CN107980045A - 含有靶蛋白的外来体的制备方法及利用由所述制备方法制备的外来体来将靶蛋白传递至细胞质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及大量制备含有靶蛋白的外来体的方法,能够用于制备所述外来体的外来体制备用载体,由所述方法制备的含有靶蛋白的外来体及利用制得的外来体将靶蛋白传递至细胞质的方法。利用本发明提供的制备含有靶蛋白的外来体的方法,能够以高收率制备含有靶蛋白的外来体,从而能够在利用外来体来治疗疾病方面广泛地使用。
Description
技术领域
本发明涉及利用光特异性结合蛋白来制备含有靶蛋白的外来体的方法,以及利用由所述制备方法制备的外来体将靶蛋白传递至细胞质的方法。
背景技术
人体大致由200多种的100万亿个细胞组成,生理活性通过细胞内的各种蛋白质的作用来调节,以维持生命。
细胞被由磷脂组成的双层膜结构的细胞膜所包围,细胞膜阻止异物进入细胞。迄今为止开发的蛋白质治疗剂仍不能透过细胞膜进入细胞质内,而是作用于细胞外部,或者作用于细胞膜上的受体(receptor)以将信号传递至细胞内,从而显示出生理效果。
细胞质中存在大量的蛋白质,它们通过相互作用来调节生理活性,如果能够将蛋白质治疗剂直接放入细胞内,即放入细胞质内,则细胞活性将能够得到更有效的控制。
最近,正在积极展开对于使靶蛋白通过细胞膜而直接流入细胞内的方法的研究。当制备通过细胞膜的作为肽的细胞膜通过区域(蛋白转导离子区域(Protein Transduction Domains,PTDs))和靶蛋白的重组蛋白(recombinant protein)而进行施用时,则可以通过细胞膜进入到细胞质内(图1)。作为细胞膜通过蛋白转导域(PTD),例如有HIV-1TAT、HSV VP22、Antp、dfTAT、Hph-1等,将其与靶蛋白结合的融合蛋白以重组蛋白形态进行生产后,需要进行分离的过程,但在该过程中,存在不能正常进行蛋白质重折叠(refolding)的问题,从而会导致活性降低,蛋白质被非特异性传递,在活体内引起免疫反应的风险大,而且费用昂贵,还存在收率低的问题。
与各种纳米颗粒(nanoparticle)结合的靶蛋白可以通过内吞作用(Endocytosis)通过细胞膜而进入到细胞质内(图2)。纳米颗粒的例子有,金NP(Gold NP)、脂质体NP(Liposome NP)、磁性icNP(Magnet icNP)、聚合物NP(Polymeric NP)等,它们与靶蛋白的结合体的分离大部分发生在细胞内的溶酶体(lysosome)中,因此靶蛋白在溶酶体内部进行分解而失去活性,或者因靶蛋白与纳米颗粒在细胞质中难以进行分离,从而使纳米颗粒具有毒性,这会成为问题。
外来体(Exosome)为具有50~200nm大小的膜结构的小囊泡,其含有蛋白质、DNA和RNA等,向细胞外分泌,用于细胞间的信号传递。
外来体是在以下过程中被发现的。即在红细胞成熟的最后阶段,通过排出并去除细胞内的蛋白质,从而使得红细胞内仅存留血红蛋白的过程中发现的。在通过电子显微镜来研究这种外来体时发现,该外来体不直接从细胞质膜(plasma membrane)分离,而是从被称为多泡体(Mult ivesicular bodies,MVBs)的细胞内特异性分离区排出并分泌到细胞外的。即,多泡体和细胞质膜进行融合时,这样的小囊泡就会被释放到细胞外的环境中,将其称为外来体(图3)。
虽然还不能明确地确定这种外来体是基于什么样的分子机制而产生的,但是已知包括B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突细胞、巨核细胞(megakaryocyte)和巨噬细胞等在内的多种免疫细胞与干细胞及肿瘤细胞等在存活的状态下,会生产并分泌外来体。
外来体包含细胞内的各种蛋白质、DNA、RNA等。被包含在这样的外来体中而向细胞外分泌的物质通过与细胞膜之间的融合(fusion)或内吞作用(endocytosis)而会再次流进其它的细胞内,从而起到细胞间信使的作用。此外,通过对包含在这种外来体中而向细胞外分泌的物质进行分析,可以用于诊断特异性疾病。
外来体内还包含各种类型的微小RNA。已知有通过检测其存在与否及其丰度来诊断疾病的方法(参照KR10-2010-0127768A)。尤其是国际专利公开第WO2009-015357A描述了一种通过检测来源于癌症患者的试样(血液,唾液,泪液等)中的外来体,从而测定微小RNA的变化量,当相较于对照组增加或减少时,预测和诊断与特定疾病之间的关联性的方法。特别地,分析从具有特定疾病(肺部疾病)的患者获得的外来体,并且具体公开了特异性微小RNA和肺部疾病之间的关联性。除了肺部疾病之外,对于利用外来体所包含的蛋白质来诊断肾脏疾病的方法也正在展开研究。
另外,外来体也可能包含抗原。同时,在抗原呈递细胞(antigen present ingcell,APC)中,包括多泡体的具有膜结构的细胞内区室中,抗原肽被负载在主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)II类分子上,因此源于此的外来体也具有抗原肽-MHCII类复合物。因此,外来体作为免疫原(immunogen)的载体,将抗原肽呈递给CD4+T淋巴细胞,从而可诱导T淋巴细胞的增殖等免疫反应。此外,能够刺激免疫反应的MHCI类和热休克蛋白(heat-shock proteins,HSPs)等分子被浓缩在外来体中,因此外来体在治疗自身免疫疾病(autoimmune disease)或肿瘤方面,能够用于增强或减少免疫。
此外,包含靶蛋白的外来体可以用于活体内各种疾病的治疗。例如,可以制备外来体,所述外来体含有显示出抗癌效果的作为靶蛋白的蛋白质或siRNA,然后将所述外来体处理至癌细胞用于癌症的治疗。(图4)。
如此地,可以将包含靶蛋白的外来体用于疾病的治疗。为此,需要能够高效地制备出包含靶蛋白的外来体。韩国专利公开第2004-0015508记载了一种制备包含特异性抗原的外来体的方法。公开了通过外来体将蛋白质释放到细胞外的方法和将这种外来体作为疫苗(vaccine)使用的方法。其中,将编码特异性抗原的基因导入到细胞系内,被导入的基因的蛋白质在细胞系内稳定地表达,从而通过外来体将蛋白质释放到细胞外。
然而,由于所述外来体是在细胞内天然形成的,因此即使将编码靶蛋白的基因导入到外来体生产细胞中,制备出内部含有被表达的蛋白质的外来体的可能性也非常低。
因此,本发明人为了开发出能够更为有效地制备出包含靶蛋白的外来体而进行深入研究的结果,确认了通过将外来体特异性标记物和靶蛋白进行融合的融合蛋白在大量制备外来体的细胞中进行表达,能够有效地制备包含靶蛋白的外来体(图5)。
此外,还确认了以下内容。靶蛋白附着在外来体的膜上,将光特异性结合蛋白对分别与外来体特异性标记物和靶蛋白进行融合的融合蛋白在大量外来体生产细胞中表达,通过照射光使各个融合蛋白进行结合,这些结合蛋白通过外来体特异性标记物而流进外来体内部,流进外来体内部后停止照射光,则外来体内部的靶蛋白和光特异性结合蛋白的融合蛋白进行分离,从而能够制得靶蛋白以游离(free)状态包含在内部的外来体。
此外,通过确认利用内部包含靶蛋白的外来体,能够使靶蛋白传递至靶细胞的细胞质中,由此公开了一种通过有效地调节细胞质中的细胞内信号(Intracellularsignaling)来治疗疾病的方法。
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于,提供一种大量制备外来体的方法,该外来体包含外来体特异性标记物和靶蛋白的融合蛋白。
本发明的另一目的在于,提供一种大量制备外来体的方法,该外来体包含利用光特异性结合蛋白对从外来体膜分离出来的靶蛋白。
本发明的再一目的在于,提供一种能够在所述外来体的制备中使用的外来体制备用载体。
本发明的又一目的在于,提供一种利用所述外来体使靶蛋白流入细胞质的方法。
用于解决问题的手段
本发明涉及一种有效地大量制备包含靶蛋白的外来体的方法。
本发明人为了开发出能够更为有效地制备将靶蛋白包含在内部的外来体的方法,在进行大量的研究中,注意到了外来体特异性标记物(CD9、CD63、CD81和CD82)。所述外来体特异性标记物的共同点在于,均是属于跨膜四蛋白(tetraspanin)家族的4次膜渗透型膜蛋白,因此,本发明人预测出,当将靶蛋白结合到所述外来体的膜蛋白时,能够比较容易地包含在外来体内部。
如此地,将外来体膜中特异性地大量存在的贯穿细胞膜的外来体特异性标记物与靶蛋白的融合蛋白,在大量制备外来体的细胞中进行表达,则能够大量制得包含靶蛋白的外来体。
具体地,本发明制备包含靶蛋白的外来体的方法,其特征为,在外来体生产细胞中导入编码融合蛋白的多核苷酸并进行表达。所述融合蛋白为外来体特异性标记物和靶蛋白结合的融合蛋白。
此时,在生成的外来体,靶蛋白与嵌入外来体膜中的外来体特异性标记物融合在一起。
所述靶蛋白呈与所述外来体的膜蛋白质结合的状态,在到达靶细胞后也不会发生分离。为了解决这一问题,进行大量的研究后,开发出以下技术。即,使用光特异性结合蛋白,瞬时将靶蛋白结合到所述标记蛋白上,从而制备内部包含靶蛋白的外来体。例如,可以利用光特异性结合蛋白CIBN和CRY2,具体地,为了使所述CIBN与所述标记蛋白之一的CD9以融合的形态表达,使所述CRY2与靶蛋白以融合的形态表达,将编码这些融合蛋白的基因导入到外来体生产细胞中。在所述外来体生产细胞中表达的CIBN-CD9融合蛋白因CD9而被包含在外来体中,此时,对所述细胞实施蓝色发光二极管(LED)光照射时,在所述外来体生产细胞中表达的靶蛋白-CRY2融合蛋白的CRY2结构域与融合在CD9上的CIBN结构域结合,从而形成靶蛋白-CRY2-CIBN-CD9形态的可逆诱导的融合蛋白,这样的融合蛋白因CD9而包含在外来体内部。一旦生产出这种内部包含靶蛋白的外来体后,并且停止照射所述蓝光LEG照射时,CIBN-CRY2结合会被解除,因此靶蛋白会以未结合在细胞膜上的状态被包含在外来体内部,从而能够制备包含靶蛋白的外来体(图5至图10)。
通过本发明制备的外来体与现有的包含目标物质的外来体相比,能够显示出完全不同的效果。为了使靶蛋白包含在外来体内部,现有的外来体采用使其以融合到外来体特异性标记物上的形态进行表达,因此,虽然所述靶蛋白被包含在了外来体内部,但是是以附着在外来体膜上的状态存在,而不能从外来体膜上分离下来,因此,只有所述外来体融合在靶细胞的细胞膜的情况下,所述靶蛋白才能传递到靶细胞内,而且即使像这样融合到靶细胞后,也是以融合在外来体膜上的与外来体结合的形态存在,因此所述靶蛋白在靶细胞内显示出其效果的概率非常低。但是,本发明提供的外来体,由于靶蛋白以未与膜结合的状态被包含在外来体内部,因此当所述外来体被靶细胞内吞(endocytosis)而进入细胞质时,由于靶蛋白不是附着在外来体膜上,因此在外来体被分解的情况下,靶蛋白能够传递至靶细胞的细胞质,并且能够在靶细胞的细胞质内自由地移动,因此具有靶蛋白能够在靶细胞质内充分显示出其生理活性的优点(图11)。
不仅如此,结合在标记蛋白上的靶蛋白的结合水平是随着照射光的强度而发生改变,因此当调节所述光的强度时,能够调节外来体内被包含的靶蛋白的含量。
因此,利用光特异性结合蛋白来制备包含靶蛋白的外来体的方法至今还未被公开过,是由本发明人首先开发并提出的。
具体地,本发明的制备包含靶蛋白的外来体的方法包括以下步骤。a)向外来体生产细胞内导入编码融合蛋白(第一融合蛋白)的多核苷酸,以及编码融合蛋白(第二融合蛋白)的多核苷酸;所述第一融合蛋白为外来体特异性标记物和第一光特异性结合蛋白结合的形态;所述第二融合蛋白为第二光特异性结合蛋白和靶蛋白结合的形态,所述第二光特异性结合蛋白能够与所述第一光特异性结合蛋白进行结合;b)向所述外来体生产细胞照射能够诱发所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白进行结合的光;以及c)在所述外来体生产细胞生产外来体之后,停止照射所述光。
本发明的术语“外来体”是指,源于被称为多泡体(multivesicular bodies,MVBs)的细胞内特定区室,并且向细胞外释放或分泌的细胞质膜结构的小囊泡。
本发明中,所述外来体将靶蛋白包含在其内部,从而能够起到向靶蛋白的靶细胞或组织运送靶蛋白的运送载体的作用,通过所述外来体运送的靶蛋白作用于靶细胞或组织,从而能够用于治疗或诊断特定的疾病。
本发明的术语“外来体生产细胞”是指能够生产所述外来体的细胞。
在本发明中,对所述外来体生产细胞没有特别限定,但可以列举如B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突细胞、巨核细胞、巨噬细胞、干细胞及肿瘤细胞等。例如,在本发明的实施例中,使用了永生化细胞系(immortalized cell line)之一的HEK293T细胞作为所述外来体生产细胞。
本发明的术语“外来体特异性标记物”是指,富含在外来体膜上的蛋白质。
在本发明中,对所述外来体特异性标记物没有特别限制,但可以列举如CD9、CD63、CD81、CD82等。例如,在本发明的实施例中,使用了CD9作为外来体特异性标记物。
CD9、CD63、CD81、CD82为4次渗透型膜蛋白,在外来体的膜蛋白上结合靶蛋白时,能够容易使靶蛋白存在于外来体内部。
本发明的术语“光特异性结合蛋白”也被称为光诱导异型二聚体形成蛋白或光诱导同型二聚体形成蛋白,是指当照射特定波长的光时,与相互不同的蛋白质结合从而能够形成异型二聚体的蛋白质,或者与同种类的其它蛋白质结合从而能够形成同型二聚体的蛋白质。
在本发明中,对所述特异性结合蛋白没有特别限定,但可以列举为光诱导异型二聚体形成蛋白,作为另外的例子,可以为隐花色素碱性螺旋-环-螺旋反应子蛋白(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix protein,CIB)、隐花色素碱性螺旋-环-螺旋反应子蛋白的N-末端结构域(N-terminal domain of CIB,CIBN)、光敏色素B(phytochrome B,PhyB)、光敏色素作用因子(phytochrome interacting factor,PIF)、FKF1(Flavinbinding,Kelch repeat,Fbox1)、GIGANTEA、隐花色素(chryptochrome,CRY)及PHR(phytolyase homolgous区域(phytolyase homolgous region))等。
尤其是在形成异型二聚体时,可以使用两种光特异性结合蛋白(第一光特异性结合蛋白及第二光特异性结合蛋白),当所述第一光特异性结合蛋白为CIB或CIBN时,与其对应的第二光特异性结合蛋白可以为CRY或PHR,当所述第一光特异性结合蛋白为PhyB时,与其对应的第二光特异性结合蛋白可以为PIF,当所述第一光特异性结合蛋白为GIGANTEA时,与其对应的第二光特异性结合蛋白可以为FKF1。
例如,在本发明的实施例中,使用CIBN作为第一光特异性结合蛋白,使用CRY2作为第二光特异性结合蛋白,所使用的光的波长设定为显示蓝光的460~490nm,所述光的强度设定为20~50μW。
此外,为了确认外来体特异性标记物与第一光特异性结合蛋白结合的第一融合蛋白是否表达以及其在细胞内的位置,也可以将标记蛋白一起进行融合。例如,本发明的实施例中,欲通过以使作为荧光蛋白的EGFP插入到CIBN与CD9或GIGANTEA与CD9结合的第一融合蛋白中的形态进行表达,来确认所述第一融合蛋白是否表达、表达水平以及在细胞内的位置。
本发明的术语“靶蛋白”是指,以与所述第二光特异性结合蛋白融合的形态表达的蛋白质,以使所述靶蛋白被包含在所述外来体的内部。
在本发明中,所述靶蛋白在细胞内表达从而能够通过外来体进行运送,对其没有特别的限制,可以列举如疾病治疗用蛋白质、疾病诊断用蛋白质等。例如,在本发明的实施例中使用了带有荧光的荧光蛋白(mCherry)作为靶蛋白。
本发明的术语“培养”是指,在通过人工适当进行调整的环境条件下培养细胞或微生物的方法。
在本发明中,将转化体培养1~3天后,替换为不含有胎牛血清的培养基后,进一步培养2~5天。
在本发明中,可以使用本领域通常使用的方法来培养转化体。
所述培养基是指培养动物细胞时使用的公知的培养基,可以选自市售的无血清培养基(serum free media),无蛋白质培养基(protein free media)及化学定义的培养基(chemically defined media)等。
所述无血清培养基为去除了培养动物细胞时使用的牛血清成分的培养基,优选SFM4CHO(克隆(HyClone))和EX-细胞(EX-Cell)(JHR生命科学(JHR Bioscience))等。可以添加胰岛素样生长因子I(Insulin like growth factor I,IGF-I)、乙醇胺(Ethanolamine)、氯化铁(Ferric chloride)及卵磷脂(Phosphatidyl choline)等,但并不限定于此。
所述无蛋白质培养基是在去除了牛血清成分的无血清培养基中,去除了源自动物的蛋白质的动物细胞培养基,尤其是去除了分子量为10kDa以上的高分子蛋白质的动物细胞培养基,可以选自ProCHO(龙沙(Lonza))和PF-CHO(胎牛血清(HyClone))等,但并不限定于此。
所述化学定义的培养基为动物细胞培养用培养基,没有源自动物的成分,构成培养基的所有组成成分为公知的具有化学结构的组分,可以选自CDM4CHO(胎牛血清(HyClone)),PowerCHO2CD(龙沙(Lonza))和CD-optiCHO(生命技术(Life Technologies))等,但并不限定于此。
本发明的术语“第一融合蛋白”是指,所述外来体特异性标记物与所述第一光特异性结合蛋白结合的形态的融合蛋白。
在本发明中,所述第一融合蛋白所包含的外来体特异性标记物与第一光特异性结合蛋白的排列顺序没有特别限制,只要所述第一融合蛋白能够在外来体生产细胞中位于朝向外来体的内部方向从而进行表达即可。作为一例,可以构成为,外来体特异性标记物的C-末端结合有第一光特异性结合蛋白的N-末端的形态。
此外,构成所述第一融合蛋白的外来体特异性标记物与第一光特异性结合蛋白可以相互直接连接,也可以通过接头连接。对所述接头没有限制,只要所述第一融合蛋白能够在外来体生产细胞中位于朝向外来体的内部方向从而进行表达即可。但是,可以使用由氨基酸构成的肽接头,更优选地,可以使用柔性(flexible)肽接头。所述肽接头可以通过将编码所述接头的核酸利用读框(inframe)连接到编码各个结构域的核酸之间,从而使所述肽接头可操作地连接到表达载体内以进行表达。
本发明的术语“第二融合蛋白”是指,所述第二光特异性结合蛋白与所述靶蛋白结合的形态的融合蛋白。
在本发明中,所述第二融合蛋白所包含的第二光特异性结合蛋白与靶蛋白的排列顺序没有特别的限制,只要所述第二融合蛋白能够在外来体生产细胞中与所述第一融合蛋白的第一光特异性结合蛋白部位进行结合而位于外来体内部即可。作为一例,可以构成为,第二光特异性结合蛋白的C-末端结合有靶蛋白的N-末端的形态。
此外,构成所述第二融合蛋白的第二光特异性结合蛋白可以相互直接连接,也可以通过接头连接。
对所述接头没有限制,只要所述第二融合蛋白能够在外来体生产细胞中与所述第一融合蛋白的第一光特异性结合蛋白部位结合而位于外来体内部即可。但是,可以使用由氨基酸构成的肽接头,更优选地,可以使用柔性(flexible)肽接头。所述太接头可以通过将编码所述接头的核酸通过读框(inframe)连接到编码各个结构域的核酸之间,从而使所述肽接头可操作地连接到表达载体内以进行表达。
同时,各个所述融合蛋白可以包含多肽,所述多肽的序列的一种以上的氨基酸残基与所述融合蛋白所包含的各个结构域的野生型氨基酸序列的氨基酸残基不同。不改变分子整体活性的蛋白质及多肽中的氨基酸交换是本领域公知的。最常见的交换发生在氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thy/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly之间。此外,可以通过氨基酸序列的突变或修饰来包含蛋白质对热、pH等的结构稳定性得到增加或蛋白质活性得到增加的蛋白质。
最后,可以通过本领域公知的化学肽合成方法来制备所述融合蛋白或构成所述融合蛋白的各个结构域的多肽,或者可以通过将编码所述结构域的基因通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)来进行扩增或通过公知的方法合成后,克隆到表达载体上从而进行表达来制备。
此外,可以通过将编码所述各个融合蛋白的多核苷酸导入到外来体生产细胞中,从而使得所述各个融合蛋白质在所述外来体生产细胞中进行表达,作为将所述多核苷酸导入到外来体的方法,可以使用本领域技术人员公知的方法,例如,可以使用表达载体来导入。
本发明的术语“表达载体”是指,能够在目标宿主细胞中表达靶肽的重组载体,是指可操作地连接有必需调节元件的基因构建体,以能够表达基因插入物。所述表达载体包括起始密码子、终止密码子、启动子和操纵子等表达调节元件,所述起始密码子及终止密码子通常被理解为编码多肽的多核苷酸序列的一部分,当引入基因构建体时,其在个体中必须要起到作用,而且需要在编码序列和读框中。载体的启动子可以是组成型或诱导型。
本发明的术语“可操作地连接(operably linked)”是指,核酸表达调节序列和编码目标蛋白质或RNA的核酸序列功能性地连接(functional linkage)的状态,以执行一般性功能。例如,启动子和编码蛋白质或RNA的核酸序列可操作地连接,从而会影响编码序列的表达。与表达载体的可操作连接可以利用本领域公知的基因重组技术来制备,部位-特异性DNA切割及连接可以使用本技术领域通常公知的酶等。
此外,所述表达载体可以包含用于排出融合多肽的信号序列,以促进蛋白质从细胞培养液中分离出来。此外,在插入的核酸序列的有效翻译中也会需要特异性起始信号。这些信号包括ATG起始密码子及相邻的序列。在某些情况下,需要提供能够包含ATG起始密码子的外因性翻译调节信号,这些外因性翻译调节信号及起始密码子可以是各种天然及合成供应源。可通过导入适当的转录或翻译增强子来增加表达效率。
根据本发明优选实施方式,所述表达载体可以通过将可确认靶蛋白是否插入到外来体内部的标签结合到所述靶蛋白上,从而进行表达。所述标签是为了确认是否存在靶蛋白而使用的,可以结合到靶蛋白与第二光特异性结合蛋白结合的相反部位上,作为一例,可以使用红色荧光蛋白、绿色荧光蛋白等荧光蛋白作为与靶蛋白C-末端部位结合的标签。
像这样设计的靶蛋白在外来体生产细胞中进行表达从而生产获得外来体后,可以通过确认在外来体中是否检测到所述荧光蛋白标签,来确认所述外来体是否包含有靶蛋白。
本发明的术语“光(light)”是指,为了将外来体生产细胞中表达的第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白临时结合而照射的光。
如上所述,第一光特异性结合蛋白在外来体生产细胞内与外来体特异性标记物一起以第一融合蛋白的形态表达,第二光特异性结合蛋白与靶蛋白一起以第二融合蛋白形态表达,对所述外来体生产细胞照射所述第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白的结合所需的光时,所述第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白结合的结果,会临时形成具有外来体特异性标记物-第一光特异性结合蛋白-第二光特异性结合蛋白-靶蛋白的形态的融合蛋白质复合体,在所述外来体生产细胞中生产外来体时,靶蛋白会通过所述外来体特异性标记物而连接到外来体上。在这种情况下,所述靶蛋白存在于外来体的内部,在生产获得外来体之后停止光照射时,第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白会分离,由此,在外来体释放时,存在于外来体内部的靶蛋白会以包含在外来体的形态释放到外部。此外,相比于持续地照射所述光,优选间歇性地照射光,以使靶蛋白能够更为有效地导入到外来体的内部。即,在间歇地照射光时,因第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白重复进行结合和分离,因此能够提高靶蛋白导入到外来体内部的概率。
此外,根据所述第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白的种类,诱导所述第一光特异性结合蛋白与第二光特异性结合蛋白结合的光的波长会不同,因此,本领域技术人员可以根据公知技术来选择使用光波长。即,当结合CRY2和CIBN时,照射460~490nm波长的光,如果光照小于10分钟时,CRY2和CIBN彼此分离,当结合PhyB和PIF时,照射650nm波长的光10分钟,当照射750nm波长的光5分钟时,PhyB和PIF彼此分离,当结合FKF1和GIGANTEA时,可以照射460nm波长的光30分钟。在本发明的实施例中,为了诱导CIBN和CRY2的结合,照射了460~490nm波长的光。
根据本发明的实施例,在大量制备外来体的永生化细胞系HEK293T细胞内表达CRY2及荧光蛋白(mCherry)的融合蛋白与CIB及CD9的融合蛋白的结果,能够观察到原来均匀地分散在细胞质中的mCherry蛋白质的分布,在照射蓝光时,则位于细胞膜、和内体类似结构等的膜中(图7)。此外,在HEK293T细胞中表达FKF1及mCherry的融合蛋白与GIGANTEA及CD9的融合蛋白时,也能够观察到类似的结果(图12)。此外,在HEK293T细胞中表达CRY2及mCherry的融合蛋白与CIBN及CD9的融合蛋白后,照射蓝光并调节光强度的结果为,能够确认在照射20~50μW的光时,外来体内所包含的mCherry蛋白显示出最高的水平(图9),将在所述细胞中生产分离出来的外来体以约为250μg/ml的浓度对异种细胞HT1080进行处理的结果,能够确认对HT1080细胞没有显示出特别的细胞毒性,mCherry蛋白传递到HT1080细胞的细胞质内(图10)。
此外,为了将本发明的外来体内的靶蛋白的导入效率及向靶细胞传递外来体的效率与常规方法进行比较,作为现有方法利用XPACK载体,将本发明的CRY2及mCherry蛋白结合的形态的融合蛋白与CIBN及CD9蛋白结合的形态的融合蛋白的表达载体导入到HEK293T细胞后,对外来体内靶蛋白生产量进行比较的结果,可以确认使用本发明的方法的导入效率显著高(图15)。此外,还能够确认用分离自外来体生产细胞的外来体对靶细胞(HeLa)进行处理后,对靶蛋白的表达程度进行比较时,利用本发明的方法分离的外来体的靶蛋白在靶细胞中的表达最高(图16)。
作为本发明的另一实施方式,提供一种外来体制备用载体,所述外来体制备用载体包括:(a)第一表达载体,其含有编码融合蛋白(第一融合蛋白)的多核苷酸,所述融合蛋白(第一融合蛋白)具有外来体特异性标记物和第一光特异性结合蛋白结合的形态;(b)第二表达载体,其含有能够导入编码靶蛋白的多核苷酸的多克隆位点和编码第二光特异性结合蛋白的多核苷酸,所述第二光特异性结合蛋白能够与所述第一光特异性结合蛋白结合。
本发明提供的外来体制备用载体中,外来体特异性标记物、第一光特异性结合蛋白、外来体生产细胞及第二光特异性结合蛋白与上面所述的相同。
本发明的术语“外来体生产用转化细胞”是指,在所述外来体细胞中导入了编码融合蛋白(第一融合蛋白)的多核苷酸,从而能够表达所述第一融合蛋白的外来体生产细胞。所述第一融合蛋白为外来体特异性标记物与第一光特异性结合蛋白结合的形态。
本发明中,所述第二表达载体包含编码所述第二光特异性结合蛋白的多核苷酸,与此相邻地可以含有多克隆位点。这样构成的第二表达载体的所述多克隆位点处导入编码靶蛋白的多核苷酸时,所述第二光特异性结合蛋白与靶蛋白可以以融合的形态(第二融合蛋白)表达。
本发明提供的外来体制备用载体不仅可以包括所述外来体生产用转化细胞及表达载体,还可以包括适合导入所述表达载体、培养外来体生产用转化细胞、分离及纯化所述外来体生产用转化细胞中生产的外来体的一种或多种其它组成成分组合物;溶液或装置。例如,可以进一步包括导入所述表达载体所需的适合的缓冲液、培养所述外来体生产转化细胞所需的培养基及容器等。
本发明的另一实施方式提供一种通过上述方法制备的、内部包含有靶蛋白的外来体。
就上述方法制备的外来体而言,在构成该外来体的原生质膜中包含有外来体特异性标记物与第一光特异性结合蛋白结合的形态的融合蛋白(第一融合蛋白),外来体的内部包含有能够和所述第一光特异性结合蛋白结合的第二光特异性结合蛋白与靶蛋白结合的形态的融合蛋白(第二光特异性结合蛋白),因此,将所述外来体对靶组织内的细胞进行处理时,外来体内部所含的第二融合蛋白能够通过原生质膜的融合而传递到靶组织内的细胞质。
内部包含所述靶蛋白的外来体可以再活体内用于多种疾病的治疗。例如,制备包含作为靶蛋白的显示出抗癌效果的蛋白质性高分子(例如抗体等)的外来体后,使用该外来体对癌细胞进行处理时,相比于常规的脂质体,能够提供生物相容性更好的抗癌治疗。
发明的效果
利用本发明提供的制备包含靶蛋白的外来体的方法,能够以高收率制备包含靶蛋白的外来体,此外,靶蛋白表现为与外来体膜分离的状态存在,因此可广泛应用于疾病的治疗中。
附图说明
图1为示出通过细胞膜通过结构域(PTD)和靶蛋白的重组蛋白使靶蛋白传递至细胞质内的方法的图(Steven R.et al.Protein transduction:unrestricted deliveryinto all cells?Trends in Cell Biology,2000)。
图2为示出通过内吞作用(endocytosis)使纳米颗粒和靶蛋白结合的结合体传递至细胞质内的方法的图(Munish Chanana et al.Physicochemical properties ofprotein-coated gold nanopart icles in biological fluids and eel Is before andafter proteolytic digestion.Angew.Chem.Int.Ed.2013)。
图3为示出外来体从细胞内多泡体(Multi vesicular bodies、MVBs)向细胞外释放并进行分离的过程的图(GracaRaposo and Willem Stoorvogel.Extracel lular vesicles:Exosomes、mi crovesi cles、and fr iends.Cell Biology200(4),373-383,2013)。
图4为示出通过标记化的外来体将siRNA传递至活体内治疗癌的过程的图(Alvarez-Erviti,L.et al.Delivery of siRNA to the mouse brain by systemicinjection of targeted exosomes.Nature biotechnology 29,341-345,2011)。
图5为示出本发明的光基因设计而成的蛋白质运输外来体的制备过程的示意图。
图6为示出当EXPLORs的光照射停止时,靶蛋白在外来体内部与光特异性结合蛋白的融合蛋白分离的过程的图。
图7为CIBN-EGFP-CD9基因和mCherry-CRY2基因被导入到HEK293T细胞的转化体中,mCherry蛋白在细胞内的位置根据是否照射蓝光而变化的荧光照片。
图8为示出获得本发明的EXPLORs的实验过程的图。
图9为示出外来体内部所捕获的靶蛋白(mCherry蛋白质)的含量根据蓝光强度而变化的测定结果的免疫印迹分析照片。
图10为示出将包含靶蛋白(mCherry)的外来体对靶细胞(HT1080细胞)进行处理后,显示出所述靶细胞中是否导入了靶蛋白的确认结果的显微镜照片,左侧示出未使用外来体处理的靶细胞,右侧示出使用外来体处理的靶细胞。
图11为示出使用包含靶蛋白(mCherry)的外来体对靶细胞(HT1080细胞)进行处理后,显示出所述靶细胞中是否导入了靶蛋白的确认结果的荧光照片(a)及根据处理所述外来体而诱发的死亡细胞的比例的比较结果的图表(b)。
图12为示出GIGANTEA-EGFP-CD9基因及mCherry-FKF1LOV导入到HEK293T细胞的转化体中,mCherry蛋白在细胞内的位置根据是否照射蓝光而变化的荧光照片。
图13为利用荧光成像的荧光素酶-mCherry(Luciferase-mCherry)融合蛋白的表达程度(a)及生产细胞中荧光素酶活性及分子个数的确认图(b)。
对照(Control):未进行任何处理的HEK293T细胞;
OVER:只导入了荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2的HEK293T细胞;
XP:利用用于外来体搭载技术而制备的商用载体XPACK(系统生物科学(SystemsBiosciences))来导入XPACK-荧光素酶-mCherry的HEK293T细胞;
EXPLOR:根据本发明的方法导入荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2和CIBN-EGFP-CD9的HEK293T细胞。
图14为确认生产的外来体内荧光素酶的活性测定(a)及分子个数(b)的图。
NEG:未进行任何处理的HEK293T细胞中生产的外来体;
OVER:导入了荧光素酶-mCherry-CRY2的HEK293T细胞中生产的外来体;
XP:利用用于外来体搭载技术而制备的商用载体XPACK(系统生物科学(SystemsBiosciences))来导入XPACK-荧光素酶-mCherry的HEK293T细胞所生产的外来体;
EXPLOR:根据本发明的方法导入荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2和CIBN-EGFP-CD9的HEK293T细胞所生产的外来体;
ON:在200μW的蓝光下培养72小时生产的外来体;
OFF:在无光条件下培养72小时生产的外来体。
图15为示出生产的外来体内靶蛋白的导入效率(loading efficiency)的图。
图16为示出使用外来体向靶细胞(HeLa)传递靶蛋白的效率的图。
对照(Control):未进行任何处理的HEK293T细胞生产的外来体;
OVER:导入了荧光素酶-mCherry-CRY2的HEK293T细胞中生产的外来体;
XP:利用用于外来体搭载技术而制备的商用载体XPACK(系统生物科学(SystemsBiosciences))来导入XPACK-荧光素酶-mCherry的HEK293T细胞所生产的外来体;
EXPLOR:根据本发明的方法导入荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2和CIBN-EGFP-CD9的HEK293T细胞所生产的外来体;
ON:在200μW的蓝光下培养72小时生产的外来体;
OFF:在无光条件下培养72小时生产的外来体。
图17为荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2和CIBN-EGFP-CD9在HEK293T细胞内相同的位置进行表达的确认图。
具体实施方式
以下,通过实施例对本发明进行更详细的说明。但是,这些实施例仅用于例示本发明,本发明的范围并不限定与此。
<实施例1>外来体的制备
<1-1>对用于制备外来体的CIBN及CRY2的结合的确认
在无光的条件下,将包含CIBN-EGFP-CD9基因的pcDNA3.1(+)载体和包含mCherry-CRY2基因的pcDNA3.1(+)载体导入到外来体生产细胞HEK293T细胞,培养24小时后,替换为不含有胎牛血清的培养基,然后进一步培养48小时。培养结束后,照射460~490nm波长的蓝光,使用共聚焦显微镜确认了照射所述蓝光之前和之后在mCherry中显示的红色荧光位置(图7)。
图7为CIBN-EGFP-CD9基因和mCherry-CRY2基因被导入到HEK293T细胞的转化体中,mCherry蛋白在细胞内的位置根据是否照射蓝光而变化的荧光照片。如图7所示,在照射诱发光特异性结合蛋白CIBN与CRY2的结合的蓝光之前,mCherry蛋白质均匀地分布在细胞质中,但是在照射蓝光之后,mCherry显示出密集到膜上的现象。分析这样的mCherry蛋白质的密集是由光特异性结合蛋白CIBN和CRY2的结合引起的。
<1-2>用于制备外来体的GIGANTEA及FKF1的结合的确认
使用包含GIGANTEA-EGFP-CD9基因的pcDNA3.1(+)载体及包含mCherry-FKFlLOV基因的pcDNA3.1(+)载体,采用与上述实施例<1-1>相同的方法,对细胞内的外来体进行了确认(所述FKF1L0V中,LOV为光-氧-电压阈(light-oxygen-voltage domain)的缩写,其表示FKF1蛋白质中通过光与其它蛋白质结合的结构域,因此,FKF1与FKF1LOV的意思相同)。
如图12所示,与所述实施例<1-1>相同,在照射诱发光特异性结合蛋白GIGANTEA和FKF1的结合的蓝光之前,mCherry蛋白质均匀地分布在细胞质内,但是在照射蓝光之后,显示出mCherry蛋白质密集到膜上的现象(图12)。因此,与所述<1-1>的结果类似地,能够确认光特异性结合蛋白GIGANTEA及FKF1的结合能够诱导mCherry蛋白质的密集。
<实施例2>外来体生产及光强度对外来体生产的影响
在以0、5、20、50或200μW的强度照射460nm波长的光的LED灯下,将分别含有CIBN-EGFP-CD9基因及mCherry-CRY2基因的各个表达载体导入到外来体生产细胞HEK293T细胞中,培养24小时后,替换为不含有胎牛血清的培养基,然后进一步培养48小时。培养结束后,分离培养液,对其进行离心分离(3000xg,15分钟)从而获得去除了细胞残留物的上清液。在上述获得的上清液中,加入所述上清液5倍体积的ExoQuick-TC外来体沉淀溶液(ExoQuick-TC Exosome Precipitation Solution)(系统生物科学(System Biosciences),山景城(Mountain View),加利福尼亚州(California),美国)进行混合,然后进行离心分离(1500xg,30分钟)后获得沉淀的外来体,在所述外来体中加入磷酸盐缓冲液(PBS)进行悬浮,从而获得外来体悬浮液。使用安装有27-G针的注射器,利用0.2μm的过滤器对所述外来体悬浮液进行过滤,从而获得单一大小的外来体(图8)。之后,利用裂解缓冲液来制备外来体溶解产物(Exosome Lysate),通过免疫印迹分析来比较外来体中含有的mCherry蛋白质的量(图9)。
图9为示出外来体内部所捕获的靶蛋白(mCherry蛋白质)的含量根据蓝光强度而变化的测定结果的免疫印迹分析照片。如图9所示,能够确认当以20~50μW的强度照射蓝光时,外来体内捕获的靶蛋白(mCherry蛋白质)的含量显示出最大值。从上述结果可知,通过调节光特异性结合蛋白结合时的光强度,能够调节外来体内部所捕获的靶蛋白的含量。
<实施例3>外来体的处理效果
在以50μW的强度照射460nm波长的光的LED灯下,将分别含有CIBN-EGFP-CD9基因及mCherry-CRY2基因的各个表达载体导入到外来体生产细胞HEK293T细胞中,按照实施例2的方法提取外来体。接着,将提取的所述外来体以250μg/ml的浓度对HT1080细胞处理24小时。然后,在所述HT1080细胞中加入含有4%PFA和0.01%GA的0.1M的磷酸缓冲溶液(pH7.4)进行固定,并附着到10%明胶凝胶上。利用液氮对附着到明胶凝胶上的细胞冷却一天,在-120℃下,利用低温超薄切片机(cryoultramicrotome)切割成45nm厚度的薄片。接着,利用抗-mCherry抗体和蛋白质A-金(Protein A-gold)对所述薄片进行免疫染色,并通过透射显微镜(Tecnai G2Spirit Twin TEM)观察了mCherry蛋白质(图10)。
图10为示出将包含靶蛋白(mCherry)的外来体对靶细胞(HT1080细胞)进行处理后,显示出所述靶细胞中是否导入了靶蛋白的确认结果的显微镜照片,左侧示出未使用外来体处理的靶细胞,右侧示出使用外来体处理的靶细胞。如图10所示,能够确认本发明的外来体在对靶细胞处理时,靶蛋白向靶细胞内传递。
<实施例4>包含靶蛋白的外来体的分析
在以50μW的强度照射460nm波长的光的LED灯下,将分别含有CIBN-EGFP-CD9基因及mCherry-CRY2基因的各个表达载体导入到外来体生产细胞HEK293T细胞中,按照实施例2的方法提取外来体。接着,将提取的所述外来体以250μg/ml的浓度对HT1080细胞处理24小时。然后,通过荧光显微镜来确认mCherry蛋白质的红荧光,通过LDH细胞死亡测定法(LDHcell death assay)比较了用外来体处理的细胞和未用外来体处理的细胞的死亡细胞的比例(图11)。
图11为示出使用包含靶蛋白(mCherry)的外来体对靶细胞(HT1080细胞)进行处理后,显示出所述靶细胞中是否导入了靶蛋白的确认结果的荧光照片(a)及根据处理所述外来体而诱发的死亡细胞的比例的比较结果的图表(b)。如图11所示,能够确认使用外来体处理并没有诱发细胞的死亡。
<实施例5>外来体的生产及生产的外来体内靶蛋白的导入效率的比较
<5-1>外来体生产效率的确认
为了将本发明的外来体的生产及生产的外来体内靶蛋白的导入程度与现有的方法进行比较,需要确认在外来体生产细胞中靶蛋白的表达,从而实施了荧光素酶活性(luciferase activity)测定实验。
作为现有方法,利用用于外来体搭载技术而制备的商用载体XPACK(系统生物科学(Systems Biosciences))来将XPACK-荧光素酶-mCherry导入到HEK293T细胞中(XP),利用本发明的方法将荧光素酶(Luciferase)-mCherry-CRY2和CIBN-EGFP-CD9导入到HEK293T细胞中(EXPLOR),之后,通过测定细胞内的荧光素酶活性来比较上述两种方法的效率。根据制造商的说明书来测定荧光素酶的活性(荧光素酶测定试剂(Luciferase Assay Reagent),普洛麦格(Promega)),然后绘制结果的标准曲线,通过该标准曲线来定量计算细胞中外来体的个数。
如图14所示,可以确认本发明的利用光特异性结合蛋白CIBN及CRY2的方法的向外来体的导入效率显著高于现有方法XP。
<5-2>对生产的外来体内靶蛋白的表达的确认
对所述实施例5-1的细胞培养72小时,分离外来体(Exoquick-TC,系统生物科学(Systems biosciences))后,通过荧光素酶活性测定来间接地比较通过现有方法XP及本发明的方法分离得到的外来体中所含的靶蛋白含量,其结果如图15所示,能够确认采用本发明的方法生产出的外来体中包含的靶蛋白的量显著高于采用现有方法生产出的靶蛋白的量(图15)。
<5-3>靶蛋白的导入效率的比较
利用上述实施例5-1及5-2的荧光素酶活性测定值,通过下述数学式1来计算出靶蛋白的导入效率(E)。
[数学式1]
E=生产的外来体内的荧光霉素活性测定值/外来体生产细胞中荧光霉素活性测定值
如图15所示,可以确认利用本发明的CRY2及CIBN结合而生产的外来体与其它比较组相比,效率高出4倍至120倍(图15)。
<实施例6>向靶细胞传递外来体的效率的比较
为了比较将导入了靶蛋白的外来体对靶细胞处理时的效率,用5×109个的外来体对HeLa细胞处理24小时,并对细胞中表达的荧光强度进行了测定,其结果如图16所示,本发明的外来体(EXPLOR)的荧光强度显著要高(图16)。
因此,可知本发明利用外来体的方法与现有方法相比,能够有效地将靶蛋白传递至靶细胞。
Claims (14)
1.一种大量制备靶蛋白附着在外来体膜上的外来体的方法,其特征在于,
所述方法包括以下步骤:
a)向外来体生产细胞内导入编码融合蛋白的多核苷酸,从而获得转化细胞,所述融合蛋白为外来体特异性标记物和靶蛋白结合的形态;
b)培养所述转化细胞。
2.一种大量制备靶蛋白从外来体膜分离出来从而存在于外来体内部的外来体的方法,所述方法包括权利要求1。
3.根据权利要求1或2所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述外来体生产细胞选自B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、树突细胞、巨核细胞、巨噬细胞、干细胞及肿瘤细胞中的任意一种以上。
4.根据权利要求1所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述外来体特异性标记物为CD9、CD63、CD81或CD82。
5.一种大量制备包含靶蛋白的外来体的方法,其特征在于,
所述方法包括以下步骤:
a)向外来体生产细胞内导入编码融合蛋白(第一融合蛋白)的多核苷酸,以及编码融合蛋白(第二融合蛋白)的多核苷酸;所述第一融合蛋白为外来体特异性标记物和第一光特异性结合蛋白结合的形态;所述第二融合蛋白为第二光特异性结合蛋白和靶蛋白结合的形态,所述第二光特异性结合蛋白能够与所述第一光特异性结合蛋白进行结合;
b)向所述外来体生产细胞照射能够诱发所述第一光特异性结合蛋白和所述第二光特异性结合蛋白进行结合的光。
c)在所述外来体生产细胞生产外来体之后,停止照射所述光。
6.根据权利要求5所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述第一光特异性结合蛋白选自CIB、CIBN、PhyB、PIF、FKF1、GIGANTEA、CRY及PHR中的任意一种以上。
7.根据权利要求5所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述第一光特异性结合蛋白为CIB或CIBN时,所述第二光特异性结合蛋白为CRY或PHR,通过照射具有460~490nm波长的光来实施所述第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白的结合。
8.根据权利要求5所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述第一光特异性结合蛋白为PhyB时,所述第二光特异性结合蛋白为PIF,通过照射具有600~650nm波长的光来实施所述第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白的结合。
9.根据权利要求5所述的大量制备外来体的方法,其特征在于,所述第一光特异性结合蛋白为GIGANTEA时,所述第二光特异性结合蛋白为FKF1,通过照射具有460~490nm波长的光来实施所述第一光特异性结合蛋白和第二光特异性结合蛋白的结合。
10.一种向细胞质传递蛋白质药物的方法,其特征在于,所述方法利用通过权利要求1、2或5所述的方法来制备的外来体。
11.一种蛋白质药物的细胞质传递用药物组合物,其特征在于,所述药物组合物含有通过权利要求1、2或5所述的方法来制备的外来体作为有效成分。
12.一种外来体制备用载体,其特征在于,所述外来体制备用载体包括:
(a)第一表达载体,其含有编码融合蛋白(第一融合蛋白)的多核苷酸,所述融合蛋白(第一融合蛋白)具有外来体特异性标记物和第一光特异性结合蛋白结合的形态;
(b)第二表达载体,其含有能够导入编码靶蛋白的多核苷酸的多克隆位点和编码第二光特异性结合蛋白的多核苷酸,所述第二光特异性结合蛋白能够与所述第一光特异性结合蛋白结合。
13.根据权利要求12所述的外来体制备用载体,其特征在于,所述第二表达载体使所述第二光特异性结合蛋白与靶蛋白融合的形态的融合蛋白(第二融合蛋白)在外来体生产细胞中表达。
14.一种外来体,其特征在于,其内部包含通过权利要求1、2或5中任一项所述的方法来制备的靶蛋白。
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