CN108753806A - 增强目标rna装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents

增强目标rna装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。同时设计一种所述的增强目标RNA装载的融合蛋白的表达载体的构建方法；制备一种含增强目标RNA装载的融合蛋白的表达载体的外泌体。并将所述表达载体或所述外泌体在基因治疗的靶向递送、RNA调控的相关疾病治疗中应用。本发明可实现对候选RNA分子高效装载，同时减少外泌体对细胞内源RNA的加载。可作为基因治疗的靶向递送提供优化型载体。

Description

增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建 方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。
背景技术
外泌体是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。CD9是一种四次跨膜分子，是外泌体的标志性膜分子。目前多个研究报道，通过改造CD9分子，如通过与EGFP融合可以实现外泌体的示踪，通过将CD9胞外段与靶向肽融合，能够增强外泌体的靶向性。
RNA结合蛋白通过转录后调控方式调节基因表达，其中有相当比例通过增加mRNA稳定性和翻译效率，促进基因表达，在多种疾病中扮演重要角色。研究表明，RNA结合蛋白在外泌体RNA分选中发挥着重要的作用。目前，如何利用RNA结合蛋白高效装载目的RNA至外泌体，以提升外泌体效能，尚缺乏有效手段。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体及其构建方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术思路如下：
发明人长期大量研究发现可利用RNA结合蛋白结合目的RNA，协助RNA进入外泌体，高效加载目的RNA，改构的外泌体作为细胞间蛋白和核酸信息分子传递的手段，可以有效实现干预内源蛋白的目的。
改构外泌体加载目标RNA，并递送至目标细胞的流程如图1所示：
在左侧的包装细胞，CD9-HuR融合蛋白和待包装的RNA(miR155或带ARE的mRNA)一并转染入包装细胞，其产生的外泌体被受体细胞吞噬后，可以释放包装的目标RNA，目标RNA可以在受体细胞发挥其抑制基因表达(装载miRNA时)或者翻译成功能蛋白(装载mRNA时)，实现干预目的基因的功能。
具体采用如下技术方案：
设计一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。
优选的，所述外泌体膜靶向蛋白为CD9。
优选的，所述RNA结合蛋白为人抗原R。
设计一种所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的构建方法，包括以下步骤：
(1)提取小鼠成纤维细胞总RNA；
(2)对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；
(3)以所述反转录cDNA为模板，扩增外泌体膜靶向蛋白和RNA结合蛋白目的条带；
(4)将目的条带经限制性内切酶酶切连入表达载体，即得。
制备一种含增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的外泌体：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，包装病毒与目的RNA共同转染外泌体包装细胞，细胞分泌的外泌体即为目的外泌体。
优选的，所述包装质粒为psPAX2和/或pMD2.G。
将所述表达载体或所述外泌体在基因治疗的靶向递送中应用。
将所述表达载体或所述外泌体在RNA调控的相关疾病治疗中应用。
与现有技术相比，本发明的有益技术效果在于：
1.本发明的表达载体与待加载的RNA共同转染或感染外泌体包装细胞，表达的融合蛋白就能够携带某类RNA进入外泌体，该外泌体可以显著提升外泌体装载目标RNA的效率，同时当该外泌体进入受体细胞后，可以有效递送RNA，发挥RNA的功能。
2.本发明可以实现对候选RNA分子(miRNA，siRNA，mRNA，lncRNA)进行高效装载，与此同时还可以减少外泌体对细胞内源RNA的加载，最大限度降低非期望的RNA进入外泌体。
3.本发明可作为基因治疗的靶向递送提供优化型载体，意义重大。
附图说明
图1为改构外泌体加载目标RNA，并递送至目标细胞的流程示意图；
图2为pcDNA3.1-CD9-HuR结构示意图；
图3为pWPI-CD9-HuR的结构示意图；
图4为CD9-HuR在包装细胞改构外泌体的示意图；
图5为粒径分析仪分析外泌体数量和大小分布图；
图6为电镜分析改构外泌体的形态特征图；
图7为Western Blot检测外泌体及包装细胞中融合蛋白及外泌体表面标志表达图；
其中，A为细胞及外泌体融合蛋白CD9-HuR的表达；B为细胞及外泌体中外泌体标志物的表达；
图8为外泌体水平装载目标RNA miR155的加载效率图；
其中，A为细胞中miR155的表达；B为外泌体中miR155的表达，细胞中部分miR155转移到外泌体；
图9为细胞水平目标RNAmiR155的表达效率及对靶基因表达SOCS1的影响图；
其中，a为共培养示意图；b为荧光标记的外泌体进入THP1细胞；c为不同处理THP1中miR155的表达；d为不同处理THP1细胞中SOCS1的蛋白表达水平的改变；
图10为动物水平观察目标RNA miR155的表达效率及对靶基因表达的影响；
其中，a为外泌体在小鼠全身的分布；b为免疫荧光显示外泌体在肝脏定位情况；c为离体器官水平外泌体的定位情况；d～h为qPCR检测外泌体向各个器官递送miR155的情况；
图11为dCas9及dCas9-AREs结构示意图；
图12为C/ebpαgRNA构建的示意图；
图13为CD9-HuR外泌体中dCas9-ARE的加载效率图；
图14为脂肪干细胞ASC细胞中dCas9 ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体显著抑制C/ebpα的表达，而对照外泌体dCas9/gRNA@CD9-HuR无此效应；
图15为动物水平dCas9 ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体显著抑制肝脏C/ebpα的表达；
具体实施方式
下面结合附图和实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
人抗原R(HuR)是最早发现的RNA结合蛋白之一，可增加多种生长因子、细胞因子mRNA的稳定性，从而上调蛋白质表达。
实施例一：构建RNA结合蛋白外泌体
构建具体步骤如下：
(1)Trizol提取小鼠成纤维细胞总RNA；
(2)利用Promega M-MLV反转录酶对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；
反应体系如表1所示：
表1反应体系
RNA模板 2μg
5×RT buffer 4μl
dNTP混合液(10mM) 2μl
0.1M DTT 2μl
M-MLV逆转录酶 1μl
总体系 20μl
将上述试剂混匀，低速短离心，置于37℃恒温箱中作用1h，随后80℃失活5min，-20℃保存。
(3)以反转录cDNA为模板，克隆RNA结合蛋白HuR的CDS区和膜分子CD9的CDS区；
引物和PCR反应体系如表2和表3所示：
表2反应引物
表3反应体系
PCR反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃30s～2min(随产物长短而定)，共设30～35个循环。
(4)克隆：
首先将CD9的PCR产物通过限制性内切酶Nhe1和Xho1克隆至pcDNA3.1载体得pcDNA3.1-CD9；
然后将HuR的PCR产物再通过限制性内切酶Xho1和EcoR1克隆至前述pcDNA3.1-CD9载体得pcDNA3.1-CD9-HuR；得到的pcDNA3.1-CD9-HuR，载体的结构如图2所示。
(5)亚克隆：
利用CD9-HuR sub-cloning为引物，以pcDNA3.1-CD9-HuR为模板；采用高保真的Pfu mix酶，扩增融合片段；
反应体系如表4所示：
表4反应体系
反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃3min，共设25个循环。
(6)将步骤(5)的PCR产物通过限制性内切酶Pac1连入pWPI载体，得pWPI-CD9-HuR融合表达载体，载体的结构如图3所示。
(7)测序确立成功后，与包装质粒(psPAX2及pMD2.G)一起共转染HEK293T细胞包装病毒，备用。
实施例二：改构外泌体理化性质验证试验
如图4所示，将实施例一构建好的表达融合蛋白CD9-HuR的病毒感染病毒包装细胞HEK293T，获得表达融合蛋白的病毒颗粒。将该病毒感染骨髓间充质细胞MSC，然后在无血清条件下培养，48～72小时之间收集外泌体，通过外泌体分离提取试剂盒ExoQuick提取外泌体。鉴定外泌体的数量、大小、融合表达的效率。
如图5所示，将收集的外泌体用PBS按1:1000稀释，然后通过Nanosight进行外泌体数量和大小的鉴定，发现外泌体的粒在40～200nm的区间内。
如图6所示，通过电镜检测进一步明确外泌体的形态，改构外泌体形态完整，结构相似。
如图7所示，为了验证融合表达的效率，将收集的外泌体进行蛋白裂解，融合通过Western Blot进行检测，观察融合蛋白CD9-HuR的表达水平；同时Western检测还验证了外泌体Marker的表达。
实施例四：改构外泌体加载核酸试验
将构建好的表达融合蛋白CD9-HuR的病毒感染外泌体包装细胞，然后给外泌体包装细胞转染待加载的miR155或dCas9-ARE，然后在无血清条件下培养，48～72小时之间收集外泌体，通过外泌体分离提取方法提取外泌体。
(1)miR155的加载和递送
miR155为直接合成。
将构建好的表达融合蛋白CD9-HuR的病毒感染外泌体包装细胞，然后给外泌体包装细胞同时转染待加载的miR155，然后在无血清条件下培养，48～72小时之间收集外泌体，通过外泌体分离提取方法提取外泌体。
分别在细胞和体内水平探讨外泌体加载、递送及干预效率。
结果如下：
(a)外泌体水平
提取外泌体，qPCR检测目标RNA分子的加载效率。
qPCR引物如表5所示：
表5反应引物
结果如图8所示，与对照外泌体相比，融合蛋白CD9-HuR修饰的外泌体显著增加了miR155水平。
(b)细胞水平
将收集的miR155@CD9-HuR外泌体进行荧光标记，然后与THP1细胞共孵育，24小时后，免疫荧光观察外泌体进入目的细胞的效率。裂解细胞，观察细胞内目标RNA miR155表达显著增加，而其靶基因SOCS1表达显著降低。
结果如图9所示，CD9-HuR改构外泌体高效递送了miR155进入THP1细胞，进而抑制SOCS1的表达。
(c)动物水平
将收集的外泌体进行荧光标记，然后尾静脉注射入小鼠体内，24小时后，小动物荧光成像观察外泌体在全身各个组织的定位。在此基础上，进一步收集各种组织，免疫荧光观察外泌体进入目的细胞的效率。裂解组织，观察目标RNA的表达效率及对靶基因表达的影响。
结果如图10所示，该外泌体主要将miR155递送至小鼠肝脏细胞。
(2)dCas9-ARE/sgRNA的加载和递送
dCas9-ARE的构建方法如下：
以lenti dCAS-VP64_Blast(Addgene#61425)为模板，通过dCas9引物(表6)；采用高保真的Pfu mix酶，扩增融合片段；
表6反应引物
反应体系如表7所示：
表7反应体系
反应条件为：预变性，95℃3min；循环，95℃15s，58℃15s，72℃2min，共设25个循环。
随后将PCR产物通过限制性内切酶Pac1和BstB1连入pWPI载体，得pWPI-dCas9融合表达载体。随后，将载体通过BstB1酶切后，将AREs双链退火后连入pWPI-dCas9载体，克隆测序正确的载体即为pWPI-dCas9-AREs。具体结构如图11所示。
C/ebpαgRNA载体构建：
合成表8序列，退火；将plenti-gRNA puro载体通过BsmB1酶切，回收载体；将退火序列连入plenti-gRNA puro载体。得到的正确克隆即为C/ebpαgRNA载体，结构示意图如图12。
表8 C/ebpαgRNA载体构建序列
分别将上述dCas9-AREs、C/ebpαgRNA与包装质粒(psPAX2及pMD2.G)一起共转染HEK293T细胞包装病毒，备用。
将构建好的表达融合蛋白CD9-HuR的病毒、dCas9-ARE、C/ebpαgRNA或其对照病毒感染外泌体包装细胞，然后在无血清条件下培养，48～72小时之间收集外泌体，通过外泌体分离提取方法提取外泌体。
(a)外泌体水平
提取外泌体，qPCR检测目标RNA分子dCas9-ARE的加载效率。qPCR引物如表9所示：
表9反应引物
结果如图13所示，融合蛋白CD9-HuR修饰的外泌体显著增加了dCas9-ARE的RNA水平，而不能增加对照dCas9的水平。
(b)细胞水平
将收集的dCas9 ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体或对照外泌体与ASC细胞共孵育，48小时后观察细胞内目标C/ebpαRNA表达水平。
结果如图14所示，dCas9/gRNA@CD9-HuR外泌体高效递送了dCas9 ARE/gRNA进入细胞，进而抑制C/ebpαRNA的表达。
(c)动物水平
将收集的dCas9 ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体或对照外泌体尾静脉注射入小鼠体内，48小时后，裂解肝脏组织，观察目标C/ebpαRNA的表达。
结果如图15所示，该dCas9 ARE/gRNA@CD9-HuR外泌体显著抑制小鼠肝脏细胞C/ebpαRNA的表达。
上面结合附图和实施例对本发明作了详细的说明，但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，在此不再一一详述。

Claims (8)

1.一种增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括目标RNA结合蛋白序列和外泌体膜靶向蛋白序列；所述目标RNA结合蛋白序列包括RNA结合蛋白全序列或RNA结合结构域序列；所述外泌体膜靶向蛋白能够定位于外泌体。
2.根据权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述外泌体膜靶向蛋白为CD9。
3.根据权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体，其特征在于，所述RNA结合蛋白为人抗原R。
4.一种权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）提取小鼠成纤维细胞总RNA；
（2）对RNA进行反转录得小鼠成纤维细胞cDNA；
（3）以所述反转录cDNA为模板，扩增外泌体膜靶向蛋白和RNA结合蛋白目的条带；
（4）将目的条带经限制性内切酶酶切连入表达载体，即得。
5.一种含权利要求1所述的增强目标RNA装载入外泌体的融合蛋白的表达载体的外泌体，其特征在于，所述外泌体的制备方法为：将所述载体与包装质粒一起共转染HEK293T细胞包装病毒，病毒感染外泌体包装细胞，同时转染待包装RNA，分泌的外泌体即目的外泌体。
6.根据权利要求5所述的外泌体，其特征在于，所述包装质粒为psPAX2和/或pMD2.G。
7.权利要求1所述表达载体或权利要求5所述外泌体在基因治疗的靶向递送中的应用。
8.权利要求1所述表达载体或权利要求5所述外泌体在RNA调控的相关疾病治疗中的应用。
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