CN110106151B - 基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用 - Google Patents

基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用。基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCC NO.17413。该细胞系为可以稳定表达水貂源Nectin4基因的Vero细胞系，细胞的犬瘟热病毒敏感性更好，分离的病毒效价稳定，不会发生适应性突变和毒力致弱的问题。本发明提供的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，其中，所用优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQ ID NO.1所示。该方法操作简便，安全性高。

Description

基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用。
背景技术
犬瘟热是由副粘病毒科(Paramyxoviridae)麻疹病毒属(Morbillivirus)的犬瘟热病毒(Canine distemper virus，CDV)感染引起的多种动物共患传染病。CDV囊膜由Ⅰ型和Ⅱ型糖蛋白的融合(F)蛋白和血凝素(H)蛋白构成。CDV进入易感宿主需要细胞受体为介导，CDV-H蛋白与膜表面受体蛋白相结合并引起穿膜运动，CDV的细胞受体主要包括信号淋巴细胞激活分子(SLAM)和细胞黏附分子4(Nectin-4)，Nectin4作为CDV其中一个受体，在病毒粘附与侵染过程中起重要作用。
病毒分离技术是对犬瘟热的诊断和病毒致病性研究的重要手段，然而CDV强毒体外培养时对大多数细胞的不敏感性极大限制了该技术的应用，研究证实，美洲狨猴B细胞(B95a细胞)为包括麻疹病毒(Measles virus，MV)和CDV等副粘病毒的敏感细胞，但由于B95a细胞是一种EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)转化的细胞，在培养过程中会有分泌EB病毒的危险，应用其对病毒分离的实验须在Ⅱ级生物安全实验室进行，因此大大限制了其在CDV分离上的应用。
目前，针对CDV野毒株的分离一般通过易感动物肺巨噬细胞与Vero(非洲绿猴肾细胞)或MCDK(犬肾上皮连续细胞)等传代细胞系共培养的方法，但此类方法除存在操作复杂、耗费时间长和分离得到病毒效价不稳定等缺点外，由于以上传代细胞为犬瘟热病毒非敏感细胞，对于分离到的犬瘟热病毒很可能在适应细胞的过程中发生了毒力基因的突变，造成病毒株的致弱。因此，建立一种快速且敏感的分离犬瘟热病毒的方法是当前犬瘟热诊断及其病毒致病性研究中的瓶颈和难点。
近来，Seki等(2003)应用建立的稳定表达犬SLAM的Vero细胞系(Vero.DogSLAMtag)较Vero和B95a细胞更快速且敏感地从疑似犬瘟热病犬体内分离到犬瘟热病毒，该细胞系在接毒后12h即可产生明显CPE。分离得到的犬瘟热强毒效价稳定且具有明显的致细胞病变(CPE)，病毒主要结构基因的氨基酸序列也未发生适应性突变。此后，在国外该细胞系以其表达受体的稳定性和对CDV高度敏感性在CDV分离和致病性研究中得到广泛的应用。在国内，该细胞系被多家科研单位直接引进用于犬瘟热病毒研究。本实验室曾用BHK-21细胞(王雅文2018)成功构建稳定表达水貂的SLAM的细胞系，但是不同的受体SLAM和Nectin4序列的差异可能影响受体与CDV的相互作用，进而可能导致表达Nectin4宿主细胞对CDV易感性不同和病毒的分离效率的差异。
因此，开发一种可以对犬瘟热病毒强毒株敏感分离并且对犬瘟热病例进行快速诊断的细胞系具有重要的意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
基于上述原因，本发明的第一目的在于提供一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，以缓解现有技术中犬瘟热病毒敏感细胞系不稳定，分离犬瘟热病毒效率低等技术问题。
本发明的第二目的在于提供上述犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。
本发明的第三目的在于提供上述犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。
本发明的第四目的在于提供一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，以缓解现有技术中使用病毒等操作不安全，要求高，操作繁琐，细胞系易产生致弱等问题。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCCNO.17413。
上述犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。
上述犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。
进一步地，所述产品包括试剂或试剂盒。
一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系；
所述优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述优化水貂源Nectin4基因缺少信号肽序列和终止密码子序列。
进一步地，所述宿主细胞包括Vero细胞系或MCDK细胞系，优选为Vero细胞系。
进一步地，将优化水貂源Nectin4基因插入到含有HA标签和Igκ链信号肽的pDisplay载体中，得到含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体。
进一步地，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体通过瞬时转染引入宿主细胞。
进一步地，所述筛选包括抗生素梯度浓度压力选择和有限稀释法选择。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCC NO.17413。本发明首次从水貂胎盘中克隆得到Nectin4基因，并利用该基因制备得到基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系。该细胞系为可以稳定表达水貂源Nectin4基因的Vero细胞系，选用水貂源Nectin4受体，细胞系对犬瘟热病毒敏感性更好，可以有效分离犬瘟热病毒，分离效率高，并且分离的病毒效价稳定，病毒遗传信息稳定，不会发生适应性突变和毒力致弱的问题。
本发明提供的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，其中，所用优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQ ID NO.1所示。该方法操作简便，安全性高，选用水貂源Nectin4受体，CDV的敏感性更高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的一种制备方法技术路线图；
图2为实施例1中从母貂胎盘中克隆Nectin4基因的PCR结果图；
图3为实施例1中重组质粒PEASY-blunt-zero-minkNectin4的酶切验证图；
图4为实施例2中优化Nectin4基因的PCR结果图；
图5为实施例2中重组质粒pDisplay-mNectin-4表达Nectin4蛋白的结果图；
图6为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系的筛选结果图，其中，图A为Vero细胞，图B为G418筛选的细胞，图C为有限稀释法筛选第5天的细胞，图D为有限稀释法筛选第10天的细胞；
图7为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系间接免疫荧光结果图，其中，图A为细胞系培养10代的间接免疫荧光结果，图B为细胞系培养15代的间接免疫荧光结果；
图8为实施例3中稳定表达mNectin4的细胞系的Western blot结果图；
图9为实施例5中SD(14)7毒株接种到VMN细胞的结果图，其中，图A为vero细胞，图B为毒株接种第3天，图C为毒株接种第4天。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系Nectin4稳定表达细胞系，于2019年03月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.17413，该菌株的分类名为Nectin4稳定表达细胞系，拉丁名：Vero-mink-Nectin4。
该细胞系为可以稳定表达水貂源Nectin4基因的Vero细胞系，细胞的犬瘟热病毒敏感性更好，可以有效分离犬瘟热病毒，分离效率高，并且分离的病毒效价稳定，病毒遗传信息稳定，不会发生适应性突变和毒力致弱的问题。
上述犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。该细胞系对犬瘟热病毒敏感，可以实现强毒株的敏感分离，并且不会产生病毒毒力致弱，病毒的遗传信息稳定。
上述犬瘟热病毒敏感细胞系在犬瘟热病毒鉴定或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。该细胞系可以对犬瘟热病毒敏感，可以快速灵敏地诊断出犬瘟热病毒，特别是强毒株。需要说明的是，所述的犬瘟热病毒鉴定是指非诊断治疗目的的快速鉴定。
在本发明一些实施方式中，产品包括试剂或试剂盒。该试剂或试剂盒包括上述犬瘟热病毒敏感细胞系，培养液等物质，通过将目标样本加入犬瘟热病毒敏感细胞系中培养，检测得到犬瘟热病毒或强毒株。
一种基于水貂源Nectin4(mNectin4)受体的犬瘟热病毒敏感细胞系的制备方法：将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体引入宿主细胞，筛选得到表达水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，其中，优化水貂源Nectin4基因的序列如SEQ ID NO.1所示：
GGCGAGCTGGAGACCTCGGACCTGGTGACCGTGGTGCTGGGCCAGGACGCCAAGCTGCCCTGCTTCTACCGAGGGGACCCCGGCGAGCAGGTGGGGCAGGTGGCCTGGGCTCGGGTGGGCGCGGGCGAGGGCCCCCGGGAGCTAGCGCTGCTGCATATCCAATACGGGCTGCACGTGGGCGCGGCCTACGAGGGCCGCGTGGAGCAGCCGCCGCCCCCACGGAGCCCCCTGGACGGCTCCGTGCTCCTGCGCAACGCGGTGCAGGCCGACGAGGGCGAATACGAGTGCCGCGTCAGCACCTTCCCCGCGGGCAGCTTCCAGGCGAGGCTGCGGCTCCGCGTGCTAGTGCCTCCCCTGCCCTCTCTGAACCCTGGTCCTGCGCTAGAAGAGGGCCAGGGCCTGACGCTAGCAGCCTCCTGCACAGCAGAGGGCAGCCCAGCCCCCAGCGTGACCTGGGACACGGAGGTCAAGGGCACCGCGTCCAGCCGCTCATTCAAGCACTCCCGCTCAGCGGCTGTCACGTCCGAGTTCCACCTGGTGCCCAGCCGCAGCATGAATGGAAAGCCGCTCACCTGCGTGGTGTCCCACCCCGGTCTGCTCCAGGACCAGAGGATCACCCACGTCCTCCATGTGGCCTTCCTCGCTGAGGCCTCTGTGAGGGGCCTTGAAGACCAGAAGCTGTGGCAGGTTGGCAAAGAAGGAGCCACTCTCAAGTGCCTGAGCGAAGGGCACCCCCCACCCTCGTACAACTGGACACGGTTGGACGGGCCCCTGCCCAGCGGGGTCCGAGCGGAAGGGGACACGCTGGGTTTTCCTCCGCTGACCACAGAGCACAGTGGCATCTACGTGTGCCACGTCAGCAATGAGCTCTCCTCCAGGGACTCTCAGGTCACTGTGGATGTTCTTGACCCTCAGGACGCCCCCGGGAAGCAGGTGGACCTGGTGTCGGCCTCTGTGGTGGTGGTGGGGGTGATCGCCGCCCTCCCCTTCTGCCTCCTGGCCGTCGTGGTGCTGCTCATGTCTCGCTACCACCGGCGCAAGGCTCAGCAGATGACCCAGAAGTATGAGGAGGAGTTGACCCTGACCAGGGAGAACTCCATCCGGAGGCTGCATTCCCATCACACGGACCCCAGGAGCCAGCCGGAGGAGAGTGTAGGGCGGAGAGCCGAGGGCCACCCTGATAGTCTCAAGGACAACAGTAGCTGCTCTGTGATGAGTGAAGAGCCAGAGGGCCGCAGTTACTCCACACTGACCACGGTGAGGGAGATCGAAACACAGACAGAACTGCTGTCTCCGGGCTCTGGGCGGGCCGAGGAGGAGGAAGACCGGGATGAAGGCATCAAACACGCCATGAACCATTTCGTTCAAGAGAATGGGACCCTGCGGGCCAAACCCACGGGCAATGGCATCTACATCAATGGGCGGGGGCATCTGGTC(SEQ ID NO.1)。
CDV对宿主受体SLAM和Nectin4的敏感性是不同的，对同一株病毒、同一时间、同一接种量感染受体为SLAM或Nectin4的稳定的细胞系，发现病毒分别感染SLAM或Nectin4细胞系，出现融合的时间、融合效率和病毒滴度之间均存在差异，病毒感染Nectin4的病毒滴度明显高于SLAM。因此，采用水貂源Nectin4基因为表达的目的基因，构建能更敏感分离犬瘟热病毒的Vero.mNectin4细胞系。
在本发明一些实施方式中，上述优化水貂源Nectin4基因缺少信号肽序列和终止密码子序列。去除信号肽序列和终止密码子序列，并选择用载体的天然终止密码子和Igκ链信号肽，可以提高水貂源Nectin4基因蛋白表达量并使其在细胞膜外表达。
在一些实施方式中，宿主细胞包括Vero细胞系或MCDK细胞系，优选为Vero细胞系。Vero细胞更易消化传代，减少了操作时间和降低了操作难度，并且有利于工业化生产。
在一些优选地实施方式中，将优化水貂源Nectin4基因插入到含有HA标签和Igκ链信号肽的pDisplay载体中，得到含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体。
在优选地实施方式中，优化水貂源Nectin4基因为，以水貂胎盘为模板来源，克隆富集得到的Nectin4基因，再去除信号肽序列和终止密码子序列后得到的基因序列。选择pDisplay作为载体，其PCMV启动子可以促进质粒在哺乳动物细胞内的高效表达并利用SignalP4.1Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在线软件预测Nectin4序列的信号肽，将不带有信号肽的Nectin4受体基因插入到多克隆位点BgII和SalI之间，使其在细胞膜外表达，缩短病毒增殖时间，去除基因片段的终止密码子，利用载体本身天然的终止密码子增强蛋白表达量。此外构建外源表达基因PDisplay载体含有HA标签和Igκ链信号肽，外源表达基因可以借助PDisplay载体HA标签鉴定外源蛋白表达鉴定；Igκ链信号肽能增强外源蛋白表达，并使表达外源蛋白锚定在细胞膜表面。
从水貂胎盘中克隆得到水貂源Nectin4基因所用的引物如下表所示：
序列(5’-3’) 序列号
Nectin4-F GCTCCGCCTTCTGAACGAT SEQ ID NO.2
Nectin4-R CTGGGTCAGACCAGATGCC SEQ ID NO.3
在一些优选地实施方式中，将含有优化水貂源Nectin4基因的转基因载体通过瞬时转染引入宿主细胞。
在一些优选地实施方式中，筛选包括抗生素梯度浓度压力选择和有限稀释法选择。采用G418抗生素梯度浓度压力选择和有限稀释法相结合的方法进行筛选，其中，G418抗生素的浓度优选为1000μg/ml，直至阴性细胞99％全部死亡，采用有限稀释法筛选受体稳定表达细胞，最后选取单个克隆且生长良好的单克隆细胞株。
在一种实施方式中，构建犬瘟热病毒敏感细胞系的具体的技术路线如图1所示：
(1)利用RT-PCR技术，从母水貂胎盘中克隆Nectin4基因，并测序进行基因序列分析，去除信号肽和终止密码子得到优化水貂源Nectin4基因。
(2)将优化水貂源Nectin4基因克隆到真核表达载体pDisplay中，构建真核表达质粒pDisplay-mNectin4。
(3)将重组质粒瞬时转染Vero细胞系，确定基因正常表达。
(4)瞬时转染成功表达后，通过G418抗生素加压筛选和有限稀释法筛选到能稳定表达mNectin4的Vero细胞系，建立稳定表达细胞系Vero.mNectin4。
(5)应用该细胞系对犬瘟热阳性组织样品进行病毒分离。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
实施例1水貂源Nectin4基因的克隆
以GenBank上发表的雪貂的Nectin4基因序列为参考，设计表达水貂Nectin4的RT-PCR扩增引物，首次成功从母水貂胎盘中克隆Nectin4基因。扩增产物经过1％的琼脂糖凝胶电泳，获得1530bp片段与预期结果大小一致，结果见图2。
获得Nectin4基因的引物序列如下：
序列(5’-3’) 序列号
Nectin4-F GCTCCGCCTTCTGAACGAT SEQ ID NO.2
Nectin4-R CTGGGTCAGACCAGATGCC SEQ ID NO.3
将Nectin4基因与PEASY-blunt-zero质粒重组得到PEASY-blunt-zero-minkNectin4，酶切验证结果如图3所示。
实施例2表达mNectin4真核表达质粒pDisplay-mNectin4的构建
为了增加mNectin4的表达量，利用PEASY-blunt-zero-minkNectin4基因为模版，将mNectin4基因去除信号肽和终止密码子序列，得到优化水貂源mNectin4基因并克隆到真核表达载体pDisplay中。设计带有BgII和SalI酶切位点上下游引物：
Figure BDA0002065625050000101
构建pDisplay-mNectin4真核表达质粒。
PCR反应体系为:模板1.2μL，上下游引物各0.4μL(10pmoL/μL)，premixTaq酶10μL，ddH2O补足20μL。扩增程序为:94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，35个循环；72℃5min。PCR得到目标片段如图4所示，产物通过1％琼脂糖凝胶回收后，经BgII和SalI酶双酶切后与同样酶切的pDisplay载体16℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取菌落培养后提取重组质粒经酶切鉴定阳性重组质粒。阳性重组菌液大量培养后经去内毒素试剂盒提取质粒，使其达到可转染用标准，-20℃保存备用。
转染：将vero(2×106/cell)细胞平铺于6孔板中，2％FBS的DMEM培养，过夜生长至细胞密度达到70％～90％时转染为宜。①7.5μl Lipofectin3000试剂于117.5μl Opti-MEM培养基中，混匀后室温静置2min。②4μg待转染质粒DNA于总体积为125μl Opti-MEM、8μlP3000混匀后室温静置2min。混合①、②两种溶液，室温静置15min。质粒转染之前弃掉培养板中的旧培养基，更换为1％FBS的DMEM培养，将Lipofectin试剂－DNA混合物250μl散状分布加入6孔中。同时设置重复转染孔及正常细胞培养孔，35℃5％CO2培养箱相培养48h。
Western Blot：细胞用1ml/cell PBS洗2次，加入预冷的RIPA Buffer 200μL(RIPABuffer：PMSF＝100：1)溶液中含有RNA酶抑制剂，溶液于振荡器上20min，直至细胞全部裂解完全。10000g离心10min，上清液与4×蛋白buffer4:1比列混匀，100℃变性10min，将样品加入8％SDS-PAGE变性蛋白胶中，400mA恒流湿转37min于PVDF膜上，5％脱脂乳封闭2h，一抗HA标签单抗(12CA5，roche)用PBS1:1000稀释，室温缓慢震荡孵育2h。1:5000的HRP山羊抗鼠(生工)二抗室温震荡孵育1h，最后将ECL显色液均匀加入膜上，于Tanon 5200扫描仪中扫描结果如图5所示。
实施例3稳定表达mNectin4的细胞系的筛选和建立
pDisplay-mNectin4真核表达质粒转染Vero细胞中，采用G418抗生素梯度浓度压力选择和有限稀释法相结合的方法进行筛选，具体如下：Vero细胞(2×106/cell)均匀平铺于6孔板中，5％FBS的DMEM培养基，5％CO2、37℃培养箱中培养，当细胞密度达到70％～90％时，将4μg pDisplay-mNectin-4真核表达质粒按Lip3000转染说明书转染，1000μg/ml G418抗生素压力选择，每3天更换一次培养基，直至阴性细胞99％全部死亡，经过6轮筛选后细胞形成一个个细胞簇。采用有限稀释法筛选受体稳定表达细胞，最后选取单个克隆且生长良好的单克隆细胞株转至6孔板中培养，经过两轮亚克隆后筛选获得1株稳定表达pDisplay-mNectin4基因的细胞系命名为VMN细胞系(即为本发明提供的保藏编号为CGMCCNO.17413的基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系)。从初代的Vero细胞到G418抗生素筛选，再到有限稀释法筛选的过程中，细胞形态如图6所示，其中，图A为Vero细胞，图B为G418筛选的细胞，图C为有限稀释法筛选第5天的细胞，图D为有限稀释法筛选第10天的细胞。
将亚克隆转接到T25瓶中扩大培养，按常规在细胞长满时消化、传代，筛选得到的阳性细胞系采用间接免疫荧光(IF)和Western blot方法鉴定水貂Nectin4基因在Vero细胞中的蛋白表达情况。间接免疫荧光结果如图7所示，其中，图A为细胞系培养10代的间接免疫荧光结果，图B为细胞系培养15代的间接免疫荧光结果，可以看到大量稳定增殖的细胞。Western blot结果如图8所示，细胞系可以稳定表达Nectin-4基因
实施例4稳定表达mNectin4的Vero细胞系稳定性评价
通过对建立的10，15代的稳定表达mNectin4的Vero.mNectin4细胞系进行2次冻融\复苏，鉴定Nectin4基因是否依旧正常表达，评价Vero.mNectin4细胞系对外源基因是否持续稳定的表达。结果表明细胞系可以稳定表达Nectin4基因，成功构建得到稳定表达mNectin4的Vero细胞系。
实施例5 CDV强毒株在Vero.mNectin4细胞系中的生长情况
应用该细胞系对本实验室保存的犬瘟热阳性病料SD(14)7株进行病毒分离，结果通过细胞病变CPE，并通过对CDV H基因克隆测序进行犬瘟热病毒基因序列分析，证实其在分离过程中病毒基因序列未发生适应性突变。
SD(14)7毒株接种到VMN细胞的结果如图9所示，其中，图A为vero阴性细胞，图B为毒株接种第3天，图C为毒株接种第4天。将SD(14)7毒株接种到VMN细胞72小时后，观察到合胞体出现，继续观察，发现合胞体不断变大，而将相同剂量SD(14)7接到正常的vero细胞中，没有出现细胞融合、细胞拉网等CPE。说明本发明提供的表达Nectin4受体的细胞系可介导病毒在细胞上生长繁殖。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院特产研究所
<120> 基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系、制备方法和应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> 貂
<400> 1
ggcgagctgg agacctcgga cctggtgacc gtggtgctgg gccaggacgc caagctgccc 60
tgcttctacc gaggggaccc cggcgagcag gtggggcagg tggcctgggc tcgggtgggc 120
gcgggcgagg gcccccggga gctagcgctg ctgcatatcc aatacgggct gcacgtgggc 180
gcggcctacg agggccgcgt ggagcagccg ccgcccccac ggagccccct ggacggctcc 240
gtgctcctgc gcaacgcggt gcaggccgac gagggcgaat acgagtgccg cgtcagcacc 300
ttccccgcgg gcagcttcca ggcgaggctg cggctccgcg tgctagtgcc tcccctgccc 360
tctctgaacc ctggtcctgc gctagaagag ggccagggcc tgacgctagc agcctcctgc 420
acagcagagg gcagcccagc ccccagcgtg acctgggaca cggaggtcaa gggcaccgcg 480
tccagccgct cattcaagca ctcccgctca gcggctgtca cgtccgagtt ccacctggtg 540
cccagccgca gcatgaatgg aaagccgctc acctgcgtgg tgtcccaccc cggtctgctc 600
caggaccaga ggatcaccca cgtcctccat gtggccttcc tcgctgaggc ctctgtgagg 660
ggccttgaag accagaagct gtggcaggtt ggcaaagaag gagccactct caagtgcctg 720
agcgaagggc accccccacc ctcgtacaac tggacacggt tggacgggcc cctgcccagc 780
ggggtccgag cggaagggga cacgctgggt tttcctccgc tgaccacaga gcacagtggc 840
atctacgtgt gccacgtcag caatgagctc tcctccaggg actctcaggt cactgtggat 900
gttcttgacc ctcaggacgc ccccgggaag caggtggacc tggtgtcggc ctctgtggtg 960
gtggtggggg tgatcgccgc cctccccttc tgcctcctgg ccgtcgtggt gctgctcatg 1020
tctcgctacc accggcgcaa ggctcagcag atgacccaga agtatgagga ggagttgacc 1080
ctgaccaggg agaactccat ccggaggctg cattcccatc acacggaccc caggagccag 1140
ccggaggaga gtgtagggcg gagagccgag ggccaccctg atagtctcaa ggacaacagt 1200
agctgctctg tgatgagtga agagccagag ggccgcagtt actccacact gaccacggtg 1260
agggagatcg aaacacagac agaactgctg tctccgggct ctgggcgggc cgaggaggag 1320
gaagaccggg atgaaggcat caaacacgcc atgaaccatt tcgttcaaga gaatgggacc 1380
ctgcgggcca aacccacggg caatggcatc tacatcaatg ggcgggggca tctggtc 1437
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gctccgcctt ctgaacgat 19
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ctgggtcaga ccagatgcc 19
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgaagatctg gcgagctgga gacctc 26
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcggtcgacg accagatgcc cccgcccatt 30

Claims (4)

1.一种基于水貂源Nectin4受体的犬瘟热病毒敏感细胞系，保藏编号为CGMCCNO.17413。
2.权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在培养和/或分离犬瘟热病毒强毒株中的应用。
3.权利要求1所述的犬瘟热病毒敏感细胞系在制备犬瘟热病毒鉴定产品或制备犬瘟热病毒诊断产品中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂或试剂盒。
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