KR102316777B1 - 엑소좀 생산 조절 세포, 이를 포함하는 조성물, 이로부터 얻은 엑소좀 및 엑소좀 생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포, 그로부터 얻은 엑소좀 및 엑소좀 생산 방법에 관한 것으로 엑소좀의 생산을 억제시키는 효과가 있다.

Description

엑소좀 생산 조절 세포, 이를 포함하는 조성물, 이로부터 얻은 엑소좀 및 엑소좀 생산 방법{CELL FOR REGULATING PRODUCTION OF EXOSOME, COMPOSITION INCLUDING THE SAME, EXOSOME OBTAINED THEREFROM AND METHOD FOR PRODUCING EXOSOMES}

본 발명은 엑소좀 및 엑소좀을 생산하는 방법에 관한 것이다.

엑소좀(exosome)은 세포 내에서 자연적으로 만들어지는 나노 크기의 소포체로서, 단백질 및 유전적 정보를 포함하고 있어 세포 밖으로 유전정보를 포함한 다양한 신호를 다른 세포에 전달하여 발달과정, 증식, 분화, 면역조절, 혈관생성, 다양한 질병의 진행 등에 관여하고 있다. 생체 나노소포체(nanovesicle)인 엑소좀의 경우 면역반응을 피할 수 있고, 인체 적합성이 뛰어나며, 약물탑재 기능, 특정세포로의 표적전달 효과, 혈액 내 안정성 등의 장점을 통해 최근 약물 전달체로 큰 관심을 받고 있다.

또한, 세포고사 세포 유래 엑소좀(Apoptotic Cell-derived Exosome)은 세포고사(apoptosis)로 사멸하는 세포로부터 분비되는 엔도좀(Endosome) 기원의 소낭(vesicle)으로 엑소좀과 크기, 밀도 및 단백질이라는 점에서 유사하며, 고유의 표면단백질인 S1PR1과 S1PR3 (Sphingosine-1-phosphate receptor 1 and 3)를 가진다. 또한 세포고사 엑소좀(Apoptotic Exosome)은 대식세포(macrophage)와 동물모델에서 염증성 사이토카인과 케모카인 등의 분비를 증가시키는 DAMP(Damage-associated molecular pattern)로써 역할을 한다.

이러한　엑소좀을 상업적으로 이용하기 위해서는 다량이면서 양질의　엑소좀이 필요하다. 그러나 현재 얻을 수 있는　엑소좀의 양은 매우 소량에 불과하고, 엑소좀의 생산량을　증가시킬 수 있는 물질에 대한 개발도 아직까지 미비한 실정이다.

그러므로 엑소좀을 생산하기 위한 새로운 방법에 대한 연구가 더 필요하다.

국제공개공보 WO2012/087241(2012.06.28)

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포를 포함하는 엑소좀 생산 조절 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포로부터 얻은 엑소좀을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주 및 종양 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 세포에 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 유전자를 재조합한 벡터를 트랜스펙션한 후 배양하는 단계; 를 포함하는 엑소좀 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포를 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은, GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME(DFNA5), 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예는 GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 억제용 세포를 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은, GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 엑소좀의 생산을 억제하는 것일 수 있다.

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본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은, 엑소좀의 막에 존재하는 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 세포는, 줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주, 또는 종양 세포에 세포사멸 유도 물질을 처리하여 얻어진 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 줄기세포는, 중배엽줄기세포 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell), 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 면역세포는, 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 체세포는, 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포 (keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 세포주는, CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK-293 STF 세포, 293T/17 세포, 293T/17 SF 세포, 또는 HEK-293.2sus 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, NuLi-1 세포, ARPE-19 세포, VK2/E6E7 세포, Ect1/E6E7 세포, RWPE-2 세포, WPE-stem 세포, End1/E6E7 세포, WPMY-1 세포, NL20 세포, NL20-TA 세포, WT 9-7 세포, WPE1-NB26 세포, WPE-int 세포, RWPE2-W99 세포, 및 BEAS-2B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 종양세포는 인간 난소암 세포주(SKOV3, OVCAR3), 인간 유방암 세포주(MCF-7, T47D, BT-474), 인간 간암종 세포주(Hep3B, HepG2), 인간 아교 교아종 세포주(U87MG, U251), 인간 대장암 세포주(SW480, HT-29, HCT116, Caco-2), 인간 폐암 세포주(A549, NCIH358, NCI-H460), 인간 전립선암 세포주(22RV1), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간 흑색종 세포주(A375), 및 인간 위암 세포주(NCI-N87)로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포를 포함하는 엑소좀 생산 조절 조성물을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 세포는,　엑소좀의 수,　엑소좀　유래　단백질,　및　엑소좀　유래 RNA의 함량을 감소시키는 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포로부터 얻은 엑소좀을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시예는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 억제용 세포로부터 얻은 엑소좀을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 엑소좀은, GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상; 의 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질을 과발현시켜 배양한 세포로부터 얻은 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 엑소좀은 세포고사 유래 엑소좀(apoptotic exosome)인 것일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 엑소좀의 직경은 100 nm ~ 250 nm일 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예는 줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주 및 종양 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 세포에 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 유전자를 재조합한 벡터를 트랜스펙션한 후 배양하는 단계; 를 포함하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 엑소좀 생산 방법은 상기 세포에 세포고사(apoptosis)를 유도한 후 배양액으로부터 엑소좀을 분리하는 단계; 를 더 포함할수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 엑소좀 생산 방법에서 상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은, GSDMA, GSDMC, GSDMD 및 GSDME(DFNA5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 엑소좀의 생산을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 엑소좀 생산 방법에서 상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은, GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고, 엑소좀의 생산을 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 조절용 세포와 이를 이용한 엑소좀 생산 방법에 의하면 엑소좀의 생산을 조절하는 효과가 있다. 상기 엑소좀은 의약, 제약, 식품 및 화장품 등의 여러 분야에 활용될 수 있다.

도 1은 HeLa 세포주에서 Gasdermin 과발현에 의한 Apoptotic exosome의 생산 증가를 나타낸 것이다.
도 2는 293T 세포주에서 Gasdermin 과발현에 의한 Apoptotic exosome의 생산 증가를 나타낸 것이다.
도 3은 DFNA5와 GSDMD의 knock-out에 의한 apoptotic 엑소좀 생산이 억제됨을 나타낸 것이다.
도 4는 DFNA5 과발현된 세포주와 knock-out 세포주의 시간에 따른 엑소좀 생산의 변화를 나타낸 것이다.
도 5는 Gasdermin family 단백질의 엑소좀 내 축적에 관한 데이터를 나타낸 것이다.
도 6은 Gasdermin family 단백질의 full-length form과 degraded form이 엑소좀의 막에 축적된 것을 나타낸 것이다.

이하, 본 출원을 보다 상세히 설명한다.

이하의 특정한 기능적 설명들은 단지 본 출원의 개념에 따른 실시예를 설명하기 위하여 예시된 것으로, 본 출원의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.

본 출원의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경을 가할 수 있고 여러가지 형태를 가질 수 있으므로 특정 실시예들은 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 출원의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시 형태에 한정하려는 것이 아니며, 본 출원의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용하는 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로 본 출원을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 출원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 명세서에서 "가스더민군(Gasdermin family)" 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 GSDMA, 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어지는 GSDMB, 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어지는 GSDMC, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 GSDMD, 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어지는 DFNA5(GSDME) 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어지는 DFNB59로 구성되어 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서 "가스더민군(Gasdermin family)" 유전자는 서열번호 1로 이루어지는 GSDMA 유전자, 서열번호 3으로 이루어지는 GSDMB 유전자, 서열번호 5로 이루어지는 GSDMC 유전자, 서열번호 7로 이루어지는 GSDMD 유전자, 서열번호 9으로 이루어지는 DFNA5(GSDME) 유전자 및 서열번호 11로 이루어지는 DFNB59 유전자로 구성되어 있다. 이들 유전자는 각각의 서열번호의 염기서열로 이루어지는 유전자뿐만 아니라, 인간 개체 안에서 생길 수 있는 변이체도 포함할 수 있다, 예를 들면 서열번호 1, 3, 5, 7, 9 또는 11의 염기 배열로 이루어지는 유전자에 있어서 1개 또는 몇 개의 염기가 결실, 치환 및/또는 부가된 유전자로서, 다형성이나 돌연변이에 근거하는 변이에 의해 생기는 것이 포함된다. 또한, 각각의 유전자는 서열번호 7의 염기 서열에 대해서, 80%이상, 예를 들면, 85%이상, 90%이상, 95%이상, 97%이상, 98%이상, 99%이상, 99.5%이상, 99.7%이상 또는 99.9%이상의 동일성을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 이루어지는 변이체를 포함한다. 염기서열의 동일성은 BLAST, FASTA 등의 공지의 알고리즘을 이용하여 결정할 수 있다. 또한, 각각의 유전자는 각각의 서열번호의 염기 서열로 이루어지는 유전자에 대해서, 엄격한 조건하에서 혼성화된 염기서열로 이루어지는 변이체를 포함한다. 또한, 본 명세서에 있어서, 엄격한 혼성화 조건의 예로서는, 예를 들면 하이브리드 후 세정 조건으로서 통상 「1×SSC, 0.1%SDS, 37℃」정도의 조건일 수 있다. 특별히 제한되지 않지만, 보다 엄격한 하이브리드 조건으로서 「0.5×SSC, 0.1%SDS, 42℃」정도, 또한 엄격한 하이브리드 조건으로서 「0.1×SSC, 0.1%SDS, 65℃」정도의 조건일 수 있다. 이들의 변이체 유전자는 서열 번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는　단백질과 동등한 기능을 가지는　단백질을 코드하는 것이다.

본 발명의 하나의 실시예에서 GSDMA 단백질, GSDMB 단백질, GSDMC 단백질, GSDMD 단백질, DFNA5(GSDME) 단백질 및 DFNB59 단백질은 각각의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질뿐만 아니라, 인간 개체 안에서 생길 수 있는 변이체도 포함하고, 각각의 서열번호의 서열로 이루어지는　단백질에 있어서 1개 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 및/또는 부가된　단백질로서 다형성이나 돌연변이에 근거하는 변이에 의해 생기는 것이 포함된다. 다만, 이들의 변이체 인간 단백질들은 각각의 서열번호의 아미노산 서열로 이루어지는　단백질과 동등한 기능을 가지는 것이다.

본 명세서에서 "GSDMD(GasderminD)"는 염증조절복합체(inflammasome)에 의해 활성화되는 Caspase [caspase 1, caspase 4와 caspase 5 (인간) 또는 caspase 1과 caspase 11 (마우스)]의 분열(cleavage)에 의해 C-terminal inhibitory domain으로부터 N-terminal domain이 분리되는데, 분리된 N-terminal domain이 세포막에서 올리고머화(oligomerization)되며 지름 10-16 nm의 구멍을 뚫는다. 이 구멍을 통해 염증성 사이토카인인 IL1

와 IL18의 분비가 일어나고 결국에는 세포막의 파열과 함께 파이롭토시스(pyroptosis)가 일어나 세포내 구성분의 세포외 분비를 유도한다.

본 명세서에서 "DFNA5"유전자로 발현되는 GSDME(GasderminE) 단백질은 세포고사 과정 중에 활성화되는 caspase 3에 의해 잘려서 네크롭토시스(secondary necrosis) 또는 파이롭토시스(pyroptosis)를 유도한다. DFNB59를 제외한 모든 Gasdermin의 N-terminal domain은 세포막에 구멍을 낼 수 있다.

본 명세서에서 "파이롭토시스(Pyroptosis)"는 괴사와 유사하지만 아폽토시스(apoptosis)가 아닌 원형질막, 세포 팽창 및 원형질막 파괴에 기공 형성을 특징으로 하는 세포 사멸의 한 유형이다.

본 명세서에서 "사이토카인(cytokine)"은 면역 세포가 분비하는 단백질을 통틀어 일컫는 말이다. 사이토카인은 세포로부터 분비된 후 다른 세포나 분비한 세포 자신에게 영향을 줄 수 있다. 즉, 대식세포의 증식을 유도하거나 분비 세포 자신의 분화를 촉진하기도 한다.

본 명세서에서 염증조절복합체(inflammasomes)"는 세포의 감염이나 스트레스 등 선천성 면역 방어체계(innate immune defenses)와 관련된 IL-1t와 같은 염증성 사이토카인의 성숙을 유도하는 분자적 기작이 되는 물질이다.

본 발명의 하나의 실시예에서 상기 엑소좀 생산 조절 조성물은 가스더민 군 유전자를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서 상기 엑소좀 생산 조절 조성물은 배양 배지를 포함할 수 있다.

상기 배양 배지는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Isocove's Modified Dulbecco's Medium), KnockOut DMEM, E8(Essential　8　Medium) 등의 상업적으로 제조된 배지 또는 인위적으로 합성한 배지를 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 배양 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함하며, 아미노산, 항생제 등을 더 포함할 수 있다.

상기 배양 배지는 단백질 합성저해효소를 더 포함할 수 있다. 구체적으로 시클로헥사미드(Cycloheximide), 아니소마이신(Anisomycin), 아우린트리카르복실산(Aurintricarboxylic acid), 디프테리아독소(Diphtheria toxin), 에데인(Edeine), 푸시딘산(Fusidic acid), 팍타마이신(Pactamycin), 퓨로마이신(Puromycin), 리신(Ricin), 플루오린화나트륨(Sodium fluoride), 스파르소마이신(Sparsomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 트리코더마(Trichoderma)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 유사한 기전의 단백질 합성저해효소이면 대체가 가능하다.　

상기 배양 배지는 TNFα를 더 포함할 수 있다. 상기 TNFα는 5~500 ng/mL의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명자는 연구실험을 통해 Gasdermin family의 단백질 (GSDMA, GSDMC, GSDMD, DFNA5)이 세포고사 엑소좀(apoptotic exosome)의 막 (membrane)에 표현되어 있음을 발견하였고, Gasdermin family 단백질의 과발현이 세포고사 엑소좀(Apoptotic exosome)의 분비에 영향을 미침을 확인하였다. 구체적으로, DFNA5가 apoptotic exosome 분비의 중요한 조절자이며, DFNA5의 발현 증가에 따라 세포고사 엑소좀(apoptotic exosome)의 생산을 촉진시키는 것을 확인하였다. 그 외 GSDMA, GSDMC 및/또는 GSDMD 단백질의 발현도 엑소좀의 생산을 촉진시킬 수 있는 것을 확인하였다. 또한, DFNA5, GSDMA, GSDMC, 및/또는 GSDMD를 포함하는 Gasdermin family의 단백질은 용량 증가에 따라 엑소좀 생산량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 하나의 실시예에서, Gasdermin family의 단백질인 GSDMA, GSDMC, GSDMD, 및/또는 DFNA5은 엑소좀 마커 단백질일 수 있다. GSDMA, GSDMC, GSDMD, 및/또는 DFNA5의 단백질은 온전한 형 (full-length form)과 절단된 형(degraded from)이 엑소좀의 막에 존재할 수 있다. 그러므로, 다양한 임상 질환의 표본에서 apoptotic 엑소좀의 존재 유무를 판별하고 정량할 수 있는 표지로 활용할 수 있다.

그리고, Gasdermin family의 단백질 중 GSDMB 및/또는 DFNB59 단백질의 과발현은 세포고사 엑소좀(Apoptotic exosome)의 생산을 억제할 수 있으므로, GSDMB 및/또는 DFNB59 단백질은 엑소좀 분비를 억제하는 마커로서 활용할 수 있다.

상기 엑소좀은 세포고사 유래 엑소좀(apoptotic exosome) 또는 줄기세포 유래 엑소좀일 수 있다.

상기 세포고사 유래 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주, 또는 종양 세포에 세포사멸 유도 물질을 처리하여 얻어진 것일 수 있다.

상기 줄기세포는, 중배엽줄기세포(mesoderm stem cell), 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell), 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell)는 배아 줄기세포(ES Cell), 미분화생식선세포(EG Cell), 역분화줄기세포(iPS Cell) 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 다능성 줄기세포(multipotent stem cell)는 중간엽 줄기세포(지방유래, 골수유래, 제대혈 또는 탯줄유래 등), 조혈계 줄기세포(골수 또는 말초 혈액 등에서 유래), 신경계 줄기세포, 생식 줄기세포 등의 성체 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 인간 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포 hES-MSC(Human embryonic stem cell-derived mesenchymal stroma cells), 골수 유래 중간엽 줄기세포 BM-MSC(Bone marrow mesenchymal stem cell), 탯줄 유래 중간엽 줄기세포 UC-MSC(Umbilical cord mesenchymal stem cell), 또는 지방유래 중간엽 줄기세포 ADSC(Adipose Derived Stem Cell-Condtioned Medium)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 줄기 세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있고, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있으며, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 줄기세포는 배아 줄기세포, 성체 줄기세포 또는 유도만능줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "배아 줄기세포(embryonic stem cell)"는 배아의 발생과정에서 추출한 세포로, 수정란이 모체의 자궁에 착상하기 직전인 포배기 배아에서 내세포괴(inner cell mass)를 추출하여 체외에서 배양한 것을 의미한다.

상기 배아 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(多能性, pluripotent)이거나 전능성(全能性, totipotent)이 있는 자가재생능(selfrenewal)을 갖는 세포를 의미하며, 넓은 의미로는 배아 줄기세포로부터 유래한 배아체(embryoid bodies)도 포함한다.

상기 배아 줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 배아 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "성체 줄기세포(adult stem cell)"는 제대혈이나 다 자란 성인의 골수, 혈액 등에서 추출되는 세포로 구체적 장기의 세포로 분화되기 직전의 세포를 의미하며, 필요한 때에 신체 내 조직으로 발달할 수 있는 능력을 보유한 미분화 상태의 세포를 의미한다.

상기 성체 줄기세포는 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 성체 줄기세포, 인간 또는 동물 조직 유래 중배엽 줄기세포(mesenchymal stromal cell), 인간 또는 동물 조직 유래 유도만능줄기세포로부터 유래된 중배엽 줄기세포 및 인간 또는 동물 조직 유래 다분화능 줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)"는 분화된 세포들로부터 인위적인 역분화 과정을 통해 다능성 분화능을 가지도록 유도된 세포들을 의미하며, "역분화줄기세포"와 동일한 의미로 사용될 수 있다.

상기 인위적인 역분화 과정은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 센다이바이러스를 이용한 바이러스-매개 또는 비바이러스성 벡터 이용,　단백질　및 세포 추출물 등을 이용하는 비바이러스-매개 역분화 인자의 도입에 의해 수행되거나, 줄기세포 추출물, 화합물 등에 의한 역분화 과정을 포함할 수 있다.

상기 유도만능줄기세포는 배아 줄기세포와 거의 동일한 특성을 가지며, 구체적으로는, 유사한 세포 모양을 가지고,　유전자,　단백질　발현이 유사하며, in vitro 및 in vivo에서 전분화능을 가지고, 테라토마(teratoma)를 형성하며, 생쥐의 배반포(blastocyst)에 삽입시켰을 때, 키메라(chimera) 생쥐를 형성하고,　유전자의 생식선 전이(germline transmission)가 가능하다.

상기 유도만능줄기세포는 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 개, 고양이, 생쥐, 토끼 등의 모든 유래의 유도만능줄기세포를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인간 또는 동물 조직은, 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 인간 또는 동물의 다양한 조직 기원의 줄기세포는 예를 들어, 조혈모세포, 유선 줄기세포, 장 줄기세포, 혈관내피 줄기세포, 신경 줄기세포, 후각신경 줄기세포 및/또는 정소 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 면역세포는, 수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 체세포는, 섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포 (keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 선택되는 것일 수 있다.

상기 세포주는, CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK-293 STF 세포, 293T/17 세포, 293T/17 SF 세포, 또는 HEK-293.2sus 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, NuLi-1 세포, ARPE-19 세포, VK2/E6E7 세포, Ect1/E6E7 세포, RWPE-2 세포, WPE-stem 세포, End1/E6E7 세포, WPMY-1 세포, NL20 세포, NL20-TA 세포, WT 9-7 세포, WPE1-NB26 세포, WPE-int 세포, RWPE2-W99 세포, 및 BEAS-2B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

상기 종양세포는 난소암, 유방암, 간암, 뇌암, 대장암, 전립선암, 자궁경부암, 폐암, 위암, 피부암, 췌장암, 구강암, 직장암, 후두암, 갑상선암, 부갑상선암, 결장암, 방광암, 복막암, 부신암, 설암, 소장암, 식도암, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 요관암, 요도암, 인두암, 질암, 편도암, 항문암, 흉막암, 흉선암 또는 비인두암으로부터 유래하는 것일 수 있다.

상기 종양세포는 인간 난소암 세포주(SKOV3, OVCAR3), 인간 유방암 세포주(MCF-7, T47D, BT-474), 인간 간암종 세포주(Hep3B, HepG2), 인간 아교 교아종 세포주(U87MG, U251), 인간 대장암 세포주(SW480, HT-29, HCT116, Caco-2), 인간 폐암 세포주(A549, NCIH358, NCI-H460), 인간 전립선암 세포주(22RV1), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간 흑색종 세포주(A375), 및 인간 위암 세포주(NCI-N87)로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 명세서에서 "생산　촉진"이란 대조군에 비하여 특정물질의 생산, 생성, 방출 등이 동일한 시간 내에서　증가되는 것을 의미한다.

구체적으로는, 줄기세포로부터　엑소좀이 생산되는 수량과,　엑소좀　내　단백질, RNA 등의 함량이　증가되는 것을 의미한다.

이하 본 발명을 실험예, 실시예 및 비교예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 비교예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험예 1: 세포 및 시약(Cells and reagents) 준비

HeLa cell line (human cervical cancer)은 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 minimal essential media (MEM)에서 배양하였다. 293T (human embryonic kidney) 세포주는 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 100 U/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin이 첨가된 DMEM에서 배양하였다. Staurosporine은 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)에서 구입하였다, 각각의 항체는 다음의 회시에서 구입하였다.: Anti-GSDMA (ProSci, CA), anti-GSDMB (Santa Cruz, CA), anti-GSDMC (ProteinTech, Manchester, UK), anti-GSDMD (Sino biological, Beijing, China) anti-DFNA5 (Sino biological, Beijing, China), anti-DFNB59 (Novusbio, Colorado), anti-GAPDH (Santa Cruz, CA), anti-tubulin (Sigma-Aldrich, Yongin, Korea), anti-CD63 (Santa Cruz, CA), anti-S1PR1 (EMD Millipore, Princeton, NJ), anti-S1PR3 (Santa Cruz, CA).

실험예 2: Lentivirus 입자의 제조 및 stable cell line의 제조

GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME), 또는 DFNB59 cDNA는 Sino biological (Beijing, China)에서 구입하였으며, pCDH-CMV-MCS-EF1-puro Lentiviral vector (System Biosciences)나 pCDH-EF1-MCS-T2A-puro Lentivrial vector (System Biosciences)에 subcloning하였다. 모든 lentiviral vector는 293TN cells (System Biosciences)에 Lipofectamine 2000 transfection reagents (Invitrogen)를 이용하여 transfection하였으며 2일 후, psudo-virus particle을 수거한 후 HeLa 세포와 293T세포에 감염시켰다. HeLa 세포와 293T 세포는 감염 2일째부터 puromycin (2 ug/ml)을 처리하고 2주간 더 배양하여, gasdermin family gene을 발현하는 세포들을 선별하였다. 그리고 유전자의 과발현을 western blot으로 확인하였다.

실험예 3: CRISPR / Cas9 시스템을 이용한 Knock-out 세포주 제작

Knock-out 세포주의 제작은 Feng Zhang lab.의 LentiCRISPR v2 vector (Addgene #52961)를 이용하였다. DFNA5와 GSDMD를 targetting할 수 있는 각각 4쌍의 oligonucleotide (20 mer)를 제작한 후, LentiCRISPR v2에 cloning 한 후, lentiviral particle을 위의 방법으로 제조한 후, HeLa 세포에 감염시켰다. 2 주간 puromycin (2 ug/ml) selection후, 유전자의 knock-out을 western blot으로 확인하였다.

실험예 4: 세포고사 엑소좀(apoptotic exosome)의 분리

세포의 세포고사(apoptosis) 유도 후, 배양액 (conditioned media)으로부터 세포고사 엑소좀(apoptotic exosome)을 분리하였다. 배양액을 300 x g에서 5-20 분간 그리고 2,000 x g에서 5-40 분간 두 번 원심분리한 부유액 (supernatants)을 100,000 x g에서 20-120분간 초원심분리하여 최종적으로 엑소좀을 분리하였다. 분리한 엑소좀 pellet은 PBS (phosphate-buffered cell line)이나 RIPA buffer (pH 7.5 50mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1mM EDTA)에 부유하였다. 엑소좀 막(membrane) 성분의 분리를 위해, PBS에 부유한 엑소좀을 100 mM Na₂CO₃ (pH 11)으로 1시간 처리한 후, PBS로 세척하였다.

실험예 5: Nanoparticle Tracking Analysis

Nanoparticle tracking analysis는 ZetaView Nanoparticle Tracking Analyzer를 이용하여, 다음의 조건에서 분석하였다: camera sensitivity (80), shutter (250), frame rate (30f/s), Min brightness(20), Max size (1000), Min size (8), traces (12).

< 실시예 1>. HeLa 세포주에서 Gasdermin family gene의 과발현에 의한 엑소 좀의 분비 증가

HeLa 세포주에 Gasdermin family gene [GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME), DFNB59]을 과발현시킨 후, 24시간동안 staurosporine (1 uM) 처리하여 세포고사 (apoptosis)를 유도하였다. 배양액으로부터 엑소좀을 분리하고 엑소좀 갯수와 직경을 nanoparticle tracking analysis (NTA)로 그리고 엑소좀의 마커 단백질 (CD63, S1PR1, S1PR3)의 발현을 western blot으로 분석하였다.

도 1(A)는 HeLa 세포주에 Gasdermin family gene [GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME), DFNB59]을 과발현시킨 후, 24시간동안 staurosporine(1 uM) 처리하여 세포고사(apoptosis)를 유도한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하고 엑소좀의 마커 단백질(CD63, S1PR1, S1PR3)의 발현을 western blot으로 분석한 것이다. 도 1(B)과 (C)는 엑소좀 갯수와 직경을 nanoparticle tracking analysis (NTA) 한 것이다. 표 1은 Gasdermin의 과발현 HeLa 세포주의 Apoptotic 엑소좀 분비량을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 1 및 표 1과 같이 GSDMA, GSDMC, GSDMD, 그리고 DFNA5의 과발현은 직경 100 ~ 200 nm의 엑소좀 크기의 입자의 분비를 통계적으로 유의하게 증가시켰으며, 엑소좀의 마커인 CD63, S1PR1, S1PR3의 발현도 유사하게 증가시켰다. 특히 DFNA5의 과발현은 엑소좀의 분비를 가장 많이 증가시켰다. 이에 반해 GSDMB와 DFNB59의 과발현은 엑소좀의 분비를 통계적으로 유의하게 억제하였다.

Cells	Mean Partcle Number/ 10 7 Cells	S.D ./ 10 7 Cells
HeLa	4.62857 ×1012	1.56 ×1010
Vector	4.69286 ×1012	1.65 ×1010
GSDMA	5.27104 ×1012	2.44 ×1010
GSDMB	2.17699 ×1012	8.21 ×109
GSDMC	7.09091 ×1012	4.30 ×1010
GSDMD	7.04082 ×1012	8.07 ×1010
DFNA5	2.14286 ×1013	1.56 ×1011
DFNB59	1.48819 ×1012	7.30 ×1019

< 실시예 2>. 293T 세포주에서 Gasdermin family gene의 과발현에 의한 엑소 좀의 분비 증가

Gasdermin family gene이 과발현된 293T 세포주에서 staurosporine (10 uM) 처리 후, 48시간동안 배양하여 apoptosis를 유도하였다.

도 2(A)는 239T 세포주에 Gasdermin family gene [GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, DFNA5(GSDME), DFNB59]을 과발현시킨 후, 24시간동안 staurosporine(1 uM) 처리하여 세포고사(apoptosis)를 유도한 배양액으로부터 엑소좀을 분리하고 엑소좀의 마커 단백질인 CD63, S1PR1, S1PR3의 발현을 western blot으로 분석한 결과이다. 도 2(B)는 엑소좀 갯수를 nanoparticle tracking analysis (NTA) 한 결과를 나타낸 것이다. 표 2는 Gasdermin의 과발현 239T 세포주의 Apoptotic 엑소좀 분비량을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 2 및 표 2와 같이 gasdermin family gene 중에서 DFNA5 과발현 이 293T 세포에서 엑소좀의 분비를 증가시켰으며, DFNB59의 과발현은 엑소좀의 분비를 통계적으로 유의하게 억제하였다.

Cells	Mean Partcle Number/ 10 7 Cells	S.D ./ 10 7 Cells
293T	7.54 ×1010	5.72 ×109
Vector	7.28 ×1010	1.09 ×1010
GSDMA	8.33 ×1010	5.27 ×109
GSDMB	6.8 ×1010	9.16 ×109
GSDMC	8.42 ×1010	1.01 ×1010
GSDMD	8.61 ×1010	6.48 ×109
DFNA5	1.79 ×1011	1.49 ×1010
DFNB59	3.6 ×1010	3.88 ×109

< 실시예 3> DFNA5와 GSDMD의 knock-out에 의한 apoptotic 엑소좀 분비의 억제

HeLa 세포주에서 과발현시 엑소좀의 분비를 증가시킨 gasdermin 중에서 DFNA5와 GSDMD를 CRSPR/Cas9을 이용하여 knock-out 시킨 후, stauroporine 처리에 의한 apoptotic exosome의 분비를 측정하였다.

도 3의 A와 D는 CRISPR/Cas9에 의해 DFNA5나 GSDMD를 knock-out시킨 세포주를 각각 4개씩 만들고 발현 억제를 western blot으로 확인한 것이다. 도 3의 B, E는 엑소좀 마커의 발현을 western blot으로 나타낸 것이다. 그리고, 각각의 세포주를 24시간 동안 staurosporine (1 uM) 처리하고 엑소좀을 분리한 후 분리된 엑소좀의 개수를 NTA 법으로 측정하여 도 3의 C, F에 나타내었다.

Cells	Mean Partcle Number/ 10 7 Cells	S.D ./ 10 7 Cells
HeLa	4.55 ×1012	4.81 ×1011
Vector	3.7 ×1012	6.56 ×1011
DFNA5 KO-1	2.52 ×1011	4.48 ×1010
DFNA5 KO-2	2.94 ×1011	4.34 ×1010
DFNA5 KO-3	1.386 ×1011	2.94 ×1010
DFNA5 KO-4	3.08 ×1011	2.8 ×1010

Cells	Mean Partcle Number/ 10 7 Cells	S.D ./ 10 7 Cells
HeLa	4.69 ×1012	3 ×1011
Vector	4.76 ×1012	3.57 ×1011
GSDMD KO-1	2.73 ×1012	2.21 ×1011
GSDMD KO-2	2.87 ×1012	1.29 ×1011
GSDMD KO-3	3.22 ×1012	3.54 ×1011
GSDMD KO-4	3.01 ×1012	2.74 ×1011

표 3 및 표 4는 각각 DFNA5 knock-out HeLa 세포주의 Apoptotic 엑소좀 분비량 및 GSDMD knock-out HeLa 세포주의 Apoptotic 엑소좀 분비량을 나타낸 것이다.

그 결과, 도 3, 표 3 및 표 4와 같이 DFNA5를 Knock-out시킨 4개의 세포주 모두에서 엑소좀의 분비가 완전히 억제됨을 NTA에 의한 엑소좀의 개수 측정과 엑소좀의 마커에 대한 western blot에서 확인하였다. GSDMD의 knock-out은 부분적으로 엑소좀의 분비를 억제하였다.

< 실시예 4> DFNA5 과발현 세포주와 knock-out 세포주의 시간에 따른 엑소좀 분비의 변화

HeLa 세포주, control vector를 infection 시킨 HeLa 세포주, DFNA5를 과발현시키거나 knock-out시킨 HeLa 세포주를 staurosporine (1 uM)을 처리한 후, 시간에 따라 생산된 엑소좀을 분리하고 NTA법에 의해 엑소좀의 개수를 측정하고 western blot으로 엑소좀 마커의 발현을 측정하였다.

도 4에서 A는 control vector를 infection 시킨 HeLa 세포주, DFNA5를 과발현 또는 knock-out시킨 HeLa 세포주를 staurosporine (1 uM)을 처리한 후, 시간에 따라 분비된 엑소좀을 분리하고 NTA법에 의해 엑소좀의 개수를 나타낸 것이고, B는 western blot으로 엑소좀 마커의 발현을 측정한 것이다(H: from parental HeLa cells; V: vector-infected HeLa cells; D: the cells over-expressing DFNA5; K: the cells knocked out in DFNA5).

도 4를 참조하면, DFNA5의 과발현은 대조군에 비해 시간에 따라 엑소좀의 생산을 급격히 증가시켰으나, DFNA5의 knock-out은 모든 시간에서 엑소좀의 생산을 억제하였다. 이 결과는 DFNA5의 발현 조절을 통해, 세포에서 apoptotic 엑소좀의 분비를 조절할 수 있음을 보여준다.

< 실시예 5> Apoptotic 엑소좀의 생산을 촉진하는 Gasdermin family 단백질

HeLa 세포주, 형질전환된 대조군 벡터, Gasdermin family gene을 과발현시킨 HeLa 세포주에서 Gasdermin의 발현을 정상 세포용해액(lysate)과 staurosporine (1 uM)을 처리한 세포용해액과 비교 분석하였다.

도 5는 HeLa 세포, 형질전환된 대조군 벡터, Gasdermin의 과발현 HeLa 세포를 staurosporine (1 uM) 처리한 후, 엑소좀을 분리한 후 같은 양의 미처리 대조군 세포주 용해액 (C), staurosporine을 처리한 세포주 용해액 (S), 세포고사 엑소좀 용해액 (A)으로 gasdermin family 단백질 종류별로 western blot을 시행한 것을 나타낸 것이다(화살표: full-length gasdermin; 화살표머리: Degraded gasdermin).

도 6은 Gasdermin이 과발현된 HeLa 세포를 staurosporine (1 uM) 처리한 후, 엑소좀을 분리한 후 같은 단백질 양의 정상 세포주 용해액 (C), staurosporine을 처리한 세포주 용해액 (S), staurosporine 처리 세포 배양액 (C' Media), 엑소좀 (Exosome), 엑소좀 막 (membrane) (Exo Memb)을 gasdermin family 단백질 종류별로 western blot을 시행한 것을 나타낸 것이다(화살표: full-length gasdermin; 화살표머리: Degraded gasdermin)

도 6을 참조하면 GADMA, GSDMC, GSDMD, DFNA5의 온전한 형(full-length)과 절단된 형(degraded from)은 stauroporine을 처리한 HeLa 세포의 배양액보다 분리한 엑소좀의 막(membrane)에 축적되어 있음을 확인하였다.

그러므로 세포고사 엑소좀의 분비를 증가시키는 gasdermin family 단백질인 GSDMA, GSDMC, GSDMD, DFNA5의 온전한 형 (full-length form)과 절단된 형 (degraded from)은 엑소좀의 막에 존재하는 새로운 엑소좀 마커로 사용할 수 있으며, 다양한 임상 질환의 표본에서 apoptotic 엑소좀의 존재 유무를 판별하고 정량할 수 있는 표적으로 응용할 수 있다. 그리고 이러한 연구를 통해 엑소좀이 다양한 인간의 질환에서의 역할을 할 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CK-Exogene Co., Ltd. <120> CELL FOR REGULATING PRODUCTION OF EXOSOME, COMPOSITION INCLUDING THE SAME, EXOSOME OBTAINED THEREFROM AND METHOD FOR PRODUCING EXOSOMES <130> 20P0604T <150> KR 10-2020-0078274 <151> 2020-06-26 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1338 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgaccatgt ttgaaaatgt cacccgggcc ctggccagac agctaaaccc tcgaggggac 60 ctgacaccac ttgacagcct catcgacttc aagcgcttcc atcccttctg cctggtgctg 120 aggaagagga agagcacgct cttctggggg gcccggtacg tccgcaccga ctacacgctg 180 ctggatgtgc ttgagcccgg cagctcacct tcagacccaa cagacactgg gaattttggc 240 tttaagaata tgctggacac ccgagtggag ggagatgtgg atgtaccaaa gacggtgaag 300 gtgaagggaa cggcagggct ctcgcagaac agcactctgg aggtccagac actcagtgtg 360 gctcccaagg ccctggagac cgtgcaggag aggaagctgg cagcagacca cccattcctg 420 aaggagatgc aagatcaagg ggagaacctg tatgtggtga tggaggtggt ggagacggtg 480 caggaggtca cactggagcg agccggcaag gcagaggcct gcttctccct ccccttcttc 540 gccccattgg ggctacaggg atccataaat cacaaggagg ctgtaaccat ccccaagggc 600 tgcgtcctgg cctttcgagt gagacagctg atggtcaaag gcaaagatga gtgggatatt 660 ccacatatct gcaatgataa catgcaaacc ttccctcctg gagaaaagtc aggagaggag 720 aaggtcatcc ttatccaggc atctgatgtt ggggacgtac acgaaggctt caggacacta 780 aaagaagaag ttcagagaga gacccaacaa gtggagaagc tgagccgagt agggcaaagc 840 tccctgctca gctccctcag caaacttcta gggaagaaaa aggagctaca agaccttgag 900 ctcgcacttg aaggggctct agacaaggga catgaagtga ccctggaggc actcccaaaa 960 gatgtcctgc tatcaaagga ggccgtgggc gccatcctct atttcgttgg agccctaaca 1020 gagctaagtg aagcccaaca gaagctgctg gtgaaatcca tggagaaaaa gatcctaccc 1080 gtgcagctaa agctggtgga gagcacgatg gaacagaact tcctgctgga taaagagggt 1140 gttttccccc tgcaacctga gctgctctcc tcccttgggg acgaggagct gaccctcacg 1200 gaggctctag tcgggctgag tggcctggaa gtgcagagat cgggccccca atatatgtgg 1260 gacccagaca ccctccctcg cctctgtgct ctttatgcag gcctctctct ccttcagcag 1320 cttaccaagg cctcctaa 1338 <210> 2 <211> 445 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Thr Met Phe Glu Asn Val Thr Arg Ala Leu Ala Arg Gln Leu Asn 1 5 10 15 Pro Arg Gly Asp Leu Thr Pro Leu Asp Ser Leu Ile Asp Phe Lys Arg 20 25 30 Phe His Pro Phe Cys Leu Val Leu Arg Lys Arg Lys Ser Thr Leu Phe 35 40 45 Trp Gly Ala Arg Tyr Val Arg Thr Asp Tyr Thr Leu Leu Asp Val Leu 50 55 60 Glu Pro Gly Ser Ser Pro Ser Asp Pro Thr Asp Thr Gly Asn Phe Gly 65 70 75 80 Phe Lys Asn Met Leu Asp Thr Arg Val Glu Gly Asp Val Asp Val Pro 85 90 95 Lys Thr Val Lys Val Lys Gly Thr Ala Gly Leu Ser Gln Asn Ser Thr 100 105 110 Leu Glu Val Gln Thr Leu Ser Val Ala Pro Lys Ala Leu Glu Thr Val 115 120 125 Gln Glu Arg Lys Leu Ala Ala Asp His Pro Phe Leu Lys Glu Met Gln 130 135 140 Asp Gln Gly Glu Asn Leu Tyr Val Val Met Glu Val Val Glu Thr Val 145 150 155 160 Gln Glu Val Thr Leu Glu Arg Ala Gly Lys Ala Glu Ala Cys Phe Ser 165 170 175 Leu Pro Phe Phe Ala Pro Leu Gly Leu Gln Gly Ser Ile Asn His Lys 180 185 190 Glu Ala Val Thr Ile Pro Lys Gly Cys Val Leu Ala Phe Arg Val Arg 195 200 205 Gln Leu Met Val Lys Gly Lys Asp Glu Trp Asp Ile Pro His Ile Cys 210 215 220 Asn Asp Asn Met Gln Thr Phe Pro Pro Gly Glu Lys Ser Gly Glu Glu 225 230 235 240 Lys Val Ile Leu Ile Gln Ala Ser Asp Val Gly Asp Val His Glu Gly 245 250 255 Phe Arg Thr Leu Lys Glu Glu Val Gln Arg Glu Thr Gln Gln Val Glu 260 265 270 Lys Leu Ser Arg Val Gly Gln Ser Ser Leu Leu Ser Ser Leu Ser Lys 275 280 285 Leu Leu Gly Lys Lys Lys Glu Leu Gln Asp Leu Glu Leu Ala Leu Glu 290 295 300 Gly Ala Leu Asp Lys Gly His Glu Val Thr Leu Glu Ala Leu Pro Lys 305 310 315 320 Asp Val Leu Leu Ser Lys Glu Ala Val Gly Ala Ile Leu Tyr Phe Val 325 330 335 Gly Ala Leu Thr Glu Leu Ser Glu Ala Gln Gln Lys Leu Leu Val Lys 340 345 350 Ser Met Glu Lys Lys Ile Leu Pro Val Gln Leu Lys Leu Val Glu Ser 355 360 365 Thr Met Glu Gln Asn Phe Leu Leu Asp Lys Glu Gly Val Phe Pro Leu 370 375 380 Gln Pro Glu Leu Leu Ser Ser Leu Gly Asp Glu Glu Leu Thr Leu Thr 385 390 395 400 Glu Ala Leu Val Gly Leu Ser Gly Leu Glu Val Gln Arg Ser Gly Pro 405 410 415 Gln Tyr Met Trp Asp Pro Asp Thr Leu Pro Arg Leu Cys Ala Leu Tyr 420 425 430 Ala Gly Leu Ser Leu Leu Gln Gln Leu Thr Lys Ala Ser 435 440 445 <210> 3 <211> 1212 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgttcagcg tatttgagga aatcacaaga attgtagtta aggagatgga tgctggaggg 60 gatatgattg ccgttagaag ccttgttgat gctgatagat tccgctgctt ccatctggtg 120 ggggagaaga gaactttctt tggatgccgg cactacacaa caggcctcac cctgatggac 180 attctggaca cagatgggga caagtggtta gatgaactgg attctgggct ccaaggtcaa 240 aaggctgagt ttcaaattct ggataatgta gactcaacgg gagagttgat agtgagatta 300 cccaaagaaa taacaatttc aggcagtttc cagggcttcc accatcagaa aatcaagata 360 tcggagaacc ggatatccca gcagtatctg gctacccttg aaaacaggaa gctgaagagg 420 gaactaccct tttcattccg atcaattaat acgagagaaa acctgtatct ggtgacagaa 480 actctggaga cggtaaagga ggaaaccctg aaaagcgacc ggcaatataa attttggagc 540 cagatctctc agggccatct cagctataaa cacaagggcc aaagggaagt gaccatcccc 600 ccaaatcggg tcctgagcta tcgagtaaag cagcttgtct tccccaacaa ggagacgatg 660 aagaaggatg gtgcttcatc ctgtttagga aagtctttgg gttcggagga ttccagaaac 720 atgaaggaga agttggagga catggagagt gtcctcaagg 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Asp Ile Ser Leu Glu Arg Leu Lys Ser 450 455 460 Ser Val Lys Ala Val Ile Leu Lys Asp Ser Lys Val Phe Pro Leu Leu 465 470 475 480 Leu Cys Ile Thr Leu Asn Gly Leu Cys Ala Leu Gly Arg Glu His Ser 485 490 495 <210> 11 <211> 1059 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 atgtttgctg ctgctaccaa gagctttgtc aagcaagttg gagatggagg gagattagtt 60 cctgttccaa gcctcagtga agctgacaaa tatcaacctc taagtctggt ggtaaaaaag 120 aagcgatgct ttctgtttcc tagatataaa tttacttcaa caccttttac actgaaagat 180 attctcctag gagacagaga aatttcagct ggtatttcat cttatcaatt actgaattat 240 gaagatgaat cagatgtttc actctatgga aggcgaggta accatattgt aaatgacgtt 300 gggattaacg ttgctggatc agattccatt gcagtgaaag cttcatttgg tatagtaacc 360 aaacatgaag tggaagtatc aacattactc aaagaaatta ctacacgaaa aattaacttt 420 gaccacagct tgatacgtca gtcaaggagc agcagaaagg cagtattgtg tgtggtcatg 480 gagagcatcc gaaccacacg acagtgctca ctgtctgtgc atgctggaat tcgaggggaa 540 gcaatgcggt ttcactttat ggatgaacag aatcccaagg gaagggacaa agctattgtt 600 ttcccagcac atacaaccat agctttcagt gtttttgaac tcttcatata cctggatggt 660 gcctttgacc tttgtgtcac ttcagtgtca aaaggaggat ttgaaaggga agaaacggca 720 acatttgcac tgctgtacag gttgagaaat atcctatttg aaagaaatag aagagtgatg 780 gatgtcattt ctcgttcaca gctttacttg gatgatcttt tttctgacta ctatgacaaa 840 cctctcagca tgactgatat ttcactcaaa gaagggaccc atatccgagt taacttactt 900 aatcacaaca ttcccaaagg gccttgcata ctctgtggaa tggggaactt caaaagggag 960 acagtttatg ggtgctttca gtgttctgtt gatggtcaga agtatgtgag acttcatgca 1020 gttccttgtt ttgatatttg gcacaagagg atgaaataa 1059 <210> 12 <211> 352 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Phe Ala Ala Ala Thr Lys Ser Phe Val Lys Gln Val Gly Asp Gly 1 5 10 15 Gly Arg Leu Val Pro Val Pro Ser Leu Ser Glu Ala Asp Lys Tyr Gln 20 25 30 Pro Leu Ser Leu Val Val Lys Lys Lys Arg Cys Phe Leu Phe Pro Arg 35 40 45 Tyr Lys Phe Thr Ser Thr Pro Phe Thr Leu Lys Asp Ile Leu Leu Gly 50 55 60 Asp Arg Glu Ile Ser Ala Gly Ile Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Tyr 65 70 75 80 Glu Asp Glu Ser Asp Val Ser Leu Tyr Gly Arg Arg Gly Asn His Ile 85 90 95 Val Asn Asp Val Gly Ile Asn Val Ala Gly Ser Asp Ser Ile Ala Val 100 105 110 Lys Ala Ser Phe Gly Ile Val Thr Lys His Glu Val Glu Val Ser Thr 115 120 125 Leu Leu Lys Glu Ile Thr Thr Arg Lys Ile Asn Phe Asp His Ser Leu 130 135 140 Ile Arg Gln Ser Arg Ser Ser Arg Lys Ala Val Leu Cys Val Val Met 145 150 155 160 Glu Ser Ile Arg Thr Thr Arg Gln Cys Ser Leu Ser Val His Ala Gly 165 170 175 Ile Arg Gly Glu Ala Met Arg Phe His Phe Met Asp Glu Gln Asn Pro 180 185 190 Lys Gly Arg Asp Lys Ala Ile Val Phe Pro Ala His Thr Thr Ile Ala 195 200 205 Phe Ser Val Phe Glu Leu Phe Ile Tyr Leu Asp Gly Ala Phe Asp Leu 210 215 220 Cys Val Thr Ser Val Ser Lys Gly Gly Phe Glu Arg Glu Glu Thr Ala 225 230 235 240 Thr Phe Ala Leu Leu Tyr Arg Leu Arg Asn Ile Leu Phe Glu Arg Asn 245 250 255 Arg Arg Val Met Asp Val Ile Ser Arg Ser Gln Leu Tyr Leu Asp Asp 260 265 270 Leu Phe Ser Asp Tyr Tyr Asp Lys Pro Leu Ser Met Thr Asp Ile Ser 275 280 285 Leu Lys Glu Gly Thr His Ile Arg Val Asn Leu Leu Asn His Asn Ile 290 295 300 Pro Lys Gly Pro Cys Ile Leu Cys Gly Met Gly Asn Phe Lys Arg Glu 305 310 315 320 Thr Val Tyr Gly Cys Phe Gln Cys Ser Val Asp Gly Gln Lys Tyr Val 325 330 335 Arg Leu His Ala Val Pro Cys Phe Asp Ile Trp His Lys Arg Met Lys 340 345 350

Claims (20)

1. GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질의 발현을 조절하여 배양한 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 청구항 1에 있어서,
   상기 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질은,
   엑소좀의 막에 존재하는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
6. 청구항 1에 있어서,
   상기 세포는,
   줄기세포, 면역세포, 체세포, 세포주, 또는 종양 세포에 세포사멸 유도 물질을 처리하여 얻어진 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
7. 청구항 6에 있어서,
   상기 줄기세포는,
   중배엽 줄기세포(mesoderm stem cell), 만능성 줄기세포(pluripotent stem cell), 다능성 줄기세포(multipotent stem cell), 또는 단분화능 줄기세포(unipotent stem cell)인 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
8. 청구항 6에 있어서,
   상기 면역세포는,
   수지상세포(dendritic cell), 자연살해세포(natural killer cell), T 세포(T cell), B 세포 (B cell), 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg cell), 자연 살해 T 세포(natural killer T cell), 선천성 림프구 세포(Innate lymphoid cell), 대식세포(macrophage), 과립구(Granulocyte), 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T: Chimeric antigen receptor-T cell), 림포카인 활성 살해세포(LAK: Lymphokine-activated killer Cell) 및 사이토카인 유도성 살해세포(CIK: Cytokine Induced Killer Cell)로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
9. 청구항 6에 있어서,
   상기 체세포는,
   섬유아세포(fibroblast), 연골세포(chondrocyte), 활액막 세포(synovial cell), 피부각질세포 (keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 조골세포(osteoblast), 파골세포(osteoclast) 및 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
   
10. 청구항 6에 있어서,
    상기 세포주는,
    CHO 세포, NS0 세포, Sp2/0 세포, BHK 세포, C127 세포, HEK293 세포, HEK293T 세포, HEK-293 STF 세포, 293T/17 세포, 293T/17 SF 세포, 또는 HEK-293.2sus 세포, HT-1080 세포, PER.C6 세포, NuLi-1 세포, ARPE-19 세포, VK2/E6E7 세포, Ect1/E6E7 세포, RWPE-2 세포, WPE-stem 세포, End1/E6E7 세포, WPMY-1 세포, NL20 세포, NL20-TA 세포, WT 9-7 세포, WPE1-NB26 세포, WPE-int 세포, RWPE2-W99 세포, 및 BEAS-2B 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
    
11. 청구항 6에 있어서,
    상기 종양 세포는,
    인간 난소암 세포주(SKOV3, OVCAR3), 인간 유방암 세포주(MCF-7, T47D, BT-474), 인간 간암종 세포주(Hep3B, HepG2), 인간 아교 교아종 세포주(U87MG, U251), 인간 대장암 세포주(SW480, HT-29, HCT116, Caco-2), 인간 폐암 세포주(A549, NCIH358, NCI-H460), 인간 전립선암 세포주(22RV1), 인간 자궁경부암 세포주(HeLa), 인간 흑색종 세포주(A375), 및 인간 위암 세포주(NCI-N87)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 세포.
    
12. 청구항 1 및 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 세포를 포함하는 엑소좀 생산 억제용 조성물.
    
13. 청구항 12에 있어서,
    상기 세포는,　
    엑소좀의 수,　엑소좀　유래　단백질,　또는　엑소좀　유래 RNA의 함량을　감소시키는 것을 특징으로 하는 엑소좀 생산 억제용 조성물.
    
14. 청구항 1 및 청구항 5 내지 청구항 11 중 어느 한 항의 세포로부터 얻은 엑소좀.
    
15. 청구항 14에 있어서,
    상기 엑소좀은,
    GSDMB 및 DFNB59로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 가스더민 군(Gasdermin family) 단백질을 과발현시켜 배양한 세포로부터 얻은 것을 특징으로 하는 엑소좀.
    
16. 청구항 14에 있어서,
    상기 엑소좀은 세포고사 유래 엑소좀(apoptotic exosome)인 것을 특징으로 하는 엑소좀.
    
17. 청구항 14에 있어서,
    상기 엑소좀의 직경은 100 nm ~ 250 nm인 것을 특징으로 하는 엑소좀.
    
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