩增。扩增覆盖了整个Kernow-Cl基因组的总共六个重叠片段，并通过融合PCR连接成两个重叠片段，其随后在每一片段中存在的唯一限制性位点处连接在一起。改造编码基因组的5’端使之具有唯一的Xbal位点和T7RNA聚合酶核心启动子。将3’端改造成包含一段16个腺苷，随后为唯一的Mlul[用于质粒线性化的位点]，其后依次为Hindll。将全长的基因组cDNA连接至pBlueScriptSK(+)质粒(Stratagene)的多接头的Xbal和Hindll位点之间。

第6代的RT-PCR共有序列用2步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)来确定，其揭示了高变区(HVR)中58个氨基酸的符合读框的插入片段。该插入片段通过Blast搜索鉴定与人核糖体蛋白S17最紧密相关。

通过在HepG2/C3A细胞中的六次连续传代选择的病毒是包含人S17基因的一部分的重组病毒，这一事实直至对第6代病毒测序后才被发现(见上文)。尽管包含了171nt插入S17序列的病毒基因组可用病毒/人引物对通过嵌套RT-PCR在粪便中检测，它们组成如此少的准种以致其未表示在粪便接种物的病毒HVR区的120个cDNA克隆中(数据未显示)。为了确定在传代系列中包含该插入片段的病毒何时首次出现，以及其何时成为优势种类，6个细胞培养物传代水平的每一个的培养基中的病毒HVR区通过RT-PCR扩增、克隆并测序。

测序分析的结果表明来自第一代的11个克隆中的两个已包含S17序列并从第2代以后，其存在于大多数克隆中(表5)。令人惊讶的是，不同的哺乳动物基因插入片段，114nt长，存在于来自第一代细胞培养物中11个克隆中的5个，在这种情况下，来自粪便的120个克隆中发现2个存在几乎相同的序列。该114个核苷酸长的序列从GTP酶激活蛋白基因序列的中间缺少10nt并由重新排列的基因片段(GenBank AB384614.1)组成，其中GTP酶nt 3009-3105后为3'端的GTP酶nt 2981-3008，并且阅读框被改变，以致该序列，如插入的话，编码无关的氨基酸序列，当针对所有已知的非冗余蛋白质数据库搜索该序列时，该序列不与任何序列匹配。然而，该插入片段在随后的第2-6代克隆中的任一代中均没有检测到。

感染性cDNA病毒克隆

培养细胞的培养基应包含病毒准种的成员，该成员最能感染细胞并在这些细胞中完成复制周期。因此，从之前已用包含原始Kernow毒株的粪便悬浮液接种了111天的HepG2/C3A细胞(第1代病毒)的培养基中扩增的未克隆cDNA片段中构建Kernow病毒的第一全长cDNA克隆。该Kernow第1代cDNA克隆p1缺少S17插入片段(GenBank HQ389543)并与粪便中的病毒的共有序列相差15个氨基酸(表7)。将其转染至S10-3肝癌细胞中，5-6天后通过对ORF2蛋白染色的细胞的免疫荧光显微术进行监测。转染了第1代克隆的体外转录物的S10-3细胞的2％以下产生了可检测的ORF2蛋白，表明该病毒基因组，尽管可感染，但缺少有利于稳定复制的元件。S17插入片段并入cDNA克隆中产生p1/S17，这增加了转染细胞的数量，尽管水平仍低于大约10％。

为了获得更可靠的病毒并鉴定有利于细胞培养适应的区域，将p1/S17 cDNA的便利的限制性片段依次用从第6代、适应细胞培养物的病毒中扩增的未克隆的PCR产物的准种取代(表6)。将来自这些新的全长基因组的多个克隆的转录物转染至S10-3细胞中并通过免疫荧光显微镜检查ORF2的产生。产生最高百分比转染细胞的克隆用作下一次取代的骨架并将此过程重复4次以上。最终，将所有的克隆在同一实验中通过流式细胞术进行比较(图5)。第一个3个连续片段的取代将突变引入了3'ORF2和非编码区(nt 6812-聚A)、3'ORFl和ORF2/ORF3重叠(nt 4608-6812)以及ORFl的5'的第三位(nt 671-2182)：在这三个片段中，仅6812-A_n的取代显着增加了转染的效率(图5)。在跨越nt 4608-6812的第6代PCR扩增子中，最能加强转染水平的序列，包含消除了ORF3中仅2个甲硫氨酸密码子(aa 1和69)的突变(表6)；免疫荧光显微镜确定了来自该cDNA克隆的病毒和3个随后的cDNA克隆的病毒并不产生ORF3蛋白(数据未显示)。具有最大增强作用的第6代片段跨越nt 2182-3063并包含X结构域中的3个天然存在的氨基酸突变和HVR中的单个脯氨酸缺失：另外该片段中的4个脯氨酸密码子通过定点诱变至CCA密码子而改变，以便保留氨基酸序列同时破坏极大阻碍了PCR和序列分析的HVR中的C残基簇。第五个片段的取代(nt 3063-4608)包含解旋酶和聚合酶基因的高度保守的区域，没有引入任何氨基酸的改变并且没有明显作用(p＝0.067)。最后，恢复ORF3的甲硫氨酸起始密码子以使可由P6病毒产生ORF3蛋白。甲硫氨酸密码子的存在与否对S10-3细胞的转染水平没有明显影响(比较p6/ORF3无效和p6的转染水平(p＝1.0)]。该克隆，排除插入片段，与粪便共有序列差别16个氨基酸，与pi 1差别25个氨基酸，并且与第6代共有序列差别仅两个氨基酸(ORFl中aa 598＝R到C和ORF2中aa 593＝T到A)。将最后p6克隆的转录物常规转染10-45％的S10-3细胞。

由于X结构域的功能未知并且HVR的脯氨酸密码子中C到A的变化是改造而非天然的，这可确定X结构域中的三个突变或片段2182-3063中HVR的C到A的同义突变是否对增强转染是最重要的。由于脯氨酸密码子的回复突变将重新造成测序问题，选择X结构域中的氨基酸密码子用于回复突变。X结构域域中的所有3个突变均回复突变至p1 cDNA克隆中存在的原始密码子并在转染6天后用流式细胞仪对转染水平进行定量(图6)。来自包含三个回复的X结构域突变的克隆的转录物(P＝0.0006)在转染S10-3细胞中明显没有来自p6 cDNA克隆的转录物效率高，并与来自缺少HVR脯氨酸突变和X结构域突变两者的671-2182克隆没有显著差异(P＝0.12)，表明打断了聚C段的工程化改变对转染具有的影响最小，而X区域中三个突变中的一个或多个发挥了重要的作用。

为了确定S17序列的作用是否局限于在其插入p1 cDNA克隆后所观察到的转染水平的中度增加，将S17序列选择性地从包含所有点突变的p6 cDNA克隆中去除以产生p6delS17。流式细胞术确认了S17序列添加至p1病毒基因组显著增加了这些基因组的转染效率，尽管水平未接近重组p6基因组所达到的水平(图7)。出乎意料的是，来自适应了p6细胞培养物的cDNA克隆的S17序列的去除使基因组转录物的转染效率急剧地降低至仅优于p1cDNA克隆的效率的3倍(图7)。该结果表明负责系列克隆转染效率渐进改善的点突变在不存在S17序列的情况下大多是无效的。

基于ORF2蛋白免疫染色的流式细胞术分析揭示了产生可检测的ORF2蛋白的细胞百分比，但其并不提供产生的ORF2蛋白的量的定量比较或在ORF2合成期间ORF2蛋白的量的定量比较。为了确认并延伸流式细胞术数据，将ORF2的5'部分用符合读框的gaussia荧光色素酶报告基因替代以产生p6/luc：该荧光色素酶具有导致其分泌并在细胞培养基中累积的信号序列。因此，可从同一培养物中取多个时间点。

荧光色素酶系统通过测量由包含有功能的聚合酶或不能合成病毒RNA的突变的、无功能的聚合酶的病毒p6/luc分泌入培养基中的荧光色素酶的量来确立。但来自转染了p6/luc聚合酶突变体的S10-3细胞或来自未转染的S10-3细胞的培养基中的荧光色素酶信号在第2天其峰值时少于111单位/24小时，转染了p6/luc的细胞培养基中的荧光色素酶信号从第1天的2163单位/24小时升高至第4-6天的3600万单位/24小时以上(数据未显示)。

因此，如基于亚基因组mRNA中荧光色素酶基因的ORF2定位所预测的，荧光色素酶的产生需要病毒RNA合成。接着将p6/luc病毒的荧光色素酶产生与突变以缺失S17插入片段或消除三个X基因突变的p6/luc病毒的荧光色素酶产生进行比较。由带或不带S17插入片段的p6/luc病毒产生的荧光色素酶，在转染后第6天达到峰值，但p6/luc单位与p6/luc(delS17)单位之比稳步增加并在第7天达到52倍，因而确定了所述S17插入片段赋予了明显的生长优势并充当细胞培养物适应性突变(图8A)。此外，三个X基因回复突变的荧光色素酶数据与流式细胞分析的数据一致(图8B)；转染了p6/luc X基因回复突变体的培养物比转染了p6/luc病毒的培养物产生的荧光色素酶更少。有趣的是要注意，如图8A和8B中所示，第9天的p6/luc病毒荧光色素酶的值大幅下降，但仍接近突变体的平台水平。

同义突变并不降低转染

S17插入片段的增强作用可能归结于RNA序列或蛋白序列。在尝试区分这些可能性的过程中，在两种克隆中改变第三个碱基(S17中58个密码子的93％和70％)(嘌呤到嘌呤和嘧啶到嘧啶)而不改变编码的氨基酸，除了两个M变成了I。这两种克隆各自成功转染细胞的数量与p6的细胞数量没有明显差异(图9)，尽管预测的RNA结构和ΔG与p6的RNA结构和ΔG不同(delta G＝-120.38)并且彼此的RNA结构和ΔG不同(对于克隆#1和2，ΔG分别＝-102.99和98.97)。因此，增强作用似乎发生在蛋白水平。

插入片段大小的影响

之前的研究证明了S17插入片段对Kernow病毒在细胞培养物中的生长的重要性，但未提供其如何发挥功能的任何见解。由于粪便接种物的第一代已为GTP酶插入片段对细胞培养物中Kernow毒株生长的可能的增强作用提供了证据，该插入片段替代了p6克隆中的S17插入片段以评估其影响。尽管114nt GTP酶的插入片段增加了转染细胞的数量，其效率仅为171nt S17插入片段的大约一半(图10A)。为了确定插入片段本身的长度是否是一个因素，用编码绿色荧光蛋白(GFP)的N-端或C-端58个氨基酸的序列替代了S17序列。选择GFP是因为它与多种伴侣作为融合蛋白在许多细胞类型中表达时表现得相对温和。而且，事实上，荧光显微术表明，当整个编码区与S17插入片段的3端符合读框地融合时产生GFP(数据未显示)；然而，无论是编码GFP的N-端还是C-端的58个氨基酸的174nt对S10-3细胞的转染水均无可检测到的作用(图10A，图10B)。因此，其自身的核苷酸和/或氨基酸数目并非决定性因素。大小的作用还通过从p6的S17插入序列中去除一半核苷酸以产生编码S17插入片段的N端一半、C端一半或中间部分的87-90nt的序列来测试。将所有3种构建体以相似程度转染细胞，其比若存在整个插入片段时平均低1/2-1/6，并且比其不存在时多2.5倍(图10C)。最后，另一种哺乳动物基因序列(S19核糖体蛋白)的117个核苷酸，我们发现其插入来自不同的慢性感染戊型肝炎病人的另一种基因型3毒株的HVR中，替代了p6克隆中的S17序列。虽然在该不同的基因型3毒株中携带S19序列的基因组已在HepG2/C3A细胞培养期间被选定，多为具有含S17的Kernow基因组，来自此基因型3毒株的该序列转移至Kernow毒株仅导致中度增强(图10D)。

P6编码可感染猪细胞和人细胞的病毒

用于转染的S10-3细胞和第6代病毒适应的HepG2/C3A细胞均为人肝癌细胞，因此确定p6病毒是否保留了原始粪便接种物的还能在猪细胞中生长的能力是重要的。将p6和p6del S17的转录物电穿孔至LLC-PK1猪肾细胞中，在5天后通过流式细胞术来测定该细胞。ORF2蛋白在两种构建体的猪细胞中产生，这证明负链基因组和亚基因组mRNA已被各自合成。31％以上的猪细胞被p6克隆转染，相比之下被缺少S17插入片段的p6克隆转染的猪细胞为12％，从而证明了S17序列增强了猪细胞的转染，如同其增强了人细胞的转染一样(图11A)。接着，测试p6病毒本身感染猪细胞的能力。将生长于HepG2/C3A细胞中的p6病毒的两个不同批次平行地在HepG2/C3A细胞和LLC-PK细胞上测滴度(图11B)。在两种情况中，猪细胞上比人细胞上的感染滴度高，但两种制备物的差别变化，并在第一种情况中达到了显著性(p＝0.0087)而在第二种中没有(p＝0.064)。然而，将LLP-CK细胞上的滴度除以HepG2/C3A细胞上的滴度的比值分别为2.4和1.5，其与之前报道的未克隆的第6代病毒准种的两种制备物的5.49和2.84的比值没有显著性差异。显然，p6 cDNA克隆编码了这样的病毒，该病毒能感染源于基因型3HEV的两大宿主种类每一类的培养细胞。

S17序列对基因型1毒株的作用

来自基因型1 cDNA克隆即Sar 55的转录物容易转染S10-3细胞，但使病毒适合在细胞培养物中生长的最初的实验失败了。先前的实验已证明在其HVR中包含来自p6病毒的S17序列的重组Sar55基因组(Sar 55/S17)能够转染S10-3细胞，但没有进行与缺少该插入片段的Sar55基因组的定量比较，因此，将Sar55和Sar55/S17转录物转染至S10-3细胞中，将该细胞在5天后接受流式细胞术，两组转录物产生的ORF2阳性细胞数量相似，表明S17序列既不增强也不减弱Sar55基因组在该系统中的转染效率(图12A)。

由于Kernow病毒之前已显示了这样多样化的宿主范围(参见，以上的实例)，测试p6转录物转染仓鼠BHK-21细胞的能力并发现其产生ORF2阳性细胞，虽然效率较低(BKH-21和S10-3分别为3.8％对比30.1％)。因此，还通过流式细胞术测试Sar 55和Sar55/S17转录物转染BHK-21细胞的能力，尽管考虑到基因型1病毒的有限的宿主宿主范围这些细胞是不可能的宿主。令人惊讶的是，不仅仓鼠细胞被Sar55基因组转染，转染细胞的数量通过S17插入片段的引入提高了近7倍(图12B，P<0.0001)。在独立的实验中，S17插入片段的转染的增强通过免疫荧光显微术来证实(数据未显示)。

P6编码能在HepG2/C3A细胞中生长并传播的病毒。由于p6 cDNA的基因组来源于适应在HepG2/C3A细胞中生长的病毒，通过该cDNA克隆编码的病毒预期能在这些细胞的培养物中有效地复制并传播：相比之下，涉及病毒运出中ORF3蛋白的之前的研究表明不能产生ORF3的p6病毒基因组可能与p6基因组转染一样多的细胞，但该病毒不会传播到其他细胞。将P6病毒基因组和p6/ORF3无效基因组电穿孔至HepG2/C3A细胞中并通过流式细胞仪监测病毒的产生和传播。p6病毒和ORF3无效突变体惊人地显示了相似的模式，并且两者在整个培养物中呈现有效地复制和传播：在两种情况下，ORF2蛋白阳性细胞的百分比从第5天的约15％增加至第14天的70％以上(图13)。独立的实验产生了相似的结果，在第5-15天，对于p6病毒而言，阳性细胞的百分比从12.4％(+/-1.96)增加至59.7％(+/-0.87)，对于ORF3无效突变体而言，阳性细胞的百分比从13.3％(+/-0.31)增加至67.8％(+/-5.57)。虽然这些结果证明p6克隆的确编码了适应细胞培养物的病毒，这两种病毒的细胞到细胞传播的相似水平令人费解，因为据报道有效的病毒运出需要有功能的ORF3蛋白(13，14)；在这些报道中，在不存在ORF3蛋白情况下的病毒释放仅为其存在时的约10％。通过RT-PCR从第9天的培养基中扩增的无效突变体基因组的ORF3区域的序列分析证实了，不存在甲硫氨酸密码子并且通过细胞免疫荧光显微术没有检测到ORF3蛋白(数据未显示)。然而，从两种培养物中的培养基进行的感染性空斑测定鉴定p6病毒的11630FFU/mL的平均值，并且ORF3无效突变体为两倍多的23200FFU/mL(数据未显示)。通过实时RT-PCR对培养基中病毒基因组数量的确定最多地揭示了：ORF3无效突变体释放至培养中的病毒基因组比p6病毒确实少大约1/10。每FFU病毒基因组的数量的计算表明ORF3无效突变体病毒的特定感染性比p6病毒本身的特定感染性高大约20倍。因此，由于缺少ORF3而导致的细胞运出的减少通过感染性的增加而抵消，从而使无效突变体能够与母本p6病毒同样有效的通过培养物传播。

总结-实施例3

构建适应在HepG2/C3A人肝癌细胞中生长的戊型性肝炎病毒的感染性cDNA克隆。该病毒是异常的，因为适应病毒的高变区中包含编码58个氨基酸的人S17核糖体蛋白的171个核苷酸的插入片段。来自6次连续传代的病毒的分析表明带有该插入片段的基因组在第一代期间就被选择了，这表明其赋予了明显的生长优势。来自该cDNA的RNA转录物和由它们编码的病毒可感染人和猪的细胞，其为该人畜共患病毒的主要宿主物种。诱变研究证明S17插入片段是细胞培养物适应的主要因素。54个同义突变引入至插入片段没有可检测的作用，因而暗示蛋白而非RNA，作为重要组分。插入片段截短50％使转染水平下降约1/3。通过不同的核糖体蛋白序列或通过GTP酶激活蛋白序列替代S17序列导致转染水平的局部增强，而用58个氨基酸的绿色荧光蛋白的替代没有影响。当插入基因型1毒株的高变区时所述S17序列没有影响人肝癌细胞的转染，但该嵌合基因组获得了在仓鼠细胞中复制的显著能力。

讨论-实施例1和2

Kernow-Cl毒株为在细胞培养物中生长的来自慢性感染患者的第一个HEV毒株；在其它独特的特征之中，其表现出了非常广泛的宿主范围。它不仅是被发现感染非灵长类物种的细胞的第一个HEV毒株，而且跨越动物的跨物种感染的范围与鸡和小鼠一样多样化是完全出乎意料的并且基于现有的知识未被预测到。值得注意的是所用病毒无一是已空斑纯化的，因此每种接种物都可能代表混合的群体；因此，感染灵长类动物细胞的病毒实质上可能与感染其他物种细胞的病毒不同。一旦构建了具有强大复制能力的感染性cDNA克隆，可研究生物多样性和细胞培养物获得的突变体的影响。

虽然第6代病毒产生足够的胞外病毒，从而允许进行之前不可能的实验，但细胞培养的HEV的低特异感染性施加一些困难。在细胞培养物中产生的基因型1(14)和基因型3(13)病毒与粪便中排出的那些病毒明显不同，在于它们包含ORF3蛋白并且其毒粒不被很容易沉淀粪便毒粒的抗ORF2抗体来沉淀。

基因型3病毒感染猪细胞比人细胞更有效的证明结果与相对于该基因型散发性的人感染的全球范围内已记录的广泛的猪感染是一致的(18)。基因型1和3毒株的相反取向的程度和一致性为本研究中人细胞对比猪细胞或鹿细胞提供了证据(图2)，表明本文所述的细胞培养系统可用于进一步研究影响跨物种HEV感染的那些因素。

没有解决如何调节ORF2蛋白相对于ORF3蛋白的产生的问题，但观察到鹿细胞中针对Sar-55 ORF2的产生的偏好及其在引入来自Kernow-C 1毒株的短5’RNA序列后的改善(图3B)，表明调节相隔很近的密码子的翻译可根据宿主种类而明显不同，并且这提供了一种限制宿主范围的机制。显而易见的是，ORF2衣壳蛋白合成的抑制危害到可感染其它细胞的毒粒装配的能力。

用于翻译起始的AUG密码子的选择根据Kozak定义的规则由位置和邻近该密码子的核苷酸来指导(23)。虽然基因型1和3的双顺反子mRNA具有相同的经典的Kozak序列，但基因型3的ORF3和ORF2的相关AUG密码子是比基因型1的ORF3和ORF2的相关AUG密码子更紧凑的三个核苷酸，并且已知密码子之间的距离能影响起始偏好。因此，AUG间距(其在基因型内是保守的)中的这种差异可能解释了基因型1和3在鹿细胞中不同的翻译模式。

在猪细胞中，没有观察到ORF2的差异化翻译并且Kernow-Cl(基因型3)和Sar-55(基因型1)似乎无论在人细胞还是在猪细胞中都有相似的两种蛋白的比值。然而，因为滴度测定基于可检测的ORF2的产生，相对于其他物种在一个物种中ORF2的低效基因型-特定性翻译可解释为什么Sar-55的滴度在猪细胞上始终低于人细胞并且对于Kernow-Cl刚好相反(图2)。

定性或者定量的受体差异性，为宿主范围的差异性提供了另一种解释。HEV的特异性受体尚未被鉴定。得益于受体决定的宿主范围，第6代病毒对猪细胞比人细胞保持了更高的滴度，尽管适应了在人细胞中的生长。Sar-55和Kernow-Cl衣壳蛋白之间有54个氨基酸的差异(8.2％)，而在粪便和第6代衣壳蛋白之间仅有5个氨基酸的差异，提示适应的病毒可能已保留了粪便病毒的受体相互作用特异性。

ORF3也是限制宿主范围的重要候选物。ORF3蛋白可能通过与一种或多种细胞蛋白的相互作用，为病毒运出所必需(13,14)。由于Sar-55和Kernow-Cl的ORF3蛋白相差17.5％(114个氨基酸中的20个)，Kernow-Cl但非Sar-55的ORF3可能能够有效地与参与病毒离开的猪细胞蛋白相互作用，因此，Sar-55的复制周期将被中止。

HEV的基因组间的重组和基因组内的重组罕有报道(24)。因此，相当值得注意的是，人RNA序列在第6代病毒中获得。由于具有该插入片段的基因组在粪便中被检测到，因此插入并非是细胞培养物的产物。

可通过实验截短但非消除Sar-55的HVR，表明该序列本身并不关键(22)。通过Pudupakam等(22)比较的HVR对应于Kernow-Cl ORFl的氨基酸706-792。所有毒株中大约涵盖ORFl的氨基酸215-957的HVR及周围区域没有确定的功能，并且其被简单地认定为HVR上游的Y和木瓜蛋白酶样结构域以及下游的脯氨酸铰链区和X结构域。因此，HVR内的插入预期并不能破坏任何功能。HVR并未被广泛表征，但一项比较(22)表明在每种基因型内，某些序列模式可为保守的；基因型1和3的HVR序列在该比较中基本上是不同的。与Sar-55的71个氨基酸相比，Kernow-Cl粪便共识序列包含86个氨基酸。然而，当存在S17插入片段时Kernow-Cl和构建的Sar-55嵌合体都是活的这一实施，证明该区域能够耐受大量变化。

Takahashi等最近表明，几乎具有高HEV滴度的任何血清都可感染培养的细胞(25)。RNA病毒作为准种存在，考虑到开发HEV的细胞培养系统中的巨大难度，似乎具有高滴度的样品具有增加的包含变体的可能性，所述变体具有允许培养细胞感染所需的一系列正确的突变。Kernow-Cl毒株感染来自如此广谱的物种(从啮齿动物到灵长类)的细胞的出色能力，最可能反映了在免疫功能低下的宿主中延长的感染期间产生的高滴度和复杂的准种：这种可能，连同HEV可通过与宿主细胞的序列重组获得新信息的证明结果一起，导致了患者的慢性HEV感染对于该“新兴病毒”的进化具有重要意义这样的结论。因此，在其成为慢性之前治愈HEV感染是可取的，不仅为患者的健康，也为未来对该病毒的控制。

讨论-实施例3

对于HEV研究，我们构建的感染性基因型3cDNA克隆提供了另外的工具。由于肝脏是该病毒的靶器官，故转染或感染人肝脏(HepG2/C3A)细胞并产生大量活病毒的能力可提供更可信的模型系统，其中重新审视许多已完好实施的研究，该研究产生了有趣的数据但受限于它们依赖于脱离实际的一种病毒蛋白的过表达。此外，p6病毒感染猪细胞的能力可证明鉴定将基因型1和2毒株的宿主范围限制至人和非人灵长类动物的参数是有用的。我们开发的荧光色素酶复制子应该对于一些研究特别有用，因为它允许方便的连续取样并且极其敏感：由于荧光色素酶基因位于亚基因组mRNA上，荧光色素酶的产生可作为亚基因组RNA的合成及稳定性的间接指标。这种新的模型系统已提供了第一手证据，之前未表征的X基因区具有病毒复制的功能，因为其中的三个突变非常有利于转染后感染状态的建立(图6和图8)。

HEV基因组中包含的人S17基因序列的发生完全出乎意料(实施例1)，这是特别令人惊讶的，因为首先其表明，病毒基因组已与宿主RNA重组，第二，该事件明显赋予了导致在细胞培养物中选择该极其微小的准种病毒的性能。这种情况随后用来自另一名慢性感染患者的基因型3毒株来重复(Nguyen et al,2012出版,J.General Virol.)，表明HEV的非常规重组未必是罕见事件。在本研究中，我们证明了该重组病毒早在细胞培养物的第一代时就出现了(表5)：其在之后的所有代次中均为显性，这强烈表明了其在细胞培养物适应中发挥了关键作用。感染性cDNA克隆的突变研究明确证明了该插入片段是使得有效的病毒能在细胞培养物中增殖的主要因素。逐步的克隆策略证实了除了S17插入片段之外的突变也有利于适应(图5)：因此，通过从终构建体中去除S17插入片段之后的点突变来发现转染增强的几乎完全消除是有意义的(图7)。一个可能的解释是插入的S17序列增强了RNA的稳定性/可翻译性或有利于ORF1蛋白的折叠/加工/稳定。HEV的蛋白水解加工的问题尚未得到解决。但是，由于将同义突变引入S17插入片段的24至32％的以核苷酸位置并不明显影响转染的水平(图9)，似乎病毒RNA不可能为重要因素，而是表明其作用处于蛋白水平。Pudupakam等的缺失实验显示，降低标准HVR的大小可降低HEV的毒力或减少其在细胞培养物中的复制。我们的基于S17插入片段截短50％的数据证明了插入片段的大小，以及因此HVR的大小有关系，但是替代GFP、GTP酶或S19基因片段的实验(图10的A、B、D)表明，插入片段和基因组本底的氨基酸组成有助于增强。该结论与当交换基因型1毒株的HVR和基因型3毒株的HVR时，显示体外复制减少的数据相一致。

S17序列增加了Sar55基因组在此类不太可能的物种例如仓鼠细胞中复制能力的事实，使人们推测新的综合征(例如最近与HEV感染相关的神经障碍)可反映由于HVR中的变化可导致感染新的细胞类型的能力。当然，这种可能性是值得探索的。

没有HEV重组和基因型间重组的记录罕有报道。回想起来，这可能反映了4种人基因型的不同的传播途径和固定的地理分布导致鲜有2种或更多种易区分的基因组的共感染；除非具体搜索，否则可能不会注意基因型内的重组。然而，我们对仅来自所检查的两名患者的HEV基因组中包含的三种不同的人序列的发现表明，HEV可能经历比所认识到的更频繁的重组。需要另外的研究以确定这些特定的核糖体蛋白基因的插入是偶然发生的，还是反映HEV复制的一些未知方面。

用人HepG2/C3A和猪LLC-PK1细胞的转染和感染实验证明了p6病毒保留了粪便病毒准种跨越物种界限的能力并展示了对猪细胞的偏爱，尽管在猪细胞上的较高滴度仅在一例中是统计学上显著的。相比之下，此前报道粪便接种物在猪细胞上的滴度比人细胞高至13倍，这表明可能有粪便准种的其它成员，这些成员具有对猪细胞感染有利或对人细胞感染有害的突变(图13)。是否受体或其他因素决定了宿主范围尚不得而知。p6克隆的病毒和粪便中病毒的共有序列之间，在衣壳蛋白中有四个氨基酸的差异，其可能影响受体的相互作用。四个突变中的两个还存在于代表HepG2/C3A细胞第一选择步骤的p1病毒克隆中，，所以值得关注的是，确定是否这些突变中的任一种回复至粪便中的共识序列将增加猪细胞上的相对滴度。

尽管p6病毒和ORF3无效病毒两者最终传播并感染了培养的大部分HepG2/C3A细胞，但是它们这样的过程相对缓慢并且直至7天后未感染细胞的比例尚未开始增加(图11)。相比之下，早在转染后1天就在培养基中检测到荧光色素酶表达(2163单位)并且到第2天已升高了38倍(图8A)。由于荧光色素酶从亚基因组mRNA中翻译，在该实验中病毒负链和亚基因组mRNA必须在第0-2天达到最大，这表明病毒RNA和/或蛋白的合成很可能不是限速的，而是装配、成熟和/或分泌负责感染性HIV毒粒相对较慢的产生。值得注意的是由于荧光色素酶构建体缺少衣壳基因，其不可传播，所以图8中的数据表明p6亚基因组mRNA的翻译在下降前的第7-8天持续处于峰值速率。

或许最使人困惑的结果是发现不可产生ORF3蛋白的病毒在培养物中如同能合成ORF3蛋白的病毒一样有效的传播。该结果带来的问题远多于答案。在特定感染性中观察到的差异提供了为何会发生这种情况的解释，但为何存在特定感染性差异的问题仍然存在。

材料与方法

来源患者

HEV颗粒纯化自慢性共感染HEV至少2年的一名48岁HIV感染男性的粪便(5)。就诊时，该患者已查明肝硬化并伴有活性炎症成分。此外，他具有周围神经病变的临床特征。这被认为是HEV相关的并发症，因为HEV在其CSF中被检出并且症状被病毒清除消除。获自该名患者的病毒株被命名为Kernow-Cl HEV(26)。

细胞培养

Huh-7人肝癌细胞最初在日本被分离出来(Nakabayashi et al，1982)。Huh-7细胞的亚克隆S10-3细胞和Caco-2细胞(HTB-37)的亚克隆C25j细胞在内部被分离出来。所有其他细胞系购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)并描述于补充方法中。大多数细胞系在补充了2mM的L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素(Sigma,St.Louis,MO)和10％胎牛血清(C25j为20％)(Bio-Whittaker,Walkersville,MD)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)(cellgro,Mediatech,Manassas,Va)中培养。鹿肝细胞和鸡肝细胞培养于补充了20％胎牛血清(Bio-Whittaker,Walkersville,MD)的Opti-MEM(Gibco)中。HepG2/C3A、C25j、鹿和鸡细胞生长于1型鼠尾胶原蛋白(Millipore)上。所有的细胞储存液均在存在5％CO₂的情况下在37℃下生长。

病毒储存液

所有病毒储存液，除第6代病毒之外，均由在PBS中的10％粪便悬浮液(pH 7.4)组成；RT-PCR滴度范围为10⁶-10⁸基因组当量/100μL，并且不能预测感染滴度。基因型1毒株Sar-55(GenBank M80581.1)和Akluj(GenBank AF 107909)分别分离自巴基斯坦和印度的患者。基因型3US-2毒株(GenBank AF060669)获自一名美国患者并在恒河猴中扩增。基因型3Kernow-Cl(“康沃尔(Cornwall)”古老的凯尔特语(Cornish))毒株获自如上所述的共感染HIV的慢期感染戊型肝炎患者。第6代病毒为通过连续传代适合在HepG2/C3A细胞中生长的Kernow-Cl粪便病毒。

质粒构建

HEV毒株Sar-55的感染性cDNA克隆、PSK-E2(GenBank登录号AF444002)和质粒CMV-Sar如上述(16,27)。质粒CMV-MT29通过将Sar-55亚基因组RNA的前29个核苷酸用质粒CMV-Sar中的Kernow-Cl HEV的前29个核苷酸替换来产生。质粒CMV-Kernow通过以下来构建：扩增粪便中Kernow-Cl病毒的整个双顺反子mRNA并将其克隆至pCMV5122中，如同Sar-55所进行的(16)。包含正向(Sar55-S17)、反向(Sar55-S17R)和反向互补(Sar55-S17RC)人S17基因序列的Sar-55cDNA克隆通过以下来构建：扩增来自第6代Kernow-C1病毒的人S17基因并将其通过融合PCR符合读框地插入PSK-E2的HVR区内的核苷酸2251-2252之间。感染性质粒pSK-E2-MT29通过将pSK-E2中Sar-55的双顺反子区的前29个核苷酸用Kernow-C1的前29个核苷酸替换来产生。

体外转录和培养细胞的转染

如之前所描述(27)和补充方法中所详细描述的，全长病毒cDNA用T7RNA聚合酶转录并将加帽的转录物用DMRIE-C(Invitrogen)转染至S10-3或鹿细胞中。LLC-PK1细胞通过所有尝试的转染方法都被杀死了。如补充方法中所描述的，利用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将CMV质粒转染至S10-3细胞和鹿细胞中。

培养细胞的感染

感染前一天，按100,000个细胞/孔接种于8孔Lab-Tek^TMII-CC^2TM载玻片(Nunc)上。将病毒储存液稀释于Opti-MEM(Gibco)中并将100μL稀释的病毒加入各孔中，并在CO₂培养箱中于34.5℃下在孵育5小时。移除病毒混合物，将细胞用PBS洗涤并加入培养基，接着在34.5℃下孵育3天。

免疫荧光分析和空斑形成测定

将8孔腔室玻片上的细胞用丙酮固定并用黑猩猩的抗-ORF2和兔抗-ORF3双染。如之前(28)和补充方法中所描述的，用荧光显微镜显现染色的细胞或空斑并手动计数。

用于ORF2蛋白和ORF3蛋白定量的流式细胞术分析

将在100mm平皿(Corning)中培养的转染细胞用胰蛋白酶消化并在4℃下用1mL甲醇固定15分钟。免疫染色与用于贴壁细胞的是相同的，除了单独等分的细胞对ORF2蛋白和ORF3蛋白进行染色。用PBS洗涤后，将细胞重新悬浮于1mL的PBS中并用FACScan流式细胞仪(Becton Dickinson)分析。每个样品共获取20,000个事件并将使用BD CellQuest^TM软件分析数据。

RT-PCR

RNA用Trizol LS(Invitrogen)提取，反转录并用Qiagen试剂盒扩增。将从琼脂糖凝胶洗脱的PCR产物直接测序以提供粪便和第6代共有序列，或者将PCR产物克隆，然后测序以提供代表性的HVR序列。详见补充方法。

生长曲线

将接种了10⁶HepG2/C3A细胞的T25烧瓶用1mL预先滴定的粪便病毒或经稀释含有与HepG2/C3A细胞大致相同的FFU的第6代病毒储存液接种。在实验结束时将各稀释接种物的等分试样冻于-80℃用于再次滴定。在37℃下孵育5小时后，去除培养基，将细胞用Optimem洗涤3次，加入含10％胎牛血清和抗生素的2.5mL DMEM中并在37℃下孵育烧瓶。收集培养基并在指定的时期用新鲜培养基替换。将收集的培养基滤过0.45μm滤器并在-80℃下按l00μL的等分试样冷冻。所有冷冻样品，包括接种物，按三等分在相同条件下平行处理以测定FFU和RNA的浓度：在同一测试中的直接比较表明粪便接种物包含22,000的FFU4，相比之下第6代病毒包含4200FFU。对第7天以后的值进行Wilcoxon测试。

统计

由国家过敏和传染病研究所生物统计研究科(Biostatistics Research Branchof the National Institute of Allergy and Infectious Diseases)的数理统计员进行统计。除生长曲线分析之外全部使用学生t-检验。

补充材料与方法

细胞：购自美国典型培养物保藏中心的细胞系是(人肝癌HepG2/C3A(CRL-10741)和PLC/PRF/5(CRL-8024)、人肺癌A549(CCL-185)、鹿肝OHH1.Li(CRL-6194)、猪肾LLC-PK1(CL-101)、LLC-P 1A(CL-101.1)和SK-RST(CRL-2842)、狗肾MDCK、(CCL-34)、猫肾CRFK(CCL-94)、兔肾LLC-RK1(CCL-106)、鸡肝LMH(CRL-2117)和小鼠肝Hepa 1-6(CRL-1830)。

体外转录和培养细胞的转染。将质粒PSK-E2在位于戊型肝炎病毒(HEV)的聚(A)尾下游的Bglll位点处线性化。如前所述的用T7Riboprobe体外转录系统(Promega)和Anti-Reverse Cap Analog(Ambion)来产生加帽的RNA转录物(Emerson，2001年，见上文)。对于S10-3或C25j细胞的转染，将40μl RNA转录混合物、1mL Opti-MEM(Gibco)和16μl DMRIE-C(Invitrogen)混合并加入六孔板的一个孔中。对具有高RNA转染效率的这些细胞系进行选择：C25j细胞产生最高水平的感染病毒，但其留在胞内并需要通过细胞裂解来收获。对于鹿细胞的转染，将体外转录的RNA用RNeasy试剂盒(Qiagen)按照制造商的方案进行纯化。将纯化的RNA(2.5μg)稀释于500μL Opti-MEM(Gibco)中，逐滴加入含有500μLOpti-MEM(Gibco)和5μL Lipofectamine 2000(Invitrogen)的混合物中，并在室温下孵育20分钟，然后加入六孔板的一个孔中。在转染混合物在34.5℃下在CO₂培养箱中孵育5小时后，将转染混合物更换培养基替换，并继续在34.5℃下孵育。LLC-PK1细胞被所有尝试的转染方法杀死。对于质粒DNA的转染，S10-3和/或鹿细胞生长于六孔板上并如上所述用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染2μg DNA。S10-3细胞和/或鹿细胞的DNA转染在37℃的CO₂培养箱下进行6小时。在将转染混合物更换培养基后，在37℃下继续孵育。

电穿孔，HepG2/C3A细胞和LLC-PK1细胞被DMRIE杀死，因此利用设置在240伏和950电容的BioRad Gene Pulser II和BioRad比色杯#165-2086通过电穿孔来转染这些细胞。RNA转录物用TRIzol LS(Invitrogen)从100μL转录混合物中提取，用异丙醇沉淀，用75％乙醇洗涤并重新悬浮于50μL水中。将100mm平皿中汇合的单层细胞用胰蛋白酶/EDTA分离，用等体积的含1％结晶牛血清白蛋白的PBS混合并在40℃下于1600RPM沉淀5分钟。将细胞重新悬浮于400μL Optimum中，与RNA混合，脉冲并加入包含20％胎牛血清的培养基。将细胞置于平板或烧瓶中并在37℃(HepG2/C3A)或34.50℃下过夜孵育；在已电穿孔的HepG2/C3A细胞的T25烧瓶中补充来自一T25烧瓶未处理细胞的四分之一，以提供足够促进生长的培养密度。次日早上，将培养基用含10％血清的新鲜培养基更换并继续培养。

免疫荧光分析和空斑形成测定。将玻片上的转染或感染的细胞，用PBS洗涤并用丙酮固定和透化。ORF2蛋白和ORF3蛋白通过以下来检测：将固定的细胞与来自HEV感染的黑猩猩的HEV ORF2的特异性超免疫血浆(Chi 313)(Emerson，2004，同上)和兔抗ORF3肽抗体(Emerson，2004，同上)的混合物在室温下孵育45分钟。(将黑猩猩的血浆预吸附在各个细胞系上以尽量使背景染色最小化)。在用PBS洗涤后，将细胞与Alexa Fluor 488山羊抗人IgG(Molecular Probes)和Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG(Molecular Probes)的混合物在室温下孵育30分钟。用PBS洗涤后，加入含DAPI(Vector Laboratories)的Vectashield封片介质，用Zeiss Axioscope 2Plus荧光显微镜在40倍放大倍数下观察细胞。通过手动对阳性细胞或空斑进行计数。

用野生型和突变的cDNA克隆对S10-3和鹿细胞进行转染。转染前一天将S10-3和鹿细胞接种于6孔板中并在约70-80％汇合度时转染。每板的3个孔用Sar-55的野生型感染性cDNA(pSKE2)或突变体转染，在该突变体中pSK-E2双顺反子区域的前29个核苷酸被Kernow-C1的前29个核苷酸替换(pSK-E2-MT29)。对于转染的S10-3细胞中HEV蛋白的FACS分析，每孔中的细胞用胰蛋白酶消化并转移至单独的管中。ORF2蛋白和ORF3蛋白的免疫染色和FASC分析如材料和方法中所述的来进行。对于第5天的鹿细胞的免疫染色，将每孔中的细胞在第4天用胰蛋白酶消化，根据代码转移至八孔腔室玻片的单独的孔中，并在第5天进行免疫染色。在代码被破坏前将所有ORF2和ORF3染色的细胞进行手动计数。

RT-PCR。RNA用Trizol LS(Invitrogen)提取。对于粪便和第6代病毒的共有序列，将RNA用Superscript II RNase H反转录酶(Invitrogen)反转录并通常用QiagenLongRange PCR试剂盒扩增；将比较麻烦的富含C的区域用Qiagen LongRange 2步RT-PCR试剂盒扩增。产物在琼脂糖凝胶上电泳、洗脱并直接测序。高变区(HVR)用Qiagen LongRange2步RT-PCR试剂盒通过巢式RT-PCR进行扩增。用于检测174个碱基的插入片段的四个引物组的每一对包括与HEV序列匹配的一条引物以及与该插入序列匹配的一条引物。电泳后，将产物直接测序。用于扩增整个HVR的嵌套引物组与HVR任一侧的HEV序列匹配。将可见的产物和正好在该产物上方和下方的区域从琼脂糖凝胶中洗脱并用Zero Blunt TOPO PCR克隆试剂盒(Invitrogen)克隆，对120个独立的集落进行测序。将培养基中的RNA基因组通过实时RT-PCR(TaqMan)来定量。

尽管已通过阐述和实例的方式，出于精晰理解的目的详细地描述了之前的发明，但是显而易见的是本领域的技术人员鉴于本发明的教导，在不背离附加的权利要求的精神或范围的情况下可作出某些改变和修改。

本说明书中引用的所有出版物、登陆号、专利和专利申请通过引用并入到本文中，其程度如同明确且单独地指出将每一篇通过引用并入。

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表1.转染了野生型和突变的cDNA克隆的感染性转录物的鹿细胞中ORF2蛋白和ORF3蛋白的产生情况。

1.这些培养物用每种病毒基因组转染。

2.HEV毒株Sar-55的感染性cDNA克隆。

3.HEV的感染性cDNA克隆，其中pSK-E2中的Sar-55双顺反子区的前29个核苷酸被Kernow-C1的前29个核苷酸替代。

4.将转染的细胞在代码下转移至8孔腔室玻片中，在第5天免疫染色并将各孔中所有的ORF2-和ORF3-阳性的细胞在代码破坏前计数。

表2.用野生型和突变的cDNA克隆的感染性转录物转染后S10-3细胞中ORF2蛋白和ORF3蛋白的FACS分析。

5.三种培养物用每种病毒基因组转染。

6.HEV毒株Sar-55的感染性cDNA克隆。

7.HEV的感染性cDNA克隆，其中pSK-E2中的Sar-55双顺反子区的前29个核苷酸被Kernow-C1的前29个核苷酸替代。

8.细胞在转染后第5天对ORF2蛋白和ORF3蛋白免疫染色。

9.对所示病毒蛋白染色的细胞的百分比。

表4.粪便中的病毒与在HepG2/C3A细胞中传代6次的病毒的共有序列的比较情况¹。

1.未列出：具有37/44U/C或C/U的44个散乱的沉默突变

2.基于粪便病毒的序列的位置；插入片段未编号

3.粪便病毒的核苷酸或氨基酸之后为第6代病毒中的核苷酸或氨基酸

4.高变区

5. 3’非编码区

表5.来自每次传代水平的HVR克隆的比较情况。

克隆的数量

传代(克隆数)	S171	GTP酶2	缺失(nt数)3
				1(11)	2	5	1(171)4；1(612；2(501)
2(10)	9	0	1(738)
				3(8)	8	0	0
4(10)	8	0	2(435)5
				5(8)	8	0	0
6(11)	10	0	1(381)

¹具有编码58个氨基酸的S17插入片段的克隆的数量

²包含114nt的GFP酶但缺失S17的克隆的数量

³相对于第6代但包含S17插入片段的缺失

⁴缺少缺失和S17插入片段

⁵具有去除S17的3'45nt的缺失的两个相同的克隆

表6:通过于第6代病毒交换片段而对第1代Kernow病毒的逐步修饰

¹括号表示突变[第1代/第6代]:大写字母＝氨基酸，小写字母＝核苷酸

²下划线表示ORF2中的氨基酸突变

³聚腺苷段的长度

表7.粪便病毒共有序列与传代病毒共有序列的比较情况

¹依照不含S17插入片段的粪便病毒编号[GenBank HQ389543]..

²点突变为大写字母，邻接的氨基酸小写字母。数字表示的大写字母的氨基酸的氨基酸位置。

³每病毒列的字母表示该位置上存在的氨基酸。

⁴斜线表示混合物。

序列表

SEQ ID NO:l HEV Kernow基因型3复制型变体

SEQ ID NO:2"ORF1"氨基酸序列；下划线区域为高变区中的插入片段

/codon_start＝1

/product＝"non-structural protein"

/protein_id＝”ADV71352.1"

/db_xref＝"GI:319748766"

MEAHQFIKAPGITTAIEQAALAAANSALANAVVVRPFLSRLQTE

ILINLMQPRQLVFRPEVLWNHPIQRVIHNELEQYCRARAGRCLEVGAHPRSINDNPNVLHRCFLRPVGRDVQRWYSAPTRGPAANCRRSALRGLPPVDRTYCFDGFSRCAFAAETGVALYSLHDLWPADVAEAMARHGMTRLYAALHLPPEVLLPPGTYHTTSYLLIHDGDRAVVTYEGDTSAGYNHDVSILRAWIRTTKIVGDHPLVIERVRAIGCHFVLLLTAAPEPSPMPYVPYPRSTEVYVRSIFGPGGSPSLFPSACSTKSTFHAVPVHIWDRLMLFGATLDDQAFCCSRLMTYLRGISYKVTVGALVANEGWNASEDALTAVITAAYLTICHQRYLRTQAISKGMRRLEVEHAQKFITRLYSWLFEKSGRDYIPGRQLQFYAQCRRWLSAGFHLDPRVLVFDESVPCRCRTFLKKVAGKFCCFMRWLGQECTCFLEPAEGLVGDHGHDNEAYEGSEVDQAEPAHLDVSGTYAVHGHQLVALYRALNVPHDIAARASRLTATVELVAGPDRLECRTVLGNKTFRTTVVDGAHLEANGPEQYVLSFDASRQSMGAGSHNLTYELTPAGLQVRISSNGLDCTATFPPGGAPSAAPGEVAAFCAALYRYNRFTQRHSLTGGLWLHPEGLLGIFPPFSPGHIWESANPFCGEGTLYTRTWSTSGFSSDFSPPEAAAPASAAAPGLPHPTPPASDIWALPPPSEECYTRLGNDFHTNKRVCEEIAIIPSKKPRNKMAGYVTHLMKRIQRGPVRGISIKLQEE AQVDAASVPLTLVPAGSPSPVVSPSPPPPPPVRKPSTPPPSRTRRLLYTYPDGAKVYAGSLFESDCDWLVNASNPGHRPGGGLCHAFHQRFPEAFYPTEFIMREGLAAYTLTPRPIIHAVAPDYRVEQNPKRLEAAYRETCSRRGTAAYPLLGSGIYQVPVSLSFDAWERNHRPGDELYLTEPAAAWFEANKPAQPALTITEDTARTASLALEIDAATEVGRACAGCTISPGIVHYQFTAGVPGSGKSRSIXQGDVDVVVVPTRELRNSWRRRGFAAFTPHTAARVTNGRRVVIDEAPSLPPHLLLLHMQRASSVHLLGDPNQIPAIDFEHAGLVPAIRPELAPTSWWHVTHRCPADVCELIRGAYPKIQTTSRVLRSLFWNEPAIGQKLVFTQAAKAANPGAITVHEAQGATFTETTVIATADARGLIQSSRAHAIVALTRHTEKCVILDAPGLLREVGISDVIVNNFFLAGGEVGHHRPSVIPRGNPDQNLGTLQAFPPSCQISAYHQLAEELGHRPAPVAAVLPPCPELEQGLLYMPQELTVSDSVLVFELTDIVHCRMAAPSQRKAVLSTLVGRYGRRTKLYEAAHSDVRESLARFIPTIGPVQATTCELYELVEAMVEKGQDGSAVLELDLCNRDVSRITFFQKDCNKFTTGETIAHGKVGQGISAWSKTFCALFGPWFRAIEKEILALLPPNVFYGDAYEESVLAAAVSGAGSCMVFENDFSEFDSTQNNFSLGLECVVMEECGMPQWLIRLYHLVRSAWILQAPKESLKGFWKKHSGEPGTLLWNTVWNMAIIAHCYEFRDFRVAAFKGDDSVVLCSDYRQSRNAAALIAGCGLKLKVDYRPIGLYAGVVVAPGLGTLPDVVRFAGRLSEKNWGPGPERAEQLRLAVCDFLRGLTNVAQVCVDVVSRVYGVSPGLVHNLIGMLQTIADGKAHFTETIKPVLDLTNSIIQRVE

SEQ ID NO:3 ORF3 CDS:5348..5689

/codon_start＝1

/product＝"viral protein"

/protein_id＝"AD71353.1"

/db_xref＝"GI:319748767"

MGSPCALGLFCCCSSCFCLCCPRHRPASRLAVVVGGAAAVPAVV

SGVTGLILSPSPSPIFIQPTPSPPISFHNPGLELALGSRPAPLAPLGVTSPSAPPLPPAVDLPQLGLRR

SEQ ID NO:4 ORF2 CDS:5359..7341

/codon_start＝1

/product＝"capsid protein"

/protein_id＝"ADV71354.1"

/db_xref＝"GI:319748768"

MCPRVVLLLFFVFLPMLPAPPAGQPSGRRRGRRSGGAGGGFWGD

RVDSQPFALPYIHPTNPFAADIVSQSGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSAAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQATYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTRAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKTEVGKTRES

SEQ ID NO:5 Kernow C1 HEV核酸序列

SEQ ID NO:6 Kernow C1 ORF1 CDS:27.5153

/codon_start＝1

/product＝"polyprotein"

/protein_id＝"ADV92628.1"

/db_xref＝"GI:320005195"

MEAHQFIKAPGITTAIEQAALAAANSALANAVVVRPFLSRLQTE

ILINLMQPRQLVFRPEVLWNHPIQRVIHNELEQYCRARAGRCLEVGAHPRSINDNPNVLHRCFLRPVGRDVQRWYSAPTRGPAANCRRSALRGLPPVDRTYCFDGFSRCAFAAETGVALYSLHDLWPADVAEAMARHGMTRLYAALHLPPEVLLPPGTYHTTSYLLIHDGDRAVVTYEGDTSAGYNHDVSILRAWIRTTKIVGDHPLVIERVRAIGCHFVLLLTAAPEPSPMPYVPYPRSTEVYVRSIFGPGGSPSLFPSACSTKSTFHAVPVHIWDRLMLFGATLDDQAFCCSRLMTYLRGISYKVTVGALVANEGWNASEDALTAVITAAYLTICHQRYLRTQAISKGMRRLEVEHAQKFITRLYSWLFEKSGRDYIPGRQLQFYAQCRRWLSAGFHLDPRVLVFDESVPCRCRTFLKKVAGKFCCFMRWLGQECTCFLEPAEGLVGDHGHDNEAYEGSEVDQAEPAHLDVSGTYAVHGHQLVALYRALNVPHDIAARASRLTATVELVAGPDRLECRTVLGNKTFRTTVVDGAHLEANGPEQYVLSFDASRQSMGAGSHNLTYELTPAGLQVRISSNGLDCTATFPPGGAPSAAPGEVAAFCGALYRYNRFTQRHSLTGGLWLHPEGLLGIFPPFSPGHIWESANPFCGEGTLYTRTWSTSGFSSDFSPPEAAAPASAAAPG LPHPTPPVSDIWALPPPSEESQVDAASVPLTLVPAGSPNPIVLPXPPPPPPVRKPSTPPPSRTRRLLYTYPDGAKVYAGSLFESDCDWLVNASNPGHRPGGGLCHAFHQRFPEAFYWTEFIMREGLAAYTLTPRPIIHAVAPDYRVEQNPKRLEAAYRETCSRRGTAAYPLLGSGIYQVPVSLSFDAWERNHRPGDELYLTEPAAAWFEANKPAQPALTITEDTARTANLALEIDAATEVGRACAGCTISPGIVHYQFTAGVPGSGKSRSIQQGDVDVVVVPTRELRNSWRRRGFAAFTPHTAARVTNGRRVVIDEAPSLPPHLLLLHMQRASSVHLLGDPNQIPAIDFEHAGLVPAIRPELAPTSWWHVTHRCPADVCELIRGAYPKIQTTSRVLRSLFWNEPAIGQKLVFTQAAKAANPGAITVHEAQGATFTETTVIATADARGLIQSSRAHAIVALTRHTEKCVILDAPGLLREVGISDVIVNNFFLAGGEVGHHRPSVIPRGNPDQNLGTLQAFPPSCQISAYHQLAEELGHRPAPVAAVLPPCPELEQGLLYMPQELTVSDSVLVFELTDIVHCRMAAPSQRKAVLSTLVGRYGRRTKLYEAAHSDVRESLARFIPTIGPVQATTCELYELVEAMVEKGQDGSAVLELDLCNRDVSRITFFQKDCNKFTTGETIAHGKVGQGISAWSKTFCALFGPWFRAIEKEILALLPPNVFYGDAYEESVFAAAVSGAGSCMVFENDFSEFDSTQNNFSLGLECVVMEECGMPQWLIRLYHLVRSAWILQAPKESLKGFWKKHSGEPGTLLWNTVWNMAIIAHCYEFRDFRVAAFKGDDSVVLCSDYRQSRNAAALIAGCGLKLKVDYRPIGLYAGVVVAPGLGTLPDVVRFAGRLSEKNWGPGPERAEQLRLAVCDFLRGLTNVAQVCVDVVSRVYGVSPGLVHNLIGMLQTIADGKAHFTETIKPVLDLTNSIIQRVE

SEQ ID NO:7:Kernow C1 HEV ORF3 CDS:5177..5518

/codon_start＝1

/product＝"unknown"

/protein_id＝"ADV92630.1"

/db_xref＝"GI:320005197"

MGSPCALGLFCCCSSCFCLCCPRHRPASRLAVVVGGAAAVPAVV

SGVTGLILSPSPSPIFIQPTPSPPMSFHNPGLELALGSRPAPLAPLGVXSPSAPPLPPAVDLPQLGLRR

SEQ ID NO:8:Kernow C1 HEV ORF2 CDS:5188..7170

/codon_start＝1

/product＝"capsid protein"

/protein_id＝"ADV92629.1"

/db_xref＝"GI:320005196"

MRPRVVLLLFFVFLPMLPAPPAGQPSGRRRGRRSGGAGGGFWGD

RVDSQPFALPYIHPTNPFAADVVSQSGAGTRPRQPPRPLGSAWRDQSQRPSAAPRRRSAPAGAAPLTAVSPAPDTAPVPDVDSRGAILRRQYNLSTSPLTSSVASGTNLVLYAAPLNPLLPLQDGTNTHIMATEASNYAQYRVVRATIRYRPLVPNAVGGYAISISFWPQTTTTPTSVDMNSITSTDVRILVQPGIASELVIPSERLHYRNQGWRSVETTGVAEEEATSGLVMLCIHGSPVNSYTNTPYTGALGLLDFALELEFRNLTPGNTNTRVSRYTSTARHRLRRGADGTAELTTTAATRFMKDLHFTGTNGVGEVGRGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENAQQDKGITIPHDIDLGDSRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQAVARSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRGKLSFWEAGTTRAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVAISTYTTSLGAGPTSISAVGVLAPHSALAVLEDTVDYPARAHTFDDFCPECRTLGLQGCAFQSTIAELQRLKMKVGKTRES

SEQ ID NO:9 HEV Kernow基因型3复制型变体中存在的ORF1插入片段

CYTRLGNDFHTNKRVCEEIAIIPSKKPRNKMAGYVTHLMKRIQRGPVRGISIKLQEEA

SEQ ID NO:10编码HEV Kernow基因型复制型变体中另外的插入片段的核酸

TGATATTTGGGCGTTACCACCGCCCTCCGAGGAGG--------TAAAAGACAAAGATGATCTGGGGCCTGACAGATTCTCAACACTCCCAGCCCTAGACTCAGTGCGCAAGCTCAGGTGG CTGAGGATATTACCATTTAGAAAGAAAGGAAAACAAG-----AGCAGGTCGATGCAGCATCTGTGCCCCTTACC

Claims (16)

1.感染性戊型肝炎病毒(HEV)基因型3cDNA克隆，其中所述感染性克隆相对于SEQ IDNO:5所示的HEV核酸序列，在编码ORF1高变区的核酸序列区域中包含插入片段，并且其中所述插入片段编码长度为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57个氨基酸的SEQ ID NO:9区段的符合读框的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的感染性HEV基因型3cDNA克隆，其中由所述插入片段编码的符合读框的氨基酸序列为SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

3.如权利要求1或2所述的感染性HEV基因型3cDNA克隆，其中所述插入片段位于ORF1的高变区中，使得由所述插入片段编码的第一个氨基酸出现在相对于SEQ ID NO:6的第750位。

4.如权利要求1所述的HEV基因型3cDNA克隆，其中所述cDNA克隆的核酸序列为SEQ IDNO:1的核酸序列。

5.感染性戊型肝炎病毒(HEV)基因型3cDNA克隆，其中所述cDNA克隆相对于SEQ ID NO:5所示的HEV核酸序列，在编码ORF1高变区的核酸序列区域中包含插入片段，其中所述插入片段的序列如下：

TAAAAGACAAAGATGATCTGGGGCCTGACAGATTCTCAACACTCCCAGCCCTAGACTCAGTGCGCAAGCTCAGGTGGCTGAGGATATTACCATTTAGAAAGAAAGGAAAACAAG。

6.包含戊型肝炎病毒(HEV)基因型3或基因型1的核酸序列的感染性cDNA克隆，其中所述感染性克隆在编码ORF1高变区的核酸序列区域中包含插入片段，并且其中所述插入片段编码长度为40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56或57个氨基酸的SEQID NO:9区段的符合读框的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的感染性cDNA克隆，其中由所述插入片段编码的符合读框的氨基酸序列为SEQ ID NO:9的氨基酸序列。

8.细胞培养系统，其包含含有权利要求1-4中任一项所述的cDNA克隆的细胞，其中所述细胞为人细胞、猪细胞或非人灵长类动物细胞。

9.如权利要求8所述的细胞培养系统，其中所述细胞为肝细胞、肾细胞或肺细胞。

10.产生疫苗的方法，所述方法包括将获自权利要求1-4中任一项所述的cDNA克隆的RNA引入细胞中并获得由所述RNA产生的病毒。

11.如权利要求10所述的方法，其中将所述RNA作为病毒颗粒引入细胞中。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述细胞为MRC 5肺细胞。

13.产生疫苗的方法，所述方法包括：

将获自权利要求1-4中任一项所述的cDNA克隆的RNA引入人细胞系中，其中所述RNA不能产生ORF3；以及

得到由所述RNA产生的病毒。

14.非诊断目的地评价进行了病毒处理过程的目标产品的病毒状况的方法，所述方法包括：

将利用权利要求1-7中任一项所述的cDNA克隆产生的HEV病毒加入所述产品中；

将所述产品进行能去除和/或灭活所述产品中存在的病毒的病毒处理过程；以及

在所述病毒处理过程之后或期间测定产品中残留的所加病毒的水平。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述目标产品为水、血液或动物食用的饲料。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述目标产品为人食用的食品。