JP7150233B2 - 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 - Google Patents
多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7150233B2 JP7150233B2 JP2019554440A JP2019554440A JP7150233B2 JP 7150233 B2 JP7150233 B2 JP 7150233B2 JP 2019554440 A JP2019554440 A JP 2019554440A JP 2019554440 A JP2019554440 A JP 2019554440A JP 7150233 B2 JP7150233 B2 JP 7150233B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- stem cells
- cells
- cell
- uprt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/33—Heterocyclic compounds
- A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
- A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
- A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
- A61K31/513—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cytosine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
- C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
- C12Y204/02009—Uracil phosphoribosyltransferase (2.4.2.9)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
- C12Y305/04—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amidines (3.5.4)
- C12Y305/04001—Cytosine deaminase (3.5.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
即ち、本発明は、以下の〔1〕~〔17〕を提供するものである。
(1)多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
(2)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。
(1)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
(2)神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
(A1)多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程、
(A2)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
(B1)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程、
(B2)神経幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を導入する工程。
本発明の脳腫瘍治療用細胞製剤は、シトシンデアミナーゼ(CD)によって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(CD-UPRT遺伝子)を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むことを特徴とするものである。
(A)材料と方法
<ヒトiPS細胞>
使用したヒトiPS細胞(1210B2)は、京都大学iPS細胞研究所(CiRA)から入手した。1210B2は、ヒト末梢血単核細胞にエピソーマルベクターを用いて再プログラミング因子を導入する方法(Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, Sato Y, Amano N, Watanabe A, Goshima N, Yamanaka S. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 2013 Mar;31(3):458-66.)によって樹立された。ヒトiPS細胞は、iMatrix-511(ニッピ社製)でコートしたプラスチック培養ディッシュに播種し、Stem Fit AK03またはAK03N培地(味の素社製)を用いて、既知のフィーダーフリーの方法(Nakagawa M, Taniguchi Y, Senda S, Takizawa N, Ichisaka T, Asano K, Morizane A, Doi D, Takahashi J, Nishizawa M, Yoshida Y, Toyoda T, Osafune K, Sekiguchi K, Yamanaka S. A novel efficient feeder-free culture system for the derivation of human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 2014 Jan 8;4:3594.)で維持培養した。
ヒトiPS細胞からNS/PCsへの分化誘導は、既知の方法(Sugai K, Fukuzawa R, Shofuda T, Fukusumi H, Kawabata S, Nishiyama Y, Higuchi Y, Kawai K, Isoda M, Kanematsu D, Hashimoto-Tamaoki T, Kohyama J, Iwanami A, Suemizu H, Ikeda E, Matsumoto M, Kanemura Y, Nakamura M, Okano H. Pathological classification of human iPSC-derived neural stem/progenitor cells towards safety assessment of transplantation therapy for CNS diseases. Mol Brain. 2016 Sep 19;9(1):85.)により行った。まずiPS細胞の培地中に10μM ROCK阻害剤Y276352(和光純薬工業社製)を添加し、1~3時間インキュベーションした後、PBSで洗浄し、TrypLE Select(Life Technologies社製)を用いて単一細胞へ分散した。単一細胞へ分散されたヒトiPS細胞は、10μM ROCK阻害剤Y276352を添加したEB(embryoid body)形成培地(C液を添加していないStem Fit培地に10μM SB431542, 100nM LDN-193189を添加)に懸濁し、低接着96穴培養プレート(Prime Surface 96V,住友ベークライト社製)の1ウェルあたり9.0×103細胞/75μlになるように播種し、培養した。1日後にEB形成培地75μlを加え、以降、毎日半分量のEB形成培地を交換し、13~14日間培養することにより、EBを得た。各ウェルからEBを回収し、NS(neurosphere)培地(D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)(和光純薬工業社製)に20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子(PeproTech社製), 20 ng/ml 組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2 (PeproTech社製), 103 units/ml 組換えヒト白血病阻止因子(ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム(エイワイファーマ社製)を添加)で7日間培養した。培地交換は、培養3日か4日目に1度行った。細胞塊を遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁した。1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコ(Corning社製)に播種し、3~4日ごとに培地交換を行い、10日間培養することにより1次NS/PCsを得た。同様にして、1次NS/PCsを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、3~4日ごとに培地交換を行い、7~10日間培養することにより2次、3次、4次、5次NS/PCsを得た。
yCD-UPRT発現レンチウイルスベクターの作製
yCD(yest cytosine deaminase)-UPRT(uracil phosphoribosyl transferase)のcDNAは、pSELECT-zeo-Fcy::furプラスミド(InvivoGen社製)よりPCR法によりpENTR/D-TOPO(Thermo Fisher Scientific社製)にサブクローニングし、塩基配列を確認したものを使用した。yCD-UPRT cDNAをレンチウイルスベクタープラスミドCSIV-EF-RfA-IRES2-hKO1にサブクローニングし、CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1を得た。CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1は、EF-1αプロモーター下でyCD-UPRTとhKO1(Humanized Kusabira-Orange蛍光タンパク質遺伝子)が発現するレンチウイルスベクターの作製に使用した。レンチウイルスベクターは既知の方法により作製した(Miyoshi H, Blomer U, Takahashi M, Gage FH, Verma IM. Development of a self-inactivating lentivirus vector. J Virol. 1998 Oct;72(10):8150-7.; Kurita R, Suda N, Sudo K, Miharada K, Hiroyama T, Miyoshi H, Tani K, Nakamura Y. Establishment of immortalized human erythroid progenitor cell lines able to produce enucleated red blood cells. PLoS One. 2013;8(3):e59890.; Hashizume O, Ohnishi S, Mito T, Shimizu A, Ishikawa K, Nakada K, Soda M, Mano H, Togayachi S, Miyoshi H, Okita K, Hayashi J. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 2015 May 22;5:10434.)
ヒトiPS細胞から分化誘導した2次~4次NS/PCsを遠心で回収し、TrypLE Selectを用いて単一細胞へ分散後、NS培地に懸濁し、1×105細胞/mlの濃度で低接着フラスコに播種し、CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1レンチウイルスベクターをMOI(multiplicity of infection) 1~2で感染させ、3~4日ごとに培地交換を行い、7日間培養した。得られたNS/PCsに対して同様に再度CSIV-EF-yCD-UPRT-IRES2-hKO1レンチウイルスベクターをMOI 1~2で感染させ、yCD-UPRT発現NS/PCs治療用幹細胞(TSC(1))を作製した。yCD-UPRT発現NS/PCsは、培地に5-FC(Fluorocytosine) 1μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。
GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRT遺伝子を導入したiPS細胞の作製
CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いてGAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込むため、GAPDHとyCD-UPRTとBsd(blasticidin耐性遺伝子)が2A peptide配列で繋がった形で挿入されるような相同組み換え用コンストラクト(HR-GAPDH-2A-yCD-UPRT-2A-Bsd)と、GAPDHの終止コドン近辺をターゲットとするgRNAおよびCas9発現ベクターコンストラクト(U6-GAPDH-gRNA4-Cas9)を作製した。これらのコンストラクトをヒトiPS細胞株(1210B2)にエレクトロポレーションで導入し、ブラストサイジンS存在下で培養し、クローニングを行った。相同組み換えiPS細胞株の確認は、各クローンのgenomic PCRおよびgenomic sequencingによる塩基配列確認により行った。
GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRTを組み込んだiPS細胞から、NS/PCsへ分化誘導を行い、2次~5次NS/PCsを得た(TSC(2))。培地には常時ブラストサイジンS 2μg/mlを添加し培養を行った。yCD-UPRT発現NS/PCsは、培地に5-FC 1μg/mlを添加することにより細胞死が誘導されることを確認した。
ヒトグリオーマ細胞株U87にffLuc(Venus蛍光タンパク質とLuc2ホタルルシフェラーゼの融合遺伝子)発現レンチウイルスベクター(CSII-EF-ffLuc)(Takahashi Y, Tsuji O, Kumagai G, Hara CM, Okano HJ, Miyawaki A, Toyama Y, Okano H, Nakamura M. Comparative study of methods for administering neural stem/progenitor cells to treat spinal cord injury in mice. Cell Transplant. 2011;20(5):727-39.)を感染させ、セルソーターによるクローンソートを行い、ffLucが安定に高発現するU87細胞株を得た。
yCD-UPRT発現・治療用幹細胞TSC(1)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法(混合移植モデル)
U87-ffLuc 1×105個/2μlとyCD-UPRT発現TSC(1) (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入) 5×105個/2μlを混合し、全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した。その翌日から21日間、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群1: TSC(+)/5-FC(+) 5mg/day, n=9)。もう一群として、5-FC (10mg/ml)を100μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群2: TSC(+)/5-FC 1mg/day, n=9)。コントロール群は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(+)/5-FC(-), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(-)/5-FC(+) 5mg/day, n=3)。同一個体の腫瘍の継時的変化はIVIS in vivo imaging systemで1週間ごとに観察した。IVIS撮影時は、イソフルラン吸入麻酔下にVivoGloTM Luciferin 30mg/ml を200μl腹腔内投与し、ピークに達する10分で撮影を行った。
全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にU87-ffLuc 1×104個/2μlを移植し、5日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入)を1×106個/2μl移植した。その2日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の生着を確認した後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(TSC(+)/5-FC (+) 5mg/day, n=9)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(+)/5-FC(-), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(-)/5-FC(+) 5mg/day, n=3)。
腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記混合移植モデルの治療効果の検討と同様に行った。
U87-ffLucを、1×105個、全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した(day0)。Day 7にyCD-UPRT発現TSC (NS/PCsにyCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入)を、同部位に定位的に移植した。その翌日(Day 8)に非灌流下で、断頭し、ビブラトームを用いて200μm厚の脳切片を作製し、sterile porous (0.4 μm) insert membranes (Merck Millipore)上でスライス培養を開始した。ガラスボトムには、1800μlのNS(neurosphere)培地(D-MEM/Ham's F-12培地(HEPES含有)(和光純薬工業社製)に20 ng/ml 組換えヒト上皮成長因子(PeproTech社製), 20 ng/ml 組換えヒト線維芽細胞増殖因子-2 (PeproTech社製), 103 units/ml組換えヒト白血病阻止因子(ナカライテスク社製), 2% B-27 supplement (Thermo Fisher Scientific社製), 1単位/ml ヘパリンナトリウム(エイワイファーマ社製)を添加)で満たした。腫瘍はVenusにより緑に、TSCはhKO1により赤で標識されており、同日より共焦点顕微鏡によりタイムラプスで5日間撮影を行った。治療ディッシュには、上記培地に200μlの10mg/mlの5-FCを投与した。コントロールディッシュ1には、培地に200μlの1M PBSを投与した。コントロールディッシュ2として、テモゾロミド 250μMを投与した。2日に1度培地交換を行い、5-FC, PBS, テモゾロミドを同様に投与した。
全身麻酔したT細胞欠損マウス (Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にU87-ffLuc 1×104個/2μlを移植し、5日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (iPS細胞にyCD-UPRTをCRISPR/Cas9で導入)を1×106個/2μl移植した。その2日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の生着を確認した後、さらに2日後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(TSC(+)/5-FC (+), n=8)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC/5-FC (-),n=7)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(-)/5-FC (+),n=3)。
腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記と同様に行った。
Tet誘導 yCD-UPRT発現レンチウイルスベクターの作製
yCD-UPRT cDNAをレンチウイルスベクタープラスミドCSIV-RfA-TRE-EF-KTにサブクローニングし、CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTを得た。CSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTは、EF-1αプロモーター下でhKO1とrtTA(reverse Tet-controlled transactivator)が発現し、テトラサイクリン(Tet)誘導型プロモーター下でyCD-UPRT が発現するレンチウイルスベクターの作製に使用した。レンチウイルスベクターは既知の方法により作製した。
ヒトiPS細胞にCSIV-yCD-UPRT-TRE-EF-KTレンチウイルスベクターをMOI約15で感染させ、培養後、セルソーターによるクローンソートを行い、hKO1が安定に高発現するiPS細胞株を得た。Tet誘導yCD-UPRT発現iPS細胞は、培地にドキシサイクリン(Dox)1μg/ml、5-FC 1μg/mlの添加で細胞死が誘導されることを確認した。
Tet誘導yCD-UPRT発現iPS細胞からNS/PCsへの分化誘導を行い、2次、3次Tet誘導yCD-UPRT発現NS/PCsを得た。これらTet誘導yCD-UPRT発現NS/PCsも、培地にDox 1μg/ml、5-FC 1μg/mlの添加で細胞死が誘導されることを確認した。
U87-ffLuc 1×105個/2μlとTSC(3)(iPS細胞にTet誘導 yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで導入) 5×105個/2μlを混合し、全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)に定位的に移植した。その翌日から5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(治療群1: TSC(+)/5-FC(+)/Dox(+) , n=7)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(+)/5-FC(+)/Dox (-), n=9)。また、U87-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(-)/5-FC(+)/Dox(+), n=4)。Doxは200mg/kg含有の餌により経口摂取させた。腫瘍評価方法や生存曲線解析などはすべて上記と同様に行った。
(1)yCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法(混合移植モデル)
<概要>
治療幹細胞と腫瘍細胞を混合移植する場合(混合移植モデル)の自殺遺伝子細胞療法の概要を図1に示す。導入する自殺遺伝子は、酵母シトシンデアミナーゼ(yCD)とプロドラックである5-フルオロシトシン(5-FC)の組み合わせを用いた。CDは5-FCを 5-フルオロウラシル(5-FU)に変換することにより、DNAおよびRNA合成を抑制し、細胞死へ誘導するが、さらにyCDとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ(UPRT)遺伝子を組み合わせることにより、UPRTが5-FU をチミジル酸シンターゼ阻害剤の5-FUMP へ変換するため、yCD 単独と比べ100倍以上の強いバイスタンダー効果が得られる。局所のバイスタンダー効果は細胞周期依存性であり、腫瘍細胞のみを選択的に殺傷するため、高い治療指数(therapeutic index)が期待される。
両治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は著明に縮小傾向を示した(図2)。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は有意に低く、特に2週目以降で顕著であった(図3)(TSC(+)/5FC(+) 5mg/day vs TSC(+)/5FC(-), 2週目, P=0.0046, t-test)。
グリオーマ細胞(U87)は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群1の腫瘍体積は0.76±0.84mm3で、治療群2の腫瘍体積は2.15±1.86mm3で、両者ともコントロール群1の51.59±7.62mm3と比較して、有意に小さかった(図4及び図5)(TSC(+)/5FC(+) 5mg/day vs TSC(+)/5FC(-), P=0.00033, t-test)。また、治療群1の腫瘍体積は、治療群2よりもさらに小さい傾向にあった。さらに、治療群1では3匹中1匹は、3週目時点で腫瘍は確認されず、腫瘍の完全消失を予想される結果となった。
両治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた(図7)。平均生存期間は治療群1で42日、治療群2で34日、コントロール群1で25日、コントロール群2で21日であった(TSC(+)/5FC(+) 5mg/day vs TSC(+)/5FC(-), logrank, p=0.001)。また、治療群1は治療群2よりもさらに有意に生存期間は延長した。
<概要>
腫瘍形成後に治療幹細胞を移植する場合(腫瘍形成後移植モデル)の自殺遺伝子細胞療法の概要を図8に示す。混合移植モデルの場合と同様に、induced Pluripotent Stem (iPS細胞)をNS/PCs に分化誘導後、yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで遺伝子導入し、自殺遺伝子yCD-UPRTを発現する治療用幹細胞(Therapeutic stem cell: TSC)を樹立した。
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した(図9)。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は有意に低く、特に2週目以降で顕著であった(図10)(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), P=0.032 t-test)。
グリオーマ細胞(U87)は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積は0.82±1.23mm3で、コントロール群1の43.73±24.0mm3と比較して、有意に小さかった(図11及び12)(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), P=0.036, t-test)。
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた(図14)。平均生存期間は治療群で36日、コントロール群1で20日、コントロール群2で21日であった(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), logrank, p=0.0013)。
ffLuc-U87を1×105個、T細胞欠損マウス (右線条体)に定位的に移植した(day0)。Day 7にTSC(iPS細胞をNC/PCsに分化誘導後、yCD-UPRTをレンチウイルスベクターで遺伝子導入して作製したTSC)を、同部位に定位的に移植した。その翌日に非灌流下で、断頭しビブラトームを用いて200μm厚の脳切片を作成し、sterile porous (0.4 μm) insert membranes上でスライス培養を開始した。腫瘍はVenusにより緑に、TSCはhKO1により赤で標識されており、同日より共焦点顕微鏡で5日間撮影を行った。治療群として、培地に200μlの10mg/mlの5-FCを投与した。コントロール群1として、培地に200μlの1M PBSを、コントロール群2として、テモゾロミド 250μMを投与した。治療群では、移植したTSCは腫瘍内に遊走拡散し、その後5-FCに良好に反応死滅し、その後周囲腫瘍が死滅していく様子を観察することができた(図15、図16、図17)。コントロール群1では、TSCは生存を続け、腫瘍の内部にまで遊走侵入する様子を確認できた(図15、図16、図17)。コントロール群2として、テモゾロミドでは一時的な腫瘍増大に抑制効果はあったが、縮小効果は認めなかった(図15)。
<概要>
ゲノム編集による自殺遺伝子を組込んだiPS細胞を利用した自殺遺伝子細胞療法の概要を図18に示す。治療用神経幹細胞の安定供給のためには、ヒトiPS細胞にyCD-UPRT遺伝子を導入することが望ましい。レンチウイルスベクターによる遺伝子導入では、染色体にランダムに挿入されるため、挿入部位の遺伝子変異や周辺遺伝子の活性化、位置効果によるyCD-UPRTの不活性化が懸念される。この問題解決のため、CRISPR/Cas9ゲノム編集技術を用いて、GAPDH遺伝子領域にyCD-UPRTを挿入したiPS細胞を作製した。このiPS細胞からNS/PCsを誘導し、yCD-UPRTを発現する治療用幹細胞(Therapeutic stem cell: TSC)を得た。
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した(図19)。発光イメージングのROI値を計測すると、治療群は低い傾向にあり、特に2週目以降で顕著であった(図20)(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), P=0.067, t-test)。
グリオーマ細胞(U87)は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積は6.02±7.08mm3で、コントロール群の74.12±31.6mm3と比較して、有意に小さかった(図21及び図22)(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), P=0.022, t-test)。また治療群では、腫瘍が完全消失した個体も認めた(5-FC投与前 day7の時点で、IVISで腫瘍生着を確認済)。
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた(図23)。平均生存期間は、治療群で35日(うち一匹は解析のため打ち切り)、コントロール群1で20日、コントロール群2で21日であった(TSC(+)/5FC(+) vs TSC(+)/5FC(-), logrank, p=0.0042)。治療群では、腫瘍が完全に消失し、生存を続けた例も認めた。
<概要>
Tet誘導yCD-UPRT発現治療用幹細胞TSCを用いた悪性脳腫瘍に対する自殺遺伝子細胞療法の概要を図24に示す。NS/PCsではなく、iPS細胞の段階でレンチウイルスベクターによってyCD-UPRT遺伝子を導入するために、テトラサイクリンで誘導可能なyCD-UPRTをレンチウイルスベクターによってiPS細胞に導入し、ドキシサイクリン(Dox)を添加したときのみ遺伝子発現するようにした。その結果、Dox非添加状態では、iPS細胞は問題なくEBを経てNS/PCsに誘導可能であり、その後、Doxを添加しyCD-UPRTを発現させることで、5-FCに反応良好なNS/PCsを得た。
治療群では両コントロール群と比較して、腫瘍は縮小傾向を示した(図25)。グリオーマ細胞(U87)は蛍光タンパクVenusが遺伝子導入されているため、蛍光顕微鏡を用いて腫瘍体積を定量的に解析した。治療群の腫瘍体積はコントロール群と比較して、縮小傾向にあった(図26)。
治療群では両コントロール群と比較して、有意な生存期間の延長が認められた(図27)。平均生存期間は治療群で25.5日、コントロール群1で20日、コントロール群2で19日であった(TSC(+)/5-FC(+)/Dox(+) vs TSC(+)/5-FC(+)/Dox(-), logrank, p=0.004)。
<CRISPR/Cas9によるyCD-UPRT発現・治療幹細胞(TSC)を用いた悪性脳腫瘍幹細胞 (hG008)に対する自殺遺伝子細胞療法(腫瘍形成後移植モデル)>
全身麻酔したT細胞欠損マウス(Female BALB/c nude mouse, 20g, 6w)の右線条体(大泉門より右方2mm、脳表より深さ3mm)にヒトグリオーマ幹細胞株hG008-ffLuc 5×105個/2μlを移植し、45日後に同部位に定位的にyCD-UPRT発現TSC (iPS細胞にyCD-UPRTをCRISPR/Cas9で導入)を1×106個/2μl移植した。その7日後、IVIS in vivo imaging systemで腫瘍の信号を確認した後、治療群は、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(TSC(+)/5-FC (+) 5mg/day, n=8)。コントロール群1は、1M PBS 500μlを2週間同様に投与した(コントロール群1: TSC(+)/5-FC(-), n=7)。また、hG008-ffLucのみを移植した群も別のコントロール群として作製し、こちらは、5-FC (10mg/ml)を500μl 1回/日 2週間腹腔内投与した(コントロール群2: TSC(-)/5-FC(+) 5mg/day, n=3)。
IVIS in vivo imagingでは、治療群はコントロール2群と比較して5-FC投与後著明に信号は縮小した(図29)。IVISの信号のROIは治療群は有意に低く、5-FC投与後7Wの時点では、p=0.0019と有意にコントロール群1と有意差を認めた(図30)。
hG008はVenus蛍光タンパク質で蛍光標識し可視化している。びまん性に浸潤する腫瘍モデルであるため、体積の計測は困難であるが、明らかに治療群はコントロール群1と比較して腫瘍は減少している(図31)。また対側に浸潤する腫瘍が治療群はほとんど認めない(図31)。
生存曲線は、治療群は有意に延長し、log-rank検定でコントロール群1とp=0.0026と有意差を認めた(図32)。
Claims (11)
- シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグとともに使用される脳腫瘍治療用細胞製剤であって、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する多能性幹細胞由来の神経幹細胞を含むこと、及び多能性幹細胞由来の神経幹細胞が、(1)多能性幹細胞にシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子をゲノム編集により多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域に導入する工程を行い、次に(2)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程を行うことにより得られる神経幹細胞であることを特徴とする脳腫瘍治療用細胞製剤。
- シトシンデアミナーゼによって5-フルオロウラシルに変換されるプロドラッグが、5-フルオロシトシンであることを特徴とする請求項1に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
- ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項1又は請求項2に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
- シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする請求項1に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
- 遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする請求項4に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
- 多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする請求項1乃至5のいずれか一項に記載の脳腫瘍治療用細胞製剤。
- 以下の工程(A1)を行い次に工程(A2)を行う方法であることを特徴とするシトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を有する神経幹細胞の作製方法、
(A1)シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、ゲノム編集により多能性幹細胞のハウスキーピング遺伝子の領域に挿入する工程、
(A2)多能性幹細胞を神経幹細胞へ分化させる工程。 - ハウスキーピング遺伝子が、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項7に記載の神経幹細胞の作製方法。
- 工程(A1)において、シトシンデアミナーゼ遺伝子及びウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を、発現を人為的に調節できる遺伝子構造物とすることを特徴とする請求項7又は請求項8に記載の神経幹細胞の作製方法。
- 遺伝子構造物が、ドキシサイクリンの添加によって発現する遺伝子構造物であることを特徴とする請求項9に記載の神経幹細胞の作製方法。
- 多能性幹細胞が、iPS細胞であることを特徴とする請求項7乃至10のいずれか一項に記載の神経幹細胞の作製方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022083217A JP2022103424A (ja) | 2017-11-20 | 2022-05-20 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017223202 | 2017-11-20 | ||
JP2017223202 | 2017-11-20 | ||
PCT/JP2018/042629 WO2019098361A1 (ja) | 2017-11-20 | 2018-11-19 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022083217A Division JP2022103424A (ja) | 2017-11-20 | 2022-05-20 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2019098361A1 JPWO2019098361A1 (ja) | 2020-11-19 |
JP7150233B2 true JP7150233B2 (ja) | 2022-10-11 |
Family
ID=66539796
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019554440A Active JP7150233B2 (ja) | 2017-11-20 | 2018-11-19 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
JP2022083217A Pending JP2022103424A (ja) | 2017-11-20 | 2022-05-20 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022083217A Pending JP2022103424A (ja) | 2017-11-20 | 2022-05-20 | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210369785A1 (ja) |
EP (1) | EP3714894B1 (ja) |
JP (2) | JP7150233B2 (ja) |
CN (1) | CN111356463A (ja) |
WO (1) | WO2019098361A1 (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2020101570A1 (en) * | 2018-11-14 | 2020-05-22 | Advanced Cell Therapeutics Pte Ltd | Stem cell infusion |
CN115379845A (zh) * | 2020-03-31 | 2022-11-22 | 学校法人庆应义塾 | 使用了基因组编辑多能干细胞的治疗药 |
CN112553286A (zh) * | 2020-11-05 | 2021-03-26 | 北京大学深圳医院 | 自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017079673A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Genomic engineering of pluripotent cells |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2006345726A (ja) | 2005-06-14 | 2006-12-28 | Hamamatsu Univ School Of Medicine | 脳腫瘍治療用発現ベクター |
CN103484462B (zh) * | 2013-09-02 | 2016-04-27 | 广东药学院 | Survivin启动子调控CD基因的重组腺病毒载体构建及其应用 |
JP6684163B2 (ja) | 2016-06-17 | 2020-04-22 | 日本サーモスタット株式会社 | サーモアクチュエータのケーシング構造 |
WO2018207808A1 (ja) * | 2017-05-09 | 2018-11-15 | 学校法人 慶應義塾 | 脳腫瘍治療用細胞製剤 |
-
2018
- 2018-11-19 JP JP2019554440A patent/JP7150233B2/ja active Active
- 2018-11-19 US US16/765,257 patent/US20210369785A1/en active Pending
- 2018-11-19 CN CN201880074333.5A patent/CN111356463A/zh active Pending
- 2018-11-19 EP EP18878961.4A patent/EP3714894B1/en active Active
- 2018-11-19 WO PCT/JP2018/042629 patent/WO2019098361A1/ja unknown
-
2022
- 2022-05-20 JP JP2022083217A patent/JP2022103424A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2017079673A1 (en) | 2015-11-04 | 2017-05-11 | Fate Therapeutics, Inc. | Genomic engineering of pluripotent cells |
Non-Patent Citations (9)
Title |
---|
ABOODY, K.S. et al.,Neural stem cells display extensive tropism for pathology in adult brain: Evidence from intracranial,Proc Natl Acad Sci U S A,2000年,Vol.97, No.23,p.12846-51 |
ALTANER, C.,Prodrug Gene Therapy for Cancer Medicated by Mesenchymal Stem/Stromal Cells Engineered to Express Ye,J Stem Cell Res Ther,2015年,Vol.5, No.2,Article No.1000264 |
KALIMUTHU, S. et al.,Tet-On regulating HSV-sr39tk suicide gene expressing mesenchymal stem cells with dual reporter syste,J Nucl Med,2016年,Vol.57, suppl.2,Abstract No.1397 |
KAO, T. et al.,GAPTrap: A Simple Expression System for Pluripotent Stem Cells and Their Derivatives,Stem Cell Reports,2016年,Vol.7, No.3,p.518-26 |
KIM, J.H. et al.,Therapeutic effect of genetically modified human neural stem cells encoding cytosine deaminase on ex,Biochem Biophys Res Commun,2012年,Vol.417, No.1,p.534-40 |
LEE, E.X. et al.,Glioma Gene Therapy Using Induced Pluripotent Stem Cell Derived Neural Stem Cells,Mol Pharm,2011年,Vol.8,No.1515-24 |
MECA-CORTES, O. et al.,CRISPR/Cas9-Mediated Knockin Application in Cell Therapy: A Non-viral Procedure for Bystander Treatm,Mol Ther Nucleic Acids,2017年09月,Vol.8,p.395-403 |
WANG, C. et al.,Neural stem cell-based dual suicide gene delivery for metastatic brain tumors,第21回Cell Death学会学術集会プログラム抄録集,2012年,p.57 |
ZENG, Z.J. et al.,The cell death and DNA damages caused by the Tet-On regulating HSV-tk/GCV suicide gene system in MCF,Biomed Pharmacother,2014年,Vol.68,p.887-92 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3714894A4 (en) | 2021-07-14 |
CN111356463A (zh) | 2020-06-30 |
JP2022103424A (ja) | 2022-07-07 |
EP3714894A1 (en) | 2020-09-30 |
US20210369785A1 (en) | 2021-12-02 |
EP3714894B1 (en) | 2023-11-01 |
JPWO2019098361A1 (ja) | 2020-11-19 |
WO2019098361A1 (ja) | 2019-05-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2022103424A (ja) | 多能性幹細胞を用いた自殺遺伝子脳腫瘍治療薬 | |
TWI838348B (zh) | 具有記憶功能之t細胞或b細胞之增強劑、惡性腫瘤復發抑制劑、及對t細胞或b細胞誘導記憶功能之誘導劑 | |
JP6725699B2 (ja) | Trailとcdを発現している間葉系幹細胞およびその使用 | |
JP2016513974A (ja) | 造血幹細胞系列を初期化するための組成物および方法 | |
JP2018512047A (ja) | 汎用キラーt細胞 | |
US20220204924A1 (en) | Engineered endothelial cells expressing an ets transcription factor | |
JP7051060B2 (ja) | 脳腫瘍治療用細胞製剤 | |
US10947503B2 (en) | Method for modifying T cell population | |
Kobayashi et al. | A reversibly immortalized human hepatocyte cell line as a source of hepatocyte‐based biological support | |
JP2023504075A (ja) | Car-nk細胞を得る方法 | |
WO2007008309A2 (en) | Stem and progenitor cell expansion by evi, evi-like genes and setbp1 | |
WO2019027298A9 (ko) | Trail 및 cd를 발현하는 중간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방또는 치료용 약학 조성물 | |
JP6855579B2 (ja) | T細胞を得る方法及び使用 | |
CN113840914A (zh) | 诱导细胞融合的痘苗病毒及其应用 | |
US20230257713A1 (en) | Immunotherapy method of targeted chemokine and cytokine delivery by mesenchymal stem cell | |
US20230270855A1 (en) | Genetically Modified T-Cells and PI3K/AKT Inhibitors For Cancer Treatment | |
Karolak | Fas and Fas Ligand in the Development of the Hematopoietic System: A Grant Proposal | |
Marrow | STEM CELL BIOLOGY/PLASTICITY |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD01 | Notification of change of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7426 Effective date: 20200616 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20200616 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20210928 |
|
A871 | Explanation of circumstances concerning accelerated examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A871 Effective date: 20210928 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211019 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211210 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20211210 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220222 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220520 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220520 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20220520 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20220610 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20220614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220628 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220715 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220809 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220830 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7150233 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |