CN107164409B - 犬瘟热病毒敏感细胞系slam-mdck及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM‑MDCK及其构建方法和应用。本发明通过将犬源信号淋巴激活分子(SLAM)通过逆转录病毒载体构建到MDCK细胞中，构建了稳定表达犬SLAM基因的MDCK细胞SLAM‑MDCK。犬瘟热病毒感染SLAM‑MDCK细胞系后，产生的病变快、增殖滴度高，适合犬瘟热病毒的分离和培养。因此，该细胞系在犬瘟热病毒的分离、感染犬瘟热的确诊、以及犬瘟热病毒疫苗的研制和生产中具有重要意义。

Description

犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK及其构建方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞系领域，具体地指一种犬瘟热病毒敏感细胞系 SLAM-MDCK及其构建方法和应用。
背景技术
犬瘟热(Canine distemper，CD)是由副粘病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)感染犬所引起的急性、热性及高度接触性的一种烈性传染病。主要临床特征是双相热，眼、鼻、消化道等处粘膜炎症，以及卡他性肺炎、皮炎及神经症状。自1809年首次报道以来，该病呈现了全球范围内流行的趋势，给伴侣动物与野生动物造成了严重影响。CDV分为亚洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亚洲Ⅱ型(Asia-Ⅱ)、欧洲型(Europe)、美洲Ⅱ型(America-Ⅱ)、北极型(Arctic)和疫苗型(Vaccine)6个不同的基因型，但公认只有一个血清型。
CDV的自然感染宿主十分广泛，并且呈现不断扩大的趋势。已由传统的犬科、鼬科及浣熊科扩展到了食肉目的所有8个科，以及偶蹄目猪科、灵长目的猕猴属和鳍足目海豹科等多种动物。
病毒的分离鉴定对于疫病的确诊以及掌握病毒的变异和流行情况具有非常重要的意义。虽然CDV具有囊膜，但结构易脆，对环境的抵抗力非常弱，易被光和热灭活，对乙醚、氯仿、甲醛等有机溶剂敏感，导致分离CDV的成功率很低。目前该病毒的分离多采用犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)及绒猴淋巴细胞系(B95 α)等传代细胞系。使用MDCK分离野毒株时病毒所形成的细胞病变不明显且形成时间较长，而Vero分离病毒的成功率不高且会导致病毒毒力下降。B95α虽然分离的成功率较高，但利用其分离到的病毒株具有利用人源及绒猴源SLAM(Signaling lymphocytic activation molecμLe,信号淋巴激活分子)受体侵入机体造成生物安全的隐患。因此建立能用于分离与增殖CDV的敏感细胞系，在CDV的确诊、疫苗研制以及致病机制研究中具有重要意义。正因如此，对细胞进行改造，使其适应病毒增殖，一直以来是CDV分离鉴定工作中亟待解决的问题。
Tatsuo等(2001)证实CDV可利用犬信号淋巴细胞激活分子 SLAM(又称CD150)作为感染宿主动物的细胞受体。在此基础上，赵建军等(2010)分别克隆了犬瘟热易感动物—狐狸、貉和水貂的 SLAM基因，并证实该3种SLAM可分别作为CDV感染宿主动物的细胞受体。因此，2010年，高玉伟等通过构建通过质粒转染的方式，证实了表达SLAM的Vero细胞，可在感染后36-48h就能出现CPE，但该细胞存在质粒易丢失以及传代不稳定等不足。2012年，姜骞等采用了慢病毒四质粒包装系统获得一株表达犬源SLAM的稳定细胞系MDCK-CSL，该细胞系将SLAM基因整合到MDCK细胞的基因组上，从而克服了高学伟等所建立的的细胞系质粒容易丢失的问题，且将接毒后CPE的时间缩短到24h。但姜骞等所构建的病毒系统基于 HIV的骨架，且需要3-4个质粒共转染，方法较为复杂，对实验室要求也较高。而本发明提供的一种基于逆转录病毒载体的构建方式，只需要2种质粒，而且操作简便，所构建的细胞系可以稳定遗传，安全性好、而且具有CDV病毒病变快、增殖滴度高，适合CDV病毒的分离和培养的特点。这在CDV的确诊、CDV疫苗的研制和生产中具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供了一种犬瘟热病毒敏感细胞系 SLAM-MDCK及其构建方法和应用。通过逆转录病毒载体构建稳定表达犬源信号淋巴激活分子(SLAM)基因、更适合CDV分离和增殖的MDCK细胞系。其为CDV的分离、疫病的确诊、疫苗毒株的培养和增殖提供更适合的细胞系。逆转录病毒载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因的效果，而且该病毒载体由于不含有病毒组装和增殖的元件而不能重新组装成病毒，因此具有很好的安全性，已广泛应用于稳定表达细胞系的构建以及基因治疗等研究中。
为实现上述目的，本发明重组了一种逆转录病毒重组质粒 pRetroX-SLAM，所述SLAM基因通过BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ酶切位点替换逆转录病毒载体pRetroX-Tet3G的tet3G基因，其中，所述SLAM 基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种上述逆转录病毒重组载体pRetroX-SLAM 的制备方法，包括以下步骤：
1)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板设计引物对，且引物上加有BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ和保护碱基；
SLAM-P1:
5’-AACGGATCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTTC-3’；
SLAM-P2:
5’-AGAGGGGCGGAATTCTTAGCTCTCTGGGAACGCAC-3’；
2)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板进行PCR，得到 PCR产物；
3)用BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用BamHI和EcoRI将逆转录病毒载体pRetroX-Tet3G进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收pRetroX大片段；
4)将回收的pRetroX大片段和回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，将筛选得到的阳性克隆质粒用BamHI、EcoRI进行酶切验证，获得逆转录病毒重组载体pRetroX-SLAM。
作为优选方案，所述步骤2)中，PCR反应体系为：
Figure BDA0001271433100000041
反应程序：
98℃10min，98℃10s；56℃30s；72℃1min 30Cycle，72℃ 10min。
本发明还提供了一种犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK，所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK基因组中含有权利1所述逆转录病毒载体pRetroX-SLAM基因组其中5，LTR至3，LTR的核苷酸序列，所述5，LTR至3，LTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
上述所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK的制备方法，包括以下步骤：
1)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板设计引物对，且引物上加有BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ和保护碱基；
SLAM-P1:
5’-AACGGATCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTTC-3’；
SLAM-P2:
5’-AGAGGGGCGGAATTCTTAGCTCTCTGGGAACGCAC-3’；
2)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板进行PCR，得到 PCR产物；
3)用BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用BamHI和EcoRI将逆转录病毒载体pRetroX-Tet3G进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收pRetroX大片段；
4)将回收的pRetroX大片段和回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，得到pRetroX-SLAM；
5)将构建的质粒pRetro-SLAM和包膜质粒pVSV-G混合后，转染GP2-293细胞，培养得到包装好的SLAM逆转录病毒；
6)将制备的SLAM逆转录病毒与无血清的DMEM培养基混合均匀，感染生长状态良好的MDCK细胞，然后用含有G418的DMEM 培养基进行筛选，纯化得到目的细胞，即为犬瘟热病毒敏感细胞系 SLAM-MDCK。
作为优选方案，所述步骤2)中，PCR反应体系为：
Figure BDA0001271433100000061
反应程序：
98℃10min，98℃10s；56℃30s；72℃1min 30Cycle，72℃ 10min。
作为优选方案，所述步骤5)的具体步骤如下：
将GP2-293细胞均匀的铺于6孔细胞板中，当GP2-293细胞密度达到70-80％时转染：将培养基弃掉，加入1.5ml无血清的Opti-MEM 培养基，将2μg质粒pRetro-SLAM和2μg包膜质粒pVSV-G混匀后，再与8μL Lipofectamine2000混匀，接入到GP2-293细胞中；培养48h，收集细胞上清500g，离心10min，收集上清，即为包装好的SLAM 逆转录病毒。
作为优选方案，所述步骤6)的具体步骤如下：
1)将生长状态良好的MDCK细胞，均匀的铺于6孔细胞培养板 12小时后，弃上清；将制备的逆转录病毒1mL与无血清的DMEM 培养基1mL轻轻混匀后，加入到6孔细胞培养板中，感染24h后，弃上清；将细胞用300μL胰蛋白酶消化处理，用10％FBS的DMEM 重悬MDCK细胞，将MDCK细胞均匀铺于10mm的细胞培养皿中，置37℃，5％CO2培养箱中培养。培养24h后，弃掉旧的培养基，更换10％FBS的DMEM培养基，同时加终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，与此同时加入一组没有用逆转录病毒感染的MDCK细胞作为对照；
2)7天后待感染组细胞长满，同时对照组细胞已经全部死亡，将感染组细胞一传十，继续用终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，挑选单集落细胞扩大培养，并再次使用G418筛选，连续筛3代，纯化出目的细胞，即为犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK。
本发明还提供了一种上述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK 在CDV病毒的分离和培养、CDV疫苗的研制和生产中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明针对传统的MDCK、Vero等细胞系分离CDV病毒时效率低且不稳定的特点，以及基于慢病毒构建的表达SLAM的细胞系程序复杂等特点，构建了基于逆转录病毒体系的稳定表达SLAM的 MDCK细胞系。该细胞系构建时只需要2种质粒，而且操作简便，所构建的细胞系可以稳定遗传，安全性好、而且具有CDV病毒病变快、增殖滴度高、更适合CDV病毒增殖等特点。这在CDV的确诊、 CDV疫苗的研制和生产中具有重要意义。
附图说明
图1为pRetroX-Tet 3G图谱；
图2为pVSV-G质粒图谱；
图3为pRetroX-SLAM质粒酶切和PCR鉴定图；
图中，第1、2、3、4泳道为酶切鉴定，两条酶切目的条带的大小分别为7377bp和1024bp，第5、6、7、8泳道为PCR鉴定，目的条带的大小为1024bp，第9泳道为空白对照，Maker：DL5000。
图4为提取无内毒素pRetroX-SLAM质粒和酶切鉴定图，
图中，第1、2泳道为第一批质粒，第3、4泳道为第二批质粒，第1、3泳道是质粒鉴定，条带大小为8401bp第2、4泳道是酶切鉴定，条带大小分别为1024bp与7377bp，Maker：DL5000。
图5为1000μg/mL G418筛选阳性细胞株7天后图，
图中，图5A为对照组图，图5B为试验组图；
图6为RT-PCR鉴定所筛选的细胞株是否可以转录SLAM基因图，
图中，第1泳道为实验组，第2泳道为MDCK细胞对照组，第 3泳道为空白对照组，Maker：DL2000Plus；
图7为RT-PCR鉴定SLAM-MDCK细胞是否可以稳定转录SLAM 基因
图中，1～3泳道分别为第5代、第7代、以及9代SLAM-MDCK 细胞，4泳道为MDCK细胞对照，目的条带大小为1024bp，Maker： DL2000Plus；
图8为SLAM-MDCK与MDCK细胞分离CDV的功能性检测
图中，图8A为MDCK细胞图8B为SLAM-MDCK细胞；
图9为RT-PCR鉴定SLAM-MDCK与MDCK上清中是否含有 CDV
图中，第一泳道为SLAM-MDCK，第二泳道为MDCK，目的条带的大小为761bp，Maker：DL2000
图10为11号CDV在SLAM-MDCK传至第3代时病毒检测
图中，第一泳道为实验组，第二泳道为空白对照组，Maker： DL2000；
图11为11号CDV在SLAM-MDCK传至第6代时病毒检测图中，第一泳道为实验组，第二泳道为空白对照组，Maker：DL5000，
图12为11号CDV在SLAM-MDCK传至第9代时病毒检测
图中，第一泳道为实验组，第二泳道为空白对照，Maker：DL5000。
图13为病毒基因表达的水平图。
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
下述具体实施中涉及的主要材料、试剂及仪器
1、细胞及质粒基因犬肾细胞系(MDCK)由ATCC提供，GP2-293 细胞购自Clontech公司。SLAM基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成，pVSV-G质粒、逆转录病毒载体pRetroX-Tet3G购自Clontech公司。
2、常用的生物学试剂DMEM培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自德国PAN Biotech公司，Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA Maker DL2000、DNA Maker DL5000购自南京诺唯赞生物科技有限公司，BamH Ⅰ、ECOR Ⅰ限制性内切酶、dNTP MIX、RRI、PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit均购自TaKaRa公司， SYBER Green Master购自Thermo Fisher公司、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒及去内毒素试剂盒均购自TIANGEN公司，G418购自 Sigma公司。
3、主要仪器设备台式低温高速离心机(Eppendorf 5404R)，XP 基因扩增仪TC-XP-D(杭州博日科技有限公司)，电热恒温水浴锅 DK-S22型(上海精宏实验设备有限公司)，SCW-CZ-650型洁净工作台(苏州宏瑞净化科技有限公司)，立式双开门低温保存箱BCD-610W(博西华家用电器有限公司)，DHP-9162型恒温培养箱(上海福玛实验设备有限公司)，DYY-6C型核酸电泳仪(北京六一生物科技有限公司)，UV-1000型台式紫外分析仪(上海佳联科技有限公式)， MODEL CKX31SF(OLYMPUS CORPORATION Philippines)，HDL 洁净工作台(北京东联哈尔仪器制造有限公司)，MODELIX70-S8F2 (OLYMPUS OPTICAL JAPAN)，立式超低温保存箱DW-86L626 (青岛海尔特种电器有限公司)，Centrifuge 542R(Eppendorf)，凝胶成像系统、生物安全柜、普通光学显微镜型、恒温水浴槽DK-80型 (上海精宏实验设备有限公司)，恒温培养摇床ZHWY一2012C(上海智城分析仪器制造有限公司)，Applied Biosystems实时荧光定量 PCR仪器Vii7(Thermo Fisher)，倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX70)。
1.犬源SLAM逆转录病毒重组载体pRetro-SLAM的构建
1)将逆转录病毒载体骨架质粒pRetroX-Tet3G(载体图谱如图1 所示)，使用BamHⅠ和EcOR Ⅰ进行酶切，酶切反应20μL体系： pRetroX-Tet3G 10μL，10x Buffer 2μL，BamH Ⅰ0.5μL，EcOR Ⅰ0.5μL， ddH2O 7μL。充分混匀后置于37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳回收7377bp的载体片段；
2)根据SLAM基因的序列(由上海捷瑞生物工程有限公司合成) 以及BamH Ⅰ和EcORⅠ序列，合成引物：
SLAM-P1:5’-AACGGATCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTTC-3’；
SLAM-P2:5’-AGAGGGGCGGAATTCTTAGCTCTCTGGGAACGCAC-3’；
反应体系为20μL：：Template 2μL，SLAM-p1 1μL，SLAM-p2 1μL， dNTP 1μL，10xTrans Tag-T Buffer 2μL，Trans Tag-T DNA Polymeyase 1μL，ddH2O 12μL。反应程序：98℃10min，98℃10s；56℃30s； 72℃1min 30Cycle，72℃10min；目的条带大小为1024bp，经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定条带大小正确。
3)按照TIANGEN小量胶回收试剂盒说明书，将目的条带回收。进行BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切。酶切反应20μL体系为：Template 17μL， 10x Buffer 2μL，BamH Ⅰ0.5μL，cOR Ⅰ0.5μL。充分混匀后置于37℃水浴3h，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定正确，回收目的片段。
4)将回收后SLAM基因片段和pRetroX载体片段进行连接反应，反应体系为10μL：SLAM片段7μL，pRetroX载体1μL，10XT4DNA 连接酶Buffer 1μL，T4连接酶1μL。反应程序：16℃连接过夜。将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，具体程序如下：
5)从-80℃冰箱中取200μL E.coIi DH5α感受态细胞悬液，在冰上解冻。将10μL的连接产物加入到感受态细胞悬液中，轻轻摇匀置于冰上放置30min后，42℃水浴锅热击45s，接着冰浴2min。加入 0.6mL LB 37℃震荡培养1小时，取200μL均匀涂布于含Amp浓度为100μg/mL的LA平皿上，放置37℃恒温培养箱倒置培养过夜，挑取单菌落，接于5mL含Amp浓度为100μg/mL抗生素的LB培养基， 37℃摇床震荡过夜。使用TIANGEN质粒小提试剂盒提取过夜增菌培养物中的质粒。
6)将提取的质粒用BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ进行双酶切鉴定，同时进行PCR鉴定。双酶切反应体系为20μL：Plasmid 2μL，BamH Ⅰ0.5μL， EcOR Ⅰ0.5μL，10x Buffer 2μL，ddH2O 15μL。将其混合后轻轻摇匀，置于37℃作用3h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
7)PCR鉴定同上扩增SLAM基因所述，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶切鉴定与PCR鉴定正确(如图3)。将质粒进行测序，测序结果与原SLAM基因序列用DNAman软件进行比较分析，序列完全正确。
8)将该菌株接入100mL含Amp浓度为100μg/mL的LB培养基， 37℃摇床震荡培养24小时。使用TIANGEN无内毒素质粒大提试剂盒提取质粒，将提取的质粒用BamH Ⅰ和EcOR Ⅰ进行双酶切鉴定，同时进行质粒鉴定，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。提取了两批去内毒素质粒，鉴定结果正确(如图4)，并命名为pRetro-SLAM。
2.SLAM逆转录病毒的包装
将构建的质粒pRetro-SLAM和包膜质粒pVSV-G(质粒图谱如图 2所示)1:1混合后，转染GP2-293细胞。具体程序如下：将GP2-293 细胞均匀的铺于6孔细胞板中，当密度达到70-80％时转染，将培养基弃掉，加入1.5ml无血清的Opti-MEM培养基，将2ug质粒 pRetro-SLAM和2ug包膜质粒pVSV-G混匀后，再与与8μL Lipofectamine2000混匀，接入到GP2-293细胞中。培养48h，收集细胞上清500g，离心10min，收集上清，即为包装好的SLAM逆转录病毒。
3.测定G418对MDCK细胞最小杀死浓度
正常的MACK细胞不含有G418抗性基因。将G418按终浓度为 0μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、 700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1000μg/mL、1100μg/mL。分别接种生长密度为70％左右的MDCK单层细胞。每个浓度三个重复，持续培养7天后发现当G418的浓度为900μg/mL时MDCK细胞95％死亡，当浓度为1000μg/mL时MDCK细胞全部死亡，因此确定最低致死MDCK的G418浓度为1000μg/mL(表1)。
表1：G418对正常MDCK细胞最低致死浓度
Figure BDA0001271433100000131
注释：—：细胞0％死亡，+：细胞约20％死亡，++：细胞约40％死亡，+++：细胞约60％死亡，++++：细胞约80％死亡，+++++：细胞100％死亡。
4.SLAM逆转录病毒感染MDCK细胞及阳性MDCK细胞株的筛选
1)将生长状态良好的MDCK细胞，均匀的铺于6孔细胞培养板 12小时后，弃上清。将制备的逆转录病毒1mL与培养基1mL轻轻混匀后，加入到6孔细胞培养板中，感染24h后，弃上清。将细胞用 300μL胰蛋白酶消化处理，用10％FBS的DMEM重悬MDCK细胞，将MDCK细胞均匀铺于10mm的细胞培养皿中，置37℃，5％CO2 培养箱中培养。培养24h后，弃掉旧的培养基，更换10％FBS的DMEM 培养基，同时加终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，与此同时加入一组没有用逆转录病毒感染的MDCK细胞作为对照。
2)7天后待感染组细胞长满，同时对照组细胞已经全部死亡(如图5)，将感染组细胞一传十，继续用终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，挑选单集落细胞扩大培养，并再次使用G418筛选，连续筛3 代，纯化出目的细胞。
5.RT-PCR对阳性细胞株的鉴定
鉴定SLAM基因是否成功整合到MDCK细胞基因组并且可以正常转录，本研究通过RT-PCR的方法进行鉴定。将阳性细胞传代3次后，取细胞与培养基的的混合物500μL于无RNAase的1.5mLEP管， EP管中加入800μL的Trizol，室温放置5min。EP管中加入200μL三氯甲烷，震荡15s，冰上放置10min。4℃，12000rpm，10min离心，吸取水相层约400μL于含400μL异丙烷1.5ml无RNAase EP管，混匀，冰上放置10min。4℃，12000rpm，10min离心，管底有白色沉淀。弃上清，加入700μL用DEPC水配置75％的乙醇，轻轻震荡，室温放置5min。8000rpm，5min离心弃上清，风干RNA沉淀，沉淀由白色变为透明为宜，加入20μLDEPC水溶解RNA沉淀，取1μL为模版，用TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit做RT-PCR鉴定。 20μL体系：Mix 1μL，2xBuffer 10μL，SLAM-P1 1μL，SLAM-P2 1μL， RNase Free H20 6μL，Template 1μL。反应程序：50℃30min，94℃ 2min，94℃30s；58℃30s；72℃1min 30Cycle，72℃10min。目的条带的大小为1024bp。(如图6)。
6.阳性细胞株是否可以稳定转录SLAM基因的检测
对外源基因SLAM在阳性细胞上稳定转录的检测，选取第5代、第7代以及第9代的阳性细胞，提取细胞中的总RNA，进行RT-PCR 检测，同时设立正常MDCK细胞作为阴性对照，同上述SLAM基因的检测。结果如图1～3泳道分别为第5代、第7代、以及9代 SLAM-MDCK细胞，4泳道为MDCK细胞对照，目的条带大小为 1024bp，Maker：DL2000Plus。实验证明，SLAM-MDCK细胞在G418 抗性筛选环境中传至第9代仍能保持外援基因SLAM在RNA水平的稳定转录(如图7)。
逆转录病毒感染MDCK细胞24h，最低致死MDCK细胞G418 浓度连续三代加压筛选获得阳性细胞。对外源基因SLAM在RNA水平稳定性检测，通过提取阳性细胞的总RNA进行RT-PCR鉴定，同时设定正常的MDCK细胞作为阴性对照，鉴定结果在阳性细胞中， SLAM基因在RNA水平可以转录。将筛选到的阳性细胞命名为 SLAM-MDCK细胞。
7.SLAM-MDCK与MDCK分离CDV病毒的比较
1)采集经胶体金试纸条检测为阳性的犬瘟热病例的眼鼻拭子和血液，4℃，3000rpm，10min离心取上清，4℃，8000rpm，5min再次离心，在超净台中取上清经0.22um滤器过滤除菌后，将上清样品分装于灭菌的1.5mlEP管中，放于-80℃备用。
2)待SLAM-MDCK与MDCK培养至铺满单层后，弃去旧的培养基，用胰酶清洗一遍后加入适量的胰酶放入37℃温箱中消化5min 左右，弃去胰酶，加入适量的无血清的DMEM培养基进行重悬，将制成细胞重悬液和处理过的CDV阳性样品按照1000:1的比例，每个做三个重复接于12孔细胞培养板放于细胞培养箱中培养，3h细胞贴壁后，弃去上清换含2％胎牛血清的DMEM维持培养基继续放入细胞培养箱中进行观察。
24h后进行观察，MDCK细胞有轻微的病变而SLAM-MDCK有大量的细胞死亡，脱落，细胞发生融合现象，并出现圆缩等典型的 CPE变化(如图8)，表明SLAM-MDCK产生的病变更加明显，更适合用于CDV的分离。
3)将在SLAM-MDCK上产生明显病变，但在MDCK上病变不明显的细胞上清液，提取RNA，，利用合成的CDV H基因的特异性鉴定引物，进行RT-PCR鉴定。
其中，用于鉴定CDV病毒的RT-PCR的引物为：
CDV-P1：5’-CCTTGTGTGTAGAAGAGAGC-3’
CDV-P2：5’-ATAAGAAATCGTCCGGATTG-3’；
扩增的片段大小为761bp，用TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit，扩增的体系为20μL：Template 1.5μL，2xBuffer 10μL， CDV-P1 1μL，CDV-P2 1μL，RRI 0.5μL，dNTP 1μL，Mix 1μL，DEPC H2O 5μL。
扩增的程序为：50℃30min，94℃5min，94℃45s；58℃30s； 72℃1min；30Cycle，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，第1泳道SLAM-MDCK，第2泳道为MDCK，Maker：DL2000 Plus(如图9)。
8.分离到CDV毒株H的序列分析
扩增H基因，
其中，用于扩增CDV H基因全长序列的引物为：
CDV-H1:5’-AACAATGCTCTCCTACCAAGA-3’；
CDV-H2:5’-AATGCTAGAGATGGGTTTATT-3’；
扩增片段大小为1921bp，用TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit，扩增的体系为20μL：RNA 1.5μL，2xBuffer 10μL，CDV-H1 1μL，CDV-H2 1μL，RRI 0.5μL，Mix 1μL,DEPC H2O 5μL。扩增的程序：50℃30min，94℃5min，94℃45s；54℃1min；72℃2min；30Cycle，72℃10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。将目的条带回收测序后，进行核苷酸和氨基酸分子进化分析。
结果显示不论是在核苷酸和氨基酸分子进化分析都与犬瘟热病毒基因相似度非常高。故将该犬瘟热毒株命名为11号犬瘟热病毒。也说明SLAM-MDCK更适合CDV病毒的分离和增殖。
9.11号CDV在SLAM-MDCK上稳定增殖试验
将所分离到的CDV的11号犬瘟热病毒在SLAM-MDCK连续传代至第9代，分别取第3代、6代、9代细胞毒进行RT-PCR鉴定，以上述扩增H基因全长的引物进行检测，反应程序与反应体系也如同上述所述(如图10、11、12)。结果显示在这三代收取的上清样品中都可以检测到CDV。说明SLAM-MDCK适合CDV的分离和增殖。
10.11号CDV在SLAM-MDCK细胞系上的增殖曲线测定
将分离到的11号犬瘟热病毒以1:10与1:100两个比例按照同步接种方式接种于MDCK与SLAM-MDCK细胞，做5个重复，24h后收取第一组病毒样品，48h后随机收取第二组病毒样品，以此类推，每隔24h收取下一组病毒样品至5组的病毒样品全部收取完。将5组细胞病毒样品提取总RNA，用15μL的DEPC水溶解RNA沉淀，取 11μL RNA溶液反转成cDNA，反应体系20μL：AMV 1μL，5xBuffer 4μL，RRI 1μL，P1 1μL，dNTP 2μL，Template 11μL。
引物序列如下：
P1:5’-GCCAGACCTGAGGAGTTATTGA-3’；
P2:5’-CTGCGTTACAGACTTGATTTGC-3’；
反应程序为：37℃10min，42℃59min，72℃15min，16℃2min。将5组cDNA作为模版来做qPCR来比较不同组中犬瘟热病毒的含量。反应体系为20μL：Syber-green 10μL，P1 0.5μL，P2 0.5μL，Template 1μL，DEPC H2O 8μL。反应程序：94℃5min，94℃30s；53℃30s； 72℃30s；30cyble，72℃10min。
结果显示在1:10与1:100两个比例接毒时犬瘟热病毒在无论是在 SLAM-MDCK还是MDCK细胞都是24h时病毒含量最高，且在24h 时SLAM-MDCK组病毒含量高5-6个CT值，说明我们所构建的 SLAM-MDCK细胞系对分离犬瘟热病毒有较高的敏感性，且 SLAM-MDCK细胞系有适于犬瘟热病毒在其中增殖的特性。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
<110> 华中农业大学
<120> 犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK及其构建方法和应用
<211>1029bp
<212> DNA
<213> SLAM基因
<400> 1
ATGGATTCCAGGGGCTTCCTCTCCCTGCGCTGCCTGCTGGTCCTCGCCCTGGCGTCCAAGCTGAGCTGTGGGACAGGTGAGAGCTTGATGAATTGCCCAGAAGTCCCTGGGAAGTTGGGAAGCAGTTTGCAGCTGTCCTTGGCATCCGAAGGGATAAGCAAGAGGATGAACAAGAGCATCCACATCCTTGTCACAAGGGCGGAATCACCGGGAAACAGTATCAAGAAGAAAATAGTGTCTCTGGATCTGCCAGAAGGGGGGTCTCCACGCTACCTGGAAAATGGCTATAAATTTCATCTGGAAAACCTGACCCTGAGGATCCTGGAAAGCAGGAGGGAAAATGAAGGCTGGTACTTCATGACCCTGGAGGAGAACTTTTCAGTTCAACACTTTTGTCTGCAGCTGAAGCTCTATGAGCAGGTCTCCACTCCAGAAATTAAGGTGTTGAACTGGACCCAGGAGAATGGGAACTGCAGCATGATGCTGGCCTGCGAAGTGGAAAAGGGGGACAATGTGGTTTACAGCTGGAGTGAGAAACTGGGGATTGACCCACTGATCCCAGCCAACAGTTCTCACCTCTTGCACCTCAGCCTCGGCCCTCAGCATGTCAACAACGTCTATGTCTGCACCGTGAGCAACCCCGTCAGCAACCGCTCATGGTCCTTCAACCCATGGTCCAAGTGCAGGCCAGAGTCTTCGGTGCCAAGACAATGGAGACTGTATGCTGGGCTCTTCTTAGGGGGTATCGTTGGTGTCATCTTGATTTTCGAAGTGGTATTACTGCTGTTGAGAAGAAGAGGTAAAACAAATCATTACAAGCCAACAAAGGAAGAAAAAAGCCTTACCATCTATGCCCAGGTCCAGAAATCAGGTTCTACTCAGAAGAAACCTGATCCCTTGCCAGCTGAGGACCCCTGCACCACCATTTATGTTGCTGCCACAGAACCTGTCCCAGAACCTGCCCCAGAACCTGTGCAGGAACCACATTCTATCACGGTCTATGCCAGCGTGACGTTCCCAGAGAGCTGA
<210>2
<211> 5031bp
<212> DNA
<213> 5'LTR至3'LTR的核苷酸序列
<400> 2
CAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGCGCGCCAGTCTTCCGATAGACTGCGTCGCCCGGGTACCCGTATTCCCAATAAAGCCTCTTGCTGTTTGCATCCGAATCGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCACGACGGGGGTCTTTCATTTGGGGGCTCGTCCGGGATTTGGAGACCCCTGCCCAGGGACCACCGACCCACCACCGGGAGGTAAGCTGGCCAGCAACTTATCTGTGTCTGTCCGATTGTCTAGTGTCTATGTTTGATGTTATGCGCCTGCGTCTGTACTAGTTAGCTAACTAGCTCTGTATCTGGCGGACCCGTGGTGGAACTGACGAGTTCTGAACACCCGGCCGCAACCCTGGGAGACGTCCCAGGGACTTTGGGGGCCGTTTTTGTGGCCCGACCTGAGGAAGGGAGTCGATGTGGAATCCGACCCCGTCAGGATATGTGGTTCTGGTAGGAGACGAGAACCTAAAACAGTTCCCGCCTCCGTCTGAATTTTTGCTTTCGGTTTGGAACCGAAGCCGCGCGTCTTGTCTGCTGCAGCGCTGCAGCATCGTTCTGTGTTGTCTCTGTCTGACTGTGTTTCTGTATTTGTCTGAAAATTAGGGCCAGACTGTTACCACTCCCTTAAGTTTGACCTTAGGTCACTGGAAAGATGTCGAGCGGATCGCTCACAACCAGTCGGTAGATGTCAAGAAGAGACGTTGGGTTACCTTCTGCTCTGCAGAATGGCCAACCTTTAACGTCGGATGGCCGCGAGACGGCACCTTTAACCGAGACCTCATCACCCAGGTTAAGATCAAGGTCTTTTCACCTGGCCCGCATGGACACCCAGACCAGGTCCCCTACATCGTGACCTGGGAAGCCTTGGCTTTTGACCCCCCTCCCTGGGTCAAGCCCTTTGTACACCCTAAGCCTCCGCCTCCTCTTCCTCCATCCGCCCCGTCTCTCCCCCTTGAACCTCCTCGTTCGACCCCGCCTCGATCCTCCCTTTATCCAGCCCTCACTCCTTCTCTAGGCGCCGGAATTGAAGATCTGGGGGATCGATCCTCTAGAGTCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGGACCTGCAGGAATTGATCCGCGGCCGCACCGGTAGGCCTCGTACGCTTAATTAACGGATCCATGGATTCCAGGGGCTTCCTCTCCCTGCGCTGCCTGCTGGTCCTCGCCCTGGCGTCCAAGCTGAGCTGTGGGACAGGTGAGAGCTTGATGAATTGCCCAGAAGTCCCTGGGAAGTTGGGAAGCAGTTTGCAGCTGTCCTTGGCATCCGAAGGGATAAGCAAGAGGATGAACAAGAGCATCCACATCCTTGTCACAAGGGCGGAATCACCGGGAAACAGTATCAAGAAGAAAATAGTGTCTCTGGATCTGCCAGAAGGGGGGTCTCCACGCTACCTGGAAAATGGCTATAAATTTCATCTGGAAAACCTGACCCTGAGGATTCTGGAAAGCAGGAGGGAAAATGAAGGCTGGTACTTCATGACCCTGGAGGAGAACTTTTCAGTTCAACACTTTTGTCTGCAGCTGAAGCTCTATGAGCAGGTCTCCACTCCAGAAATTAAGGTGTTGAACTGGACCCAGGAGAATGGGAACTGCAGCATGATGCTGGCCTGCGAAGTGGAAAAGGGGGACAATGTGGTTTACAGCTGGAGTGAGAAACTGGGGATTGACCCACTGATCCCAGCCAACAGTTCTCACCTCTTGCACCTCAGCCTCGGCCCTCAGCATGTCAACAACGTCTATGTCTGCACCGTGAGCAACCCCGTCAGCAACCGCTCATGGTCCTTCAACCCATGGTCCAAGTGCAGGCCAGAGTCTTCGGTGCCAAGACAATGGAGACTGTATGCTGGGCTCTTCTTAGGGGGTATCGTTGGTGTCATCTTGATTTTCGAAGTGGTATTACTGCTGTTGAGAAGAAGAGGTAAAACAAATCATTACAAGCCAACAAAGGAAGAAAAAAGCCTTACCATCTATGCCCAGGTCCAGAAATCAGGTTCTACTCAGAAGAAACCTGATCCCTTGCCAGCTGAGGACCCCTGCACCACCATTTATGTTGCTGCCACAGAACCTGTCCCAGAACCTGCCCCAGAACCTGTGCAGGAACCACATTCTATCACGGTCTATGCCAGCGTGACGTTCCCAGAGAGCTGAGAATTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAAGCTTGCCACAACCATGGCTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGATCGGCTAGAGTCGACCCGGACGGGACGCTCCTGCGCCTGATACAGAACGAATTGCTTGCAGGCATCTCATGAGTGTGTCTTCCCGTTTTCCGCCTGAGGTCACTGCGTGGATGGAGCGCTGGCGCCTGCTGCGCGACGGCGAGCTGCTCACCACCCACTCGAGGGCTGCAGCGCTGCAGAGGCCGAGTGCAGAACTGCTCCAAAGGGACCTCAAGGCTTTCCGAGGGACACTAGGCTGACTCCATCGAGCCAGTGTAGAGATAAGCTTATCGATTAGTCCAATTTGTTAAAGACAGGATATCAGTGGTCCAGGCTCTAGTTTTGACTCAACAATATCACCAGCTGAAGCCTATAGAGTACGAGCCATAGATAAAATAAAAGATTTTATTTAGTCTCCAGAAAAAGGGGGGAATGAAAGACCCCACCTGTAGGTTTGGCAAGCTAGCTTAAGTAACGCCATTTTGCAAGGCATGGAAAAATACATAACTGAGAATAGAGAAGTTCAGATCAAGGTCAGGAACAGATGGAACAGGGTCGACCCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGGGGCGCCAGTCCTCCGATTGACTGAGTCGCCCGGGTACCCGTGTATCCAATAAACCCTCTTGCAGTTGCATCCGACTTGTGGTCTCGCTGTTCCTTGGGAGGGTCTCCTCTGAGTGATTGACTACCCGTCAGCGGGGGTCTTTCATT

Claims (4)

1.一种犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK，所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK基因组中含有逆转录病毒载体pRetroX-SLAM基因组中的5’LTR至3’LTR的核苷酸序列，所述5’LTR至3’LTR的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；其特征在于：所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK由以下步骤制备而成：
1)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板设计引物对，且引物上加有BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ的酶切位点；
SLAM-P1:
5’-AACGGATCCGCCACCATGGATTCCAGGGGCTTC-3’；
SLAM-P2:5’-AGAGGGGCGGAATTCTTAGCTCTCTGGGAACGCAC-3’；
2)根据上述SLAM基因的核苷酸序列为模板进行PCR，得到PCR产物；
3)用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ将PCR产物进行酶切，纯化回收；同时，用BamHI和EcoRI将逆转录病毒载体pRetroX-Tet3G进行双酶切，酶切产物跑琼脂糖凝胶电泳检测并回收pRetroX-Tet3G大片段；
4)将回收的pRetroX-Tet3G大片段和回收的PCR产物用T4连接酶4℃连接过夜，得到pRetroX-SLAM；
5)将构建的质粒pRetroX-SLAM和包膜质粒pVSV-G混合后，转染GP2-293细胞，培养得到包装好的SLAM逆转录病毒；
6)将制备的SLAM逆转录病毒与无血清DMEM培养基混合均匀，感染生长状态良好的MDCK细胞，然后用含有G418的DMEM培养基进行筛选，纯化得到目的细胞，即为犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK。
2.根据权利要求1所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步骤2)中，PCR反应体系为：
Figure FDA0002503720310000011
Figure FDA0002503720310000021
反应程序：
98℃ 10min，98℃ 10s；56℃ 30s；72℃ 1min 30个循环，72℃ 10min。
3.根据权利要求1所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步骤5)的具体步骤如下：
将GP2-293细胞均匀的铺于6孔细胞板中，当GP2-293细胞密度达到70-80％时转染：将培养基弃掉，加入1.5ml无血清的Opti-MEM培养基，将2μg质粒pRetroX-SLAM和2μg包膜质粒pVSV-G混匀后，再与8μL Lipofectamine2000混匀，接入到GP2-293细胞中；培养48h，收集细胞上清500g，离心10min，收集上清，即为包装好的SLAM逆转录病毒。
4.根据权利要求1所述犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK，其特征在于：所述步骤6)的具体步骤如下：
1)将生长状态良好的MDCK细胞，均匀的铺于6孔细胞培养板12小时后，弃上清；将制备的逆转录病毒1mL与无血清DMEM培养基1mL轻轻混匀后，加入到6孔细胞培养板中，感染24h后，弃上清；将细胞用300μL胰蛋白酶消化处理，用10％FBS的DMEM重悬MDCK细胞，将MDCK细胞均匀铺于10mm的细胞培养皿中，置37℃，5％CO2培养箱中培养；培养24h后，弃掉旧的培养基，更换10％FBS的DMEM培养基，同时加终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，与此同时加入一组没有用逆转录病毒感染的MDCK细胞作为对照；
2)7天后待感染组细胞长满，同时对照组细胞已经全部死亡，将感染组细胞一传十，继续用终浓度为1000μg/mL G418进行筛选，挑选单集落细胞扩大培养，并再次使用G418筛选，连续筛3代，纯化出目的细胞，即为犬瘟热病毒敏感细胞系SLAM-MDCK。
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