WO2019027298A2 - Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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이순민
김혜연
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Definitions

  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, mesenchymal stem cells expressing TRAIL and CD. Background technology
  • the TRAILCTumor Necrosis Factor-Related Listeria ss Inducing Ligand is a TNF-related apoptosis-inducing ligand protein that selectively induces apoptosis in cells in the human body.
  • TRAIL selectively kills cells by activating apoptotic signaling pathway by binding to cell death receptor-4 (DR-4), DR-5, decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface .
  • DR-4 cell death receptor-4
  • DR-5 decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface .
  • TRAIL is not expressed in all human tissues.
  • Neuroglia Neuroglia (Neuroglia) is involved in neuroinflammatory diseases and apoptosis (Dorr J. et al., J Neurosci., 22 (4): RC209, 2002) ).
  • glial ganglion develops, and it is known that the glial ganglion destroys the normal brain tissue and travels around the brain and is difficult to treat.
  • therapies for treating such glioma attempts have been made to treat TRAIL by artificially expressing TRAIL in cancer cells, but it is difficult to effectively express TRAIL in cancer cells.
  • CEKcytosine deaminase induces cell death by converting 5-FC (5-fhiorocytosine), a prodrug that is harmless to humans, into 5-FU (5-fluorouracil), a cytotoxic anticancer substance.
  • 5-FU represents a by-stander ef fect that is secreted out of the cell and kills the surrounding cells.
  • Such chemotherapy using CD and 5-FC may be useful for treating glioma.
  • the proliferation of stem cells is limited, the expression level of CD decreases over time, and the anti-cancer effect of 5-FU is recovered.
  • a cell-based treatment method is being developed all over the world, and a lot of research is underway on cell therapy using adult stem cells.
  • MSCs Mesenchymal stem cells
  • the MSC can be relatively easily obtained from various tissues such as bone marrow, umbilical cord blood, and fat.
  • MSCs have specificity to migrate to inflammatory, cancerous or injured areas and are also of great advantage as delivery vehicles for delivery of therapeutic drugs.
  • the immune function of the human body can be controlled by inhibiting or activating the functions of immune cells such as T cells, B cells, dendritic cells and natural killer cells.
  • T cells T cells, B cells, dendritic cells and natural killer cells.
  • Korean Patent No. 1585032 discloses a cell treatment agent containing mesenchymal stem cells cultured in a hydrogel.
  • the above document provides a composition which can be directly administered by shortening the pretreatment process in the step of separating mesenchymal stem cells for use as a cell therapy agent.
  • One aspect of the present invention provides a method for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, mesenchymal stem cells transformed to express TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL) and cytosine deaminase (CD)
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the invention provides the use of a pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • Another aspect of the present invention provides a method of treating cancer comprising the step of administering the pharmaceutical composition of the present invention to a subject.
  • the pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells as an active ingredient of the present invention inhibits the formation and metastasis of cancer cells by inducing apoptosis of cancer cells.
  • the mesenchymal stem cell has a high cell proliferation rate as an immortalized mesenchymal stem cell and can regulate the expression of TRAIL and CD protein in the presence or absence of the doxycycline treatment, The possibility of abnormal differentiation is low, and cell death is induced by 5-FC treatment, so that residual stem cells can be removed, and safety is high.
  • the anticancer effect of the cell line expressing TRAIL and CD at the same time is superior, and thus the pharmaceutical composition of the present invention can be usefully used for prevention or treatment of cancer.
  • FIG. 1 compares the cell proliferation rate according to the presence or absence of immortalization of mesenchymal stem cells (MSC) The graph is:
  • imMSC immortalized MSC
  • MSC MSC not immortalized
  • ⁇ axis accumulated PDL.
  • Figure 2 is a schematic representation of the construction of a gene construct inserted in a pBD-4 lentivirus vector:
  • TRE a promoter comprising tetracyclin response elements
  • TRAIL TNF-associated cell death-induced mögald
  • IRES internal ribosome entry site
  • CD CD protein
  • FIG. 3 shows the expression of CD90, CD44, CD105 and CD73 surface antigen proteins in TRAIL protein and MSCXBM-03 expressing CD protein.
  • FIG. 4 is a graph showing that the BM-03 cell line maintains its pluripotency after transfection through lipogenesis, osteogenesis, or differentiation into cartilage-forming cells.
  • FIG. 5A shows the expression levels of TRAIL and CD in the BM-03 cell line, which is a deposit cell line. Marker 1 for lane, negative control for lane 2, positive control for lane 3, BM-03 cell line for lanes 4 to 6.
  • FIG. 5B is a diagram quantifying the expression of TRAIL and CD in a BM-03 cell line, which is a deposit cell line, by quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR).
  • FIG. 6 is a graph showing the expression of TRAIL protein in the BM-03 cell line according to the presence or absence of Dox treatment.
  • FIG. 7 is a graph showing the cytotoxic effect of BM-03 cell line with or without 5-FC treatment on BM-03 cell line through FACS.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression of TRAIL, CCR2 and CXCR4 in the BM-03 cell line.
  • FIG. 9 is a graph showing the measurement of the PDL value of the BM-03 cell line obtained by subculturing.
  • Fig. 11 is a photograph showing the effect of inhibiting tumor formation by injection of BM-03 cell line using human glioma-induced mice.
  • FIG. 12 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG.
  • Fig. 13 shows the increase in survival days of human glioma-induced mice according to BM-03 cell line injection and 5-FC administration.
  • FIG. 14 is a photograph showing the inhibitory effect of tumor formation upon BM-03 cell line injection by concentration using human glioma-induced mice.
  • FIG. 15 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG. 14.
  • FIG. 15 is a graph showing the tumor size measured based on the photograph of FIG. 14.
  • FIG. 16 is a graph showing an increase in survival days of human glioma-induced mice following BM-03 cell line injection by concentration.
  • 17 is a diagram showing an experimental method for confirming tumor mobility of a BM-03 cell line using a transwell chamber.
  • FIG. 18 shows tumor mobility of BM-03 cell line in vitro using a transwell chamber.
  • FIG. 19 is a view showing in vivo tumor mobility of BM-03 cell line using glioma-induced mice.
  • FIG. 19 is a view showing in vivo tumor mobility of BM-03 cell line using glioma-induced mice.
  • FIG. 20 is a diagram showing the degree of death of cancer cells after treatment with immortalized mesenchymal stem cells (imMCS), BM-03 cell line and / or 5-FC in three glioma cells.
  • FIG. 21 is a diagram showing the degree of death of stem cells after treatment with immortalized mesenchymal stem cells (imMCS) or BM-03 cell line and / or 5-FC in three glioma cells.
  • FIG. 22 is a graph showing the survival rate of glioma-induced mice after single administration of BM-03 cell line to glioma-induced mice.
  • FIG. 23 is a graph showing the survival rate of glial stem-induced mice after multiple administration of BM-03 cell line to glioma-induced mice. Best Mode for Carrying Out the Invention
  • One aspect of the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising, as an active ingredient, transformed cells expressing TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL) and cytosine deaminase (CD) to provide.
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • TRAIL is a TNF-associated cell death-inducing ligand protein, which refers to a type II transmembrane protein of the TNF family.
  • the TRAIL selectively induces apoptosis of transformed cells as one of suicide genes.
  • the TRAIL is in the form of a homotrimer capable of binding to three receptors.
  • the TRAIL binds to apoptosis receptor-4 (DR-4), DR-5, decoy receptor or decoy receptor-2 present on the cell surface to activate apoptosis signaling system.
  • DR-4 apoptosis receptor-4
  • DR-5 decoy receptor
  • decoy receptor decoy receptor
  • the TRAIL may be a human-derived protein, and may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the gene encoding TRAIL may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, while the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 may be the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the TRAIL-encoding gene may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the TRAIL-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding a mutant of TRAIL that maintains TRAIL activity.
  • the variant of TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence coding for the mutant TRAIL may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
  • CD used in the present invention means a cytosine deaminase protein.
  • the CD may be in the form of a fusion protein in which CD and UPRT (uracil phosphoribosyl transferase) are combined, and in this specification, CD may be used with CD:: UPRT.
  • the CD contains 5-FC (5-fu luocytosine), which is harmless to the human body It is converted to 5-FU (5-fluorouracil), an anticancer substance with cytotoxicity, to induce apoptosis.
  • 5-FU 5-fluorouracil
  • 5-FU an anticancer substance with cytotoxicity
  • the gene coding for the CD is fused with the FCY1 gene encoding CDase of Saccharomyces cerevisiae and the FURlAl05 gene encoding UPRTase from which 35 amino acids are deleted from the N-terminus, (codon-opt imitat ion).
  • FCY1 gene encoding CDase of Saccharomyces cerevisiae
  • FURlAl05 gene encoding UPRTase from which 35 amino acids are deleted from the N-terminus, (codon-opt imitat ion).
  • Such sequences may be those described in U.S. Patent No. 5,338,678, WO 96/16183, and WO 99/54481.
  • the CD may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the CD is about 70% identical to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, "80%, may have a more than 90% or 95% homology.
  • Gene encoding CD is encoding an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the gene encoding the CD may be a nucleotide sequence of SEQ ID NO: Homology with the sequence of about 70%, 80%, 90%, or 95%.
  • the gene encoding the CD may be a nucleotide sequence encoding a mutant of CD that maintains CD activity.
  • the variant of CD may have a homology of about 70%, 80%, 90% or 95/4 or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the nucleotide sequence encoding the variant CD may have about 70%, 80%, 90% or 95% homology with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the cell can be a human embryonic stem cell (hES), a bone marrow stem cell (BMSC), a mesenchymal stem cell (MSC), a human neural stem cell cervical cells, hNSC, limbal stem cells, or oral mucosal epithelial cells.
  • hES human embryonic stem cell
  • BMSC bone marrow stem cell
  • MSC mesenchymal stem cell
  • human neural stem cell cervical cells hNSC
  • hNSC human neural stem cell cervical cells
  • hNSC hNSC
  • limbal stem cells or oral mucosal epithelial cells.
  • the cells may be mesenchymal stem cells have.
  • the mesenchymal stem cells may be immortalized.
  • the mesenchymal stem cells may be one in which hTERT and c-Myc attractants are introduced.
  • transformation used in the present invention means that a foreign gene is introduced into a cell regardless of the gene carrier and the introduction method, and the trait of the cell is changed by the introduced foreign gene.
  • the transformation can be carried out by introducing TRAIL and a gene encoding a mutant that maintains the activity of CD, TRAIL and CD into a stem cell through a method known in the art.
  • a method known in the art for example, transfection, microinjection, transduction, cell fusion, calcium phosphate precipitation, liposome-mediated transfection, DEAE dextran-mediated transfection (DEAE Dextran or by other known methods for introducing a nucleic acid into a cell, such as by electroporation, electroporation, mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, gene gun, (Wu et al., J. Bio. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem., 263: 14621-14624 1988).
  • electroporation electroporation, mediated transfection, polybrene-mediated transfection, electroporation, gene gun
  • transfection means delivering a gene loaded into a recombinant lentivirus vector through a viral infection.
  • the transformed cells may be transfected with a recombinant lentivirus.
  • the lentivirus means a virus of retroviruses characterized by a prolonged incubation period. Lentiviruses can transfer genetic information into the DNA of a host cell. It is one of the most effective methods of gene transfer vectors that can replicate in non-dividing cells.
  • the transformed cells can be prepared by the following method:
  • hTERT and c-Myc is a mesenchymal stem cell as a solidifying immortal gene
  • other genes are known in addition to the hTERT immortalized gene and C -M yc can also be used.
  • the hTERT and c-Myc proteins may be polypeptides having the amino acid sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 7, respectively.
  • the genes encoding the hTERT and c-Myc proteins may be polynucleotides having the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 8, respectively.
  • tTA is a gene capable of regulating the expression of a target protein, and means tetracycline transactivator.
  • the Tet-off system used in the present invention can regulate the expression of a target protein according to the presence or absence of tetracycline or doxycycline as described above.
  • the third infection of step 2) above can be carried out by harvesting the recombinant lentiviral vector of the present invention containing both TRAIL and CD genes in one vector.
  • the TRAIL and CD genes can be prepared into respective gene constructs and inserted into two lentiviral vectors, respectively. That is, a recombinant lentiviral vector in which a gene construct encoding a TRAIL protein is expressed and a recombinant lentiviral vector in which a gene construct constructed to express a gene encoding the CD protein is inserted Can be used for tea infections.
  • the transformed mesenchymal stem cells prepared as described above were designated as BM-03 and deposited on Jan. 6, 2017 with the accession number KCTC 13182BP at the BRC Center of the Korea Biotechnology Research Institute.
  • packaging plasmid and &quot
  • Envelope plasmid means a plasmid or an isolated nucleic acid that is used to efficiently produce lentivirus from a lentivirus vector.
  • the packaging plasmids and the envelope plasmids can be used as the Can be used in conjunction with the recombinant lentiviral vector of the present invention to efficiently produce a recombinant lentivirus from a recombinant lentiviral vector.
  • Such constructs contain elements useful for preparing and packaging lentiviral vectors in host cells. Such elements include structural proteins such as gag precursors; processing proteins such as pol precursors; Protease, envelope proteins, and expression and regulatory signals necessary to produce proteins in host cells and to produce lentiviral particles.
  • Production of the recombinant lentivirus may be carried out using Clontech Laboratories' Lent iX Lent i Viral Expression System or a packaging plasmid (for example, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP etc.) provided by Addgene or an envelope plasmid , PMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG), or a plasmid vector synthesized using a known sequence.
  • a packaging plasmid for example, pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP etc.
  • lentivirus vector means a vector of retrovirus, in the form of single stranded RNA.
  • the lentiviral vector may also be referred to as a lentiviral transfer vector.
  • the lentivirus vector can be inserted into the genomic DNA of a target cell to stably express the gene, and can transfer the gene to the dividing cell and the non-dividing cell. Since the vector does not induce the immune response of the human body, the expression is continuous.
  • there is an advantage that large size genes can be delivered as compared with adenovirus vectors which are conventionally used as virus vectors.
  • the recombinant lentiviral vector may comprise a gene encoding a TNF-associated cell death-inducing ligand protein (TRAIL), and a cytosine deaminase (CD) protein.
  • TRAIL TNF-associated cell death-inducing ligand protein
  • CD cytosine deaminase
  • the recombinant lentiviral vector may further comprise a gene encoding thymidine kinase (T), CCR2 or CXCR4 protein.
  • T thymidine kinase
  • the TK is an enzyme that catalyzes the thymidyl acid production reaction by binding phosphoric acid at the? -Position of? T? P to thymidine, whereby thymidine is transformed into the triphosphate form. Modified thymidine
  • the gene coding for the TK may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 may be the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 .
  • the CCR2 protein may be any known sequence.
  • the CCR2 may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19.
  • the CCR2-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 .
  • the CXCR4 protein may be any known sequence.
  • the CXCR4 may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21.
  • the CXCR4-encoding gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21, and the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 may be the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22 .
  • the CCR2 and CXCR4 proteins may increase the therapeutic efficacy of the mesenchymal stem cells of the present invention by increasing the mobility of the cancer cells.
  • the same cell line having such characteristics can be produced in large quantities, and thus it can be developed as a commercial therapeutic agent.
  • TRAIL and CD expressing mesenchymal stem cells of the present invention can be cell lines expressing CD, TRAIL, CCR2, CXCR4, CD90, CD44, CD105 and / or CD73 proteins.
  • such cell lines can be cell lines expressing over 80% TRAIL protein and over 90% expressing CCR2 and CXCR4 when measured by FACS analysis.
  • the cell line may be a cell line expressing CD90, CD44, CD105 and / or CD73 protein.
  • the cell line may be a cell line expressing the CD90, CD44 and CD105 proteins.
  • the cell line may be a cell line expressing the CD90, CD105 and CD73 proteins.
  • the cell line may also be a cell line expressing the CD44, CD105 and CD73 proteins.
  • the cell line may also be a cell line expressing the CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins.
  • such cell lines may be cell lines expressing more than 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 9 or more of CD9 CD44, CD105 and / or CD73 protein when measured by FACS analysis.
  • the TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells of the present invention are CD34, CDllb, 0.0 > CD19, < / RTI > CD45 and HLA-DR proteins.
  • the TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells were found to contain 10%, 5%, 3%, 2%, or 1% of CD34, CDllb, CD19, CD45 and HLA-DR proteins when measured by FACS analysis Lt; / RTI > or less.
  • the mesenchymal stem cells of the present invention express CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins as cell surface markers while expressing TRAIL, CD (cytosine deaminase), CCR2 and CXCR4 protein (95/3 or more as measured by FACS analysis ), CD34, CDllb, CD19, CD45, and HLA-DR proteins (less than 1% as measured by FACS assays).
  • CD90, CD44, CD105 and CD73 proteins as cell surface markers while expressing TRAIL, CD (cytosine deaminase), CCR2 and CXCR4 protein (95/3 or more as measured by FACS analysis ), CD34, CDllb, CD19, CD45, and HLA-DR proteins (less than 1% as measured by FACS assays).
  • the recombinant lentiviral vector of the present invention may contain one or two promoters.
  • the promoter may be a cytomegalovirus (CMV), respiratory syncytial virus (RSV), human elongation factor-1 alpha (EF-1 alpha), or tetracycline response elements (TRE) promoter .
  • CMV cytomegalovirus
  • RSV respiratory syncytial virus
  • EF-1 alpha human elongation factor-1 alpha
  • TRE tetracycline response elements
  • the recombinant lentiviral vector can regulate the expression of TRAIL protein and CD protein by one promoter.
  • the promoter may be operably linked to a gene encoding a protein to be expressed.
  • the TRAIL and CD may be linked to a TRE promoter.
  • the TRE promoter may activate the transcription of the promoter-associated gene by the tTACtetracyclin in transactor protein. Specifically, the tTA protein binds to the TRE promoter and activates transcription when tetracyclin or doxycyclin is absent. If they are present, they can not bind to the TRE promoter and activate the transcription. Thus, the expression of TRAIL protein and CD protein can be regulated by the addition of tetracycline or doxycycline.
  • operably linked means that a particular polynucleotide is linked to another polynucleotide so that it can perform its function. That is, the fact that a gene encoding a specific protein is operatively linked to a promoter implies that it is transcribed into mRNA by the action of the promoter and ligated so as to be translated into the protein.
  • the gene when linked to be transcribed, it may include an internal ribosome entry site (IRES) so that each protein can be expressed from the single transcript.
  • IRS internal ribosome entry site
  • IRES internal ribosome entry site
  • cancer used in the present invention means a common cancer including both blood cancer and solid cancer.
  • the cancer may be selected from the group consisting of gastric cancer, colon cancer, breast cancer, lung cancer, non-small cell lung cancer, bone cancer, pancreatic cancer, skin cancer, head or neck cancer, melanoma, uterine cancer, ovarian cancer, endometrial cancer, Hodgkin's disease, Cancer of the brain, brain tumor, sarcoma cancer, esophageal cancer, small intestine cancer, thyroid cancer, prostate cancer leukemia, lymphoma, bladder cancer, central nervous system tumor and spinal cord tumor.
  • the pharmaceutical composition may further include a pharmaceutically acceptable carrier as a kind of cell therapy agent.
  • a pharmaceutically acceptable carrier include those conventionally used in the manufacture of medicines such as lactose, dextrose, sucrose, sorbic, mannitol, starch, acacia rubber, calcium phosphate alginate, gelatin, maltodextrin, microcrystalline cells, Water, syrup, methylcellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil, and the like.
  • compositions of the present invention may further comprise pharmaceutically acceptable additives selected from the group consisting of lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifying agents, suspending agents, preservatives and combinations thereof.
  • the carrier may comprise from about 1% to about 99.99% by weight, preferably from about 90% to about 99.99% by weight, based on the total weight of the pharmaceutical composition of the invention, and the pharmaceutically acceptable excipient is about 0.1% By weight to about 20% by weight.
  • the pharmaceutical composition may be prepared by a conventional method, using a pharmaceutically acceptable carrier and May be prepared in unit dosage form by formulation with excipients, or may be prepared by penetration into a multi-dose container.
  • the formulations may be in the form of solutions, suspensions, syrups or emulsions in oils or aqueous media, or in the form of excipients, powders, granules or capsules, and may additionally contain dispersing or stabilizing agents.
  • Another aspect of the present invention provides the use of a pharmaceutical composition of the present invention for preventing or treating cancer.
  • Another aspect of the invention provides the use of a pharmaceutical composition of the invention for the manufacture of a medicament for the prophylaxis or treatment of cancer.
  • Yet another aspect of the present invention provides a method of preventing or treating cancer as described above, comprising the step of administering the pharmaceutical composition to a subject.
  • the subject may be a mammal, particularly a human being.
  • the route of administration and dosage of the pharmaceutical composition may be administered to a subject in various ways and amounts depending on the condition of the patient and the side effects, and the optimal administration method and dose may be selected by a person skilled in the art within a suitable range.
  • the pharmaceutical composition may be administered in combination with another drug or physiologically active substance whose therapeutic effect is known to the disease to be treated, or may be formulated in combination with other drugs.
  • the pharmaceutical composition When the pharmaceutical composition is administered parenterally, examples thereof include subcutaneous, intraocular, intraperitoneal, oral, rectal, orbital, intracerebral, intracranial, spinal, intracerebral, There is intravenous, intravenous.
  • the pharmaceutical composition comprising the TRAIL and CD-expressing mesenchymal stem cells was administered intravenously or intracranially.
  • the above administration may be administered one or more times, one to three times, specifically two doses.
  • they can be administered at intervals of 12 to 48 hours and 24 to 36 hours, and specifically, at intervals of 24 hours. In one embodiment of the invention, it was repeatedly administered at intervals of 24 hours for 7 days.
  • the administration in the case of adult cells per il l .OxlO l.OxlO 5 to 11 cells can be administered in an amount of specifically l.OxlO l.OxlO 7 to 9 cells.
  • the dose is high, it can be administered several times a day.
  • Example 1 Preparation of lentiviral vector containing the immortalized gene
  • lentiviral vectors each containing the non-calcified genes c-Myc and hTERT were prepared. At this time, a gene construct expressing the tTA protein was inserted together to use the Tet-of-f system.
  • a pBD lentivirus vector was constructed by replacing the EF promoter sequence with the expression cassette of the pWPT vector (Addgene, USA) by a CMV promoter and then adding an RSV promoter to the plasmid.
  • the c-Myc gene (SEQ ID NO: 8) and the thymidine kinase (TK) gene (SEQ ID NO: 6) were inserted into the pBD lentivirus vector so that the expression could be regulated by the CMV promoter.
  • the prepared vector was designated pBD-1.
  • the hTERT gene (SEQ ID NO: 10) was inserted into the pBD lentivirus vector so that the expression could be regulated by the CMV promoter.
  • the gene having resistance to zeocin (ZeoR; SEQ ID NO: 16) was inserted so that expression could be regulated by the RSV promoter.
  • the prepared vector was designated pBD-2.
  • tTA tetracycline inactivation gene
  • SEQ ID NO: 12 tetracycline inactivation gene
  • PuroR puromycin
  • the cells were allowed to stand at 37 0 C for about 5 minutes and then the cells were desorbed.
  • the desorbed cells were neutralized by the addition of DMEM medium containing 7m 10% (v / v) FBS.
  • the neutralized cells were collected in 50 ml tubes and centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and the cells were resuspended in DMEM supplemented with 10% 10% (v / v) FBS.
  • the resuspended cells were counted in a hematocytometer, and the cells were divided into 1.2 ⁇ 10 7 cells in a 150-gauge dish.
  • lentiviruses produced from pBD-1, pBD-2 and pBD-3 lentiviral vectors were prepared at concentrations of 4.0xl0 8 TU / m ⁇ , 2.0xl0 8 TU / and 1.2xl0 9 TU / i, respectively.
  • Immortalized MSCs were prepared using lentiviruses containing the immortalized genes produced in Example 1.2. Above.
  • bone marrow-derived MSCs were prepared by the following method. Specifically, a bone marrow aspirate was obtained from a iliac crest of a healthy donor. This was coincident with 20 IU / of heparin in a sterile container to inhibit coagulation. The bone marrow mixed solution was centrifuged for 7 minutes at a temperature of 40 ° C and 739 RCF, and then the supernatant was removed and fused with a 10-fold volume of sterilized water. This was centrifuged again under the same conditions to obtain cell pellets.
  • the resulting pellet was suspended in DMEM-low glucose (11885-084, Gibco, USA) medium containing 20% (v / v) FBS and 5 ng / And dispensed into culture flasks. It was incubated at 37 ° C and 53 ⁇ 4 C0 2 for 24 to 48 hours and then replaced with fresh medium. Subsequently, the cells were subcultured by replacing them with new medium at intervals of 3 days to 4 days. After 2 weeks of culture, the cells were analyzed by using a fluorescence cell analyzer (FACS).
  • FACS fluorescence cell analyzer
  • the selected cells were infected with 100 M (l) of PBD-3 lentivirus vector. After infection, 1 g / m < 2 > of puromycin was added to the culture of stabilized cells to select cells infected with pBD-3 lentivirus.
  • FIG. 1 shows the cell proliferation rate according to the presence or absence of MSC.
  • the MSC cells infected with lentiviruses containing the immortalized genes c-Myc and hTERT retained high cell proliferation rates even after 120 days of culture.
  • the cell proliferation rate of normal MSC cells decreased rapidly after 40 days of culture.
  • Example 2 Preparation of lentivirus containing TRAIL and CD gene
  • Example 2.1. TRAIL and CD gene The TRAIL gene (SEQ ID NO: 2) and the CD gene (SEQ ID NO: 4) were inserted into the pBD lentivirus vector prepared above.
  • the inserted TRAIL and CD genes were linked to the IRES (internal ribosome entry site) and their expression was regulated by the TRE promoter.
  • IRES is a ribosome binding site that allows translation to begin without the 5'-cam structure, allowing two proteins to be expressed in one mRNA.
  • the TRE promoter can regulate the expression of the gene linked to the promoter according to the presence or absence of doxycyclin (631311, Clontech, USA).
  • the prepared vector was named pBD-4, and the structure of the gene construct is shown in FIG.
  • Example 2.2 Production of lentiviruses containing TRAIL and CD genes Lentiviruses were produced in the same manner as described in Example 1.2. Above using lentiviral vectors containing the TRAIL and CD genes prepared in Example 2.1. Above. The lentivirus produced was prepared at a concentration of 7.6 ⁇ 10 8 TU / liter.
  • Example 1.3 The immortalized MSC prepared in Example 1.3. Above was infected with lentivirus containing the TRAIL and CD gene produced in Example 2.2, and MSCXBM-03 expressing TRAIL and CD among the infected MSCs Respectively. Infection was carried out in the same manner as described in Example 1.3.
  • Example 3.1 MSC transfection with lentiviruses including TRAIL and CD genes
  • the immortalized MSCs were infected with lentivirus containing TRAIL and CD genes, and then 1 / day of doxycycline was added to the culture medium of the stabilized cells to inhibit the expression of TRAIL and CD. After the cells were stabilized, they were cultured for 72 hours in a culture medium in which isoleucine was removed to induce the expression of TRAIL and CD. FACS was performed on the cells to select TRAIL-expressing cells on the cell surface. Specifically, MSCs infected with lentivirus containing TRAIL and CD genes were divided into 5 ⁇ 10 5 cells per FACS tube.
  • the FACS flow was then centrifuged at 4O < 0 > C and 1,500 rpm for 5 minutes to remove the supernatant.
  • the cells were resuspended by adding 1 1 of FACS complete solution (PBS containing 2% fetal bovine serum) and centrifuged under the same conditions to remove supernatant. The above washing procedure was performed once more and the cells were resuspended in 1 FACS buffer.
  • FACSCLSRFortessa BD biosciences, USA
  • cells expressing TRAIL were selected.
  • the selected cells were cultured to form colonies.
  • Cells of a single clone were cultured from the formed colonies to establish a cell line and designated BM-03.
  • the cell line BM-03 was deposited with KCTC 13182BP on Jan. 6, 2017 to the BRC of the Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology.
  • MSC assay kit (Stemf lowTM, Cat No 562245, BD). Experiments were performed according to the manual included in each kit, and the experimental results are shown in FIG.
  • the BM-03 cell line of the present invention expresses CD90, CD44, CD105, and CD73 surface antigen protein in 95% or more and expresses CD34, CD1B, CD19, CD45 And HLA-DR were found to be less than 1 ⁇ ⁇ .
  • the expression ratio of surface markers was found to be in a wide range (6CK90D) according to cel l populations. Through the expression of these surface antigen proteins, heterogeneous bone- -MSC, the cell line of the present invention shows homogenous characteristics.
  • BM-03 cell line was seeded in a 12-well plate at a concentration of lxlO < 4 > cells / cm < 2 > to confirm the ability to differentiate into adipocytes.
  • the temperature was 37 ° C,
  • the suspension was suspended at a concentration of 1.6 ⁇ 10 7 cels / s, 5 of which was seeded in 24 wells and cultured for 2 hours.
  • the cartilage-forming differentiation medium (StemPro® cartilage formation kits, ThermoFisher Scientif ic, A10071-01) was added to the medium, and the medium was replaced at 3-day intervals and cultured for 14 days. After the culture, the medium was removed and the pellet was taken out from the dish by DPBS. After cryosecting, Alcian blue staining was performed and confirmed with a microscope.
  • the results of Experimental Examples 2.1 to 2.3 are shown in FIG.
  • the BM-03 cell line had a transdifferent ability to differentiate.
  • the established cell line BM-03 was thawed for about 1 minute in a constant temperature water bath at 37 0 C, transferred to 15 tubes containing 9 ml PBS, and then allowed to ceel down for 5 minutes at 1,500 rpm. After the PBS was completely removed, the pellet was suspended in 200 ml PBS in a 1.5 ml tube and transferred.
  • GDNA was prepared using NucleSoPin® Ti ssue (Liao, 740952.250), and PCR products were prepared as shown in Table 1 below. At this time, 100 ng of BM-03 plasmid DNA was used as a positive control and 1 ⁇ of purified water (dw) as a negative control.
  • the DNA Si ze Marker was loaded and loaded from the next well into the negative control, the positive control, and the 3 BM-03 specimens in the order of 10 ⁇ l each. Thereafter, electrophoresis was carried out at 100 V for 20 minutes, and a gel photograph was taken. The results are shown in FIG. 5A.
  • PCR-products of the same size (1.2 kb) as the positive control were observed in all of the BM-03 cell line samples.
  • qRT-PCR quantitative reverse transcriptase chain reaction
  • the BM-03 cell line was subcultured to a 5x10 5 cell number in a T75 flask using a DMEM medium containing 10% (v / v) FBS and a medium containing and without dorsifacillin 2 / ⁇ ⁇ .
  • Cells were obtained after 3 days of culture. Cells were counted and 5x10 5 cells were stained with PE ant i-human CD253 (TRAIL) antibody (BioLegend, 308206), PE Mouse IgGl and ⁇ Isotype Control Antibody (BioLegend, 400112).
  • TRAIL PE ant i-human CD253
  • TRAIL protein and CD protein were expressed in the prepared mesenchymal stem cells and confirmed to be regulated by the Tet-of-f system.
  • FACS was used to analyze the proportion of BM-03 cell lines expressing TRAIL, CCR2 and CXCR4. Specifically, in FACS Buf fer (PBS containing 2% fetal bovine serum) containing the antibody described in Table 3 below, the cells were incubated at 4 0 C
  • FACS analysis was performed using an LSR Fortessa TM cell analyzer (BD Biosciences) and analyzed with f lowJo_V10 or BD FACS Diva software.
  • PCR method TRAIL_CD : UPRT 1, 194 bp band confirmed
  • Human glioma cell line U-87MG cells were obtained from the American Type Culture Collection and cultured in DMEM medium supplemented with 10% (v / v) FBS at 37 0 C and C0 2 5% Respectively.
  • the U-87MG cells were transfected with lentivirus containing a gene encoding firefly luciferase (Luc) to produce U-87MG-Luc cells that stably express Luc. After that,
  • U-87MG-Luc cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% (v / v) FBS at 37 0 C, CO 2 5% Lt; / RTI >
  • mice were anesthetized intraperitoneally with ketamine / xylazine to intracranial xenografts of the U-87MG-Luc cells in 6-week-old male nude mice (Athymic Nude mice).
  • the ⁇ ⁇ ⁇ 5 was resuspended cells may U-87MG-Luc cells in 3 ⁇ PBS, using a micro-injection pump (microinfusion pump) captured transferred to a Hamilton syringe (Hami l ton Company, Reno, NV).
  • mice were then stereotactically injected into the right frontal lobe or both hemispheres located 2 mm bregma and 1 mm anteriorly at a depth of 2.5 mm from the skull base of the anesthetized mouse ly).
  • BM-03 cells were resuspended in 8 ⁇ l PBS, and the tumors in mice injected with 500 mg / kg of 5-FC for 7 days and mice not injected Respectively.
  • BM-03 cells were injected on days 7, 21, and 35 after U-87MG-Luc cells were injected into the mice.
  • mesenchymal stem cells of 2x10 4 , lxlO 5, or 5x10 5 cells were resuspended in 8 fd PBS, and then 5-FC of 500 mg / kg was present in mice injected for 7 days and mice not injected Lt; / RTI > U-87MG-Luc cells were injected into mice and the amount of in vivo luminescence was measured at a weekly interval from 6 days after the injection by a known method (Kim SM et al., International Journal of Nanomedicine 11: 13-23, 2016). Survival lasted up to 90 days.
  • mice injected with BM-03 cells and 5-FC showed luminescence lower than those of mice administered with control and BM-03 cells alone. Also, as shown in Fig. 13, BM-03 cells and 5-FC Survival of mice also increased.
  • Figs. The results of multi-dose administration experiments are shown in Figs. Specifically, as shown in FIG. 14 and FIG. 15, tumors of BM-03 cells and 5-FC treated mice showed a decrease in luminescence signal than that of control tumors. In particular, luminescence signals of BM-03 cells and 5-FC injected mice with lxlO 5 cells / 8 ⁇ or 5 ⁇ 10 5 cells / 8 ⁇ l concentration were greatly reduced. In addition, as shown in Fig. 16, the survival time of BM-03 cells and 5-FC injected mice with lxlO 5 cells / 8 ⁇ or 5 ⁇ 10 5 cells / 8 ⁇ concentration also increased in a concentration-dependent manner.
  • the cells were cultured under different conditions in a transwell chamber with a 24-well 8 iffli pore filter and shown in Fig.
  • the cultured BM-03 cells were separated by treatment with trypsin and then washed.
  • the cells were then resuspended in serum-free Dulbecco's modified Eagle's medium.
  • the upper chamber was filled with MSC at a concentration of 3 x 10 4 cells / 100 id, DMEM containing 10% FBS, DMEM supplemented with 300 ng / SDF-la, DMEM supplemented with 300 ng /
  • the conditioned media of the U87 MG culture medium was placed in the lower chamber, respectively.
  • the cells were cultured in a cell culture incubator of 37 ° C and silver is> C0 2 conditions for 48 hours.
  • the transwell chamber was then removed, washed and stained with diff-quick Kit (Sysmex). Thereafter, the number of BM-03 cells infiltrating the septum was counted by an optical microscope. In this way, the average cell number per field was calculated to evaluate the ability of BM-03 cells to migrate.
  • BM-03 cells passed through the septum in the transwell chamber into which the culture medium containing the tumor cells was added. It was confirmed that the BM-03 cell line was able to move to the tumor.
  • the BM-03 cell line was labeled with the fluorescent material DiDCABD Bioquest, Inc.) to evaluate its mobility to the brain tumor.
  • DiDCABD Bioquest, Inc. the fluorescent material DiDCABD Bioquest, Inc.
  • the tumor growth site of the glioma-producing mice prepared in Example 4.1 After BM-03 cells transplanted with DiD-labeled cells in the opposite brain, migration of BM-03 cells was observed using IVIS Spectrum In Vivo Imaging System (Perki nE 1 mer) 3 ⁇ 4-.
  • BM-03 cells were transplanted into the brain, whereas BM-03 cells transplanted to the opposite side of the tumor were moved to the opposite side of the brain.
  • human glioma cell line U87MG, U373MG or mouse glioma cell line GL26 was cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco) (Hyc lone). Specifically, on the first day of culture, glioma cells of lxlO 5 cell number were plated on a 6-well plate. The second day of culture, immortalized neural the middle of gliomas can 2xl0 5 cells to a cell Stem Cells (imMSC) or BM-03 cells 5xl0 5 cells were added. On the fourth day of culture, 5-FC of 10 wgM concentration was treated in each well. On the 6th day of culture, stem cells and glioma cells were harvested and glioma cells were analyzed by FACS.
  • DMEM fetal bovine serum
  • glioma cells As a result, as shown in Fig. 20, about 40% of the glioma cells were killed in the BM-03 cell line-treated group. In particular, over 70% of glioma cells were killed when treated with BM-03 and 5-FC. On the other hand, less than 10% of glioma cells were killed in the group treated with immortalized mesenchymal stem cells. In addition, when treated with immortalized mesenchymal stem cells and 5-FC, less than 10% of glioma cells were killed.
  • the survival rate of the experimental group treated with single dose of 8x10 5 cells / 5 id cryostor BM-03 cells was increased by 25%.
  • the BM-03 cell line was administered four times at 2-week intervals under the same conditions as the single dose, and 5-FC administration was also carried out in the same cycle to evaluate the animal test efficacy by multiple administration.
  • the survival rate of the experimental group receiving 8 ⁇ 10 5 cells / 5 ⁇ cryostor BM-03 cells increased by 25%.

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Abstract

본 발명은 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함 하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 TRAIL 및 CD 를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암세포의 형성 및 전이를 억제한다. 또한, 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽줄기세포로서 높은 세포 증식율을 가지면서， 독시사이클린 처리 유무에 따라 세포 내에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백 질의 발현을 조절할 수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인 발현으로 인한 비정 상적인 분화 가능성이 낮고, 5-FC 처리에 의해 세포사멸이 유도됨으로써 잔존 줄 기세포를 제거할 수 있어 안정성이 높다. 뿐만 아니라， TRAIL 및 CD를 동시에 발 현하는 세포주의 항암 효과가 우월함을 확인한 바, 본 발명의 약학 조성물은 암 의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

명세서
TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 기술분야
본 발명은 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함 하는 암의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 배경기술
TRAILCTumor Necrosi s Factor-Related A卿 tos i sᅳ Inducing Ligand)은 TNF—연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질로서， 인체 내 세포들의 세포사멸을 선택 적으로 유도한다. TRAIL은 세포의 표면에 존재하는 세포사멸 수용체 -4(DR-4) , DR-5, 데코이 (decoy) 수용체 또는 데코이 수용체—2와 결합하여 세포사멸 신호 전 달계를 활성화시킴으로써 세포를 선택적으로 사멸시킨다. 하지만 인간의 모든 신체 조직에서 TRAIL이 발현되는 것은 아니다. 인간의 뇌조직에서는 TRAIL이 발 현되지 않고， 대신 신경교세포 (Neurogl ia)가 신경염증성 질환 및 세포사멸에 관 여한다 (Dorr J . et al. , J Neurosci. , 22(4) :RC209 , 2002) .
한편， 신경교세포가 암세포화되면 신경교종이 발생하는데, 신경교종은 정 상적인 뇌 조직을 파괴하고 뇌 속을 돌아다녀 치료가 까다로운 질병으로 알려져 있다. 이러한 신경교종을 치료하기 위한 치료제 개발에 있어서， TRAIL을 암세포 에 인위적으로 발현시키는 방법을 통해 치료하고자 하는 시도가 이루어지고 있으 나， TRAIL을 암세포에서 효과적으로 발현시키기 어렵다는 문제가 ᅳ있다.
한편， CEKcytosine deaminase)는 인체에 무해한 전구약물인 5-FC(5- f hiorocytosine)를 세포 독성을 지닌 항암물질인 5-FU(5-f luorouraci l )로 전환시 켜 세포사멸을 유도한다. 이때， 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세 포를 죽이는 주변인 효과 (by-stander ef fect )를 나타낸다. 이러한 CD 및 5-FC를 이용한 항암치료는 신경교종을 치료하는데 유용할 수 있다. 그러나, 줄기세포의 증식에 한계가 있어 시간이 지남에 따라 CD의 발현량이 감소하게 되어 5-FU의 항 암효과가 즐어들게 되는 문제점이 있다. 한편， 전 세계적으로 세포를 이용한 치료방법이 개발되고 있으며， 성체줄 기세포를 이용한 세포치료제에 대해 많은 연구가 진행 중이다. 성체줄기세포인 중간엽즐기세포 (MSC)는 뼈， 연골, 근육， 지방， 섬유아세포 둥으로 분화할 수 있 는 다능성 (mult ipotent ) 세포이다. 상기 MSC는 골수， 제대혈， 지방 등 다양한 성 체조직에서 비교적 쉽게 얻을 수 있다. MSC는 염증， 암조직 또는 손상부위로 이 동하는 특이성이 있어， 치료 약물을 전달하기 위한 전달체로서도 큰 장점이 있 다. 또한， T 세포， B 세포, 수지상 세포 및 자연살해 세포와 같은 면역 세포의 기능을 억제하거나 활성화시켜, 인체의 면역기능을 조절할 수 있다. 그뿐 아니 라， MSC는 시험관 내 ( in vi tro)에서 비교적 쉽게 배양할 수 있다는 장점이 있다. 이러한 특성으로 인해 MSC를 세포치료제로 이용하기 위한 연구가 활발히 진행되 고 있다.
그러나， 이와 같은 MSC의 장점에도 불구하고， 세포 치료제로서 임상에 사 용할 수 있는 둥급의 MSC를 생산하는데 다음과 같은 문제가 있다. 첫째 MSC의 증식에는 한계가 있어， 이를 대량으로 생산하기 어렵다. 둘째, 수득한 MSC는 다 양한 종류의 세포가 흔합되어 있어, 생산시 동일한 효과를 유지하기 어렵다. 셋 째， MSC만을 이용할 경우 치료 효과가높지 않다.
한편， 대한민국 등톡특허 제 1585032호에서는 하이드로겔에서 배양한 중간 엽줄기세포를 함유하는 세포 치료제를 개시하고 있다. 상기 문헌에는 세포 치료 제로 사용하기 위한 중간엽줄기세포를 분리하는 공정에서 전처리 과정을 단축하 여 바로 투여 가능한 조성물을 제공하고 있으나 상기와 같은 중간엽줄기세포의 문제점 및 이를 해소하기 위한 방안에 대해서는 전혀 언급하고 있지 않다. 따라 서， 세포 치료제로 사용할 수 있는 안전하고 효과적인 중간엽줄기세포에 대한 연 구가 필요한 실정이다.
특히， CD를 발현하도록 레트로바이러스를 이용하여 신경줄기세포를 형질 전환시킨 연구가 수행된 바 있다 (Jana Portnow et al. , Clinical Cancer Research 23(12) : 2951-2960 , 2017) . 하지만， 상기 연구에서 사용된 줄기세포는 조직에서 수득한 일반적인 신경줄기세포로서 증식에 한계가 있어 대량 생산하기 어려운 문제점이 있다. 그뿐 아니라, 신경줄기세포의 증식에 한계로 인해 CD 발 현량이 감소하여 완치할 정도의 항암효과를 기대하기 어렵다. 기술적 과제
이에 본 발명자들은 효과적인 암 치료제를 개발하기 위해 연구한 결과,
TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 중간엽줄기세포가 암의 형성 및 전이를 억제하여 항암효과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 과제 해결 수단
상기 목적을 달성하기 위하여 ,
본 발명의 일 측면은， TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질 (TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 동시에 발현하도록 형질전환된 중간엽줄기세 포를 유효성분으로 포함하는 암 예방또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은， 암을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은， 본 발명의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단 계를 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 발명의 효과
본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함 하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도함으로써 암 세포의 형성 및 전이를 억제한다. 또한， 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 중간엽 줄기세포로서 높은 세포 증식율을 가지면서， 독시사이클린 처리 유무에 따라 세 포 내에서 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있기 때문에 도입 유전자의 지속적인 발현으로 인한 비정상적인 분화 가능성이 낮고， 5-FC 처리에 의해 세포 사멸이 유도됨으로써 잔존 줄기세포를 제거할 수 있어 안전성이 높다. 뿐만 아니 라， TRAIL 및 CD를 동시에 발현하는 세포주의 항암 효과가 매우 우월함을 확인한 바, 본 발명의 약학조성물은 암의 예방또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 도면의 간단한 설명
도 1은 중간엽줄기세포 (MSC)의 불사화 유무에 따른 세포 증식율을 비교한 그래프이다:
imMSC: 불사화된 MSC;
MSC: 불사화되지 않은 MSC;
X축: 배양기간; 및
γ축: 누적된 PDL .
도 2는 pBD-4 렌티바이러스 백터에 삽입한 유전자 컨스트럭트의 구성을 도식화한 것이다:
TRE: 테트라사이클린 반응 요소 (tetracycl ine response elements)를 포함 하는 프로모터；
TRAIL : TNF-연관 세포사멸 -유도뫼간드;
IRES : 내부 리보좀 진입 부위; 및
CD: CD 단백질.
도 3은 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 발현하는 MSCXBM-03)에서 CD90 , CD44, CD105 , CD73 표면항원 단백질의 발현을 확인한 도면이다.
도 4는 BM-03 세포주가 지방생성， 골형성, 또는 연골형성 세포로 분화한 것을 통해 형질감염 이후에도 다중 분화능이 유지되는 것을 확인한 도면이다. 도 5a는 기탁 세포주인 BM-03 세포주에서 TRAIL 및 CD의 발현량을 확인한 도면이다. 1번 레인은 마커， 2번 레인은 음성대조군 3번 레인은 양성대조군 4 번 내지 6번 레인은 BM-03 세포주를 나타낸다.
도 5b는 기탁 세포주인 BM-03 세포주에서 TRAIL 및 CD의 발현을 정량 역 전사 중합 효소 연쇄 반웅 (qRT-PCR)을 통해 정량한도면이다.
도 6은 독시사이클린 (Dox) 처리 유무에 따른 BM-03 세포주의 TRAIL 단백 질 발현 여부를 확인한 그래프이다.
도 7은 BM— 03 세포주에 5— FC를 처리 유무에 따른 BM— 03 세포주의 세포 사 멸효과를 FACS를 통해 확인한 그래프이다.
도 8은 BM-03 세포주의 TRAIL, CCR2 및 CXCR4의 발현 유무를 확인한 도면 이다.
도 9는 계대 배양하여 수득한 BM-03 세포주의 PDL 값을 측정하여 그래프 로 나타낸 것이다.
도 10은 BM-03 세포주의 핵형을 분석한 결과를 나타낸 것이다. 도 11은 BM-03 세포주 주입에 따른 종양 형성 억제효과를 인간 신경교종 유발 마우스를 이용해 확인한사진이다.
도 12는 도 11의 사진을 토대로 종양의 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 13은 BM-03 세포주 주입 및 5-FC 투여에 따른 인간 신경교종 유발 마 우스의 생존일 증가를 확인한 도면이다.
도 14는 농도별 BM-03 세포주 주입에 따른 종양 형성 억제 효과를 인간 신경교종 유발마우스를 이용해 확인한사진이다.
도 15는 도 14의 사진을 토대로 종양의 크기를 측정하여 그래프로 나타낸 도면이다.
도 16은 농도별 BM-03 세포주 주입에 따른 인간 신경교종 유발 마우스의 생존일 증가를 확인한 도면이다.
도 17은 트랜스웰 챔버를 이용한 BM-03 세포주의 종양 이동성을 확인하는 실험방법을 나타낸 도면이다.
도 18은 트랜스웰 챔버를 이용한 BM-03 세포주의 종양 이동성을 in vi tro 상에서 확인한 도면이다.
도 19는 신경교종 유발 마우스를 이용하여 BM-03 세포주의 종양 이동성을 in vivo상에서 확인한 도면이다.
도 20은 3 종류의 신경교종 세포에 불멸화된 중간엽줄기세포 ( imMCS) , BM- 03 세포주 및 /또는 5-FC 처리한후, 암세포의 사멸 정도를 확인한 도면이다. 도 21은 3 종류의 신경교종 세포에 불멸화된 중간엽줄기세포 ( imMCS) 또는 BM-03 세포주 및 /또는 5-FC 처리한 후, 줄기세포의 사멸 정도를 나타낸 도면이 다.
도 22는 신경교종 유발 마우스에 BM— 03 세포주를 단회투여한 후 신경교종 유발 마우스의 생존율을 나타낸 도면이다.
도 23은 신경교종 유발 마우스에 BM— 03 세포주를 다회 투여한 후 신경교 종 유발 마우스의 생존율을 나타낸 도면이다. 발명의 실시를 위한 최선의 형태
이하， 본 발명을 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 측면은， TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질 (TRAIL) 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 동시에 발현하는 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암 예방또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "TRAIL"이란， TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질로서， TNF 패밀리 중 제 2형 막관통단백질을 의미한다. 상기 TRAIL은 자살 유전자 중 하나로써， 형질전환 세포들의 세포사멸을 선택적으로 유도한다. 구체적으로， 상기 TRAIL은 세 개의 수용체에 결합할 수 있는 호모트리머 (homotrimer) 형태로 존재한다. 상기 TRAIL은 세포 표면에 존재하는 세포사멸 수용체 -4(DR-4) , DR-5, 데코이 (decoy) 수용체 또는 데코이 수용체 -2와 결합하여 세포사멸 신호 전달계를 활성화시킨다. 또한， TRAIL은 정상 세포에 대해서는 독성이 없고， 암세포에서만 특이적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다.
상기 TRAIL은 인간 유래의 단백질일 수 있으며， 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TRAIL은 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%， 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. TRAIL을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으몌 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한， 상기 TRAIL을 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 상기 TRAIL을 코딩하는 유전자는 TRAIL의 활성을 유지하는 TRAIL의 변이체를 코딩하는 염기서열일 수 있다. 상기 TRAIL의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열과 약 70%， 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한， 상기 TRAIL의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기서열과 약 70%, 80%, 90%또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "CD"란， 시토신 디아미네이즈 (cytosine deaminase) 단백질을 의미한다. 또한， 상기 CD는 CD와 UPRT(uraci l phosphor ibosyl transferase)가 결합된 융합단백질의 형태일 수 있으며， 본 명세서에서 CD는 CD: :UPRT와흔용될 수 있다.
또한， 상기 CD는 인체에 무해한 전구약물안 5-FC(5-f luorocytosine)를 세포 독성을 지닌 항암물질인 5-FU(5-f luorouraci l )로 전환시켜 세포사멸을 유도한다. 이때， 5-FU는 세포 밖으로 분비되어 주변에 인접한 세포를 죽이는 주변인 효과 (by-stander effect )를 나타낸다. 따라서， CD를 발현하는 세포에 5- FC를 처리하면 CD를 발현하는 세포 근처에서 5— FU로 인한 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
또한， 상기 CD를 코딩하는 유전자는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 CDase를 코딩하는 FCY1 유전자와， N- 말단으로부터 35개의 아미노산이 결실된 UPRTase를 코딩하는 FURlAl05 유전자를 융합하여 코돈 최적화 (codon— opt imizat ion)된 서열일 수 있다. 상기 서열은 미국 특허 게 5 ,338,678호， 국제특허공개 제 W0 96/16183호 및 국제특허공개 제 W0 99/54481호에 기재된 것일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 상기 CD는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 상기 CD는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, "80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다. CD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있다. 구체적으로， 상기 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 4로 표시되는 염기서열일 수 있다. 또한， 상기 CD을 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 약 70%ᅳ 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 상기 CD를 코딩하는 유전자는 CD의 활성을 유지하는 CD의 변이체를 코딩하는 염기서열 일 수 있다. 상기 CD의 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95¾> 이상의 상동성을 가질 수 있다. 또한， 상기 CD의 변이체를 코딩하는 염기서열은 서열번호 4의 염기서열과 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
상기 세포는 인간배아줄기세포 (human embryonic stem cel l , hES) , 골수줄기세포 (bone marrow stem cel l , BMSC) , 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cel l , MSC) , 인간신경줄기세포 (human neural stem cel l , hNSC) , 윤부줄기세포 ( l imbal stem cel l ) 또는 경구점막상피세포 (oral mucosal epithel ial cel l )일 수 있다. 구체적으로， 상기 세포는 중간엽줄기세포일 수 있다.
또한， 상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것일 수 있다. 구체적으로， 상기 중간엽줄기세포는 hTERT 및 c-Myc 유잔자가 도입된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "형질전환"이란 유전자 전달체와 도입방법에 상관없이 외래 유전자를 세포에 도입하여， 도입된 외래 유전자에 의해 세포의 형질이 바뀌는 것을 의미한다.
상기 형질전환은 TRAIL 및 CD와 TRAIL 및 CD의 활성을 유지하는 변이체를 코딩하는 유전자를 당업계에 공지된 방법을 통해 줄기세포에 도입하여 수행될 수 있다. 예를 들면， 형질감염 (transfection), 미세주사， 형질도입 (transduction)， 세포융합， 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염 (liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염 (DEAE Dextran- mediated transfection) , 폴리브렌一매개된 형질감염 (polybrene一 mediated transfection) , 전기천공법 (electroporation), 유전자 총 (gene gun) 또는 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다 (Wu et al., J. Bio. Chem. , 267:963-967， 1992； Wu and Wu, J. Bio. Chem. , 263:14621-14624 1988). 하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 용어 "형질감염 (transfection)"은， 바이러스 감염 (infection)을 통하여 재조합 렌티바이러스 백터에 적재된 유전자를 전달하는 것을 의미한다. 구체적으로， 상기 형질전환된 세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것일 수 있다.
상기 렌티바이러스는 장기간의 잠복기를 특징으로 하는 레트로 바이러스과의 바이러스를 의미한다. 렌티바이러스는 숙주세포의 DNA 내에 유전정보를 전달할 수 있다. 비분열 세포에서 복제할 수 있는 유전자 전달 백터의 가장 효과적인 방법 중 하나이다.
상기 형질전환된 세포는 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다:
1) 중간엽줄기세포에 hTERT 및 c-Myc 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 1차 감염시키는 단계;
2) 1차 감염된 중간엽줄기세포에 tTA 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 2차 감염시키는 단계;
3) 2차 감염된 중간엽줄기세포에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 3차 감염시키는 단계 .
상기 단계 1)에서 hTERT 및 c-Myc는 중간엽줄기세포를 불사화시키는 유전자로서， 상기 hTERT 및 C-Myc 이외에도 불사화 유전자로 알려진 다른 유전자도 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면， 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질은 각각 서열번호 9 및 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 한편， 상기 hTERT 및 c-Myc 단백질을 코딩하는 유전자는 각각 서열번호 10 및 서열번호 8의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
상기 단계 2)에서 tTA는 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있는 유전자로， 테트라사이클린 트랜스액티베이터를 의미한다. 본 발명에서 사용된 Tet-off 시스템은， 상기 서술한 바와 같은 방법으로 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 존재 유무에 따라 표적 단백질의 발현을 조절할 수 있다.
상기 단계 2)의 3차 감염은 하나의 백터에 TRAIL 및 CD 유전자를 모두 포함하는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터를 사 ·§：하여 수행될 수 있다. 그러나, 본 발명의 다른 측면에서, 상기 TRAIL 및 CD 유전자는 각각의 유전자 컨스트럭트로 제조되어 2개의 렌티바이러스 백터에 각각 삽입될 수 있다. 즉， TRAIL 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도톡 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 백터와 CD 단백질을 코딩하는 유전자가 발현되도록 제조된 유전자 컨스트럭트가 삽입된 재조합 렌티바이러스 백터가 3차 감염에 사용될 수 있다.
상기와 같은 방법으로 제조된 형질전환된 중간엽줄기세포를 BM-03으로 명명하고, 이를 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 수탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
상기 재조합 렌티바이러스는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터， 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 (envelope) 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및 상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "패키징 플라스미드 (packaging plasmid) " 및
"엔벨로프 플라스미드 (envelope plasmid)"이란， 렌티바이러스 백터로부터 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 사용되는 플라스미드 또는 단리된 핵산을 의미한다. 상기 패키징 플라스미드 및 엔벨로프 플라스미드는 본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터로부터 재조합 렌티바이러스를 효율적으로 생산하기 위해 본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터와 함께 사용될 수 있다. 이러한 구조물은 숙주세포에서 렌티바이러스 백터를 제조하고, 이를 패키ᅳ징하는데 유용한 요소들을 함유한다. 상기 요소로는 gag 전구체와 같은 구조 단백질; pol 전구체와 같은 프로세싱 단백질; 프로테아제， 외피 단백질， 및 숙주세포에서 단백질을 제조하고 렌티바이러스 입자를 생산하는데 필요한 발현 및 조절 신호 등을 포함할 수 있다.
재조합 렌티바이러스의 생산에는 Clontech Laboratories사의 Lent i-X Lent i viral Expression System이나， Addgene사에서 제공하는 패키징 플라스미드 (예를 들어， pRSV-Rev, psPAX, pCl-VSVG, pNHP 등) 또는 엔벨로프 플라스미드 (예를 들어， pMD2.G, pLTR-G, pHEF-VSVG 등) 또는 공지의 서열을 이용하여 합성한 플라스미드 백터를 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "렌티바이러스 백터"란， 레트로바이러스의 일종으로, 단일가닥 RNA 형태의 백터를 의미한다. 상기 렌티바이러스 백터는 렌티바이러스 트랜스퍼 백터와 흔용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 백터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시키며， 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 백터는 인체의 면역반웅을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한， 종래에 사용되는 바이러스 백터인 아데노바이러스 백터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.
상기 재조합 렌티바이러스 백터는 TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질 (TRAIL) , 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.
또한， 상기 재조합 렌티바이러스 백터는 티미딘인산화효소 (thymidine kinase, T ) , CCR2 또는 CXCR4 단백질을 코딩하는 유전자를 더 포함할 수 있다. 상기 ΤΚ는 ΑΤΡ의 γ위치의 인산을 티미딘에 결합시켜 티미딜산 생성반웅을 촉매하는 효소로， 이로 인해 티미딘은 삼인산 형태로 변형된다. 변형된 티미딘은
DNA 복제에 사용될 수 없다. 따라서， 이를 포함하는 세포의 사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 상기 ΤΚ 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면， 상기 ΤΚ는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 TK를 코딩하는 유전자는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며， 상기 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 6으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CCR2 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 일 실시예에 의하면， 상기 CCR2는 서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 CCR2를 코딩하는 유전자는 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며， 상기 서열번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 20으로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CXCR4 단백질은 공지된 서열이라면 모두 사용 가능하다. 상기 CXCR4는 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 CXCR4를 코딩하는 유전자는 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며， 상기 서열번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 22로 표시되는 염기서열일 수 있다.
상기 CCR2 및 CXCR4 단백질은 본 발명의 중간엽줄기세포의 암세포 이동성을 증가시켜 치료 효능의 증대를 가져올 수 있다. 이러한 특징을 갖는 동일한 세포주를 대량으로 생산할수 있어 상업적 치료제로서 개발이 가능하다. 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 CD, TRAIL , CCR2 , CXCR4, CD90 , CD44, CD105 및 /또는 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 특히， 이러한 세포주는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우， TRAIL 단백질을 80% 이상 발현하고， CCR2 및 CXCR4를 90% 이상 발현하는 세포주일 수 있다.
또한, 상기 세포주는 CD90 , CD44, CD105 및 /또는 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 구체적으로， 상기 세포주는 CD90 , CD44 및 CD105 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한， 상기 세포주는 CD90 , CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한， 상기 세포주는 CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 또한， 상기 세포주는 CD90 , CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하는 세포주일 수 있다. 특히 이러한 세포주는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우， CD9으 CD44 , CD105 및 /또는 CD73 단백질을 90% 이상， 95%， 96%, 97%, 98%, 또는 9 이상 발현하는 세포주일 수 있다.
한편， 본 발명의 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 CD34 , CDllb , CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 발현하지 않는 세포주일 수 있다. 구체적으로， 상기 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포는 FACS 분석법을 통해 측정할 경우ᅳ CD34, CDllb, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 10%， 5%, 3%, 2%, 또는 1% 이하로 발현하는 세포주일 수 있다.
바람직하게， 본 발명의 중간엽줄기세포는 TRAIL, CD(cytosine deaminase) , CCR2 , CXCR4 단백질을 발현하면서， 세포 표면 마커로서 CD90, CD44, CD105 및 CD73 단백질을 발현하고 (FACS 분석법으로 측정하여 95¾ 이상)， CD34, CDllb, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질은 발현하지 않는 (FACS 분석법으로 측정하여 1% 미만) 세포주일 수 있다.
본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터는 1 또는 2개의 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 프로모터는 사이토메갈로바이러스 (CMV) , 호흡기세포융합바이러스 (RSV) , 인간 성장인자 -1 알파 (human elongat ion factor-1 alpha, EF-1 α ) 또는 TRE(tetracycl ine response elements) 프로모터일 수 있다. 일 실시예에 의하면， 재조합 렌티바이러스 백터는 1개의 프로모터에 의해서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 상기 프로모터는 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 일 실시예에 의하면， 상기 TRAIL 및 CD는 TRE 프로모터에 연결될 수 있다. 상기 TRE 프로모터는 tTACtetracycl ine transact ivator) 단백질에 의하여 프로모터와 연결된 유전자의 전사를 활성화시킬 수 있다. 구체적으로, tTA 단백질은 테트라사이클린 (tetracycl ine) 또는 독시사이클린 (doxycycl ine)이 존재하지 않을 때 TRE 프로모터에 결합하여 전사를 활성화시키고, 이들이 존재하는 경우에는 TRE 프로모터에 결합하지 못하여 전사를 활성화시키지 못한다. 따라서, TRAIL 단백질 및 CD 단백질의 발현은 테트라사이클린 또는 독시사이클린의 첨가 여부에 의해 조절될 수 있다.
상기 용어 "작동 가능하게 연결된 "은 특정 폴리뉴클레오티드가 그 기능을 발휘할 수 있게 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 것을 의미한다. 즉, 특정 단백질을 코딩하는 유전자가 프로모터에 작동가능하게 연결되었다는 것은 당해 프로모터의 작용에 의해 mRNA로 전사되고 당해 단백질로 번역까지 될 수 있게 연결되었다는 것을 의미한다.
본 발명의 렌티바이러스 백터에서 하나의 프로모터에서 두 개 이상의 유전자가 전사되도록 연결된 경우, 상기 하나의 전사체로부터 각각의 단백질이 발현될 수 있게 내부 리보좀 진입 부위 ( IRES)를 포함할 수 있다.
상기 "내부 리보좀 진입 부위 ( internal ribosome entry site , IRES)"는 진핵생물의 단백질 합성과정에서， 5'-캡 구조 대신 전사체의 중간 부위에서부터 번역이 가능하도록 기능을 하는 핵산 서열을 의미한다. IRES를 이용하여 하나의 전사체로부터 복수의 다른 기능을 수행하는 단백질을 생산할 수 있다. 일 실시예에 의하면, 본 발명의 재조합 렌티바이러스 백터는 TRAIL 및 CD를 IRES로 연결하여 하나의 전사체로 전사시킨 후， 이로부터 각각의 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 용어 "암"이란， 혈액암 및 고형암을 모두 포함하는 일반적인 암을 의미한다. 상기 암은 위암， 결장암， 유방암, 폐암， 비소세포성폐암， 골암， 췌장암, 피부암， 두부 또는 경부암， 흑색종， 자궁암, 난소암， 직장암， 자궁내막암， 호지킨병 (Hodgkin' s disease) , 뇌종양， 육종암， 식도암， 소장암， 갑상선암， 전립선암 백혈병, 림프종， 방광암, 중추신경계 종양 및 척수 종양으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 약학 조성물은 일종의 세포치료제로서, 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 덱스트로스， 수크로스, 솔비를 만니를， 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘ᅳ 알기네이트， 젤라틴， 규산칼슴， 미세결정성 셀를로스， 폴리비닐피를리돈， 샐를로스， 물， 시럽, 메틸셀를로스， 메틸하이드톡시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석， 스테아르산 마그네슘， 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.
또한， 본 발명의 약학 조성물은 윤활제， 습윤제 , 감미제， 향미제， 유화제， 현탁제， 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 약학 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 약 90 중량 % 내지 약 99.99 중량 ¾로 포함될 수 있으며， 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량 % 내지 약 20 중량 %로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따라， 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나， 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액， 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제， 분말제， 과립제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 측면은， 암을 예방 또는 치료하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은， 암 예방 또는 치료용 약제를 제조하기 위한 본 발명의 약학 조성물의 용도를 제공한다.
또한， 본 발명의 또 다른 측면은, 상기 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는， 상기 서술한 바와 같은 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 밌다. 상기 약학 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고， 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한， 상기 약학 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나， 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.
상기 약학 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우， 그 예로는 피하, 눈， 복강 내 근육 내， 구강， 직장, 안와 내， 뇌 내, 두개 내 ( intracranial ) , 척추 내， 뇌실 내， 수강막 내， 비 내， 정맥 내 투여가 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 상기 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 포함하는 약학 조성물을 뇌실내 또는 두개뇌 투여하였다.
상기 투여는 1회 이상， 1 내지 3회 투여될 수 있고， 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복투여하는 경우에는 12 내지 48시간， 24 내지 36시간 간격으로 투여할 수 있고， 구체적으로는 24시간 간격으로 투여할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는， 24시간 간격으로 7일 동안 반복투여하였다.
또한， 상기 투여는 세포의 경우 성인 기준 1일 l .OxlO5 내지 l.OxlO11 세포수， 구체적으로 l.OxlO7 내지 l.OxlO9 세포수의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다. 발명의 실시를 위한 형태
이하， 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐， 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 불사화된 중간엽줄기세포 (MSC)의 제조
실시예 1. 1. 불사화유전자를 포함하는 렌티바이러스 백터의 제조
MSC를 불사화시키기 위하여， 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 각각 포함하는 렌티바이러스 백터를 제조하였다. 이때， Tet-of f 시스템을 사용하기 위해 tTA 단백질을 발현하는 유전자 컨스트럭트를 함께 삽입하였다.
먼저， pWPT 백터 (Addgene , 미국)의 발현 카세트 내에 EF 프로모터 서열을 CMV 프로모터로 치환하고, 그 하위에 RSV 프로모터를 추가 연결하도록 디자인하여 합성함으로써 (바이오니아) pBD 렌티바이러스 백터를 제작하였다. 상기 pBD 렌티바이러스 백터에 c-Myc 유전자 (서열번호 8) 및 티미딘 인산화효소 (thymidine kinase , TK) 유전자 (서열번호 6)를 IRES로 연결하여 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 백터는 pBD- 1로 명명하였다.
한편, pBD 렌티바이러스 백터에, hTERT 유전자 (서열번호 10)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 여기에, 지오신 (zeocin)에 대한 저항성을 갖는 유전자 (ZeoR; 서열번호 16)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 백터는 pBD- 2로 명명하였다.
또한， pBD 렌티바이러스 백터에， tTA( tetracycl ine transact ivator) 유전자 (서열번호 12)를 CMV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도톡 삽입하였다. 여기에 퓨로마이신 (puromycin)에 대한 저항성을 갖는 유전자 (PuroR; 서열번호 14)는 RSV 프로모터에 의해 발현이 조절될 수 있도록 삽입하였다. 상기 제작된 백터는 pBD-3으로 명명하였다.
실시예 1.2. 불사화유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산
상기 실시예 1. 1.에서 제작된 렌티바이러스 백터를 이용하여, 다음과 같은 방법으로 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 생산하였다. 먼저， 렌티 -X 세포 (Clontech Laboratories, 미국)는 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지를 사용하여 150 隨 디쉬 (dish)에 배양하였다. 한편， 렌티바이러스 백터는 EndoFree Plasmin Maxi Kit(Qiagen, 미국)를 사용하여 DH5 대장균 세포로부터 추출 및 정량하였다. 상기 배양된 렌티 -X 세포를 PBS로 세척한 후， 3 »1£의 TrypLE™ Select
CTS™(Gibco, 미국)을 첨가하였다. 세포를 370C 온도에서 약 5분 동안 방치한 뒤, 세포가 탈착된 것을 확인하였다. 탈착된 세포를 7 m의 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 중화시켰다. 중화된 세포는 50 mi 튜브에 모아서 1,500 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 10 ^의 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배양배지를 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 재현탁한 세포는 헤마토사이토미터로 그 수를 측정한 뒤， 150 隨 디쉬에 1.2xl07개의 세포가 되도록 분주하였다.
상기 분주된 세포의 세포 포화도가 약 90% 정도로 배양되었을 때, 12 의 렌티바이러스 백터， 12 «g의 psPAX(Addgene; gag-pol 발현， 패키징 플라스미드)서열을 합성하여 (바이오니아) 확보된 SL-PACK 플라스미드 및 2.4 의 pMD.G 플라스미드 (Addgene; VSVG 발현 엔벨로프 플라스미드)를 합성하여 (바이오니아) 확보된 SL-ENV 플라스미스 흔합물을 상기 세포에 형질도입하였다. 형질도입을 돕기 위해, 리포펙타민 (Invitrogen, 미국)과 플러스 리에이전트 (Invitrogen, 미국)를 사용하였다. 형질도입 6시간 후， 10¾>(v/v) FBS가 포함된 DMEM으로 배지를 교환하였다. 이를 48시간 동안 배양한 뒤， 상층액을 모았다.
상기 수득된 상층액을 렌티바이러스 농축키트 (Lenti-X concentrator, Clontech Laboratories, 미국)와 흔합한 후， 40C 은도에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이를 4°C 온도， 4，000 rpm의 조건으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 수득하였다. 수득된 바이러스를 FBS가 포함되지 않은 0.5 의 DMEM에 재현탁하였다. 그 결과， pBD-l, pBD-2 및 pBD-3 렌티바이러스 백터로부터 생산된 렌티바이러스를 각각 4.0xl08 TU/m^, 2.0xl08 TU/ 및 1.2xl09 TU/i 의 농도로 준비하였다. 실시예 1.3. 불사화된 MSC의 제조
상기 실시예 1.2.에서 생산된 불사화 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 사용하여， 불사화된 MSC를 제조하였다.
먼저， 골수유래 MSC를 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 구체적으로， 건강한 공여자 (donor)의 장골능 ( i l iac crest)에서 골수천자액 (bone marrow aspirate)을 수득하였다. 이를 멸균 콘테이너에서 20 IU/ 의 헤파린과 흔합하여 응고를 억제하였다. 상기 골수 혼합액을 40C 온도， 739 RCF의 조건으로 7분 동안 원심분리한 후， 상층액을 제거하고， 10배 부피의 멸균된 물과 흔합하였다. 이를 동일한조건으로 다시 원심분리하여 세포의 펠렛을 수득하였다.
수득된 펠렛을 20%(v/v) FBS 및 5 ng/^의 b— FGF(100-18B, Peprotech, 미국)가 포함된 DMEM-low glucose( 11885-084, Gibco, 미국) 배지에 현탁하여 배양 플라스크에 분주하였다. 이를 370C 온도， 5¾ C02 조건에서 24 내지 48시간 동안 배양한 뒤， 새로운 배지로 교체하였다. 이를 3일 내지 4일 간격으로 새로운 배지로 교체하면서 계대 배양하였고， 배양 2주 후 형광세포분석기 (FACS)를 사용하여 MSC 여부를 확인하였다.
상기 실시예 1.2.에서 생산된 pBD-1 렌티바이러스로 상기 준비된 MSC를 레트로넥틴 (Retronect in, Clontech Laboratories , 미국)을 사용하여 100 M()I로 감염시켰다. 감염된 세포에 동일한 방법으로， PBD-2 렌티바이러스 백터를 100 M0I로 감염시켰다. 감염 후， 안정화된 세포의 배양액에 500 //g/ 의 지오신을 첨가하여 pBD— 2 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
상기 선별된 세포에 PBD-3 렌티바이러스 백터를 100 M()I로 감염시켰다. 감염 후, 안정화된 세포의 배양액에 1 g/m£의 퓨로마이신을 첨가하여 pBD-3 렌티바이러스가 감염된 세포를 선별하였다.
MSC의 불사화 유무에 따른 세포 증식율을 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타나는 바와 같이， 불사화 유전자인 c-Myc 및 hTERT를 포함하는 렌티바이러스에 의해 감염된 MSC 세포는， 배양 120일 이후에도 높은 세포 증식율을 유지하였다. 반면， 정상 MSC 세포는 배양 40일 이후에는 세포 증식율이 급격히 감소하였다. 실시예 2. TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스의 제작 실시예 2.1. TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스 백터의 제작 상기 제작된 pBD 렌티바이러스 백터에， TRAIL 유전자 (서열번호 2) 및 CD 유전자 (서열번호 4)를 삽입하였다. 이때, 삽입된 TRAIL 및 CD 유전자가 IRES( internal r ibosome entry site)로 연결되고， TRE 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 하였다. IRES는 리보좀 결합부위로， 5' -캠 구조가 없어도 번역 (translat ion)이 시작될 수 있도록 하여， 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질이 발현될 수 있게 한다. 한편， TRE 프로모터는 독시사이클린 (doxycycl ine, 631311 , Clontech, 미국)의 첨가 유무에 따라 상기 프로모터와 연결된 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
상기 제작된 백터는 pBD-4로 명명하였고, 그 유전자 컨스트럭트의 구조를 도 2에 나타내었다.
실시예 2.2. TRAIL 및 CD유전자를 포함하는 렌티바이러스의 생산 상기 실시예 2.1.에서 제작된 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스 백터를 이용하여， 상기 실시예 1.2.에 기재된 바와 동일한 방법으로 렌티바이러스를 생산하였다. 생산된 렌티바이러스는 7.6xl08 TU/ 의 농도로 준비하였다.
실시예 3. TRAIL 및 CD를 발현하는 MSC의 제조
상기 실시예 1.3.에서 제조한 불사화된 MSC에， 상기 실시예 2.2.에서 생산한 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시킨 후, 감염된 MSC 중 TRAIL 및 CD를 발현하는 MSCXBM-03)를 선별하였다. 감염은 실시예 1.3.에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행하였다.
실시예 3.1. TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 이용한 MSC 형질감염
상기 불사화된 MSC에 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스를 감염시킨 후， 안정화된 세포의 배양액에 1 / 의 독시사이클린을 첨가하여 TRAIL 및 CD의 발현을 억제시킨 상태로 배양하였다. 세포가 안정화된 후ᅳ 독시사이클린을 제거한 배양 배지에서 72시간 동안 배양하여 TRAIL 및 CD의 발현을 유도시켰고， 상기 세포로 FACS를 수행하여 세포 표면에 TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다. 구체적으로 TRAIL 및 CD 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 감염시킨 MSC를 FACS 튜브 당 5xl05 세포수가 되도록 분주하였다. 그 후， 상기 FACS 류브를 40C 온도에서， 1，500 rpm의 조건으로 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 여기에 1 1 의 FACS 완층액 (2% 우태아 혈청이 포함된 PBS)을 첨가하여 세포를 재현탁하고， 동일한 조건으로 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 상기의 세척 과정을 1회 더 수행한 뒤 1 의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하였다.
재현탁한 세포에 200 ^의 FACS 완층액에 0.3 ^의 LIVE/DEAD® Fixable
Near-IR Dead Cel l Stain(Li fe Technologies-Molecular Probes , 미국) 및 5 ^의 항 -TRAIL 항체인 APC ant i -human CD253 항체 (BioLegend, Cat#. 308210, 미국)를 첨가한 흔합물을 첨가하여, 4 온도에서 30분간 반웅시켰다. 반응 후， 상기와 같은 방법으로 세포를 2희 세척하였고， 상층액을 제거하였다.
그 후， 2%(v/v) 포름알데히드 및 l%(v/v) FBS를 PBS에 첨가하여 고정 완충액 (f ixing buf fer)올 제조하였다. 세척된 세포에 300 ^의 고정 완층액을 첨가하고, 40C 온도에서 최소 15분 동안 반웅시켰다. 상기 세포를
FACSCLSRFortessa, BD biosciences , 미국)기기로 분석하여， TRAIL을 발현하는 세포를 선별하였다.
또한, 상기 선별된 세포가 콜로니를 형성하도록 배양하였다. 형성된 콜로니로부터 단일클론의 세포를 배양하여 세포주를 확립하고 이를 BM-03이라고 명명하였다. 세포주 BM-03은 2017년 1월 6일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁번호 KCTC 13182BP로 기탁하였다.
실험예 1. 형질전환된 세포주에서 표면항원 단백질 발현 확인
TRAIL 및 CD를 발현하는 BM-03 세포주의 표면항원 단백질 발현을 인간
MSC 분석 키트 (Stemf lowTM, Cat No 562245, BD)를 이용하여 분석하였다. 실험은 각 키트에 포함되어 있는 매뉴얼에 따라 수행되었고， 실험 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나는 바와 같이 본 발명의 BM-03 세포주는 CD90, CD44, CD105, 및 CD73 표면항원 단백질을 95%이상 발현하고 CD34, CD1B, CD19, CD45 및 HLA-DR은 1¾ 미만으로 발현하고 있음을 확인하였다. 반면， 인체에서 분리한 골수 유래 MSC의 경우， cel l populat ion에 따라 표면 마커의 발현 비율이 넓은 범위 (6CK90D에서 확인되었다 (data not shown) . 이러한 표면항원 단백질의 발현을 통해 heterogeneous한 골수 유래 BM-MSC와 비교하여， 본 발명의 세포주가 homogenous한 특성을 나타내고 있음을 알 수 있다.
실험예 2. BM-03 세포주의 분화능 확인
실험예 2.1. 지방세포 (adipocyte)로의 분화 확인
지방세포로의 분화능을 확인을 위해 BM-03 세포주를 12-웰 플레이트에 lxlO4 cel ls/cm2의 농도로 시딩 (seeding)하였다. 일반배지를 이용하여 37°C 온도,
5% C02 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤， 지방생성 분화 배지 (StemPro® 지방생성 분화 키트， Thermo f isher Scient i fic , A10070-01)로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일마다 교체해주며 21일간 배양하였다. 배양이 완료되면 오일- 레드-오 용액 염색 (0U Red 0 solut ion staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다. ᅳ
실험예 2.2. 골아세포 (osteoblast)로의 분화 확인
골형성 확인을 위해 12-웰 플레이트에 5xl03 eel ls/cm2의 농도로 시딩하였다. 일반배지를 이용하여 370C 온도， 5% C02 배양기에서 2일 내지 3일간 배양한 뒤 골 형성 분화 배지 (StemPro® 골 형성 분화 키트, Thermo f isher
Scient i f ic , A10072-01)으로 교체하였다. 배지를 3일 내지 4일 마다 교체해주며 21알간 배양하였다. 배양이 완료되면 알리자린 -레드 -에스 염색 (Al izarin Red S staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다.
실험예 2.3. 연골세포 (chondrocyte)로의 분화 확인
연골형성 확인을 위해 1.6xl07 cel ls/ 의 농도로 현탁하여 그 중 5 ^를 24웰에 시딩한 뒤 2시간 동안 배양하였다. 연골형성 분화 배지 (StemPro® 연골형성 분화 키트， Thermo f isher Scient i f ic , A10071-01) 500 ^를 첨가한 뒤 3일 간격으로 교체해주며 14일간 배양하였다. 배양 후 배지를 제거하고 DPBS로 행구어 펠렛을 떼어내었다. 동결절편 (Cryosect ion) 과정을 거쳐 알시안 블루 염색 (Alcian Blue staining)을 한 뒤 현미경으로 확인하였다. 상기 실험예 2. 1. 내지 2.3.의 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주의 다증 분화능 (transdi f ferent i at i on)을 가지고 있음을 확인하였다.
실험예 3. 형질전환된 세포주의 도입유전자 확인 시험
상기 확립된 세포주인 BM-03 검체를 370C 온도의 항온수조에서 약 1분간 해동하고 9 ml PBS가 포함된 15 튜브에 옮긴 후 1，500 rpm으로 5분간 샐 다운 (Cel l Down)시켰다. PBS를 완전히 제거한 뒤， 1.5 mi 튜브에 200 ≠ PBS로 팰렛을 현탁하여 옮겼다. Nuc leoSpin® Ti ssue (丽, 740952.250)를 이용하여 gDNA를 준비하고 하기 표 1과 같이 흔합물을 만든 후， 하기 표 2의 단계로 PCR을 수행하였다. 이때， 양성대조군으로 100 ng의 BM-03 플라스미드 DNA를, 음성대조군으로 1 ^의 정제수 (dw)를 넣었다.
【표 11
Figure imgf000023_0001
【표 2】
Figure imgf000023_0002
DNA Si ze Marker를 로딩하였고， 다음 웰부터 음성대조군， 양성대조군， 3개의 BM- 03 검체 순서로 각각 10 ^씩 로딩하였다. 이후 100 V로 20분 동안 전기영동을 실시하였고， 겔 사진을 찍어 그 결과를 도 5a에 나타내었다.
도 5a에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주 검체 3개 모두 양성대조군과 동일한사이즈 ( 1.2kb)의 PCR 프로덕트를 확인하였다.
또한, 정량 역전사 충합 효소 연쇄 반웅 (qRT— PCR)을 수행하여 TRAIL 및 CD 유전자 발현량을 확인하였다. 전임상 연구를 위한 3가지 BM-03 세포주 (Lot#l , Lot #2 , Lot#3)를 qRT-PCR 분석에 사용했다. 상기 BM-03 세포주의 RNA 1 «g을 RT- PCR에 사용하였다. 정량을 위한 qPCR의 경우， 렌티바이러스의 생산에 사용된 BM- 03 세포주의 DNA를 연속적으로 희석시켜 표준 곡선을 만들었다.
그 결과， 도 5b에 나타난 바와 같이， 상기 Lot#l , Lot #2 및 t#3의 BM- 03 세포주로부터 검출된 TRAIL RNA의 평균은 6.22x l07 copies였고 CD RNA는 total RNA 1 //g 당 4.82χ 107 copies였다. 실험예 4. 형질전환된 세포주에서 TRAIL 및 CD 단백질의 발현 확인 상기 실시예 3. 1.에서 확립된 BM-03 세포주에서 상기 실시예 3.1.과 동일한 방법으로 TRAIL 및 CD 단백질의 발현을 유도한 뒤， FACS를 수행하여 독시사이클린의 유무에 따른 TRAIL의 발현을 확인하였다. 이후 TRAIL의 발현이 확인된 세포주에서 CD 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로， 10%(v/v) FBS가 포함된 DMEM 배지에 독시사이클린 2 /ιι^이 들어간 배지와 들어가지 않은 배지를 이용하여 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 5xl05 세포수가 되도록 계대 배양하였다. 3일 동안 배양한 뒤 세포를 수득하였다. 세포 수를 측정한 뒤 각 그룹 당 5xl05 세포를 PE ant i -human CD253(TRAIL) 항체 (BioLegend, 308206) , PE Mouse IgGl , κ Isotype Control Ant ibody (BioLegend, 400112)를 이용하여 염색하였다. 또한 죽은 세포들을 배제한 후 발현을 확인하기 위해 LIVE/DEAD® Fixable Near-IR Dead Cel l Stain Ki t (Thermos
Fisher Scient i f i c L34976) 항체를 이용하였다 ; FACS(LSRFortessa , BD Biosciences)기기로 분석하였다.
동일한 방법으로 세포를 배양한 후 독시사이클린을 제거하여 CD 발현을 유도하였다. 여기에 5-FC(5-f luorocytosine , Sigma)를 100 «g/m£의 농도로 첨가한 뒤, 48시간 후에 세포의 사멸을 관찰하였다. 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 독시사이클린을 첨가하였을 때는 TRAIL이 발현되지 않았으나， 독시사이클린이 제거된 배지에서 배양한 BM-03 세포주에서는 TRAIL이 발현되는 것을 확인하였다. 또한， 도 7에 나타난 바와 같이， CD 단백질이 발현하면， 5-FC에 의해 세포가 사멸하는 것을 알 수 있었다. 즉, CD 단백질의 발현에 의해 세포가 사멸되는 것을 관찰하였다. 따라서， 제조된 중간엽줄기세포에서 TRAIL 단백질 및 CD 단백질이 발현되고， 이는 Tet-of f 시스템에 의해 조절되는 것을 확인하였다.
또한 TRAIL , CCR2 및 CXCR4를 발현하는 BM-03 세포주의 비율을 확인하기 위해 FACS를 사용하여 분석하였다. 구체적으로, 하기 표 3에 기재된 항체가 함유된 FACS Buf fer (2% 소태아 혈청을 포함한 PBS)에서 세포를 40C 온도에서
30분 동안 반웅시켰다. 그 후， 세포를 FACS 완충액으로 세척한 후， FACS 분석 전에 Fixing Buf fer( l% 파라포름알데히드를 함유한 PBS)에 재현탁시켰다. FACS 분석은 LSR FortessaTM 세포 분석기 (BD Biosciences)를 이용하여 수행되었으며, f lowJo_V10 또는 BD FACS Diva 소프트웨어로 분석하였다.
【표 3】
Figure imgf000025_0001
발현되지 않는 TRAIL , CCR2 및 CXCR4 유전자가 BM-03 세포주에서 잘 발현하는 것을 확인하였다. 또한， 세 개 Lot의 BM-03 세포주를 분석함으로써 TRAIL, CCR2 및 CXCR4유전자의 발현 정도가 균일한 것을 확인하였다.
상기 실험예 4.의 PCR 및 FACS 분석법의 실험결과들을 취합하여， 본 발명의 중간엽줄기세포의 QC(Qual i ty Control ) 기준을 아래와 표 4와 같이 수립하였다.
【표 4】
PCR시험법 TRAIL_CD: :UPRT 1 , 194 bp band확인
CCR2_CXCR4 1 , 016 bp band확인
FACS분석법 CD90 > 80.0%
(MSC표면마커 ) CD44 > 80.0%
CD105 > 80.0% CD73 > 80.0%
Negat ive < 10.0%
FACS분석법 TRAIL ≥90%
CCR2 > 90%
GXCR4 > 90%
실험예 5. 형질전환된 세포주의 PDL (Populat ion doubl ing level ) 분석
4xl05개의 BM-03 세포주를 T75 플라스크에 2 ； ug/i 의 독시사이클린이 포함된 배지에 시딩하였다. 3일 또는 4일 정도 계대 배양하여 세포를 수득한 후， 세포수를 측정하였다. 같은 수의 세포를 시딩하여 3일 내지 4일 간격으로 PDL을 측정하였다. PDL 값은 하기 수학식 1을 이용하여 계산하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 이때， 하기 수학식 1에서 X는 초기 PDL, I는 배지에 시드된 초기 세포 수， Y는 최종 세포수율， 또는 성장기 말의 세포 수를 나타낸다.
【수학식 1】
PDL = X + 3.222 (log Y - log I) 도 9에 나타난 바와 같이 , 장기 계대 배양으로 안정된 성장을 보여주고 있음을 확인하였다.
실험예 6. 형질전환된 세포주의 핵형 분석
BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체 이상 여부를 판단하기 위해 이원생명과학연구원 (한국)에 분석 의뢰하여 정해진 프로토콜에 따라수행되었다. 분석 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주에 대하여 유전자가 이입된 세포의 염색체에서 이상 여부는 관찰되지 않았으며 정상 핵형임을 확인하였다. 실시예 4. 동물 모델을 이용한 BM-03 세포주의 항암효과 확인
실시예 4.1. 신경교종 유발 마우스 제조
아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Col lect ion)으로부터 인간 신경교종 세포주인 U-87MG 세포를 얻어서 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 370C 온도， C02 5% 조건으로 배양하였다. 상기 U-87MG 세포에 반딧불이 루시페라아제 (Luc)를 코딩하는 유전자를 포함하는 렌티바이러스로 형질감염시켜 Luc를 안정적으로 발현하는 세포인 U-87MG-Luc 세포를 제작하였다. 그 후，
U-87MG-Luc 세포를 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 370C 온도， C02 5% 조건으로 배양하였다.
6주령의 수컷 누드 마우스 (Athymic Nude Mouse)에 상기 U-87MG-Luc 세포를 두개내 이종이식 ( intracranial xenografts)하기 위해, 상기 마우스를 케타민 /자일라진 (ketamine/xylazine)으로 복강내 마취시켰다. 상기 Ιχ ΙΟ5 세포수의 U-87MG-Luc 세포를 3 μί PBS에 재현탁시킨 후, 미세주입 펌프 (microinfusion pump)를 사용하여 해밀턴 시린지 (Hami l ton Company, Reno , NV)에 옮겨 담았다. 그 후, 상기 마취된 마우스의 두개 기저 (skul l base)로부터 2.5 mm의 깊이에서 브레그마 (bregma) 2 匪 측면 및 1 mm 전방에 위치한 우측 전두엽 또는 양쪽 반구 (hemi spheres)에 정위적 (stereotact ical ly)으로 주입하였다. 실시예 4.2. BM-03 세포주에 의한 종양 억제 확인
BM-03 세포주 주입에 따른 신경교종 유발 마우스 뇌의 종양 억제를 확인하기 위해, 실시예 4. 1.에서 U-87MG— Luc 세포를 마우스에 주입하고 7일 후에 TRAIL 및 CD를 발현하는 중간엽줄기세포를 종양세포 내로 주입하였다.
단회투여 실험의 경우, 2.5xl05 세포수의 BM-03 세포를 8 μΑ PBS에 재현탁시킨 후， 500 mg/kg 농도의 5-FC를 7일간 주사한 마우스와 주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 각각 주입하였다. 다회 투여 실험의 경우, U- 87MG-Luc 세포를 마우스에 주입한지 7일， 21일 및 35일이 되는 날에 각각 BM-03 세포를 주입하였다. 구체적으로， 2xl04, lxlO5 또는 5xl05 세포수의 중간엽줄기세포를 8 fd PBS에 재현탁시킨 후， 500 mg/kg 농도의 5-FC를 7일간 주사한 마우스와 주사하지 않은 마우스에 존재하는 종양세포에 주입하였다. U- 87MG-Luc 세포를 마우스에 주입 6일 후부터 일주일 간격으로 공지의 방법을 통해 생체 내 발광 양을 측정하였다 (Kim SM et al. International Journal of Nanomedicine 11 : 13—23 , 2016) . 생존은 최대 90일 동안 이어졌다.
단회투여 실험의 결과를 도 11 내지 도 13에 나타내었다. 구체적으로， 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이 , BM-03 세포 및 5-FC를 주입한 마우스의 종양은 대조군 (control ) 및 BM-03 세포만을 투여한 마우스의 종양보다 발광이 감소하였다. 또한 도 13에 나타난 바와 같이， BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 마우스의 생존일도 증가하였다.
다회 투여 실험의 결과를 도 14 내지 도 16에 나타내었다. 구체적으로, 도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이 BM-03 세포 및 5-FC를 투여한 마우스의 종양은 대조군 (control)의 종양보다 발광신호가 감소하였다. 특히, lxlO5 cells/ 8 ≠ 또는 5χ105 cells/ 8 μί 농도의 BM-03 세포 및 5— FC를 주입한 마우스의 발광신호가 크게 감소하였다. 또한， 도 16에 나타난 바와 같이， lxlO5 cells/ 8 μί 또는 5χ105 cells/ 8 ≠ 농도의 BM-03 세포 및 5— FC를 주입한 마우스의 생존일도 농도 의존적으로 증가하였다.
실험예 7. BM-03의 종양 이동성 확인 (in vitro)
BM-03 세포주의 종양 이동성을 확인하기 위해 24-웰의 8 iffli 기공 필터가 있는 트랜스웰 챔버에서 상이한 조건으로 배양하였고 도 17에 나타내었다. 배양한 BM-03 세포를 트립신을 처리하여 분리한 후 세척하였다. 그 후， serum free Dulbecco's modified Eagle's medium에 재현탁시켰다. 상부 챔버에 3χ104 세포수 / 100 id 농도의 MSC를 넣고 무혈청 DMEM, 10% FBS가 첨가된 DMEM, 300 ng/ SDF— la가 첨가된 DMEM, 300 ng/mi MCP1이 첨가된 DMEM 또는 U87 MG 배양배지의 조정배지 (conditioned media)를 각각 하부 챔버에 넣어주었다. 그 후 세포를 37°C 은도 및 > C02 조건의 세포 배양 배양기에서 48시간 동안 배양하였다. 그 후， 트랜스웰 챔버를 꺼내어 세척하고 diff-quick Kit(Sysmex)로 염색하였다. 그 후， 격막을 침투한 BM-03 세포의 수를 광학 현미경으로 계수하였다. 이를 통해， 필드 당 평균 세포수를 계산하여 BM-03 세포의 종양 이동 능력을 평가하였다.
그 결과， 도 18에 나타난 바와 같이， 종양 세포를 배양한 배지를 넣어준 트랜스웰 챔버에서 격막을 통과한 BM-03 세포의 수가 많이 관찰되었다. 이를 통해 BM-03 세포주가 종양으로 이동하는 능력이 우수함 것을 확인하였다.
실험예 8. BM-03 세포주의 종양 이동성 확인 (in vivo)
BM-03 세포주의 종양이동성 확인을 위해， BM-03 세포주에 형광물질인 DiDCABD Bioquest, Inc.)를 표지하여 뇌종양으로의 이동성을 평가하였다. 구체적으로， 실시예 4.1에서 제작한 신경교종 유발 마우스의 종양 형성부위의 반대편 뇌에 DiD가 표지된 BM-03 세포를 이식한 후， BM-03 세포의 이동을 IVIS Spectrum In Vivo Imaging Sy s t em (Per k i nE 1 mer ) ¾- 이용하여 관찰하였다.
그 결과 도 19에 나타난 바와 같이， BM-03 세포주만을 뇌에 이식할 경우 세포의 이동이 전혀 없는 반면， 종양의 반대편에 이식한 BM-03 세포는 종양을 향해 반대편 뇌로 이동하는 것을 확인하였다.
실시예 5. BM-03 세포주의 항암 효능 확인 ( in vi tro)
상기 실시예 3. 1.에서 확립된 BM-03 세포주의 항암 효능을 확인하기 위해， 인간 신경 교종 세포주인 U87MG, U373MG또는 마우스 신경 교종 세포주인 GL26을 10% 소태아 혈청 (Gibco)이 첨가된 DMEM(Hyc lone)으로 배양하였다. 구체적으로， 배양 1일째， lxlO5 세포수의 신경교종 세포를 6—웰 플레이트에 도말하였다. 배양 2일째, 신경교종 세포에 2xl05 세포수의 불멸화된 중간엽줄기세포 ( imMSC) 또는 5xl05 세포수의 BM-03 세포를 첨가하였다. 배양 4일째， 10 wgM 농도의 5-FC를 각 웰에 처리하였다. 배양 6일째， 줄기세포 및 신경교종 세포를 수거하고 FACS를 통해 신경교종 세포를 분석하였다.
그 결과， 도 20에 나타난 바와 같이, BM-03 세포주를 처리한 군에서 모두 약 40% 정도의 신경교종 세포가 사멸되었다. 특히， BM-03 세포주 및 5-FC를 처리하였을 때 70% 이상의 신경교종 세포가 사멸되었다. 반면, 불멸화된 중간엽줄기세포를 처리한 군에서는 약 10% 미만의 신경교종 세포가 사멸되었다. 또한, 불멸화된 중간엽줄기세포 및 5-FC를 처리하였을 때도 10% 미만의 신경교종 세포가사멸되었다.
또한， 도 21에 나타난 바와 같이， BM-03 세포 및 5-FC를 처리한 군에서 줄기세포가 잔존하지 않고 대부분 사멸하는 것을 확인하였다. 또한, 이를 통해 BM-03 세포주가 CD를 잘 발현하고 암세포 살상능을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 실시예 6. BM-03 세포주의 항암 효능 확인 ( in vivo intraventr icular inj ect ion)
10마리의 6주령 BALB/c 누드 마우스에 U-87 MG-Luc lxlO5 세포수 / 3 μί 무혈청 배지를 stereotaxi c apparatus를 사용하여 브레그마 (Bregma)로부터 AP 1.00 ML 1.50 DV —3.50 좌표에 투여하여 암을 형성시켰다. 암 이식 7일 후， 8xl04 또는 8xl05 세포수 / 5 μί cryostor BM-03 세포를 AP -0.50 ML -1.20 mm,
DV -2.40 mm 위치 ( intraventr i cul ar inject ion)에 투여하였다. BM-03 투여 이를 후부터 7일간 5-FC 500 rag/kg을 복강투여하였다. 한편， 대조군으로 10마리의 누드마우스에 cryostor 5 ^를 투여하였다.
그 결과， 도 22에 나타난 바와 같이 8xl05 세포수 / 5 id cryostor BM-03 세포를 단회투여 받은 실험군의 생존율이 25%가량 증가하였다.
또한， 단회투여와 동일한 조건으로 BM-03 세포주를 2주 간격으로 4회 투여하며 5-FC 투여도 동일한 사이클로 투여하여 다회 투여를 통한 동물시험 효력을-평가하였다. 그 결과 도 23에 나타난 바와 같이， 8xl05 세포수 / 5 ≠ cryostor BM-03 세포를 다회 투여 받은 실험군의 생존율이 25% 가량 증가하였다.
【수탁번호】 기탁기관명 ： 한국생명공학연구원
수탁번호 ： KCTC13182BP
수탁일자 ： 20170106
Figure imgf000031_0001
원기탁에 '관한 수탁증 하기 국제기락기관에서 정한 규^ 7.1 에 \ ¾행¾ 수령인 (기박자): 에스엘바이젠
134SS 대한민국 경기도 성남시 분당구 대창판교로 700. 코리아바이오파크 C동 7층
I. 미생， -의 표시
국제기탁기관에서 부여한
기탁자에 의한 식별 표시:
수탁 i호:
m-03
KCTC 13182BP
Γί, 과학적 성질 및 /또는 제시 ¾ - 류학샅의 워치
상기 ί란에 표시된 미생물에는 다움이 첨부되어 있다:
( ) 과학적 성질
( ) 분^학상의 위치
(직용되는 경우 십자형 표시)
ΠΪ. 수령 및 수탁
본 국제기탁기관은 상기 I란에 표시된 미생물 수탁하였으며, 상기 미생불은 2017년 1월 6일 자ᅳ 접수되었다.
IV. 전환 신청의 접수 상기 ί란의 미생붑은 본 국제기탁기관에 자로 접수되있고 원 기락푀 부다페스트 조약에 푀거한 기락으로의 전 신 은 자로 수되었다.
V. 국세기탁기관
본 국제기탁기관의 대표자 명 칭 ： 한국생물자원선 i터 (KCTC)
서 명: 김 차 영
주 소 ： 56212 대한민국전라북도정옵시입신길 181
한국생명공학연구원 (KRIBB)
날 짜 ： 2017 년 1 원 17 ¾ 양식 BP/4 (KCTC
Figure imgf000031_0002

Claims

특허청구범위
1. TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질 (TRAIL) , 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 동시에 발현하는 형질전환된 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서,
상기 중간엽줄기세포는 불사화된 것인, 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서，
상기 중간엽즐기세포는 hTERT 및 c-Myc 유전자가 도입된 것인， 약학 조성 물
4. 제 1항에 있어서，
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 재조합 렌티바이러스로 형질감염된 것 인， 약학 조성물.
5. 제 3항에 있어서，
상기 재조합 렌티바이러스는 재조합 렌티바이러스 백터, 패키징 플라스미 드 및 엔벨로프 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계; 및
상기 형질전환된 숙주세포로부터 렌티바이러스를 분리하는 단계를 통하여 수득되는 것인， 약학조성물.
6. 제 5항에 있어서，
상기 재조합 렌티바이러스 백터는 TNF-연관 세포사멸 -유도 리간드 단백질 (TRAIL) , 및 시토신 디아미네이즈 (CD) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 것 인， 약학조성물.
7. 제 6항에 있어서，
상기 TRAIL 단백질 및 CD 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1 및 서 열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열인 것인, 약학 조성 물-
8. 제 7항에 있어서，
상기 서열번호 1 및 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 2 및 서열번호 4로 표시되는 염기서열인 것인， 약학 조성 물.
9. 제 6항에 있이서，
상기 재조합 렌티바이러스 백터가 1 또는 2개의 프로모터를 포함하는 것 인， 약학조성물.
10. 제 9항에 있어서，
상기 프로모터가 사이토메갈로바이러스 (CMV) , 호흡기세포융합바이러스 (RSV) , 인간 성장인자 -1 알파 (human elongat ion factor-1 alpha, EF-1 α 또는 TRE( tetracycl ine response elements) 프로모터인, 약학조성물.
11. 제 6항에 있어서，
상기 재조합 렌티바이러스 백터가 내부 리보좀 진입 부위 ( IRES)를 포함하 는 것인, 약학 조성물.
12. 제 1항에 있어서,
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CCR2 및 /또는 CXCR4 단백질을 발현하 는 것인， 약학조성물.
13. 제 1항에 있어서，
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD90 , CD44, CD105 및 /또는 CD73 단백 질을 발현하는 것인， 약학조성물.
14. 제 1항에 있어서,
상기 형질전환된 중간엽줄기세포는 CD34, CDllb, CD19, CD45 및 HLA-DR 단백질을 발현하지 않는 것인, 약학조성물.
15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서，
상기 암이 위암， 결장암 유방암， 폐암， 비소세포성폐암， 골암， 췌장암， 피부암， 두부 또는 경부암， 흑색종， 자궁암， 난소암， 직장암， 자궁내막암, 호지 킨병 (Hodgkin' s disease) , 뇌종양, 육종암， 식도암， 소장암, 갑상선암, 전립선 암， 백혈병, 림프종， 방광암 중추신경계 종양 및 척수 종양으로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나인 것인， 약학조성물.
16. 암올 예방또는 치료하기 위한 제 1항의 약학조성물 용도.
17. 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제조하기 위한 게 1항의 약학 조성 물 용도. 제 1항의 약학 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 치료방법.
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