KR20190015154A - Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 형성 및 전이를 억제한다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포로서 높은 세포 증식율을 가지면서, 독시사이클린 처리 유무에 따라 세포 내에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인 발현으로 인한 비정상적인 분화 가능성이 낮고, 5-FC 처리에 의해 세포사멸이 유도됨으로써 잔존 줄기세포를 제거할 수 있어 안정성이 높다. 뿐만 아니라, TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 세포주의 항암 효과가 우월함을 확인한 바, 본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물{PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING MESENCHYMAL STEM CELL EXPRESSING TRAIL AND CD}
본 발명은 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
TRAIL(Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand)은 TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질로서, 인체 내 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. TRAIL은 세포의 표면에 존재하는 세포사멸 수용체-4(DR-4), DR-5, 데코이(decoy) 수용체 또는 데코이 수용체-2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킴으로써 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 하지만, 인간의 모든 신체 조직에서 TRAIL이 발현되는 것은 아니다. 인간의 뇌조직에서는 TRAIL이 발현되지 않고, 대신 신경교세포(Neuroglia)가 신경염증성 질환 및 세포사멸에 관여한다(Dorr J. et al., J Neurosci., 22(4):RC209, 2002).
한편, 신경교세포가 암세포화되면 신경교종이 발생하는데, 신경교종은 정상적인 뇌 조직을 파괴하고 뇌 속을 돌아다녀 치료가 까다로운 질병으로 알려져 있다. 이러한 신경교종을 치료하기 위한 치료제 개발에 있어서, TRAIL을 암세포에 인위적으로 발현시키는 방법을 통해 치료하고자 하는 시도가 이루어지고 있으나, TRAIL을 암세포에서 효과적으로 발현시키기 어렵다는 문제가 있다.
한편, CD(cytosine deaminase)는 인체에 무해한 전구약물인 5-FC(5-fluorocytosine)를 세포 독성을 지닌 항암물질인 5-FU(5-fluorouracil)로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 이때, 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세포를 죽이는 주변인 효과(by-stander effect)를 나타낸다. 이러한 CD 및 5-FC를 이용한 항암치료는 신경교종을 치료하는데 유용할 수 있다. 그러나, 줄기세포의 증식에 한계가 있어 시간이 지남에 따라 CD의 발현량이 감소하게 되어 5-FU의 항암효과가 줄어들게 되는 문제점이 있다.
한편, 전 세계적으로 세포를 이용한 치료방법이 개발되고 있으며, 성체줄기세포를 이용한 세포치료제에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 성체줄기세포인 중간엽줄기세포(MSC)는 뼈, 연골, 근육, 지방, 섬유아세포 등으로 분화할 수 있는 다능성(multipotent) 세포이다. 상기 MSC는 골수, 제대혈, 지방 등 다양한 성체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증, 암조직 또는 손상부위로 이동하는 특이성이 있어, 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있다. 또한, T 세포, B 세포, 수지상 세포 및 자연살해 세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하거나 활성화시켜, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니라, MSC는 시험관 내(in vitro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특성으로 인해 MSC를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다.
그러나, 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고, 세포 치료제로서 임상에 사용할 수 있는 등급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째, MSC의 증식에는 한계가 있어, 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다양한 종류의 세포가 혼합되어 있어, 생산시 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋째, MSC만을 이용할 경우 치료 효과가 높지 않다.
한편, 대한민국 등록특허 제1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서 전처리 과정을 단축하여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있으나, 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라서, 세포 치료제로 사용할 수 있는 안전하고 효과적인 중간엽줄기세포에 대한 연구가 필요한 실정이다.
특히, CD를 발현하도록 레트로바이러스를 이용하여 신경줄기세포를 형질전환시킨 연구가 수행된 바 있다(Jana Portnow et al., Clinical Cancer Research 23(12):2951-2960, 2017). 하지만, 상기 연구에서 사용된 줄기세포는 조직에서 수득한 일반적인 신경줄기세포로서 증식에 한계가 있어 대량 생산하기 어려운 문제점이 있다. 그뿐 아니라, 신경줄기세포의 증식에 한계로 인해 CD 발현량이 감소하여 완치할 정도의 항암효과를 기대하기 어렵다.
대한민국 등록특허 제1585032호
Dorr J. et al., J Neurosci., 22(4):RC209, 2002 Xu-Yong Sunm et al., World Journal of Stem Cells, 3 (11): 96-103., 2011 Jana Portnow et al., Clinical Cancer Research 23(12):2951-2960, 2017
이에 본 발명자들은 효과적인 암 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과, TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 중간엽줄기세포가 암의 형성 및 전이를 억제하여 항암효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은, TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 동시에 발현하도록 형질전환된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 형성 및 전이를 억제한다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포로서 높은 세포 증식율을 가지면서, 독시사이클린 처리 유무에 따라 세포 내에서 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인 발현으로 인한 비정상적인 분화 가능성이 낮고, 5-FC 처리에 의해 세포사멸이 유도됨으로써 잔존 줄기세포를 제거할 수 있어 안전성이 높다. 뿐만 아니라, TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 세포주의 항암 효과가 매우 우월함을 확인한 바, 본 발명의 약학 조성물은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 중간엽줄기세포(MSC)의 불사화 유무에 따른 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
Y축: 누적된 PDL.
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 벡터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소(tetracycline response elements)를 포함하는 프로모터;
TRAIL: TNF-연관 세포사멸-유도 리간드;
IRES: 내부 리보좀 진입 부위; 및
CD: CD 단백질.
도 3은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 발현하는 MSC(BM-03)에서 CD90, CD44, CD105, CD73 표면항원 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 4는 BM-03 세포주가 지방생성, 골형성, 또는 연골형성 세포로 분화한 것을 통해 형질감염 이후에도 다중 분화능이 유지되는 것을 확인한 도면이다.
도 5a는 기탁 세포주인 BM-03 세포주에서 TRAIL 및 CD의 발현량을 확인한 도면이다. 1번 레인은 마커, 2번 레인은 음성대조군, 3번 레인은 양성대조군, 4번 내지 6번 레인은 BM-03 세포주를 나타낸다.
도 5b는 기탁 세포주인 BM-03 세포주에서 TRAIL 및 CD의 발현을 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 통해 정량한 도면이다.
도 6은 독시사이클린(Dox) 처리 유무에 따른 BM-03 세포주의 TRAIL 단백질 발현 여부를 확인한 그래프이다.
도 7은 BM-03 세포주에 5-FC를 처리 유무에 따른 BM-03 세포주의 세포 사멸효과를 FACS를 통해 확인한 그래프이다.
도 8은 BM-03 세포주의 TRAIL, CCR2 및 CXCR4의 발현 유무를 확인한 도면이다.
도 9는 계대 배양하여 수득한 BM-03 세포주의 PDL 값을 측정하여 그래프로 나타낸 것이다.
도 10은 BM-03 세포주의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 BM-03 세포주 주입에 따른 종양 형성 억제효과를 인간 신경교종 유발 마우스를 이용해 확인한 사진이다.
도 12는 도 11의 사진을 토대로 종양의 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 13은 BM-03 세포주 주입 및 5-FC 투여에 따른 인간 신경교종 유발 마우스의 생존일 증가를 확인한 도면이다.
도 14는 농도별 BM-03 세포주 주입에 따른 종양 형성 억제 효과를 인간 신경교종 유발 마우스를 이용해 확인한 사진이다.
도 15는 도 14의 사진을 토대로 종양의 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 16은 농도별 BM-03 세포주 주입에 따른 인간 신경교종 유발 마우스의 생존일 증가를 확인한 도면이다.
도 17은 트랜스웰 챔버를 이용한 BM-03 세포주의 종양 이동성을 확인하는 실험방법을 나타낸 도면이다.
도 18은 트랜스웰 챔버를 이용한 BM-03 세포주의 종양 이동성을 in vitro 상에서 확인한 도면이다.
도 19는 신경교종 유발 마우스를 이용하여 BM-03 세포주의 종양 이동성을 in vivo 상에서 확인한 도면이다.
도 20은 3 종류의 신경교종 세포에 불멸화된 중간엽줄기세포(imMCS), BM-03 세포주 및/또는 5-FC 처리한 후, 암세포의 사멸 정도를 확인한 도면이다.
도 21은 3 종류의 신경교종 세포에 불멸화된 중간엽줄기세포(imMCS) 또는 BM-03 세포주 및/또는 5-FC 처리한 후, 줄기세포의 사멸 정도를 나타낸 도면이다.
도 22는 신경교종 유발 마우스에 BM-03 세포주를 단회투여한 후 신경교종 유발 마우스의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 23은 신경교종 유발 마우스에 BM-03 세포주를 다회 투여한 후 신경교종 유발 마우스의 생존율을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명의 일 측면은, TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 동시에 발현하는 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TRAIL"이란, TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질로서, TNF 패밀리 중 제2형 막관통단백질을 의미한다. 상기 TRAIL은 자살 유전자 중 하나로써, 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로, 상기 TRAIL은 세 개의 수용체에 결합할 수 있는 호모트리머(homotrimer) 형태로 존재한다. 상기 TRAIL은 세포 표면에 존재하는 세포사멸 수용체-4(DR-4), DR-5, 데코이(decoy) 수용체 또는 데코이 수용체-2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킨다. 또한, TRAIL은 정상 세포에 대해서는 독성이 없고, 암세포에서만 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
상기 TRAIL은 인간 유래의 단백질일 수 있으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TRAIL은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. TRAIL을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 TRAIL을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 상기 TRAIL을 코딩하는 유전자는 TRAIL의 활성을 유지하는 TRAIL의 변이체를 코딩하는 염기서열일 수 있다. 상기 TRAIL의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한, 상기 TRAIL의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CD"란, 시토신 디아미네이즈(cytosine deaminase) 단백질을 의미한다. 또한, 상기 CD는 CD와 UPRT(uracil phosphoribosyltransferase)가 결합된 융합단백질의 형태일 수 있으며, 본 명세서에서 CD는 CD::UPRT와 혼용될 수 있다.
또한, 상기 CD는 인체에 무해한 전구약물인 5-FC(5-fluorocytosine)를 세포 독성을 지닌 항암물질인 5-FU(5-fluorouracil)로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 이때, 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세포를 죽이는 주변인 효과(by-stander effect)를 나타낸다. 따라서, CD를 발현하는 세포에 5-FC를 처리하면 CD를 발현하는 세포 근처에서 5-FU로 인한 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
또한, 상기 CD를 코딩하는 유전자는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 CDase를 코딩하는 FCY1 유전자와, N-말단으로부터 35개의 아미노산이 결실된 UPRTase를 코딩하는 FUR1△105 유전자를 융합하여 코돈 최적화(codon-optimization)된 서열일 수 있다. 상기 서열은 미국 특허 제5,338,678호, 국제특허공개 제WO 96/16183호 및 국제특허공개 제WO 99/54481호에 기재된 것일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 CD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 CD는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. CD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 CD을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 상기 CD를 코딩하는 유전자는 CD의 활성을 유지하는 CD의 변이체를 코딩하는 염기서열 일 수 있다. 상기 CD의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한, 상기 CD의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 세포는 인간배아줄기세포(human embryonic stem cell, hES), 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMSC), 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell, MSC), 인간신경줄기세포(human neural stem cell, hNSC), 윤부줄기세포(limbal stem cell) 또는 경구점막상피세포(oral mucosal epithelial cell)일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 중간엽줄기세포는 hTERT 및 c-Myc 유전자가 도입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "형질전환"이란, 유전자 전달체와 도입방법에 상관없이 외래 유전자를 세포에 도입하여, 도입된 외래 유전자에 의해 세포의 형질이 바뀌는 것을 의미한다.
상기 형질전환은 TRAIL 및 CD와 TRAIL 및 CD의 활성을 유지하는 변이체를 코딩하는 유전자를 당업계에 공지된 방법을 통해 줄기세포에 도입하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 형질감염(transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 유전자 총(gene gun) 또는 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "형질감염(transfection)"은, 바이러스 감염(infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 벡터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다.
구체적으로, 상기 형질전환된 세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것일 수 있다.
상기 렌티바이러스는 장기간의 잠복기를 특징으로 하는 레트로 바이러스과의 바이러스를 의미한다. 렌티바이러스는 숙주세포의 DNA 내에 유전정보를 전달할 수 있다. 비분열 세포에서 복제할 수 있는 유전자 전달 벡터의 가장 효과적인 방법 중 하나이다.
상기 형질전환된 세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 중간엽줄기세포에 hTERT 및 c-Myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 중간엽줄기세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 중간엽줄기세포에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계.
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-Myc는 중간엽줄기세포를 불사화시키는 유전자로서, 상기 hTERT 및 c-Myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질은 각각 서열번호 9 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편, 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 10 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로, 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 단계 2)의 3차 감염은 하나의 벡터에 TRAIL 및 CD 유전자를 모두 포함하는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 TRAIL 및 CD 유전자는 각각의 유전자 컨스트럭트로 제조되어 2개의 렌티바이러스 벡터에 각각 삽입될 수 있다. 즉, TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 벡터와 CD 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 벡터가 3차 감염에 사용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 형질전환된 중간엽줄기세포를 BM-03으로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프(envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "패키징 플라스미드(packaging plasmid)" 및 "엔벨로프 플라스미드(envelope plasmid)"이란, 렌티바이러스 벡터로부터 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 사용되는 플라스미드 또는 단리된 핵산을 의미한다. 상기 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터로부터 재조합 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터와 함께 사용될 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 벡터를 제조하고, 이를 패키징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 gag 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제, 외피 단백질, 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lenti-X Lentiviral Expression System이나, Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드(예를 들어, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드(예를 들어, pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등) 또는 공지의 서열을 이용하여 합성한 플라스미드 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "렌티바이러스 벡터"란, 레트로바이러스의 일종으로, 단일가닥 RNA 형태의 벡터를 의미한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터와 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시키며, 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL), 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한, 상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 티미딘인산화효소(thymidine kinase, TK), CCR2 또는 CXCR4 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 TK는 ATP의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반응을 촉매하는 효소로, 이로 인해 티미딘은 삼인산 형태로 변형된다. 변형된 티미딘은 DNA 복제에 사용될 수 없다. 따라서, 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 TK 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 TK는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TK를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CCR2 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면, 상기 CCR2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 CCR2를 코딩하는 유전자는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CXCR4 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 상기 CXCR4는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 CXCR4를 코딩하는 유전자는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 상기 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 22로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CCR2 및 CXCR4 단백질은 본 발명의 중간엽줄기세포의 암세포 이동성을 증가시켜 치료 효능의 증대를 가져올 수 있다. 이러한 특징을 갖는 동일한 세포주를 대량으로 생산할 수 있어 상업적 치료제로서 개발이 가능하다.
본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 CD, TRAIL, CCR2, CXCR4, CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 특히, 이러한 세포주는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우, TRAIL 단백질을 80% 이상 발현하고, CCR2 및 CXCR4를 90% 이상 발현하는 세포주일 수 있다.
또한, 상기 세포주는 CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포주는 CD90, CD44 및 CD105 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한, 상기 세포주는 CD90, CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한, 상기 세포주는 CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한, 상기 세포주는 CD90, CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 특히 이러한 세포주는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우, CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 발현하는 세포주일 수 있다.
한편, 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 CD34, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 발현하지 않는 세포주일 수 있다. 구체적으로, 상기 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우, CD34, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 10%, 5%, 3%, 2%, 또는 1% 이하로 발현하는 세포주일 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 중간엽줄기세포는 TRAIL, CD(cytosine deaminase), CCR2, CXCR4 단백질을 발현하면서, 세포 표면 마커로서 CD90, CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하고(FACS 분석법으로 측정하여 95% 이상), CD34, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질은 발현하지 않는(FACS 분석법으로 측정하여 1% 미만) 세포주일 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 1 또는 2개의 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α) 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 재조합 렌티바이러스 벡터는 1개의 프로모터에 의해서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 TRAIL 및 CD는 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTA(tetracycline transactivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린(tetracycline) 또는 독시사이클린(doxycycline)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는 경우에는 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현은 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 여부에 의해 조절될 수 있다.
상기 용어 "작동 가능하게 연결된"은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 발명의 렌티바이러스 벡터에서 하나의 프로모터에서 두 개 이상의 유전자가 전사되도록 연결된 경우, 상기 하나의 전사체로부터 각각의 단백질이 발현될 수 있게 내부 리보좀 진입 부위(IRES)를 포함할 수 있다.
상기 "내부 리보좀 진입 부위(internal ribosome entry site, IRES)"는 진핵생물의 단백질 합성과정에서, 5'-캡 구조 대신 전사체의 중간 부위에서부터 번역이 가능하도록 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. IRES를 이용하여 하나의 전사체로부터 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있다. 일 실시예에 의하면, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 벡터는 TRAIL 및 CD를 IRES로 연결하여 하나의 전사체로 전사시킨 후, 이로부터 각각의 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "암"이란, 혈액암 및 고형암을 모두 포함하는 일반적인 암을 의미한다. 상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 자궁내막암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 뇌종양, 육종암, 식도암, 소장암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 약 20 중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 그 예로는 피하, 눈, 복강 내, 근육 내, 구강, 직장, 안와 내, 뇌 내, 두개 내(intracranial), 척추 내, 뇌실 내, 수강막 내, 비 내, 정맥 내 투여가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 상기 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 포함하는 약학 조성물을 뇌실내 또는 두개뇌 투여하였다.
상기 투여는 1회 이상, 1 내지 3회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 24시간 간격으로 7일 동안 반복투여하였다.
또한, 상기 투여는 세포의 경우, 성인 기준 1일 1.0x105 내지 1.0x1011 세포수, 구체적으로 1.0x107 내지 1.0x109 세포수의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포(MSC)의 제조
실시예 1.1. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 벡터를 제조하였다. 이때, Tet-off 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저, pWPT 벡터(Addgene, 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터 서열을 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하도록 디자인하여 합성함으로써(바이오니아) pBD 렌티바이러스 벡터를 제작하였다.
상기 pBD 렌티바이러스 벡터에, c-Myc 유전자(서열번호 8) 및 티미딘 인산화효소(thymidine kinase, TK) 유전자(서열번호 6)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 벡터에, hTERT 유전자(서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오신(zeocin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(ZeoR; 서열번호 16)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-2로 명명하였다.
또한, pBD 렌티바이러스 벡터에, tTA(tetracycline transactivator) 유전자(서열번호 12)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신(puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자(PuroR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 벡터는 pBD-3으로 명명하였다.
실시예 1.2. 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1.1.에서 제작된 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다.
먼저, 렌티-X 세포(Clontech Laboratories, 미국)는 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 ㎜ 디쉬(dish)에 배양하였다. 한편, 렌티바이러스 벡터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5α 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다.
상기 배양된 렌티-X 세포를 PBS로 세척한 후, 3 ㎖의 TrypLE™ Select CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 37℃ 온도에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 ㎖의 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 ㎖ 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ㎖의 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁한 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤, 150 ㎜ 디쉬에 1.2x107개의 세포가 되도록 분주하였다.
상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 ㎍의 렌티바이러스 벡터, 12 ㎍의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현, 패키징 플라스미드)서열을 합성하여(바이오니아) 확보된 SL-PACK 플라스미드 및 2.4 ㎍의 pMD.G 플라스미드(Addgene; VSVG 발현, 엔벨로프 플라스미드)를 합성하여(바이오니아) 확보된 SL-ENV 플라스미스 혼합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민(Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트(Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후, 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 동안 배양한 뒤, 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트(Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 혼합한 후, 4℃ 온도에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4℃ 온도, 4,000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하였다. 수득된 바이러스를 FBS가 포함되지 않은 0.5 ㎖의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과, pBD-1, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 벡터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0x108 TU/㎖, 2.0x108 TU/㎖ 및 1.2x109 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 1.3. 불사화된 MSC의 제조
상기 실시예 1.2.에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여, 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저, 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로, 건강한 공여자(donor)의 장골능(iliac crest)에서 골수천자액(bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/㎖의 헤파린과 혼합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 4℃ 온도, 739 RCF의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하고, 10배 부피의 멸균된 물과 혼합하였다. 이를 동일한 조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다.
수득된 펠렛을 20%(v/v) FBS 및 5 ng/㎖의 b-FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose(11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 37℃ 온도, 5% CO2 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤, 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3일 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고, 배양 2주 후 형광세포분석기(FACS)를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1.2.에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴(Retronectin, Clontech Laboratories, 미국)을 사용하여 100 MOI로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로, pBD-2 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 500 ㎍/㎖의 지오신을 첨가하여 pBD-2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 pBD-3 렌티바이러스 벡터를 100 MOI로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
MSC의 불사화 유무에 따른 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타나는 바와 같이, 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는, 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면, 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다.
실시예 2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작
실시예 2.1. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터의 제작
상기 제작된 pBD 렌티바이러스 벡터에, TRAIL 유전자(서열번호 2) 및 CD 유전자(서열번호 4)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 TRAIL 및 CD 유전자가 IRES(internal ribosome entry site)로 연결되고, TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. IRES는 리보좀 결합부위로, 5'-캡 구조가 없어도 번역(translation)이 시작될 수 있도록 하여, 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질이 발현될 수 있게 한다. 한편, TRE 프로모터는 독시사이클린(doxycycline, 631311, Clontech, 미국)의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
상기 제작된 벡터는 pBD-4로 명명하였고, 그 유전자 컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
실시예 2.2. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 2.1.에서 제작된 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 이용하여, 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 7.6x108 TU/㎖의 농도로 준비하였다.
실시예 3. TRAIL 및 CD를 발현하는 MSC의 제조
상기 실시예 1.3.에서 제조한 불사화된 MSC에, 상기 실시예 2.2.에서 생산한 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시킨 후, 감염된 MSC 중 TRAIL 및 CD를 발현하는 MSC(BM-03)를 선별하였다. 감염은 실시예 1.3.에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 3.1. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 이용한 MSC 형질감염
상기 불사화된 MSC에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시킨 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 ㎍/㎖의 독시사이클린을 첨가하여 TRAIL 및 CD의 발현을 억제시킨 상태로 배양하였다. 세포가 안정화된 후, 독시사이클린을 제거한 배양 배지에서 72시간 동안 배양하여 TRAIL 및 CD의 발현을 유도시켰고, 상기 세포로 FACS를 수행하여 세포 표면에 TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
구체적으로, TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 감염시킨 MSC를 FACS 튜브 당 5x105 세포수가 되도록 분주하였다. 그 후, 상기 FACS 튜브를 4℃ 온도에서, 1,500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 1 ㎖의 FACS 완충액(2% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하고, 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기의 세척 과정을 1회 더 수행한 뒤, 1 ㎖의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하였다.
재현탁한 세포에 200 ㎕의 FACS 완충액에 0.3 ㎕의 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain(Life Technologies-Molecular Probes, 미국) 및 5 ㎕의 항-TRAIL 항체인 APC anti-human CD253 항체(BioLegend, Cat#. 308210, 미국)를 첨가한 혼합물을 첨가하여, 4℃ 온도에서 30분간 반응시켰다. 반응 후, 상기와 같은 방법으로 세포를 2회 세척하였고, 상층액을 제거하였다.
그 후, 2%(v/v) 포름알데히드 및 1%(v/v) FBS를 PBS에 첨가하여 고정 완충액(fixing buffer)을 제조하였다. 세척된 세포에 300 ㎕의 고정 완충액을 첨가하고, 4℃ 온도에서 최소 15분 동안 반응시켰다. 상기 세포를 FACS(LSRFortessa, BD biosciences, 미국)기기로 분석하여, TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
또한, 상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-03이라고 명명하였다. 세포주 BM-03은 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
실험예 1. 형질전환된 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인
TRAIL 및 CD를 발현하는 BM-03 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간 MSC 분석 키트(StemflowTM, Cat No 562245, BD)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고, 실험 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 바와 같이, 본 발명의 BM-03 세포주는 CD90, CD44, CD105, 및 CD73 표면항원 단백질을 95%이상 발현하고, CD34, CD1B, CD19, CD45 및 HLA-DR은 1% 미만으로 발현하고 있음을 확인하였다. 반면, 인체에서 분리한 골수 유래 MSC의 경우, cell population에 따라 표면 마커의 발현 비율이 넓은 범위(60~90%)에서 확인되었다(data not shown). 이러한 표면항원 단백질의 발현을 통해 heterogeneous한 골수 유래 BM-MSC와 비교하여, 본 발명의 세포주가 homogenous한 특성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
실험예 2. BM-03 세포주의 분화능 확인
실험예 2.1. 지방세포(adipocyte)로의 분화 확인
지방세포로의 분화능을 확인을 위해 BM-03 세포주를 12-웰 플레이트에 1x104 cells/cm2의 농도로 시딩(seeding)하였다. 일반배지를 이용하여 37℃ 온도, 5% CO2 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤, 지방생성 분화 배지(StemPro® 지방생성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10070-01)로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일마다 교체해주며 21일간 배양하였다. 배양이 완료되면 오일-레드-오 용액 염색(Oil Red O solution staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
실험예 2.2. 골아세포(osteoblast)로의 분화 확인
골형성 확인을 위해 12-웰 플레이트에 5x103 cells/cm2의 농도로 시딩하였다. 일반배지를 이용하여 37℃ 온도, 5% CO2 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤 골 형성 분화 배지(StemPro® 골 형성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10072-01)으로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일 마다 교체해주며 21일간 배양하였다. 배양이 완료되면 알리자린-레드-에스 염색(Alizarin Red S staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
실험예 2.3. 연골세포(chondrocyte)로의 분화 확인
연골형성 확인을 위해 1.6x107 cells/㎖의 농도로 현탁하여 그 중 5 ㎕를 24웰에 시딩한 뒤 2시간 동안 배양하였다. 연골형성 분화 배지(StemPro® 연골형성 분화 키트, Thermo fisher Scientific, A10071-01) 500 ㎕를 첨가한 뒤 3일 간격으로 교체해주며 14일간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DPBS로 헹구어 펠렛을 떼어내었다. 동결절편(Cryosection) 과정을 거쳐 알시안 블루 염색(Alcian Blue staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
상기 실험예 2.1. 내지 2.3.의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주의 다중 분화능 (transdifferentiation)을 가지고 있음을 확인하였다.
실험예 3. 형질전환된 세포주의 도입유전자 확인 시험
상기 확립된 세포주인 BM-03 검체를 37℃ 온도의 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 ㎖ PBS가 포함된 15 ㎖ 튜브에 옮긴 후 1,500 rpm으로 5분간 셀 다운(Cell Down)시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤, 1.5 ㎖ 튜브에 200 ㎕ PBS로 펠렛을 현탁하여 옮겼다. NucleoSpin® Tissue(MN, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 1과 같이 혼합물을 만든 후, 하기 표 2의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때, 양성대조군으로 100 ng의 BM-03 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ㎕의 정제수(dw)를 넣었다.
정방향 프라이머(서열번호 17) (10 pmol/㎕, GX535) 1 ㎕
역방향 프라이머(서열번호 18) (10 pmol/㎕, GX534) 1 ㎕
검체 (100 ng/㎕) 1 ㎕
정제수 17 ㎕
총 부피 20 ㎕
단계 온도 시간 횟수
1 95℃ 5분 1
2 95℃ 45초 35
58℃ 45초
72℃ 1분
3 72℃ 7분 1
4 4℃ 무한정 1
1%(v/v) 아가로오스 겔을 전기영동 키트에 넣었다. 첫번째 웰에 10 ㎕의 DNA Size Marker를 로딩하였고, 다음 웰부터 음성대조군, 양성대조군, 3개의 BM-03 검체 순서로 각각 10 ㎕씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분 동안 전기영동을 실시하였고, 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주 검체 3개 모두 양성대조군과 동일한 사이즈 (1.2kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
또한, 정량 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 수행하여 TRAIL 및 CD 유전자 발현량을 확인하였다. 전임상 연구를 위한 3가지 BM-03 세포주(Lot#1, Lot#2, Lot#3)를 qRT-PCR 분석에 사용했다. 상기 BM-03 세포주의 RNA 1 ㎍을 RT-PCR에 사용하였다. 정량을 위한 qPCR의 경우, 렌티바이러스의 생산에 사용된 BM-03 세포주의 DNA를 연속적으로 희석시켜 표준 곡선을 만들었다.
그 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 상기 Lot#1, Lot#2 및 Lot#3의 BM-03 세포주로부터 검출된 TRAIL RNA의 평균은 6.22×107 copies였고, CD RNA는 total RNA 1 ㎍ 당 4.82×107 copies였다.
실험예 4. 형질전환된 세포주에서 TRAIL 및 CD 단백질의 발현 확인
상기 실시예 3.1.에서 확립된 BM-03 세포주에서 상기 실시예 3.1.과 동일한 방법으로 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 유도한 뒤, FACS를 수행하여 독시사이클린의 유무에 따른 TRAIL의 발현을 확인하였다. 이후 TRAIL의 발현이 확인된 세포주에서 CD 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지에 독시사이클린 2 ㎍/㎖이 들어간 배지와 들어가지 않은 배지를 이용하여 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 5x105 세포수가 되도록 계대 배양하였다. 3일 동안 배양한 뒤 세포를 수득하였다. 세포 수를 측정한 뒤 각 그룹 당 5x105 세포를 PE anti-human CD253(TRAIL) 항체 (BioLegend, 308206), PE Mouse IgG1, κ Isotype Control Antibody (BioLegend, 400112)를 이용하여 염색하였다. 또한, 죽은 세포들을 배제한 후 발현을 확인하기 위해 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit(Thermos Fisher Scientific L34976) 항체를 이용하였다. FACS(LSRFortessa, BD Biosciences)기기로 분석하였다.
동일한 방법으로 세포를 배양한 후 독시사이클린을 제거하여 CD 발현을 유도하였다. 여기에 5-FC(5-fluorocytosine, Sigma)를 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가한 뒤, 48시간 후에 세포의 사멸을 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 독시사이클린을 첨가하였을 때는 TRAIL이 발현되지 않았으나, 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-03 세포주에서는 TRAIL이 발현되는 것을 확인하였다. 또한, 도 7에 나타난 바와 같이, CD 단백질이 발현하면, 5-FC에 의해 세포가 사멸하는 것을 알 수 있었다. 즉, CD 단백질의 발현에 의해 세포가 사멸되는 것을 관찰하였다. 따라서, 제조된 중간엽줄기세포에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질이 발현되고, 이는 Tet-off 시스템에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
또한, TRAIL, CCR2 및 CXCR4를 발현하는 BM-03 세포주의 비율을 확인하기 위해 FACS를 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 하기 표 3에 기재된 항체가 함유된 FACS Buffer(2% 소태아 혈청을 포함한 PBS)에서 세포를 4℃ 온도에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후, 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후, FACS 분석 전에 Fixing Buffer(1% 파라포름알데히드를 함유한 PBS)에 재현탁시켰다. FACS 분석은 LSR FortessaTM 세포 분석기(BD Biosciences)를 이용하여 수행되었으며, flowJo_V10 또는 BD FACS Diva 소프트웨어로 분석하였다.
Antibody information
TRAIL PE TRAIL(C92B9) Rabbit mAb (Cell Signaling Technology)
PE Rabbit (DA1E) mAb IgG XP® Isotype Control (Cell Signaling Technology)
CCR2 APC anti-human CCR2(CD192) Antibody (Biolegend)
APC Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl (FC) Antibody (Biolegend)
CXCR4 BV421™ anti-human CD184 (CXCR4) Antibody (Biolegend)
BV 421™ Mouse IgG2a, κ Isotype Ctrl Antibody (Biolegend)
LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation (Invitrogen)
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 골수 유래 중간엽줄기세포에서는 발현되지 않는 TRAIL, CCR2 및 CXCR4 유전자가 BM-03 세포주에서 잘 발현하는 것을 확인하였다. 또한, 세 개 Lot의 BM-03 세포주를 분석함으로써 TRAIL, CCR2 및 CXCR4 유전자의 발현 정도가 균일한 것을 확인하였다.
상기 실험예 4.의 PCR 및 FACS 분석법의 실험결과들을 취합하여, 본 발명의 중간엽줄기세포의 QC(Quality Control) 기준을 아래와 표 4와 같이 수립하였다.
PCR 시험법 TRAIL_CD::UPRT 1,194 bp band 확인
CCR2_CXCR4 1,016 bp band 확인
FACS 분석법
(MSC 표면마커)		 CD90 ≥ 80.0%
CD44 ≥ 80.0%
CD105 ≥ 80.0%
CD73 ≥ 80.0%
Negative ≤ 10.0%
FACS 분석법 TRAIL ≥90%
CCR2 ≥90%
CXCR4 ≥90%
실험예 5. 형질전환된 세포주의 PDL (Population doubling level) 분석
4x105개의 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 2 ㎍/㎖의 독시사이클린이 포함된 배지에 시딩하였다. 3일 또는 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득한 후, 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 3일 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL 값은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이때, 하기 수학식 1에서 X는 초기 PDL, I는 배지에 시드된 초기 세포 수, Y는 최종 세포수율, 또는 성장기 말의 세포 수를 나타낸다.
Figure pat00001
도 9에 나타난 바와 같이, 장기 계대 배양으로 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.
실험예 6. 형질전환된 세포주의 핵형 분석
BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원(한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라 수행되었다. 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형임을 확인하였다.
실시예 4. 동물 모델을 이용한 BM-03 세포주의 항암효과 확인
실시예 4.1. 신경교종 유발 마우스 제조
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)으로부터 인간 신경교종 세포주인 U-87MG 세포를 얻어서 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 온도, CO2 5% 조건으로 배양하였다. 상기 U-87MG 세포에 반딧불이 루시페라아제(Luc)를 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질감염시켜 Luc를 안정적으로 발현하는 U-87MG 세포인 U-87MG-Luc 세포를 제작하였다. 그 후, U-87MG-Luc 세포를 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 37℃ 온도, CO2 5% 조건으로 배양하였다.
6주령의 수컷 누드 마우스(Athymic Nude Mouse)에 상기 U-87MG-Luc 세포를 두개내 이종이식(intracranial xenografts)하기 위해, 상기 마우스를 케타민/자일라진(ketamine/xylazine)으로 복강내 마취시켰다. 상기 1×105 세포수의 U-87MG-Luc 세포를 3 ㎕ PBS에 재현탁시킨 후, 미세주입 펌프(microinfusion pump)를 사용하여 해밀턴 시린지(Hamilton Company, Reno, NV)에 옮겨 담았다. 그 후, 상기 마취된 마우스의 두개 기저(skull base)로부터 2.5 mm의 깊이에서 브레그마(bregma) 2 mm 측면 및 1 mm 전방에 위치한 우측 전두엽 또는 양쪽 반구(hemispheres)에 정위적(stereotactically)으로 주입하였다.
실시예 4.2. BM-03 세포주에 의한 종양 억제 확인
BM-03 세포주 주입에 따른 신경교종 유발 마우스 뇌의 종양 억제를 확인하기 위해, 실시예 4.1.에서 U-87MG-Luc 세포를 마우스에 주입하고 7일 후에 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 종양세포 내로 주입하였다.
단회투여 실험의 경우, 2.5x105 세포수의 BM-03 세포를 8 ㎕ PBS에 재현탁시킨 후, 500 ㎎/㎏ 농도의 5-FC를 7일간 주사한 마우스와 주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 각각 주입하였다. 다회 투여 실험의 경우, U-87MG-Luc 세포를 마우스에 주입한지 7일, 21일 및 35일이 되는 날에 각각 BM-03 세포를 주입하였다. 구체적으로, 2x104, 1x105 또는 5x105 세포수의 중간엽줄기세포를 8 ㎕ PBS에 재현탁시킨 후, 500 ㎎/㎏ 농도의 5-FC를 7일간 주사한 마우스와 주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 주입하였다. U-87MG-Luc 세포를 마우스에 주입 6일 후부터 일주일 간격으로 공지의 방법을 통해 생체 내 발광 양을 측정하였다(Kim SM et al. International Journal of Nanomedicine 11:13-23, 2016). 생존은 최대 90일 동안 이어졌다.
단회투여 실험의 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다. 구체적으로, 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 종양은 대조군(control) 및 BM-03 세포만을 투여한 마우스의 종양보다 발광이 감소하였다. 또한, 도 13에 나타난 바와 같이, BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 마우스의 생존일도 증가하였다.
다회 투여 실험의 결과를 도 14 내지 도 16에 나타내었다. 구체적으로, 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 마우스의 종양은 대조군(control)의 종양보다 발광신호가 감소하였다. 특히, 1×105 cells/ 8 ㎕ 또는 5×105 cells/ 8 ㎕ 농도의 BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 발광신호가 크게 감소하였다. 또한, 도 16에 나타난 바와 같이, 1×105 cells/ 8 ㎕ 또는 5×105 cells/ 8 ㎕ 농도의 BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 생존일도 농도 의존적으로 증가하였다.
실험예 7. BM-03의 종양 이동성 확인 ( in vitro )
BM-03 세포주의 종양 이동성을 확인하기 위해 24-웰의 8 ㎛ 기공 필터가 있는 트랜스웰 챔버에서 상이한 조건으로 배양하였고 도 17에 나타내었다. 배양한 BM-03 세포를 트립신을 처리하여 분리한 후 세척하였다. 그 후, serum free Dulbecco’s modified Eagle’s medium에 재현탁시켰다. 상부 챔버에 3×104 세포수/ 100 ㎕ 농도의 MSC를 넣고 무혈청 DMEM, 10% FBS가 첨가된 DMEM, 300 ng/㎖ SDF-1a가 첨가된 DMEM, 300 ng/㎖ MCP1이 첨가된 DMEM 또는 U87 MG 배양배지의 조정배지(conditioned media)를 각각 하부 챔버에 넣어주었다. 그 후, 세포를 37℃ 온도 및 5% CO2 조건의 세포 배양 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 트랜스웰 챔버를 꺼내어 세척하고 diff-quick Kit(Sysmex)로 염색하였다. 그 후, 격막을 침투한 BM-03 세포의 수를 광학 현미경으로 계수하였다. 이를 통해, 필드 당 평균 세포수를 계산하여 BM-03 세포의 종양 이동 능력을 평가하였다.
그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 종양 세포를 배양한 배지를 넣어준 트랜스웰 챔버에서 격막을 통과한 BM-03 세포의 수가 많이 관찰되었다. 이를 통해 BM-03 세포주가 종양으로 이동하는 능력이 우수한 것을 확인하였다.
실험예 8. BM-03 세포주의 종양 이동성 확인 ( in vivo )
BM-03 세포주의 종양이동성 확인을 위해, BM-03 세포주에 형광물질인 DiD(ABD Bioquest, Inc.)를 표지하여 뇌종양으로의 이동성을 평가하였다. 구체적으로, 실시예 4.1에서 제작한 신경교종 유발 마우스의 종양 형성부위의 반대편 뇌에 DiD가 표지된 BM-03 세포를 이식한 후, BM-03 세포의 이동을 IVIS Spectrum In Vivo Imaging System(PerkinElmer)를 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 19에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주만을 뇌에 이식할 경우 세포의 이동이 전혀 없는 반면, 종양의 반대편에 이식한 BM-03 세포는 종양을 향해 반대편 뇌로 이동하는 것을 확인하였다.
실시예 5. BM-03 세포주의 항암 효능 확인 (in vitro)
상기 실시예 3.1.에서 확립된 BM-03 세포주의 항암 효능을 확인하기 위해, 인간 신경 교종 세포주인 U87MG, U373MG 또는 마우스 신경 교종 세포주인 GL26을 10% 소태아 혈청(Gibco)이 첨가된 DMEM(Hyclone)으로 배양하였다. 구체적으로, 배양 1일째, 1x105 세포수의 신경교종 세포를 6-웰 플레이트에 도말하였다. 배양 2일째, 신경교종 세포에 2x105 세포수의 불멸화된 중간엽줄기세포(imMSC) 또는 5x105 세포수의 BM-03 세포를 첨가하였다. 배양 4일째, 10 ㎎/㎖ 농도의 5-FC를 각 웰에 처리하였다. 배양 6일째, 줄기세포 및 신경교종 세포를 수거하고 FACS를 통해 신경교종 세포를 분석하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주를 처리한 군에서 모두 약 40% 정도의 신경교종 세포가 사멸되었다. 특히, BM-03 세포주 및 5-FC를 처리하였을 때 70% 이상의 신경교종 세포가 사멸되었다. 반면, 불멸화된 중간엽줄기세포를 처리한 군에서는 약 10% 미만의 신경교종 세포가 사멸되었다. 또한, 불멸화된 중간엽줄기세포 및 5-FC를 처리하였을 때도 10% 미만의 신경교종 세포가 사멸되었다.
또한, 도 21에 나타난 바와 같이, BM-03 세포 및 5-FC를 처리한 군에서 줄기세포가 잔존하지 않고 대부분 사멸하는 것을 확인하였다. 또한, 이를 통해 BM-03 세포주가 CD를 잘 발현하고 암세포 살상능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 6. BM-03 세포주의 항암 효능 확인( in vivo intraventricular injection)
10마리의 6주령 BALB/c 누드 마우스에 U-87 MG-Luc 1x105 세포수/ 3 ㎕ 무혈청 배지를 stereotaxic apparatus를 사용하여 브레그마(Bregma)로부터 AP 1.00, ML 1.50, DV -3.50 mm 좌표에 투여하여 암을 형성시켰다. 암 이식 7일 후, 8x104 또는 8x105 세포수/ 5 ㎕ cryostor BM-03 세포를 AP -0.50 mm, ML -1.20 mm, DV -2.40 mm 위치(intraventricular injection)에 투여하였다. BM-03 투여 후, 이틀 후부터 7일간 5-FC 500 ㎎/㎏을 복강투여하였다. 한편, 대조군으로 10마리의 누드마우스에 cryostor 5 ㎕를 투여하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 8x105 세포수/ 5 ㎕ cryostor BM-03 세포를 단회투여 받은 실험군의 생존율이 25% 가량 증가하였다.
또한, 단회투여와 동일한 조건으로 BM-03 세포주를 2주 간격으로 4회 투여하며 5-FC 투여도 동일한 사이클로 투여하여 다회 투여를 통한 동물시험 효력을 평가하였다. 그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이, 8x105 세포수/ 5 ㎕ cryostor BM-03 세포를 다회 투여 받은 실험군의 생존율이 25% 가량 증가하였다.
한국생명공학연구원 KCTC13182BP 20170106
<110> SLBIGEN Inc. THE CATHOLIC UNIVERSITY OF KOREA INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING CANCER COMPRISING MESENCHYMAL STEM CELL EXPRESSING TRAIL AND CD <130> FPD/201807-0058 <150> KR 2017/0099153 <151> 2017-08-04 <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 281 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of TRAIL <400> 1 Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys 1 5 10 15 Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala 20 25 30 Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys 35 40 45 Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr 50 55 60 Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val 65 70 75 80 Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser 85 90 95 Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro 100 105 110 Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly 115 120 125 Thr Arg Gly 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Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence of hTERT <400> 10 atgcccagag ctcccagatg cagagccgtg agaagcctgc tgagaagcca ctacagagag 60 gtgctgcccc tggccacctt cgtgagaaga ctgggacccc agggctggag actggtgcag 120 agaggcgacc ccgcagcctt tagagccctg gtggcccagt gcctggtgtg cgtgccctgg 180 gacgccagac ctcctcccgc tgcccccagc ttcagacagg tgagctgcct gaaggagctg 240 gtggccagag tgctccagag actgtgcgag agaggcgcca agaacgtgct ggcctttggc 300 ttcgccctgc tggatggagc cagaggcgga cctcccgagg ccttcaccac aagcgtgaga 360 agctacctgc ccaacaccgt gaccgatgcc ctgagaggct ccggcgcctg gggcctgctc 420 ctgagaagag tgggcgacga cgtgctggtg cacctgctgg ccagatgcgc cctgttcgtg 480 ctggtggctc ccagctgcgc ctaccaggtg tgcggacccc ctctgtacca gctgggagcc 540 gccacccagg caagaccccc tccccacgcc tctggaccca gaagaagact gggctgcgag 600 agagcctgga accacagcgt gagagaggct ggcgtgcccc tgggcctgcc cgcccctggc 660 gccagaagaa gaggcggcag cgccagcaga agcctgcccc tgcccaagag acccagacgc 720 ggcgccgctc ccgagcctga gagaacaccc gtgggccagg gcagctgggc ccaccccggc 780 agaaccagag gacccagcga cagaggcttc tgcgtggtga gccctgccag acccgccgag 840 gaggccacca gcctggaggg cgccctgagc ggcaccagac acagccaccc cagcgtgggc 900 agacagcacc acgccggccc tcctagcacc agcagacccc ccagaccttg ggacaccccc 960 tgcccccctg tgtacgccga gaccaagcac ttcctgtaca gcagcggcga caaggagcag 1020 ctgagaccca gcttcctgct gagctccctg agacccagcc tgaccggcgc cagaagactg 1080 gtggagacca tcttcctggg cagcagaccc tggatgcccg gcacccccag aagactgccc 1140 agactgcccc agagatactg gcagatgaga cccctgttcc tggagctgct gggcaaccac 1200 gcccagtgcc cctacggcgt gctgctgaag acccactgcc ccctgagagc tgccgtgacc 1260 cccgcagctg gcgtgtgcgc cagagagaag ccccagggca gcgtggccgc tcccgaggag 1320 gaggacaccg atcccagaag actggtgcag ctgctgagac agcacagcag cccctggcag 1380 gtgtacggct tcgtgagagc ctgcctgaga agactggtgc ctcccggcct gtggggcagc 1440 agacacaacg agagaagatt cctgagaaac accaagaagt tcatcagcct gggcaagcac 1500 gccaagctga gcctccagga gctgacatgg aagatgagcg tgagagactg cgcctggctg 1560 aggagaagcc ctggcgtggg ctgcgtgccc gccgccgagc acagactgag agaggagatc 1620 ctggccaagt ttctgcactg gctgatgagc gtgtacgtgg tggagctgct gagaagcttc 1680 ttctacgtga ccgagaccac attccagaag aacagactgt tcttttacag gaagagcgtg 1740 tggagcaagc tccagagcat cggcatcaga cagcacctga agagagtgca gctgagagag 1800 ctgagcgagg ccgaggtgag acagcacaga gaggccagac ccgccctgct gaccagcaga 1860 ctgagattca tccccaagcc cgatggcctg agacccatcg tgaacatgga ctacgtggtg 1920 ggagccagaa cctttagaag agagaagaga gccgagagac tgaccagcag agtgaaggcc 1980 ctgttcagcg tgctgaacta cgagagagcc agaagacccg gcctgctggg cgccagcgtg 2040 ctgggcctgg acgacatcca cagagcctgg agaaccttcg tgctgagagt gagagcccag 2100 gaccctcctc ccgagctgta cttcgtgaag gtggacgtga ccggcgccta cgacaccatc 2160 ccccaggaca gactgaccga ggtgatcgcc agcatcatca agccccagaa cacctactgc 2220 gtgagaagat acgccgtggt gcagaaggcc gcccacggcc acgtgagaaa ggccttcaag 2280 agccacgtga gcaccctgac cgacctccag ccctacatga gacagttcgt ggcccacctc 2340 caggagacca gccccctgag agatgccgtg gtgatcgagc agagctcttc cctgaacgag 2400 gcctccagcg gcctgttcga cgtgttcctg agattcatgt gccaccacgc cgtgagaatc 2460 agaggcaaga gctacgtgca gtgccagggc atcccccagg gcagcatcct gagcaccctg 2520 ctgtgcagcc tgtgctacgg cgacatggag aacaagctgt tcgctggcat cagaagagac 2580 ggcctgctgc tgagactggt ggacgacttc ctgctggtga ccccccacct gacccacgcc 2640 aagaccttcc tgagaaccct ggtgagaggc gtgcccgagt acggctgcgt ggtgaacctg 2700 agaaagaccg tggtgaactt tcccgtggag gacgaggccc tgggcggcac cgccttcgtg 2760 cagatgcccg cccacggcct gtttccctgg tgcggcctgc tcctcgacac cagaaccctg 2820 gaggtgcaga gcgactacag cagctacgca agaaccagca tcagagccag cctgaccttc 2880 aacagaggct tcaaggccgg cagaaacatg agaagaaagc tgttcggcgt gctgagactg 2940 aagtgccaca gcctgttcct ggacctccag gtgaacagcc tccagaccgt gtgcaccaac 3000 atctacaaga tcctgctgct ccaggcctac agattccacg cctgcgtgct ccagctgccc 3060 ttccaccagc aggtgtggaa gaatcccacc ttcttcctga gagtgatcag cgacaccgcc 3120 agcctgtgct acagcatcct gaaggccaag aatgccggca tgagcctggg cgccaagggc 3180 gccgctggac ccctgcccag cgaggccgtg cagtggctgt gccaccaggc cttcctgctg 3240 aagctgacca gacacagagt gacctacgtg cccctgctgg gcagcctgag aaccgcccag 3300 acccagctga gcagaaagct 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caccaggtgg ccaaggagga gagagagaca 480 cctaccacag actccatgcc ccctctgctg aggcaggcca tcgagctgtt tgatcaccag 540 ggcgccgagc cagccttcct gtttggcctg gagctgatca tctgcggcct ggagaagcag 600 ctgaagtgtg agtctggagg accagcagat gccctggacg atttcgacct ggatatgctg 660 cccgccgacg ccctggacga ttttgatctg gacatgctgc ctgctgatgc cctggatgat 720 tttgacctgg atatgctgcc tggataa 747 <210> 13 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence of PuroR <400> 13 Met Thr Glu Tyr Lys Pro Thr Val Arg Leu Ala Thr Arg Asp Asp Val 1 5 10 15 Pro Arg Ala Val Arg Thr Leu Ala Ala Ala Phe Ala Asp Tyr Pro Ala 20 25 30 Thr Arg His Thr Val Asp Pro Asp Arg His Ile Glu Arg Val Thr Glu 35 40 45 Leu Gln Glu Leu Phe Leu Thr Arg Val Gly Leu Asp Ile Gly Lys Val 50 55 60 Trp Val Ala Asp Asp Gly Ala Ala Val Ala Val Trp Thr Thr Pro Glu 65 70 75 80 Ser Val Glu Ala Gly Ala Val Phe Ala Glu Ile Gly Pro Arg Met Ala 85 90 95 Glu Leu Ser Gly Ser Arg Leu Ala Ala Gln Gln Gln Met Glu Gly Leu 100 105 110 Leu Ala Pro His Arg Pro 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tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgatgtggc cggagcggtc 60 gagttctgga ccgaccggct cgggttcagc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120 gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180 aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240 gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300 ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360 gaggagcagg actaa 375 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX535 Forward primer <400> 17 ctgattgaca tggatcacga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GX534 Reverse primer <400> 18 ctctcgtcga tgaactgctt 20 <210> 19 <211> 398 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg 20 25 30 Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe 35 40 45 Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys His Lys Phe Asp Val 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gcaagaaact gaagtgtctg 300 acagacatct atctgctgaa cctggctatt tcagatctgc tgtttctgat cactctgcct 360 ctgtgggcac actccgccgc taacgagtgg gtgtttggca atgccatgtg caagctgttc 420 accgggctgt accatatcgg ttatttcggc ggaattttct ttatcattct gctgacaatc 480 gacagatacc tggccattgt gcatgcagtc tttgccctga aagctcgcac tgtgaccttc 540 ggggtggtca cctctgtgat cacatggctg gtggcagtct ttgccagtgt gccaggtatc 600 attttcacta agtgccagaa agaggatagc gtgtacgtct gtggcccata ttttccccga 660 ggatggaaca atttccacac catcatgcgt aacattctgg gcctggtgct gcccctgctg 720 atcatggtca tttgctattc tggaatcctg aagacactgc tgaggtgtcg gaatgaaaag 780 aaaagacatc gcgctgtgag ggtcatcttt acaatcatga tcgtgtactt cctgttctgg 840 actccttata acatcgtgat tctgctgaat accttccagg agttctttgg gctgagtaac 900 tgcgaatcca ctagccagct ggaccaggct acccaggtga cagagactct gggaatgacc 960 cactgctgta tcaatccaat catctacgca ttcgtggggg aaaagtttag gagcctgttc 1020 catatcgctc tgggttgccg gattgcacct ctgcagaaac ccgtgtgcgg aggtccaggg 1080 gtccgacctg gcaagaatgt gaaagtcacc acacagggcc tgctggatgg acgggggaag 1140 gggaaaagca ttgggagagc accagaagca tcactgcagg acaaggaagg ggcttaa 1197 <210> 21 <211> 376 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly 1 5 10 15 Ala Val Phe Val Ser Pro Ser His Ala Glu Gly Ile Ser Ile Tyr Thr 20 25 30 Ser Asp Asn Tyr Thr Glu Glu Met Gly Ser Gly Asp Tyr Asp Ser Met 35 40 45 Lys Glu Pro Cys Phe Arg Glu Glu Asn Ala Asn Phe Asn Lys Ile Phe 50 55 60 Leu Pro Thr Ile Tyr Ser Ile Ile Phe Leu Thr Gly Ile Val Gly Asn 65 70 75 80 Gly Leu Val Ile Leu Val Met Gly Tyr Gln Lys Lys Leu Arg Ser Met 85 90 95 Thr Asp Lys Tyr Arg Leu His Leu Ser Val Ala Asp Leu Leu Phe Val 100 105 110 Ile Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Asp Ala Val Ala Asn Trp Tyr Phe 115 120 125 Gly Asn Phe Leu Cys Lys Ala Val His Val Ile Tyr Thr Val Asn Leu 130 135 140 Tyr Ser Ser Val Leu Ile Leu Ala Phe Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Leu 145 150 155 160 Ala Ile Val His Ala Thr Asn Ser Gln Arg Pro Arg Lys Leu Leu Ala 165 170 175 Glu Lys Val Val Tyr Val Gly Val 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ctggagatta tcaagcaggg gtgtgagttt 900 gaaaatactg tgcacaaatg gatcagcatt accgaagcac tggccttctt tcattgctgc 960 ctgaacccta tcctgtatgc cttcctgggc gcaaagttta aaacatccgc ccagcatgct 1020 ctgactagcg tgagccgggg cagcagcctg aagatcctgt ctaaggggaa aaggggcggg 1080 cactcaagcg tgtctacaga gagtgaatcc tctagtttcc attcaagcta a 1131

Claims (18)

  1. TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL), 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 동시에 발현하는 형질전환된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것인, 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 중간엽줄기세포는 hTERT 및 c-Myc 유전자가 도입된 것인, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것인, 약학 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스는 재조합 렌티바이러스 벡터, 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
    상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인, 약학 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스 벡터는 TNF-연관 세포사멸-유도 리간드 단백질(TRAIL), 및 시토신 디아미네이즈(CD) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것인, 약학 조성물.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 것인, 약학 조성물.
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스 벡터가 1 또는 2개의 프로모터를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스(CMV), 호흡기세포융합바이러스(RSV), 인간 성장인자-1 알파(human elongation factor-1 alpha, EF-1α 또는 TRE(tetracycline response elements) 프로모터인, 약학 조성물.
  11. 제 6항에 있어서,
    상기 재조합 렌티바이러스 벡터가 내부 리보좀 진입 부위(IRES)를 포함하는 것인, 약학 조성물.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CCR2 및/또는 CXCR4 단백질을 발현하는 것인, 약학 조성물.
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD90, CD44, CD105 및/또는 CD73 단백질을 발현하는 것인, 약학 조성물.
  14. 제 1항에 있어서,
    상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD34, CD11b, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 발현하지 않는 것인, 약학 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암이 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 자궁내막암, 호지킨병(Hodgkin's disease), 뇌종양, 육종암, 식도암, 소장암, 갑상선암, 전립선암, 백혈병, 림프종, 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학 조성물.
  16. 암을 예방 또는 치료하기 위한 제1항의 약학 조성물 용도.
  17. 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 제1항의 약학 조성물 용도.
  18. 제1항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
KR1020180091313A 2017-08-04 2018-08-06 Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR20190015154A (ko)

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EP2832851B1 (en) * 2012-03-28 2019-04-17 Quarrymen & Co. Inc. Immortalized stem cells and medicinal composition and medicinal preparation comprising product thereof as active ingredient
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