CN111518772A - 一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用 - Google Patents

一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用，该方法包括：对hACE2基因进行PCR扩增，并将hACE2基因克隆至pEASY‑T1载体中；从载体pEASY‑T1‑hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体；将所述重组质粒转染哺乳细胞，以便获得重组慢病毒；将所述重组慢病毒与NK细胞混合，150g室温离心4小时，离心结束后加入培养基培养3‑4天。从而将hACE2基因整合到NK细胞上，使得NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，进而利用带hACE2蛋白胞外段的NK细胞抑制COVID‑19的S‑蛋白进攻正常细胞，抑制COVID‑19病毒的生长，达到预防和治疗的效果。

Description

一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(COVID-19)是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株。感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法。根据中科院的研究表明，COVID-19与SARS-CoV结合受体方式相似，均通过S-蛋白与hACE2蛋白结合感染细胞。与SARS-CoV相比，COVID-19的S-蛋白中与hACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4个发生了变化，但变化后的氨基酸，却在整体性上完美地维持了SARS-CoV的S-蛋白与hACE2蛋白互作的原结构构象。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，其与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，但其临床治疗效果有限；而外源型ACE2蛋白的数量有限。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提供一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法。该方法通过基因工程改造NK细胞，使NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，从而抑制COVID-19进攻人体细胞，达到预防和治疗的效果。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其包括以下步骤：
对hACE2基因进行PCR扩增，并将hACE2基因克隆至pEASY-T1载体中，以便获得载体pEASY-T1-hACE2；
从所述载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，以便获得重组质粒pLV-EGFP-hACE2；
将所述重组质粒pLV-EGFP-hACE2转染哺乳细胞，以便获得重组慢病毒；
将所述重组慢病毒与NK细胞混合，150g室温离心4小时，离心结束后加入培养基培养3-4天。
根据本发明的一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，该方法利用慢病毒系统将hACE2基因整合到NK细胞上，使得NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，维持hACE2蛋白数量，从而利用带hACE2蛋白胞外段的NK细胞抑制COVID-19的S-蛋白进攻正常细胞，进而抑制COVID-19病毒的生长，消灭COVID-19，达到预防和治疗的效果。
另外，根据本发明上述实施例提出的一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，还可以具有如下附加的技术特征：
根据本发明的实施例，对所述hACE2基因基因进行PCR扩增的引物对为：
hACE2-F：5′-TATGTCAA GCTCTTCCTGGCCTAGA-3′；
hACE2-R：5′-CGGAAACAGGGGGCTGGTTTCGAG-3′。
根据本发明的实施例，所述哺乳细胞为Lenti-X293T细胞系。
根据本发明的实施例，从所述载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对pEASY-T1-hACE2和pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；用DNA连接酶将酶切得到的hACE2基因产物和pLV-sf GFP(2A)Puro产物进行连接，以便获得重组质粒pLV-EGFP-hACE2。
在本发明的第二方面，本发明还提出了由上述的表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法制得的NK细胞。该NK细胞能够抑制COVID-19的S-蛋白进攻正常细胞，进而抑制COVID-19病毒的生长，消灭COVID-19，达到预防和治疗的效果
在本发明的第三方面，本发明提出了上述NK细胞的用途，所述用途用于制备抑制COVID-19病毒生长的药物。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物，所述药物组合物含有上述的NK细胞和药学上可接受的辅料。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为表面表达h ACE2的NK细胞的流式检测；
图2为NK细胞在体外对病毒的杀伤活性检测。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的技术方案。应理解，本发明提到的一个或多个方法步骤并不排斥在所述组合步骤前后还存在其他方法步骤或在这些明确提到的步骤之间还可以插入其他方法步骤；还应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。而且，除非另有说明，各方法步骤的编号仅为鉴别各方法步骤的便利工具，而非为限制各方法步骤的排列次序或限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容的情况下，当亦视为本发明可实施的范畴。
为了更好的理解上述技术方案，下面更详细地描述本发明的示例性实施例。虽然显示了本发明的示例性实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
术语“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
实施例1构建表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞
1、引物设计合成：根据NCBI上的人hACE2 mRNA序列，序列号为AY623811。用DNAman软件设计hACE2跨膜和胞外区的上下游引物，在hACE2基因N-端和C-端分别引Xba I和Xho I限制性酶切位点。
hACE2-F：5′-TATGTCAA GCTCTTCCTGGCCTAGA-3′；
hACE2-R：5′-CGGAAACAGGGGGCTGGTTTCGAG-3′。
2、RNA的收集以及PCR扩增：收集足量的生长状态良好的Caco-2细胞，根据Invitogen Trizol试剂说明书提取细胞的总RNA，加入1mL Trizol试剂，转入1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，反复颠倒数次，室温放置3min；4℃12000g离心15min；上清转移至新的1.5mL离心管中，加入500μL异丙醇，混匀，室温放置10min；4℃12000g离心10min；吸去上清，加入1mL75％乙醇，震荡混匀；4℃7500g离心5min；弃上清，带残留的乙醇挥发完全后，加入100μL1％DEPC水溶解总RNA。
RT-PCR以及PCR扩增目的基因根据Tiangen生化RT-PCR试剂盒使用说明，取1μg提取的总RNA进行反转录。利用上述设计的特异性引物在最佳扩增条件下进行PCR扩增，逆转录条件如下：第一轮分别以反转录产物cDNA为模板，PCR条件为94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，扩增30个循环，72℃补平10min。第二轮PCR以第一轮扩增的产物互为模板和引物进行重叠PCR，PCR条件为：94℃预变性3min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，扩增30个循环，72℃补平10min，获得核酸序列如SEQ ID NO:1所示的hACE2基因。
3、慢病毒过表达质粒载体的构建：将上述hACE2基因克隆至pEASY-T1载体中，连接体系为：目的片段1μL，pEASY-T1 1μL，总体积5μL，得到载体pEASY-T1-hACE2。从载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对pEASY-T1-hACE2和pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；所有操作均在冰盒上进行，双酶切的反应体系为：Xba I 2.5μL，Xho I 2.5μL，10×M Buffer 5μL，pEASY-T1-hACE2/pLV-sf GFP(2A)Puro 10μL，ddH2O up to 50μL。将加完试剂后的离心管轻轻混匀，低速离心之后置于37℃水浴锅中反应4h。反应完成后将酶切产物用0.7％琼脂糖凝胶进行电泳观察结果。切取目的条带hACE2区域和pLV-sf GFP(2A)Puro载体区域进行胶回收，测定浓度后使用In-Fusion HD Cloning Kit进行连接，连接体系为：hACE2 2μL，载体2μL，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，ddH2O up to 10μL；加完试剂后混匀，低速瞬时离心，50℃连接15min，得到连接产物。
将上述连接产物取2.5μL热转化至E.coli Competent Cell JM109中，涂布平板，37℃过夜培养。挑取单菌落摇菌培养，提取质粒。质粒用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳结果显示重组质粒条带大小与预期结果一致，将该重组质粒命名为pLV-EGFP-hACE2。
4、病毒载体的包装与浓缩纯化：将Lenti-X293T细胞在含有10％FBS的DMEM中于37℃和5％CO2下培养。当细胞密度为70-80％时进行转染实验。
将上述构建好的重组质粒pLV-EGFP-hACE2按比例加到293T细胞培养基中(细胞密度70-80％)，转染6h后，弃去培养基，PBS洗两遍后更换完全培养基。继续培养48h后，收集含慢病毒颗粒的上清。去除细胞碎片后通过超离心浓缩病毒。收集转染后48小时的293T细胞上清液。于4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片。以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。把病毒粗提液样品加入到过滤杯中(最多19ml)，盖上盖子。将过滤杯插到滤过液收集管中。组合好后，做好平衡，放在转头上。在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15分钟。离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。将过滤杯倒扣在样品收集杯上。离心力不超过1000g，时间为2分钟。过高转速会导致样品损失。把离心杯从样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
5、转染NK细胞：体外培养NK细胞，在2×105/ml悬浮细胞中加入聚凝胺polybrene至6μg/ml和按与NK细胞悬浮液培养基量(5mL)5：1上述浓缩后的病毒液，充分混匀。150g室温离心4h。离心结束后加入6mL新鲜培养基以稀释polybrene，继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
6、转染后NK细胞上ACE2的鉴定：取上述培养几天后的NK细胞，用ACE2荧光抗体共孵育，用流式细胞仪检测ACE2表达情况，并与正常NK细胞对比。结果如图1所示，ACE2荧光抗体标记后，与正常NK细胞相比，转染的NK细胞有荧光信号，说明有表达ACE2蛋白。
实施例2表达hACE2的NK细胞的杀伤活性
COVID-19的S-蛋白中与hACE2蛋白结合的5个关键氨基酸有4个发生了变化，但变化后的氨基酸，却在整体性上完美地维持了SARS-CoV的S-蛋白与hACE2蛋白互作的原结构构象。因此使用SARS-CoV的假病毒SARS-s来验证hACE2-NK与S蛋白的结合，无致病性，质控方法可靠。用SARS-s感染体外培养的293T细胞。表达hACE2的NK细胞与感染SARS-s假病毒的293T细胞置于96孔板中共孵育(细胞数量1：1，1.0*106个/mL)。共孵育2h后。加入乳酸脱氢酶LDH底物溶液100μL，37℃避光反应10min，加入30μL 1mol/L的柠檬酸终止酶促反应。在酶标仪下检测570nm下OD值，计算NK细胞的杀伤活性。
乳酸脱氢酶LDH底物溶液的配制：硝基氧化四氮唑蓝NBT 4mg，氧化型辅酶I NAD+I10mg，吩嗪二甲酯硫酸盐PMS 1mg，溶于2mL纯化水。取1.6mL上清，加入1mol/L乳酸钠溶液0.4mL，加入PBS稀释至10mL，备用。
实验分组如下：
实验组 对照组 最大对照组 最小对照组
感染293T细胞 + + + +
NK细胞 - + - -
hACE2-NK细胞 + - - -
NP-40 - - + -
注：NP-40是温和的非离子型去垢剂，1％浓度可以破坏掉细胞膜，释放全部的LDH；
NK细胞活性：(测试OD值-最小对照组OD值)/(最大对照组OD值-最小对照组OD值)×100％。
结果如图2所示，结果表明，相对于对照细胞，表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞对SARS-s病毒的杀伤作用显著增强，细胞杀伤活性从31.8％提高到78.9％，可用于抑制COVID-19进攻人体正常细胞。
综上，本发明的实施例利用慢病毒系统将hACE2基因整合到NK细胞上，使得NK细胞能够持续表达hACE2蛋白胞外段，维持hACE2蛋白数量，从而利用带hACE2蛋白胞外段的NK细胞抑制COVID-19的S-蛋白进攻正常细胞，进而抑制COVID-19病毒的生长，消灭COVID-19，达到预防和治疗的效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
序列表
<110> 厦门诺康得生物科技有限公司，来复（厦门）基因科技有限公司
<120> 一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法及其应用
<130> 无
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2220
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata acgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaaag gcgacttcag gatccttatg 1080
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catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
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aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat agagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920
tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040
tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160
agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220

Claims (7)

1.一种表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
对hACE2基因进行PCR扩增，并将hACE2基因克隆至pEASY-T1载体中，以便获得载体pEASY-T1-hACE2；
从所述载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，以便获得重组质粒pLV-EGFP-hACE2；
将所述重组质粒pLV-EGFP-hACE2转染哺乳细胞，以便获得重组慢病毒；
将所述重组慢病毒与NK细胞混合，150g室温离心4小时，离心结束后加入培养基培养3-4天。
2.如权利要求1所述的表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其特征在于，对所述hACE2基因基因进行PCR扩增的引物对为：
hACE2-F：5′-TATGTCAA GCTCTTCCTGGCCTAGA-3′；
hACE2-R：5′-CGGAAACAGGGGGCTGGTTTCGAG-3′。
3.如权利要求1所述的表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其特征在于，所述哺乳细胞为Lenti-X293T细胞系。
4.如权利要求1所述的表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法，其特征在于，从所述载体pEASY-T1-hACE2上将hACE2基因克隆至慢病毒表达载体pLV-sf GFP(2A)Puro中，用限制性内切酶Xba I和Xho I分别对pEASY-T1-hACE2和pLV-sf GFP(2A)Puro进行双酶切；用DNA连接酶将酶切得到的hACE2基因产物和pLV-sf GFP(2A)Puro产物进行连接，以便获得重组质粒pLV-EGFP-hACE2。
5.由权利要求1～4中任一项所述的表达hACE2蛋白胞外段的NK细胞的构建方法制得的NK细胞。
6.权利要求5所述的NK细胞的用途，其特征在于，所述用途用于制备抑制COVID-19病毒生长的药物。
7.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求5所述的NK细胞和药学上可接受的辅料。
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