CN112553286A - 自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法。该评价方法包括以下步骤：S1、将自杀基因转染到靶细胞，得到自杀基因细胞系；S2、使用前体药物处理自杀基因细胞系，测试得到以下三个参数：前体药物的有效剂量、杀伤时间和旁观者效应；S3、根据三个参数评估自杀基因/前药系统的疗效。根据本发明实施例的评价方法，至少具有如下有益效果：前体药物的有效剂量、杀伤时间和旁观者效应分别从不同的角度来对自杀基因/前药系统的疗效进行评价，根据这三种参数的综合完成对自杀基因/前药系统的评估，方便后续对药物的筛选和使用。

Description

自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法
技术领域
本发明涉及癌症治疗领域，尤其是涉及自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法。
背景技术
自杀基因/前药系统是近年来分子生物学领域的研究热点之一，最初应用于恶性肿瘤的治疗，目前应用较多且研究较为成熟的有单纯疱疹病毒胸腺激酶基因/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV) 系统、大肠杆菌和酵母胞嘧啶脱氨酶基因/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)系统等。其作用原理在于，本身无细胞毒性或毒性交底的前体药物能够选择性地作用域被自杀基因转染的靶细胞上，在目的基因表达产物的作用下，前体药物转化为细胞毒性物质，从而实现对靶细胞的特异性杀伤。采用这种方式杀伤异常增殖的细胞具有选择性强、特异性高等优点。但自杀基因/前药系统对于特定的疾病的治疗效果目前还缺乏相应的评价标准。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种自杀基因/ 前药系统疗效的评价方法。
本发明还提出一种药物筛选方法。
本发明的第一方面，提供自杀基因/前药系统疗效的评价方法，该评价方法包括以下步骤：
S1、将自杀基因转染到靶细胞，得到自杀基因细胞系；
S2、使用前体药物处理自杀基因细胞系，测试得到以下三个参数：前体药物的有效剂量、杀伤时间和旁观者效应；
S3、根据三个参数评估自杀基因/前药系统的疗效。
根据本发明实施例的评价方法，至少具有如下有益效果：
前体药物的有效剂量、杀伤时间和旁观者效应分别从不同的角度来对自杀基因/前药系统的疗效进行评价，根据这三种参数的综合完成对自杀基因/前药系统的评估，方便后续对药物的筛选和使用。
根据本发明的一些实施例，旁观者效应的测试方法包括如下步骤：
(1)设置具有不同比例自杀基因细胞系与正常细胞系的混合体系；
(2)在混合体系中施加前体药物，根据不同比例的混合体系的细胞存活率，得到细胞存活率-细胞比例的曲线；
(3)根据曲线确定旁观者效应。
在混合体系中根据不同比例设置自杀基因细胞系和未经自杀基因转染的正常细胞系，通过这种比例的梯度，根据施用前体药物后混合体系中细胞的细胞存活率曲线来评价旁观者效应。通过这种方式，避免因不同的自杀基因在旁观者效应原理不同的基础上导致实际的评价方法发生改变而引起的评价标准不统一。
根据本发明的一些实施例，细胞比例为自杀基因细胞占混合体系的比例，步骤(3)中根据曲线确定所述旁观者效应的方法是：计算曲线与y＝1-x的相交部分的面积，根据面积确定旁观者效应。通过曲线与y＝1-x的相交部分的面积来定量计算自杀基因的旁观者效应，从而使得评价的结果更为准确。
根据本发明的一些实施例，步骤(2)中前体药物的施加剂量为前体药物的有效剂量。采用前体药物的有效剂量来检测不同细胞比例下的细胞存活率的变化，从而使结果能够更准确地描述系统的旁观者效应。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，自杀基因细胞系是将自杀基因稳定转染靶细胞得到。稳定转染具体包括：在确定待评价的癌症的基础上(1)对靶细胞细胞系的选择；(2)对自杀基因及其敲入位点的选择；(3)敲入方法的选择等；通过上述不同类型的筛选，使自杀基因安全敲入靶细胞并实现高效表达。
根据本发明的一些实施例，敲入位点选择ROSA26，该位点极易进行基因插入操作，而且插入该位点的蛋白可以很好的进行表达，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，自杀基因通过CRISPR-Cas9系统转染到靶细胞。为了让靶细胞能稳定表达自杀基因，利用CRISPR-Cas9系统使得自杀基因更为稳定地敲入靶细胞的基因组。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，sgRNA的靶序列为ROSA26位点上如SEQ IDNo.3 所示的核苷酸序列： CCGATTAGTTTATCTTCCCACGGACTAGAGTTGGTGTCGAGGTTATTGTAATAAGGG。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，自杀基因的核酸序列的N端连接有荧光蛋白核酸序列。在自杀基因上融合荧光蛋白核酸序列，转染后表达对应的荧光蛋白，从而方便检测，促进稳转细胞系的选择。
根据本发明的一些实施例，步骤S1中，转染过程中使用的转染试剂根据转染效率和细胞毒性进行筛选。不同转染试剂会使得靶细胞中自杀基因的表达发生较大变化，因而预先通过转染效率和对具体靶细胞的细胞毒性来评估转染效果。
根据本发明的一些实施例，靶细胞为CAL27细胞，转染试剂为FuGENE HD。对于CAL27 细胞而言，FuGENE HD能够实现转染效率和细胞毒性之间较好的平衡，因而是一种很好的转染试剂。
根据本发明的一些实施例，步骤S2中，有效剂量和杀伤时间的测试方法通过细胞存活率进行测量。
根据本发明的一些实施例，细胞存活率的测量方法为MTT比色法。
本发明的第二方面，提供药物筛选方法，该药物筛选方法采用上述的评价方法对药物疗效进行筛选。
根据本发明实施例的药物筛选方法，至少具有如下有益效果：
通过上述方法可以对前体药物的疗效实现较为全面准确的评价，从而更方便地筛选出合适的药物。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例的ROSA26位点和对应的sgRNA的设计结果。
图2为本发明实施例的CD/5-FC和TK/GCV系统的整合过程的示意图。
图3为本发明实施例的转染试剂的筛选结果。
图4为本发明实施例的自杀基因细胞系的检测结果。
图5为本发明实施例的有效剂量的检测结果。
图6为本发明实施例的杀伤时间的检测结果。
图7为本发明实施例的旁观者效应的检测结果。
图8为本发明实施例的评价方法的示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在本发明的描述中，若干的含义是一个以上，多个的含义是两个以上，大于、小于、超过等理解为不包括本数，以上、以下、以内等理解为包括本数。如果有描述到第一、第二只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。
本发明的描述中，除非另有明确的限定，设置、安装、连接等词语应做广义理解，所属技术领域技术人员可以结合技术方案的具体内容合理确定上述词语在本发明中的具体含义。
本发明的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
本发明的描述中，参考术语“有效剂量”是指自杀基因/前体药物系统杀伤特定比例的肿瘤细胞所需的给药浓度。其中，特定比例可以是指包括25％、50％、75％、100％在内的任意指定比例的肿瘤细胞。肿瘤细胞可以是所有肿瘤细胞，在其中一些情况下，也可以是对自杀基因/前体药物系统不具耐药性的非耐药肿瘤细胞。
本发明的描述中，参考术语“杀伤时间”是指自杀基因/前体药物系统在特定浓度下杀灭特定比例的肿瘤细胞所需的时间。其中，特定浓度可以是任意的给药浓度，特定比例可以是指包括25％、50％、75％、100％在内的任意指定比例的肿瘤细胞。在其中一些情况下，杀伤时间是指在施用对非耐药肿瘤细胞造成100％杀灭的给药浓度下杀灭100％的非耐药肿瘤细胞所需的时间。
本发明的描述中，参考术语“旁观者效应”(Bystander effect)是指在转染了自杀基因的肿瘤细胞死亡以后，还会引起周围未转染的细胞也死亡。它是自杀基因/前药系统的一个显著特点。旁观者效应显著地扩大了自杀基因/前体药物体系杀伤肿瘤细胞的能力。旁观者效应的机理较为复杂，不同自杀基因的旁观者效应的机理也有不同，部分研究表明TK基因的旁观者效应可能主要通过缝隙连接传递，而CD基因的旁观者效应则主要通过介质传递。
本发明的描述中，参考术语“正常细胞系”是指未转染对应自杀基因的靶细胞。在一些情况下，正常细胞系也可以转入一些方便检测的荧光蛋白基因。
实施例1
自杀基因表达盒
本实施例中，选择人类ROSA26位点来稳定地将自杀基因整合到癌细胞。ROSA26是由三个外显子构成的非编码基因，该区域极易进行基因插入操作，同时容易进行同源重组，而且尚未发现功能性表达蛋白，插入该区域的蛋白可以很好的进行表达，不会影响其他内源性基因的表达和功能发挥，因而用作基因打靶的安全位点。
参考图1，敲入时，选择ROSA26位点的exon1和exon2之间的1000bp的基因组DNA，将该序列克隆出来进行同源性定向重组。该同源DNA序列分为左臂和右臂，长度分别为442 和501bp。左臂和右臂作为克隆供体，在左臂和右臂之间设有一个57bp长的sgRNA的靶序列(CCGATTAGTTTATCTTCCCACGGACTAGAGTTGGTGTCGAGGTTATTGTAATAAGGG， SEQ ID No.3)，针对该靶序列设计sgRNA1和sgRNA4，sgRNA的序列如图1中的B所示，箭头表示sgRNA的方向。sgRNA1(TGTCGAGGTTATTGTAATAA，SEQ ID No.1)，sgRNA4 (GGCACCCTTCTATTTGATTA，SEQ ID No.2)。
参考图2，选择CD/5-FC和TK/GCV作为本实施例的自杀基因/前药系统。CD来自酵母， TK来自单纯疱疹病毒。为了促进下游稳转细胞系的筛选，将荧光蛋白Venus的核酸序列融合到自杀基因的N端。自杀基因表达盒包含SV40启动子、嵌合体内含子序列、Venus核酸序列、自杀基因核酸序列以及SV40 ployA信号序列。在CRISPR-Cas9系统和sgRNA的作用下，ROSA26位点产生双链DNA断裂，自杀基因表达盒在引导下进行同源定向重组而整合到ROSA26位点。
实施例2
转染试剂的筛选
本实施例中，选择CAL27细胞(头颈部鳞状细胞癌的细胞模型)作为靶细胞。在研究中发现，该细胞系中很难达到令人满意的转染效率。因此，对多种转染试剂测试从而筛选出更合适的转染试剂。
筛选方法是在相同条件下分别利用不同的转染试剂转染CAL27细胞，对转染细胞的荧光和差分干涉对比度(DIC)图像进行评价。参考图3和表1，图3中的上一列表示荧光检测结果，下一列表示DIC图像。从图3和表1中可以看到，虽然GeneIn和ViaFect有较高的转染效率，但它们同样导致了大量的CAL27细胞死亡。在具有中度转染效率的试剂中，FuGENE HD实现了转染效率和细胞毒性之间的平衡。因此，选择FuGENE HD转染试剂。
表1.不同转染试剂转染效率和细胞毒性评价结果
转染试剂 转染效率 细胞毒性
GeneIn 高 有毒
ViaFect 高 有毒
Lipofectamine 3000 中 有毒
FuGENE HD 中 无毒
Lipofectamine LTX&PLUS 中 有毒
Lipofectamine 2000 低 有毒
实施例3
自杀基因细胞系的转染
利用FuGENE HD转染试剂将实施例1中的自杀基因表达盒通过CRISPR/Cas9系统转染到CAL27细胞中。荧光显微镜下检查筛选阳性克隆，结果如图4的A所示，稳定转染的自杀基因细胞系(CAL27-Venus-CD细胞和CAL27-Venus-TK细胞)的形态与母细胞(未转染的CAL27细胞)和控制组细胞(仅稳定表达荧光蛋白Venus的CAL27-Venus细胞)相似。测序结果表明，CD和TK基因正确插入到ROSA26位点。
对CAL27-Venus-CD细胞和CAL27-Venus-TK细胞分别施加对应的前体药物5-FC和GCV，荧光显微镜观察处理结果分别见图4的B和C，从中可以看到，CAL27-Venus和 CAL27-Venus-CD细胞系经1mM的5-FC处理48h后，CAL27-Venus-CD细胞发生死亡(图4 的B中箭头方向)，而CAL27-Venus细胞没有变化。CAL27-Venus和CAL27-Venus-TK细胞系经80μM的GCV处理48h后，CAL27-Venus-TK细胞发生死亡(图4的C中箭头方向)，而CAL27-Venus细胞没有变化。该结果表明这些自杀基因细胞系对施加的前体药物敏感， CAL27-Venus-TK和CAL27-Venus-CD细胞系适合在体外评价自杀基因/前药系统的治疗。
实施例4
前药有效剂量评价
分别用5-FC或GCV的两倍稀释液处理CAL27-Venus-CD细胞和CAL27-Venus-TK细胞4天，MTT法检测细胞活力。
检测结果如图5所示。从图中可以看到，50μM的5-FC能够杀死84％的细胞。5-FC进一步增加到100μM时，能够杀死87％的细胞，表明大约有13％的细胞不能被5-FC杀死(耐5-FC 治疗)。0.39μM的GCV能够杀死93％的细胞，GCV进一步增加100μM时，能够杀死97％的细胞，表明大约有3％的细胞不能被GCV杀死(耐GCV治疗)。就整体细胞对前药的敏感性而言，GCV(+95％)优于5-FC(+85％)。
实施例5
前药杀伤时间评价
CAL27-Venus-CD细胞使用50μM的5-FC处理，CAL27-Venus-TK细胞使用0.39μM的GCV处理。在这两种浓度下，这两种前药可以杀死所有非耐药细胞，因此作为前药的有效剂量。在对两类细胞进行前药处理后的不同时间段，分别采用MTT法测量细胞存活率。
结果如图6所示，可以看到，两种前药在处理后16小时内均不抑制细胞生长。在处理后 38小时，两种细胞生长逐渐受到抑制。38小时后，CAL27细胞通过前药处理逐渐被消灭。而到了处理后约80小时，几乎所有的药物敏感细胞被杀死。
实施例6
前药旁观者效应评价
将CAL27-Venus-CD细胞与CAL27-Venus细胞混合得到第一混合体系，其中，第一混合体系中CAL27-Venus-CD细胞的比例形成一定的比例梯度，分别为100％、75％、50％、25％和0％。将CAL27-Venus-TK细胞与CAL27-Venus细胞混合得到第二混合体系，其中，第二混合体系中CAL27-Venus-TK细胞的比例形成一定的比例梯度，分别为100％、75％、50％、 25％和0％。然后用50μM的5-FC处理第一混合体系4天，用0.39μM的GCV处理第二混合体系4天。4天后通过MTT测定测量细胞存活率。
结果如图7所示，从图中可以看到，细胞存活率与混合体系中自杀基因细胞的百分比有关。图中的蓝色虚线(y＝1-x)表示理论情况下、不存在旁观者效应时的细胞存活率曲线。如果自杀基因具有旁观者效应，则细胞存活率曲线将低于这条蓝色虚线。当自杀基因细胞系占细胞总数的25％时，CD/5-FC疗法杀死的癌细胞比TK/GCV疗法多，表明在该比例下，CD/5-FC 比TK/GCV疗法具有更好的旁观者效应。当自杀基因细胞系增加到细胞总数的50％时， CD/5-FC疗法杀死的癌细胞数量与TK/GCV疗法相同，表明在该比例下，CD/5-FC和TK/GCV 疗法在此细胞百分比上具有相同的旁观者效应。而当自杀基因细胞系在细胞总数中的比例高于50％时，TK/GCV杀死的癌细胞比CD/5-FC多。
基于不同比例的混合体系，综合考虑CD/5-FC和TK/GCV疗法的旁观者效应，对CAL27-Venus-CD细胞和CAL27-Venus-TK细胞的存活率曲线拟合，计算这两条曲线与y＝1-x的相交部分的面积，将两条曲线对应的相交部分的面积占到y＝1-x/x轴/y轴三条线围成的三角形的面积比作为旁观者效应的定量参数，结果如表2：
表2.旁观者效应评价结果
前药浓度/μM 处理时间/d 面积比％
CD/5-FC 50 4 63.2
TK/GCV 0.39 4 52.3
从上述结果可以看到，在以对应的有效剂量处理4天时，CD/5-FC疗法的疗效要略大于 TK/GCV疗法的疗效。通过对存活率曲线与理论曲线相交面积的数值，我们可以直接定量地评估出不同条件下的旁观者效应，由此可以对比不同条件下旁观者效应的区别。
评价自杀基因/前药系统的疗效的最终指标是杀死癌细胞的比例。杀死癌细胞比例越高，自杀基因的疗效越好。杀死癌细胞比例和以下几个因素相关：癌细胞种类、自杀基因的转染效率、前药浓度、前药处理癌细胞的时间以及自杀基因的旁观者效应。癌细胞种类、自杀基因的转染效率这些变量固定的条件下，癌细胞死亡率主要与前药的有效浓度、杀伤时间以及旁观者效应有影响。有效浓度、杀伤时间和旁观者效应这三种是癌细胞杀死率的独立变量，通过对这三种变量的评估来从多角度对自杀基因/前药系统疗法的疗效。需要开发针对性的疗法时，针对临床开发时的具体的需求来对这些变量进行不同的加权处理。例如，有些药物需要降低浓度，则药物有效浓度更重要；而有些情况则需要在最短时间内快速杀死癌细胞，则杀伤时间更重要；如自杀基因的转染效率不高，则旁观者效应会更加重要。参考图8，本发明对于特定的癌症类型选择具有针对性的细胞系，在拟定自杀基因/前药系统后，优选能够安全高效表达自杀基因的整合位点，将自杀基因敲入得到对应的稳转细胞系。随后通过前药有效浓度、前药杀伤时间和旁观者效应这三种变量来多角度评价自杀基因/前药系统疗法的疗效。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京大学深圳医院
<120> 自杀基因/前药系统疗效的评价方法和药物筛选方法
<130> 1
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgtcgaggtt attgtaataa 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcacccttc tatttgatta 20
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ccgattagtt tatcttccca cggactagag ttggtgtcga ggttattgta ataaggg 57

Claims (10)

1.自杀基因/前药系统疗效的评价方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将自杀基因转染到靶细胞，得到自杀基因细胞系；
S2、使用前体药物处理所述自杀基因细胞系，测试得到以下三个参数：前体药物的有效剂量、杀伤时间和旁观者效应；
S3、根据所述三个参数评估自杀基因/前药系统的疗效。
2.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，所述旁观者效应的测试方法包括如下步骤：
(1)设置具有不同比例所述自杀基因细胞系与正常细胞系的混合体系；
(2)在所述混合体系中施加前体药物，根据不同比例的所述混合体系的细胞存活率，得到细胞存活率-细胞比例的曲线；
(3)根据所述曲线确定所述旁观者效应。
3.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，所述细胞比例为自杀基因细胞系占所述混合体系的比例，步骤(3)中根据所述曲线确定所述旁观者效应的方法是：计算所述曲线与y＝1-x的相交部分的面积，根据所述面积确定所述旁观者效应。
4.根据权利要求2所述的评价方法，其特征在于，步骤(2)中前体药物的施加剂量为所述前体药物的有效剂量。
5.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中，所述自杀基因细胞系是将所述自杀基因稳定转染所述靶细胞得到。
6.根据权利要求1或5所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中，所述自杀基因通过CRISPR-Cas9系统转染到所述靶细胞。
7.根据权利要求1或5所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中，所述自杀基因的核酸序列的N端连接有荧光蛋白核酸序列。
8.根据权利要求1或5所述的评价方法，其特征在于，步骤S1中，转染所用的转染试剂根据转染效率和细胞毒性进行筛选。
9.根据权利要求1所述的评价方法，其特征在于，步骤S2中，所述有效剂量和所述杀伤时间通过细胞存活率进行测量。
10.药物筛选方法，其特征在于，采用权利要求1至9任一项所述的评价方法对药物疗效进行筛选。
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