CN108300737B - 一种表型高度一致的恶性淋巴瘤模型的建立方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于C57BL/6小鼠遗传背景的遗传修饰小鼠和遗传修饰小鼠细胞系，所述遗传修饰是使野生型C57BL/6小鼠的基因组的一种或者多种肿瘤抑制基因(例如p53基因)的表达降低或者不表达，从而获得的遗传修饰小鼠对淋巴瘤易感，能够用作小鼠淋巴瘤模型。本发明也提供了制备所述C57BL/6遗传修饰小鼠的方法。本发明还提供了所述C57BL/6遗传修饰小鼠的用途，用于筛查诱导淋巴瘤的化合物、筛选治疗淋巴瘤的化合物、筛选肿瘤标志物、筛选肿瘤发生的早期驱动物。
Description
技术领域：
本发明涉及利用遗传修饰的小鼠构建恶性淋巴瘤模型的方法和其用途。具体地，本发明通过对C57BL/6小鼠遗传背景进行基因组DNA的遗传修饰，获得了基于C57BL/6小鼠遗传背景的遗传修饰小鼠和遗传修饰小鼠细胞系。进而获得能稳定传代的纯合子和杂合子p53基因敲除小鼠。该小鼠自发或者诱发均能获得外显率高、表型一致的恶性淋巴瘤模型。本发明制备的淋巴瘤模型能够用于筛查诱导淋巴瘤的化合物、用于筛选治疗淋巴瘤的化合物、用于筛选肿瘤标志物、用于筛选肿瘤发生的早期驱动物等。
背景技术
淋巴瘤是原发于淋巴结或淋巴组织的一种常见肿瘤。虽然患有难治性淋巴瘤或者淋巴瘤复发的患者的预后由于对淋巴瘤的深入研究和新疗法的出现导致了患者显著改善的生活质量，但是患者的总体治疗效果仍然不容乐观。建立能够模拟人类淋巴瘤临床特征的的合适动物模型对于促进人们了解淋巴瘤的发病机理以及开发抗淋巴瘤药物和合理治疗淋巴瘤、药物致癌性研究等是至关重要的。
现有技术中已经报道了多种淋巴瘤的动物模型。例如，Calman K.C.报导了将可移植的加德纳淋巴肉瘤细胞悬液注射入CBA小鼠的胃或小肠中，分别在65％或34％的小鼠中建立了加德纳淋巴肉瘤模型(参见Calman K.C.,Why are small bowel tumours rare？Anexperimental model,Gut.1974；15(7):552-554)；Nakamura D报导了将分离自成年T细胞白血病/淋巴瘤(Adult T-cell leukemia/lymphoma(ATL))患者的外周血单个核细胞异种移植入NOJ小鼠产生了ATL小鼠模型(参见Nakamura D等人，A new ATL xenograft modeland evaluation of pyrrolidine dithiocarbamate as a potential ATL therapeuticagent.Exp Hematol.2015；43(11):944-950)。
但是，这些通过异种移植淋巴瘤细胞获得的模型小鼠寿命短，且无法用于淋巴瘤的发病机理研究等，因此，本领域还尝试了通过转入致癌基因或者敲除抑癌基因来构建遗传修饰小鼠，期望获得高发病率的、高表型一致的小鼠淋巴瘤模型。到目前为止，本领域尚未获得具有足够高发病率的、高表型一致的遗传修饰小鼠淋巴瘤模型。
发明概述
本发明提供了具有足够高发病率的、高表型一致的遗传修饰C57BL/6小鼠淋巴瘤模型、其制备方法、以及所述遗传修饰C57BL/6小鼠淋巴瘤模型的医药用途。
本发明的第一方面涉及一种基于C57BL/6小鼠遗传背景制备遗传修饰的C57BL/6小鼠的方法，包括：
(a)提供C57BL/6小鼠胚胎干细胞(其缩写为“ES细胞”)的群体，所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体是雄性XY C57BL/6小鼠ES细胞的群体和/或是雌性XX C57BL/6小鼠ES细胞的群体；
(b)对所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体进行靶向的遗传修饰，使得其基因组在一种或者多种肿瘤抑制基因中包含导致所述肿瘤抑制基因被异常表达的遗传修饰，其中所述异常表达是降低的表达或者不表达，优选地，所述肿瘤抑制基因是p53基因，所述靶向的遗传修饰包括对肿瘤抑制基因的缺失、敲除、插入、点突变或它们的组合；
(c)鉴定包含靶向的遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞克隆；
(d)将步骤(c)获得的C57BL/6小鼠ES细胞克隆导入小鼠宿主囊胚，其中所述小鼠宿主囊胚来自C57BL/6小鼠ES细胞的来源C57BL/6小鼠品系或者来自与所述C57BL/6小鼠品系不同的小鼠品系；和
(e)在代孕鼠中妊娠包含C57BL/6小鼠ES细胞克隆的小鼠宿主囊胚，从而由代孕鼠产生包含靶向遗传修饰的F0后代，且其中靶向的遗传修饰能够通过种系遗传而传递给后代。
在本发明的一个实施方案中，上述步骤(b)中靶向的遗传修饰是通过同源重组事件产生的或者是通过使用在目标基因组位点产生单链或双链断裂的核酸酶试剂产生的，优选地，所述核酸酶试剂是转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、大范围核酸酶或CRISPR/Cas系统。进一步地，在实施上述步骤(b)中靶向的遗传修饰的同时，还向所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体中引入了包含选择标记的异源多核苷酸，以方便鉴定包含靶向的遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞克隆。
在本发明的一个实施方案中，上述基于C57BL/6小鼠遗传背景制备遗传修饰的C57BL/6小鼠的方法还包括：
(f)将步骤(e)中鉴定的雄性F0小鼠与野生型C57BL/6雌性小鼠交配，以产生针对所述靶向遗传修饰是杂合的F1后代，
其中具有靶向遗传修饰的至少10％的F0小鼠将所述遗传修饰传递到F1后代，优选地，具有靶向遗传修饰的至少40％的F0小鼠将所述遗传修饰传递到F1后代，更优选地，具有靶向遗传修饰的至少60％的F0小鼠将所述遗传修饰传递到F1后代，
任选地，获得F1后代的、靶向遗传修饰杂合的后代。
进一步地，在上述步骤(f)后还实施步骤(g)：用F1后代的雌性小鼠与F1后代的雄性小鼠繁育，以获得靶向遗传修饰纯合的F2后代，所述纯合的F2后代能以高发病率自发产生淋巴瘤，能用作自发淋巴瘤的小鼠模型；
任选地，获得F2后代的、靶向遗传修饰纯合的后代。
在本发明的一个实施方案中，对于上述步骤(f)所获得的杂合子后代，还通过施用诱变剂来获得诱发淋巴瘤的小鼠模型。
本发明的第二方面涉及利用上述方法制备的遗传修饰杂合的C57BL/6小鼠的用途，用来筛查诱导淋巴瘤的化合物的方法，包括
(a)将候选化合物施与所述遗传修饰杂合的C57BL/6小鼠；和
(b)检测所述小鼠的淋巴瘤发病率，
当与不施用候选化合物的所述杂合子C57BL/6小鼠相比，淋巴瘤发病率显著提高，则候选化合物是潜在的导致淋巴瘤的化合物，从而应限制其在临床作为药物使用或者限制在食品中的使用。
本发明的第三方面涉及利用上述方法制备的自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型的用途，用于筛选治疗淋巴瘤的化合物，包括
(a)将候选化合物施与所述自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型；和
(b)检测小鼠模型的淋巴瘤发病率的变化，
当与不施用候选化合物的所述自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型相比时，淋巴瘤发病率显著下降，则候选化合物是潜在的治疗淋巴瘤的化合物。
本发明的第四方面涉及利用上述方法制备的遗传修饰杂合的C57BL/6小鼠、和/或自发淋巴瘤小鼠、和/或诱发的淋巴瘤的小鼠的用途，用于筛选肿瘤标志物和/或肿瘤发生的潜在早期驱动物，包括：
(a)将所述小鼠的组织和/或细胞样本与来自野生型C57BL/6小鼠的组织和/或细胞样本比较它们之间核酸和/或蛋白质的差异表达，
(b)将差异表达显著的核酸和/或蛋白质作为肿瘤标志物和/或肿瘤发生的潜在早期驱动物。
本发明的第五方面涉及利用上述方法获得的遗传修饰杂合的C57BL/6小鼠和遗传修饰纯合的C57BL/6小鼠的用途，用于筛选肿瘤发生的早期驱动物，包括
(a)在不同时间获得所述小鼠的组织和/或细胞样本，比较它们之间核酸和/或蛋白质的差异表达，
(b)筛选早期的差异表达显著的核酸和/或蛋白质作为肿瘤发生的早期驱动物。
所述肿瘤标志物和/或肿瘤发生的早期驱动物能够用于淋巴瘤的早期诊断和用于研发抗淋巴瘤的药物。
本发明的第六方面涉及C57BL/6小鼠细胞系，其为ES细胞系或者相同基因型的体细胞系，特征在于该C57BL/6小鼠细胞系的基因组在一种或者多种肿瘤抑制基因中包含导致所述肿瘤抑制基因被异常表达的遗传修饰，其中所述异常表达是降低的表达或者不表达。在一个实施方案中，所述肿瘤抑制基因选自p53、PTEN、KAI1、Casp7、Dec、E-钙粘着蛋白基因、和CD44。所述C57BL/6小鼠细胞系能够用于淋巴瘤或者视网膜变性相关的作用机制研究。
附图描述：
图1:建立和证实p53基因遗传修饰的小鼠模型的图。图1A.C57BL/6背景小鼠的ES细胞图像。图1B.C57BL/6小鼠ES细胞的核型。图1C.p53基因打靶载体中Neo盒的打靶示意图，其中用Neo盒替代了C57BL/6小鼠基因组上野生型p53基因的外显子2-5。图1D.对打靶后的ES细胞克隆进行Southern印迹分析的结果。从打靶后的ES细胞克隆提取基因组DNA，并用于Southern印迹分析。具体而言，用EcoRI消化基因组DNA后，使用探针(探针序列：P53-Probe1-F-SUN:ATCCTGACTCTGCAAGTC，P53-Probe1-R-SUN:TGCAG GTGCATGACAGTGA；P53-Probe2-F-SUN:ATCTGGTCTCCTAAACTGA AG，P53-Probe2-R-SUN:ACGTCCCACC CTCAAGTGGC)杂交至来自p53野生型等位基因的17kb片段(+)和来自p53敲除了外显子2-5的等位基因的7kb片段(-)。图1E.野生型、杂合的和纯合的p53基因遗传修饰小鼠的PCR基因分型分析。p53野生型等位基因的PCR产物预期大小为281bp，p53敲除了外显子2-5的等位基因的PCR产物预期大小为441bp。图1F.野生型、杂合的和纯合的p53基因遗传修饰小鼠的肝、脾、肺、脑和胸腺中p53基因mRNA的相对实时PCR分析。值显示为三次独立实验的平均值±标准差，并归一化为Gapdh(甘油醛3-磷酸脱氢酶)水平。
图2:显示了在p53-/-纯合小鼠中的自发淋巴瘤发生。图2A.野生型、p53-/-和p53+/-小鼠的存活曲线。所有纯合小鼠在32周前死亡，而杂合小鼠中90％和野生型小鼠100％直至32周仍存活。图2B.p53-/-纯合小鼠的自发肿瘤概况和肿瘤频率。其中，恶性淋巴瘤是最突出的类型，发生率为90.5％。图2C.恶性淋巴瘤、腺瘤、横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤的相对频率。图2D.淋巴瘤发病率高的前十种器官。
图3:显示了37.5mg/kg MNU诱导的p53+/-杂合小鼠中的淋巴瘤发生。图3A.施用37.5mg/kg MNU的p53+/-小鼠的存活曲线。图3B.p53+/-和野生型(WT)小鼠施用37.5mg/kgMNU的肿瘤特征和频率。在两种小鼠中均观察到只有淋巴瘤。p53+/-小鼠比野生型小鼠对MNU更敏感。图3C.淋巴瘤、腺瘤、横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤的相对肿瘤频率。图3D.淋巴瘤发病率高的前十种器官。
图4:显示了75mg/kg MNU诱导的p53+/-杂合小鼠中的淋巴瘤发生。图4A.施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠的存活曲线。大多数动物在MNU施用后13-17周之间死亡。图4B.p53+/-小鼠的肿瘤特征和频率。观察到淋巴瘤和腺瘤。值得注意的是，75mg/kg MNU诱导的p53+/-杂合小鼠中，淋巴瘤的发生率为100％。图4C.淋巴瘤、腺瘤、横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤的相对肿瘤频率。图4D.淋巴瘤发病率高的前十种器官。
图5:使用或不使用75mg/kg MNU处理的p53+/-杂合小鼠的脾和胸腺的重量和相对重量。图5A.野生型(WT)和使用或不使用MNU处理的p53+/-小鼠的脾重。图5B.WT和使用或不使用MNU处理的p53+/-小鼠的胸腺重量。图5C和图5D：WT和使用或不使用MNU处理的p53+/-小鼠的脾的相对重量(图5C)和胸腺的相对重量(图5D)(器官重量/体重)(每组n＝7只)。
图6:在p53+/-杂合小鼠中75mg/kg MNU诱导的淋巴瘤的组织病理学特征和免疫组织化学分析。图6A.来自施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠的变大的胸腺。图6B.来自接受柠檬酸盐缓冲液的p53+/-小鼠的胸腺。图6C.来自p53野生型C57BL/6小鼠的正常胸腺。图6D-G.分别显示了脾、胸腺、骨髓和肠系膜淋巴结的显微照片。图6D-G是脾、胸腺、骨髓和肠系膜淋巴结组织切片经苏木精和伊红(HE)染色的显微照片结果。在图6D-G中，显微镜放大倍率为x100，条＝100μm。图6H-J.使用抗CD3、CD20和CD68抗体染色的脾淋巴瘤的显微照片。图6H.脾淋巴瘤对T淋巴细胞标志物CD3染色呈阳性。图6I.脾淋巴瘤对B淋巴细胞标志物CD20染色呈阴性，和图6J脾淋巴瘤对巨噬细胞标志物CD68染色呈阴性。图6K-M.使用抗CD3、CD20和CD68抗体染色的胸腺淋巴瘤的显微照片。图6K.胸腺淋巴瘤对CD3染色呈阳性。图6L.胸腺淋巴瘤对CD20染色呈阴性，和图6M胸腺淋巴瘤对CD68染色呈阴性。图6H-M.显微镜放大倍数为x200，条＝100μm。
图7:使用或不使用75mg/kg MNU处理的雄性和雌性p53+/-杂合小鼠的体重动力学。在第2-3周和第12-13周观察到使用MNU处理的p53+/-杂合小鼠体重的低谷。第二个低谷与动物的濒死或死亡一致。数据表示为平均值±标准差(n＝10只/组)。
图8:75mg/kg MNU诱导的p53+/-淋巴瘤小鼠的血液学分析结果。图8A：白细胞(WBC)、嗜中性粒细胞(NEU)、淋巴细胞(LYM)、单核细胞(MONO)、嗜酸性粒细胞(EOS)、嗜碱细胞(BASO)和红细胞(RBC)的细胞数；图8B：NEU、LYM、MONO、EOS、BASO的相对百分数。图8C和图8D：生物化学参数的测定结果，图中的缩写具有如下含义：RDW：红细胞分布宽度；HDW：血红蛋白分布宽度；HCT：血细胞比容；MCV：平均红细胞体积；MCH：平均红细胞血红蛋白；HGB：血红蛋白；MCHC：红细胞血红蛋白浓度；PLT：血小板计数；ALT：丙氨酸氨基转移酶；AST：天冬氨酸氨基转移酶；TP：总蛋白；ALB：白蛋白；GLU:葡萄糖；CREA：肌酸酐；UREA：尿素氮；TCHO：胆固醇；TG：甘油三酯；CA：钙。
图9：显示了施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠淋巴瘤模型的非瘤微观结果，表明施用MNU的小鼠100％具有视网膜变性。
发明详述
长期以来，小鼠是生物医学研究领域的优选啮齿动物模型。已经开发了数百种小鼠品系，其中一些小鼠品系是复杂的人类疾病如癌症的极好模型。但是，通过以能很好定义的方式修饰小鼠基因组并获得合适的疾病模型仍然不是一件容易的事情，尤其是对小鼠ES细胞进行打靶并得到能够将遗传修饰进行种系传递的小鼠疾病模型是困难的。
本文描述了对C57BL/6小鼠ES细胞进行靶向遗传修饰，提供了在一种或者多种肿瘤抑制基因座中包含靶向遗传修饰的C57BL/6小鼠，所述靶向遗传修饰的C57BL/6小鼠能够用作淋巴瘤模型，用于探讨淋巴瘤的发病机制，以及寻找诊断、预防和治疗淋巴瘤的方法。
I.C57BL/6小鼠胚胎干(ES)细胞
本文提供的方法中涉及来自C57BL/6小鼠的胚胎干(ES)细胞。
在本说明书中，“干细胞”是具有无限的自我更新能力和多能性的细胞。
在本说明书中，“胚胎干细胞”和“ES细胞”可互换地使用，是指从胚胎获得的干细胞。
本发明的C57BL/6小鼠ES细胞在遗传修饰前或在遗传修饰后均具有以下特征中的一种或多种：
(a)具有种系传递能力，意思是指当将C57BL/6小鼠ES细胞植入宿主小鼠胚胎时，所述C57BL/6小鼠ES细胞的基因组传递给后代；
(b)体外具有多能性，并且能够维持多能性；
(c)是二倍体，并因此是具有两个单倍体的同源染色体组；
(d)在体外能够传代培养并保持未分化状态；
(e)具有与正常C57BL/6小鼠细胞相同数量的染色体；和/或
(f)具有自我更新，这意味着它们在保持多能性的同时能够无限地分裂。
在一个实施方案中，所述C57BL/6小鼠ES细胞是雄性XY C57BL/6小鼠ES细胞或是雌性XX C57BL/6小鼠ES细胞；包含C57BL/6小鼠ES细胞的细胞群体是雄性XY C57BL/6小鼠ES细胞的群体和/或是雌性XX C57BL/6小鼠ES细胞的群体。
本文提供的C57BL/6小鼠ES细胞可以从C57BL/6小鼠胚胎发育的任何阶段自C57BL/6小鼠胚胎获得。
II.野生型C57BL/6小鼠ES细胞基因组中欲被靶向遗传修饰的肿瘤抑制基因
本发明涉及在编码肿瘤抑制蛋白的基因中具有遗传修饰的C57BL/6小鼠。在一个方面，本发明的特征在于遗传修饰的C57BL/6小鼠，其基因组中编码肿瘤抑制蛋白的基因被修饰，导致肿瘤抑制蛋白活性降低。在该方面的一个实施方案中，经修饰的小鼠对于该基因修饰是纯合的。在该方面的另一个实施方案中，经修饰的小鼠对于该基因修饰是杂合的。
现有技术中公开了许多种肿瘤抑制基因，包括但不限于p53、PTEN、KAI1、Casp7、Dec、E-钙粘着蛋白基因、CD44。
在本发明的一个具体实施方案中，肿瘤抑制基因是p53基因。
p53基因是一种重要的肿瘤抑制基因，其在响应于DNA损伤剂或细胞内生长信号不平衡时，编码参与细胞周期调控和细胞凋亡的转录调控蛋白。在大量自发的人类肿瘤中，p53肿瘤抑制基因突变或丢失了。此外，已经显示p53基因中的种系突变与人类中称为李法美尼综合征(Li-Fraumeni syndrome)的癌症的遗传易感性相关(Srivastava S，Zou Z,Pirollo K,Blattner W,Chang EH.Germ-line transmission of a mutated p53gene ina cancer prone family with Li-Fraumeni syndrome.Nature 348:747-749,1990)。BALB/c-p53+/-小鼠模型是一种研究李法美尼综合征中的乳腺癌的独特模型(KuperwasserC,Hurlbut GD,Kittrell FS,Dickinson ES,Laucirica R,Medina D,Naber SP and JerryDJ.Development of spontaneous mammary tumors in BALB/c p53heterozygous mice.Amodel for Li-Fraumeni syndrome.Am J Pathol.2000；157(6):2151-2159)。
在一个实施方案中，对野生型C57BL/6小鼠ES细胞基因组中的p53基因进行了靶向遗传修饰。在小鼠中，野生型p53基因约长17kb，由11个外显子和10个内含子组成，编码约393个氨基酸的蛋白质，分子量约为53KD。通过对野生型p53基因的核苷酸进行置换、缺失、截短和插入，包括对p53基因的核苷酸序列进行1－1179个连续核苷酸的置换、缺失、截短和插入来遗传修饰p53基因，导致细胞中p53基因的表达降低或者不表达。所述置换、缺失、截短和插入例如是缺失p53基因中的全部或者部分外显子、缺失p53基因中的全部或者部分外显子和所述外显子之间的序列、敲除全长的p53基因、对p53基因进行点突变或它们的组合。
III.对C57BL/6小鼠ES细胞的靶向遗传修饰
可以使用对小鼠ES细胞的基因组进行靶向遗传修饰的多种方法。例如，在一个实施方案中，通过同源重组事件产生靶向遗传修饰。在另一个实施方案中，使用在目标基因组位置处产生单链或双链断裂的核酸酶试剂，然后通过非同源末端连接途径(NHEJ)修复单链或双链断裂产生靶向遗传修饰。这样的系统可用于例如产生导致靶向基因功能丧失的遗传修饰。参见，例如，Tesson等人(2011)Nature Biotechnology 29：695-696，其通过引用并入本文作为参考。所述核酸酶试剂包括转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)(WO 2010/079430)；锌指核酸酶(ZFN)(US20080182332)；大范围核酸酶(参见Epinat等人，(2003)Nucleic Acids Res 31：2952-62；WO2004031346)；和CRISPR/Cas系统(Hwang WY等人，NatBiotechnol.,2013年3月；31(3)：227-9)。
在其他实施方案中，通过构建同源重组靶向载体并导入小鼠ES细胞中，实施靶向的遗传修饰。
所述同源重组靶向载体包含欲插入ES细胞目的基因座的异源多核苷酸，并且还包含位于该异源多核苷酸侧翼的上游和下游同源臂。可使用任意合适的技术将所述同源重组靶向载体导入C57BL/6小鼠ES细胞。所述技术包括但不限于原生质体融合，例如酵母原生质球:细胞融合，脂质转染，电穿孔，磷酸钙介导的DNA转移或直接显微注射。在同源重组靶向载体导入C57BL/6小鼠ES细胞后，该载体的同源臂和ES细胞基因组中的相应靶位点之间发生同源重组，从而将重组靶向载体上的异源多核苷酸插入ES细胞的目的基因座处。
优选地，位于所述同源重组靶向载体上的、欲插入ES细胞目的基因座的异源多核苷酸包含与在小鼠ES细胞中有活性的启动子有效连接的选择标记。在本说明书中，“有效连接”指两个或更多个多核苷酸(例如，DNA)区段之间的功能性关系。一般地，“有效连接”指转录调节序列与被转录序列的功能性关系。例如，如果启动子序列在适宜的宿主细胞或其他表达系统中刺激或调节编码序列的转录，则该启动子序列与编码序列有效连接。在小鼠ES细胞中有活性的启动子包括但不限于CMV启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、泛素(Ub)启动子和CAG启动子。所述选择标记的表达优选地赋予经遗传修饰的小鼠ES细胞对抗生素的抗性。所述选择标记包括但不限于新霉素磷酸转移酶(neor)、潮霉素B磷酸转移酶(hygr)、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(puror)、杀稻瘟菌素S脱氨酶(bsrr)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)和单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)中的一种或者多种。
IV.包含靶向的遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞克隆的鉴定
对C57BL/6ES细胞实施靶向的遗传修饰操作，培养所获得的ES细胞，然后可以使用筛选培养基筛选抗性ES细胞克隆。当筛选标记基因是新霉素磷酸转移酶(neor)时，通常使用G418进行抗性筛选。进一步地，对抗性ES细胞克隆进行基因型的鉴定。可以通过Southern印迹杂交和/或PCR法，通过DNA分析鉴定出包含靶向的遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞克隆。
在一个实施方案中，对C57BL/6小鼠ES细胞的野生型p53基因进行了上述“II.野生型C57BL/6小鼠ES细胞基因组中欲被靶向进行遗传修饰的肿瘤抑制基因”中所述的遗传修饰，例如，对野生型p53基因进行了全部缺失或者部分缺失，例如缺失了图1C的外显子1－外显子11(即E1－E11)中的全部或部分区域，例如，缺失了图1C的E2-E5中的区域。在缺失了野生型p53基因中全部或部分区域的情形，能够通过检测基因长度的变化来快速鉴定遗传修饰。
V.产生作为F0后代的嵌合体小鼠、作为F1后代的遗传修饰杂合子小鼠和作为F2后代的遗传修饰纯合子小鼠
在一个实施方案中，将包含靶向的遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞用作供体细胞，导入小鼠宿主囊胚，然后在代孕鼠中妊娠包含C57BL/6小鼠ES细胞的小鼠宿主囊胚，囊胚发育一段时间后获得具有靶向的遗传修饰的F0代小鼠。
在一个实施方案中，所述小鼠宿主囊胚来自C57BL/6小鼠ES细胞的来源C57BL/6小鼠品系或者来自与所述C57BL/6小鼠品系不同的小鼠品系。例如，遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞可以植入C57BL/6小鼠宿主囊胚，或者可植入BALB/C小鼠宿主囊胚、ABI小鼠宿主囊胚或其他异种小鼠宿主囊胚。同样地，代孕鼠可以来自与遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞相同和/或小鼠宿主囊胚相同的小鼠株，或者代孕鼠可以来自与遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞不同和/或小鼠宿主囊胚不同的小鼠株。在一个非限制性实施方案中，遗传修饰的小鼠细胞来自C57BL/6菌株，小鼠宿主囊胚来自BALB/C小鼠宿主囊胚，代孕鼠来自KM小鼠或ICR小鼠。
在另一实施方案中，将嵌合体小鼠(F0代)与野生型C57BL/6小鼠交配以产生靶向遗传修饰杂合的F1后代。此外，F1后代的雄性小鼠与F1后代的雌性小鼠一起繁殖，可以获得靶向遗传修饰纯合的F2后代。
使用本发明的方法，使得具有靶向遗传修饰的至少10％的F0小鼠将遗传修饰传递到F1后代，优选地，具有靶向遗传修饰的至少40％的F0小鼠将遗传修饰传递到F1后代，更优选地，具有靶向遗传修饰的至少60％的F0小鼠将遗传修饰传递到F1后代。
可以通过多种方法如分析与C57BL/6小鼠基因组中整合的肿瘤抑制基因遗传修饰(例如，对p53遗传修饰)相关的核酸、蛋白质和代谢物来证实在C57BL/6小鼠基因组中存在肿瘤抑制基因(例如，p53基因)遗传修饰的整合。
PCR分析是对C57BL/6小鼠筛选基因组中存在肿瘤抑制基因(例如，p53基因)遗传修饰的快速方法(Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY)。使用针对目的基因座等特异的寡核苷酸引物实施PCR。
可以通过对基因组DNA实施Southern印迹分析证实C57BL/6小鼠中的肿瘤抑制基因(例如，p53基因)遗传修饰(参见上文Sambrook和Russell,2001)。通常地，从C57BL/6遗传修饰小鼠提取总DNA，用适宜的限制酶消化，在琼脂糖凝胶中分离并且转移至硝化纤维素或尼龙膜。膜或“印迹物”随后根据标准技术(参见上文Sambrook和Russell,2001)用特异性探针等以证实C57BL/6小鼠的肿瘤抑制基因(例如，p53基因)遗传修饰。
在Northern印迹分析中，从C57BL/6遗传修饰小鼠的组织分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶中分离并且根据本领域常规使用的标准方法(参见上文Sambrook和Russell,2001)印迹至尼龙滤膜上。随后通过本领域已知的方法(参见上文Sambrook和Russell,2001)使该滤膜与特异性探针杂交，检测是否存在肿瘤抑制基因(例如，p53基因)编码的RNA的表达。
可以对C57BL/6小鼠中的肿瘤抑制基因(例如，p53基因)遗传修饰实施蛋白质印迹法、生物化学测定法等以使用与肿瘤抑制基因(例如，p53基因)编码的蛋白质上存在的一个或多个表位结合的抗体，通过标准方法(参见上文Sambrook和Russell,2001)证实是否存在肿瘤抑制基因(例如，p53基因)编码的蛋白质的存在和其量。
VI.C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠作为自发淋巴瘤模型
在一个实施方案中，研究了C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠中淋巴瘤的发病率、发病和死亡时间，并进行了组织病理学检查。
在一个具体实施方案中，研究了C57BL/6p53-/-纯合子小鼠中淋巴瘤的发病率、发病和死亡时间，并进行了组织病理学检查。结果如图2所示。
从图2可见，在C57BL/6p53-/-纯合子小鼠中，淋巴瘤的自发发病率是90.5％，在12周－32周之间发病并死亡，组织病理学检查结果表明，在发生恶性淋巴瘤的器官中，脾和胸腺是淋巴瘤发生率最高的两个器官。
现有技术中报导了对几种其他遗传背景的小鼠进行p53遗传修饰后，所获得的p53-/-纯合子小鼠的肿瘤发病率、发病和死亡时间。
例如，现有技术中报导了在D3遗传背景的p53-/-纯合子小鼠中，淋巴瘤的自发发病率是71％，小鼠在26周－68周之间发病并死亡(Jacks T,Remington L,Williams BO,Schmitt EM,Halachmi S,Bronson RT and Weinberg RA.Tumor spectrum analysis inp53-mutant mice.Current biology:CB.1994；4(1):1-7)。D3p53-/-纯合子小鼠淋巴瘤的自发发病率显著地低于本发明的C57BL/6p53-/-纯合子小鼠淋巴瘤的自发发病率，且前者发病时间在半年到一年半的时间(对应于26周－68周)，而本发明的C57BL/6p53-/-纯合子小鼠的发病时间缩短到3个月到8个月之间(对应于12周－32周)。
例如，现有技术中还报导了在BABL/c遗传背景的p53-/-纯合子小鼠中，淋巴瘤的自发发病率是53％，小鼠在72周之后才发病并死亡(见上文Kuperwasser C等人)。BABL/cp53-/-纯合子小鼠淋巴瘤的自发发病率显著地低于本发明的C57BL/6p53-/-纯合子小鼠淋巴瘤的自发发病率，且前者发病时间在一年半之后(对应于72周之后)，而本发明的C57BL/6p53-/-纯合子小鼠的发病时间缩短到3个月到8个月之间(对应于12周－32周)。
因此，本发明的C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠(例如，C57BL/6p53-/-纯合子小鼠)作为自发淋巴瘤模型具有发病率高和缩短了发病时间，从而具有利于实验和临床研究的有利技术效果。
VII.C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠作为诱发淋巴瘤模型
在一个实施方案中，研究了C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠中淋巴瘤的发病率、发病和死亡时间，并进行了组织病理学检查。
在一个具体实施方案中，研究了C57BL/6p53+/-杂合子小鼠中淋巴瘤的发病率、发病和死亡时间，并进行了组织病理学检查。C57BL/6p53+/-杂合子小鼠携带一个野生型p53等位基因和一个无效p53等位基因。从图3A和图4A可见，C57BL/6p53+/-杂合子小鼠在25周期间几乎不自发淋巴瘤，小鼠是可存活的，并且看起来完全正常。但是，由于存在一个无效p53等位基因，C57BL/6p53+/-杂合子小鼠对肿瘤的发生是易感的。
人类中，李法美尼患者遗传了一个野生型p53等位基因和一个突变p53等位基因，对肿瘤的发生具有易感性。因此，人类患者的情况更类似于具有单个无效p53等位基因的杂合子小鼠。对C57BL/6p53+/-杂合子小鼠肿瘤发生的研究将为对人类患者的肿瘤预防和治疗提供有利的措施。
现有技术中已知，辐射和/或诱变剂能够用于引发肿瘤易感小鼠的发病，从而利于小鼠致癌性模型的开发和研究。因此，在一个实施方案中，对C57BL/6p53+/-杂合子小鼠施用诱变剂，观察了其肿瘤发生类型、发病率、发病和死亡时间，并进行了组织病理学检查、免疫组织化学分析、体重、血液学和血液生物化学分析。在一个实施方案中，所述诱变剂包括但不限于N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)、苯、酚酞、对甲酚定。在一个实施方案中，一次或者多次施用所述化学诱变剂。
在一个实施方案中，对C57BL/6p53+/-杂合子小鼠施用N-甲基-N-亚硝基脲(MNU)，结果如图3－8所示。结果表明，一次施用MNU就能够诱发C57BL/6p53+/-杂合子小鼠发生恶性淋巴瘤；其中一次施用75mg/kg MNU或以上导致100％的C57BL/6p53+/-杂合子小鼠发生恶性淋巴瘤；发生淋巴瘤的主要解剖部位是胸腺、脾、骨髓和淋巴结；对CD3抗原染色阳性，表明是淋巴瘤是T细胞谱系淋巴瘤；大多数C57BL/6p53+/-杂合子小鼠在13和17周之间发病并死亡，并且在23周全部死亡或濒死；在第2-3周和第12-13周观察到使用MNU处理的p53+/-杂合小鼠体重的低谷。
因此，本发明的C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠(例如，p53+/-杂合子小鼠)作为诱发淋巴瘤模型模拟了人类患者的肿瘤抑制基因的基因型(例如，p53基因型)、淋巴瘤发病率高达100％和缩短了发病时间，从而具有利于实验和临床研究的有利技术效果。
VIII.C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠作为自发淋巴瘤模型的用途和C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠作为诱发淋巴瘤模型的用途
本发明提供了C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠作为自发淋巴瘤模型的用途和C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠作为诱发淋巴瘤模型的用途。
在一个具体实施方案中，从C57BL/6p53+/-杂合子小鼠、C57BL/6p53+/-杂合子小鼠、和/或施用了化学诱变剂的C57BL/6p53+/-杂合子小鼠经时地获取组织和/或细胞样本，并与来自野生型C57BL/6小鼠的组织和/或细胞样本比较它们之间核酸和/或蛋白质的差异表达，并将差异表达显著的核酸和/或蛋白质作为肿瘤标志物和/或肿瘤发生的潜在早期驱动物。所述组织和/或细胞样本包括但不限于体液样本。在本说明书中，“体液”是指来自所述小鼠的生物学上的液体，包含例如血液、尿、淋巴细胞培养上清、腹水等。优选为血液或尿。
在一个实施方案中，提供了C57BL/6p53-/-纯合子小鼠作为自发淋巴瘤模型的用途和C57BL/6p53+/-杂合子小鼠作为诱发淋巴瘤模型的用途，用于筛选治疗淋巴瘤的化合物，包括
(a)将候选化合物施与所述自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型；和
(b)检测小鼠模型的淋巴瘤发病率的变化，
当与不施用候选化合物的所述自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型相比时，淋巴瘤发病率显著下降，则候选化合物是潜在的治疗淋巴瘤的化合物。
在一个实施方案中，将他莫昔芬施与所述自发淋巴瘤或诱发淋巴瘤的小鼠模型，并检测了小鼠模型的淋巴瘤发病率的降低。
在一个实施方案中，提供了C57BL/6p53+/-杂合子小鼠的用途，用于筛查具有诱导淋巴瘤的化合物，包括
(a)将候选化合物施与C57BL/6p53+/-杂合子小鼠；和
(b)检测所述C57BL/6p53+/-杂合子小鼠的淋巴瘤发病率，
当与不施用候选化合物的所述小鼠相比，淋巴瘤发病率显著提高，则候选化合物是潜在的导致淋巴瘤的化合物，从而应限制其在临床作为药物使用或者限制其在食品中的使用。本发明的C57BL/6p53+/-杂合子小鼠模型由于具有高达100％的淋巴瘤诱发率和发病时间为24周以内，可使人类致癌风险的预测更准确，为药物研发赢得了宝贵时间。另一方面，食品成分由于储存或加工也许会含有某种致癌物质，例如已知食物中的3-单氯-1,2-丙二醇(3-MCPD)在大鼠中诱导肾脏肿瘤。本发明的C57BL/6p53+/-杂合子小鼠模型也为这类食品中的致癌物质提供了评估致癌性的有效模型。
由于C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠淋巴瘤的自发发生时间远早于C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠淋巴瘤的发生时间，因此，通过在不同的时间点自所述两种小鼠获得核酸和/或蛋白质的差异表达，能够得到肿瘤发生的早期驱动物。在一个具体实施方案中，提供了C57BL/6p53+/-杂合子小鼠和C57BL/6p53-/-纯合子小鼠的用途，用于筛选肿瘤发生的早期驱动物，包括
(a)在不同时间获得遗传修饰杂合的C57BL/6小鼠和遗传修饰纯合的C57BL/6小鼠的组织和/或细胞样本，比较它们之间核酸和/或蛋白质的差异表达，
(b)筛选早期的差异表达显著的核酸和/或蛋白质作为肿瘤发生的早期驱动物。
IX.C57BL/6小鼠细胞系的构建和用途
本发明涉及从C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的杂合子小鼠和/或C57BL/6肿瘤抑制基因遗传修饰的纯合子小鼠获取ES细胞或者相同基因型的体细胞，经原代培养，然后传代培养后，得到可以稳定、连续传代的C57BL/6小鼠细胞系。
在一个实施方案中，所述C57BL/6小鼠细胞系的基因组经Southern印迹杂交和/或PCR法证实是携带靶向的肿瘤抑制基因遗传修饰的C57BL/6小鼠细胞系。所述C57BL/6小鼠细胞系能够用于淋巴瘤或者视网膜变性相关的作用机制研究。
以下列举实施例，用来更加具体地说明本发明，但本发明不会因此而受到任何的限制。
实施例
实施例1：C57BL/6小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的产生
将野生型C57BL/6小鼠(购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所)保持在12小时光/12小时黑暗循环中。诱导4－5周龄的雌性C57BL/6小鼠超排卵，然后与雄性C57BL/6小鼠交配。从交配后3.5天的C57BL/6孕鼠的子宫角中冲出囊胚。将囊胚于12孔板(购自美国康宁公司Corning)中在作为饲养细胞的有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)上(所述MEF细胞衍生自3T3细胞(Swissalbino)，经连续传代培养、分离克隆得到的亚系)上培养5-6天，在此期间每1-2天更换ES细胞培养基，所述ES细胞培养基是补充有15％(v/v)FBS(ExCell)、1％MEM NEAA(Gibco)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、0.1％(β-巯基乙醇(Gibco)和1％CHO-LiF的Knockout DMEM培养基(Gibco)。
根据标准方法培养囊胚(Hogan B,Costantini F,Lacy E(1994)Manipulatingthe mouse embryo:a laboratory manual,第2版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York)。随着培养的进行，囊胚中由胚胎干细胞和外周原始内胚层样细胞的中央块组成的内细胞团(inner cell mass，ICM)的尺寸显著增大。将ICM用口控微量移液管拾取到48孔板(购自美国康宁公司Corning)中，然后用0.1％胶原酶(购自美国Gibco公司)消化10－15分钟，然后用0.25％胰蛋白酶(购自美国Gibco公司)消化2－5分钟。将消化的ICM转移到新鲜的饲养细胞，即，有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞上进行继续培养，使用的培养基是上述的ES细胞培养基，直到观察到ES细胞集落。
将C57BL/6ES细胞于37℃在加湿的5％CO2培养箱中培养。将它们常规地使用补充有15％FBS(ExCell)、1％MEM NEAA(Gibco)、1％L-谷氨酰胺(Gibco)、0.1％(β-巯基乙醇(Gibco)和1％CHO-LiF的Knockout DMEM培养基(Gibco)维持在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。每2-3天传代小鼠ES细胞。对于常规传代，通过抽吸使小鼠ES细胞不贴壁并通过离心收集。然后加入0.05％胰蛋白酶以将细胞聚集体解离成单细胞。以这种方式传代细胞避免了携带对小鼠ES细胞生长有不利影响的饲养细胞。由此获得了从C57BL/6小鼠建立的ES细胞系。
实施例2：C57BL/6小鼠ES细胞的形态和核型分析
显微镜下观察C57BL/6小鼠ES细胞，如图1A所示，具有干细胞形态。
对于核型分析，将实施例1获得的C57BL/6小鼠ES细胞以1×106个细胞/孔的密度接种在6孔板(购自美国康宁公司Corning)中。铺板后一天，向培养液中加入0.5mg/ml柯西米奇(colcemid)(Sigma)，并在37℃水浴中孵育50分钟。然后将C57BL/6小鼠ES细胞进行胰蛋白酶消化，用甲醇-冰醋酸(3:1)溶液固定，并铺展在玻片上。通过显微镜分析染色体G带进行核分型。图1B中显示了所分析的C57BL/6小鼠ES细胞系核型是XY型，且染色体数目正常。
在随后的实施例中，使用所获得的C57BL/6小鼠ES细胞进行基因打靶的遗传操作。
实施例3：对C57BL/6小鼠ES细胞中p53基因进行基因打靶
首先，构建p53基因打靶载体。所述p53基因打靶载体包含p53基因的上下游同源序列、驱动新霉素选择盒(Neo盒)表达的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，其中，所述Neo盒欲替换C57BL/6小鼠ES细胞基因组上p53基因的外显子2至外显子5，所述外显子2至外显子5占p53基因编码区的约40％(图1C)。
随后，将构建的p53基因打靶载体通过电穿孔导入实施例2的已建立的C57BL/6ES细胞系中。通过同源重组，打靶载体中的Neo盒将替换了C57BL/6小鼠ES细胞基因组上p53基因的外显子2－5。通过G418抗性筛选获得表达Neo盒的ES细胞，并进行培养和增殖。随后，通过Southern印迹证实p53基因打靶载体的整合情况。
从G418抗性的ES细胞提取基因组DNA，进行Southern印迹来证实G418抗性的ES细胞集落中p53基因打靶载体的整合情况。具体而言，用限制性酶EcoRI(购自大连宝生物TAKARA公司)消化所述基因组DNA，用1％琼脂糖凝胶电泳分析。电泳后，将凝胶变性、中和、并通过毛细管转移至尼龙膜上印迹。使用DIG-标记DNA和检测试剂盒II(Roche，目录号：11585614910)，根据制造商的说明书，将DNA膜固定并与洋地黄毒苷标记的Southern印迹杂交探针杂交。由于上述打靶载体中的PGK-Neo盒插入ES细胞基因组导致获得的遗传修饰p53基因中含有另一EcoRI位点，因此，用EcoRI消化基因组DNA会产生一条额外的7kb DNA片段。使用5’探针(序列：ATCCTGACTC TGCAAGTCCC)进行检测，结果如图1D所示，其中约17kbEcoRI片段表示5’探针杂交至p53野生型等位基因，约7kb EcoRI片段表示5’探针杂交至敲除了p53基因外显子2至外显子5的p53等位基因。
具有17kb EcoRI片段和7kb EcoRI片段这两条印迹条带的泳道所对应的G418抗性ES细胞克隆是具有p53野生型等位基因和p53无外显子2－5的等位基因这两者的杂合C57BL/6小鼠ES细胞克隆，结果如图1D所示。挑选四种杂合的ES细胞克隆H7、A1、E10、E2用于以下实施例中。
实施例4：产生嵌合体小鼠、p53+/-小鼠和p53-/-小鼠
将四种杂合的ES细胞克隆H7、A1、E10、E2分别显微注射入151个野生型BALB/c小鼠囊胚中。然后，将ES细胞注射的151个囊胚转移到14只KM假孕小鼠或者ICR假孕小鼠(所述KM小鼠、ICR小鼠均购自中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所)子宫中，18－19天后，获得新生小鼠34只。根据小鼠毛色判断，34只新生小鼠中有24只具有黑白毛色，是具有杂合ES细胞特性的嵌合体小鼠，嵌合率(嵌合体小鼠数/新生小鼠数)为70.6％。嵌合体小鼠中有16只是雄性。将雄性具有杂合ES细胞特性的嵌合体小鼠与野生型C57BL/6雌性小鼠交配，获得了85只F1代小鼠(表1)，其中37只具有全黑色毛皮。对这37只具有全黑色毛皮的F1代小鼠如下所述进行PCR基因分型分析，确定了带有p53外显子2-5缺失的杂合子小鼠，表示为F1代p53+/-小鼠。将F1代p53+/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，获得后代p53+/-小鼠。
表1.通过囊胚显微注射产生C57BL/6p53+/-杂合小鼠
将所述F1代p53+/-杂合小鼠的雄性和雌性进一步互交，对获得的子代小鼠如下所述进行PCR基因分型分析，确定了带有p53外显子2-5缺失的纯合子小鼠，表示为p53-/-纯合小鼠。
PCR基因分型分析：用来鉴定野生型p53基因小鼠、杂合的和纯合的p53基因修饰小鼠。具体操作如下：使用组织基因组DNA提取试剂盒(Generay，中国上海)分离小鼠尾活组织检查样品中的基因组DNA，进行PCR以鉴定对p53基因的遗传修饰。用引物组1(P53-WT-F，AGTTCTGCCACGTGGTTGGT；P53-WT-R，GTCTCCTGGCTCAGAGGGAG)或引物组2(P53-WT-F，AGTTCTGCCACGTGGTTGGT；P53-Neo-R，CAGAGGCCACTTGTGTAGCG)扩增所制备的小鼠基因组DNA中的片段。对于p53野生型等位基因，预期的PCR产物大小为281bp；对于p53遗传修饰的等位基因，预期的PCR产物大小为441bp。因此，对于来自p53+/-杂合小鼠的基因组样本，预期的PCR产物为441bp和281bp，在电泳后能够观察到这两条条带。结果如图1E所示。
进一步地，对野生型p53基因小鼠、杂合的和纯合的p53基因修饰小鼠的肝、脾、肺、脑和胸腺中的p53基因mRNA进行了相对实时PCR定量分析。自小鼠获取所述多种组织，立即浸入RNA后稳定化试剂(Invitrogen)中并储存于-80℃。使用TRIzol(Invitrogen)从各组织提取总RNA，并使用分光光度计在OD 260nm处定量。用Superscript III(Invitrogen)，随机六聚体引发逆转录反应。使用SYBR green I试剂(Takara Bio Inc.)通过ABI 7300实时PCR系统进行实时定量PCR。Q-PCR分析的引物组为p53-Q-F,5’-CCCCTGTCATCTTTTGTCCCT-3’和p53-Q-R,5’-AGCTGGCAGAATAGCTTATTGAG-3。测得的值显示为三次独立实验的平均值±标准差，并归一化为相应的Gapdh水平。结果如图1F所示。来自p53+/-杂合小鼠的肝、脾、肺、脑和胸腺的总RNA显示出约一半的在野生型小鼠中观察到的正常p53基因表达水平，而在p53-/-纯合小鼠中不可检测到p53mRNA。
实施例5：纯合p53-/-小鼠中的自发淋巴瘤
将二十一只纯合p53-/-小鼠用于观察自发肿瘤。每天观察这二十一只纯合p53-/-小鼠并触诊，记录临床症状。
观察结果如图2A所示。与杂合型或野生型小鼠相比，p53-/-小鼠显示大幅加速的肿瘤发生。在26周前约70％的p53-/-小鼠濒死，并且全部小鼠均在32周前死亡。但是，所有野生型和90％的p53+/-小鼠直到研究结束仍存活。
将濒死的纯合p53-/-小鼠安乐死。立即尸体剖检死亡的小鼠，或者将死亡的小鼠保持在低温，第二天进行尸体剖检。组织病理学检查的组织包括肾上腺、主动脉、脑(前脑、中脑和后脑)、盲肠、结肠、十二指肠、附睾、食管、眼、股骨与骨髓、副泪腺、心、回肠、空肠、胆囊、肾、肝、肺与支气管、淋巴结(肠系膜淋巴结和下颌淋巴结)、乳腺(仅雌性)、视神经、卵巢、输卵管、胰腺、垂体前列腺、直肠、唾液腺、坐骨神经、精囊、骨骼肌(大腿)、皮肤和皮下组织、脊髓(颈部、胸部和腰部脊髓)、脾、胸骨与骨髓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺和甲状旁腺、舌、气管、肿瘤/肿块、膀胱、子宫与宫颈、阴道、和总体病变。
尸体剖检显示，21只p53-/-小鼠中有15只显示明显的胸腺变大。显微镜观察发现，在p53-/-纯合子中，观察到的最常见肿瘤是恶性淋巴瘤，在21例荷瘤动物中有19例动物罹患恶性淋巴瘤，剩下的2例小鼠中一只罹患横纹肌肉瘤和一只罹患腺癌(表2)。
表2在纯合p53-/-小鼠中的自发肿瘤
从表2可见，在纯合p53-/-小鼠中，发生恶性淋巴瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤和腺癌的频率分别为90.5％、19.0％、4.8％和4.8％。图2B示出了在纯合p53-/-小鼠发生所述肿瘤的频率。由此可见，纯合p53-/-小鼠易于发生肿瘤。
另外，在这21只纯合p53-/-小鼠中，15只(71％)只进展为淋巴瘤，21只小鼠中的3只罹患淋巴瘤和横纹肌肉瘤、1只罹患淋巴瘤和平滑肌肉瘤。淋巴瘤发生的相对频率为92.5％；最常见的第二种肿瘤是横纹肌肉瘤，其发生的相对频率为5％(图2C)。在C57BL/6背景上的该p53-/-纯合小鼠中只发现了四种类型的肿瘤。结果表明C57BL/6背景下的p53-/-纯合小鼠主要进展为淋巴瘤。
对p53-/-纯合小鼠的解剖结果表明，恶性淋巴瘤的发生部位依次是脾、胸腺、肝、心脏、肾、肺、肌肉、骨髓、胃和下颌下腺。结果如图2D所示。恶性淋巴瘤主要发生在脾和胸腺中，发生率分别为75％和71％，表明脾和胸腺是这种p53-/-纯合小鼠模型中淋巴瘤的主要器官。此外，在肝、心脏、肾和肺中也经常观察到淋巴瘤。在肌肉中观察到横纹肌肉瘤，在空肠中发现有腺癌，并且一只小鼠在胃中具有平滑肌肉瘤。
由于C57BL/6遗传背景的纯合p53-/-小鼠具有高的淋巴瘤发生率，其淋巴瘤的发生频率高于现有技术中报导的具有其他遗传背景的鼠株，因此，C57BL/6遗传背景的纯合p53-/-小鼠能用作具有高度一致性和早期发生的淋巴瘤模型。
实施例6：杂合p53+/-小鼠中的肿瘤
本实施例研究了MNU对C57BL/6野生型小鼠、纯合p53-/-小鼠、杂合p53+/-小鼠(均为几乎一半雄性和一半雌性)诱发肿瘤的影响。
1)37.5mg/kg MNU诱导的肿瘤
将MNU溶解在柠檬酸盐缓冲盐水中，配制成37.5mg/kg浓度，调节溶液的pH至4.5，以单次在第1天腹膜内注射施用，然后是6个月的观察期。
实验分组：8周龄野生型C57BL/6小鼠缓冲液组，不施用37.5mg/kg MNU(10只)；野生型C57BL/6小鼠施用37.5mg/kg MNU组(20只)；p53+/-C57BL/6小鼠缓冲液组，不施用37.5mg/kg MNU(19只)；p53+/-C57BL/6小鼠施用37.5mg/kg MNU组(17只)；纯合p53-/-C57BL/6小鼠施用37.5mg/kg MNU组(14只)。每天观察所有小鼠两次，记录临床体征。在施与MNU前至少记录一次体重，在施与MNU后每周记录体重。在施与MNU后12周开始，小鼠每周触诊直到研究结束。在26周结束时处死所有存活的动物并进行尸体剖检。
结果如表3和图3所示。不施用37.5mg/kg MNU的野生型C57BL/6小鼠缓冲液组直到实验结束仍存活。不施用37.5mg/kg MNU的p53+/-小鼠缓冲液组直到实验结束时仍存活。
施用37.5mg/kg MNU的纯合p53-/-小鼠组在施用MNU后一周内死亡。
观察施用37.5mg/kg MNU的p53+/-小鼠组和施用37.5mg/kg MNU的野生型小鼠组中肿瘤的特征和频率。在26周结束时，p53+/-C57BL/6小鼠施用37.5mg/kg MNU组的淋巴瘤发生频率为65％(11只/总17只)，且野生型C57BL/6小鼠施用37.5mg/kg MNU组淋巴瘤发生频率为10％(2只/总20只)(图3B，P<0.05)。在发病小鼠中，除恶性淋巴瘤外，未观察到其他类型的肿瘤(图3C)。图3D显示了发病小鼠中不同器官发生淋巴瘤的频率，
其中，在胸腺和脾中观察到较高的肿瘤发生率。
表3中汇总了施用37.5mg/kg MNU组和柠檬酸盐缓冲液对照组的观察结果。对发病小鼠通过解剖检查频繁观察到器官增大，其中胸腺和脾的肿块和增大高于其他器官的发生率。
表3 37.5mg/kg MNU施用动物和柠檬酸盐缓冲液对照动物的观察结果
注:*通过显微发现肿瘤发生的动物数；
2)75mg/kg MNU诱导的肿瘤
将MNU溶解在柠檬酸盐缓冲盐水中，配制成75mg/kg浓度，调节溶液的pH至4.5，以单次在第1天腹膜内注射施用，然后是6个月的观察期。
实验分组：8周龄野生型C57BL/6小鼠缓冲液组，不施用75mg/kg MNU(10只)；p53+/-C57BL/6小鼠缓冲液组，不施用75mg/kg MNU(19只)；p53+/-C57BL/6小鼠施用75mg/kg MNU组(14只)。每天观察所有小鼠两次，记录临床体征。在施与MNU前至少记录一次体重，在施与MNU后每周记录体重。在施与MNU后12周开始，小鼠每周触诊直到研究结束。在26周结束时处死所有存活的动物并进行尸体剖检。
结果如表4和图4所示。不施用75mg/kg MNU的野生型C57BL/6小鼠缓冲液组直到实验结束仍存活。不施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠缓冲液组直到实验结束时90％仍存活。
从图4A可见，在75mg/kg MNU组中，肿瘤发生的启动早于以37.5mg/kg MNU施与的动物；且在75mg/kg MNU组中，大多数动物在13和17周之间死亡，并且在23周全部死亡或濒死。这表明MNU浓度增加加速了肿瘤的发展。
微观结果显示，在75mg/kg MNU组中，恶性淋巴瘤是最主要的肿瘤，在实验结束时100％的小鼠发生恶性淋巴瘤。第二最常见的肿瘤是腺瘤，发生比率为43％(图4B)。
与纯合p53-/-小鼠组的自发肿瘤模型中产生的肿瘤类型相比较，在p53+/-C57BL/6小鼠施用75mg/kg MNU组没有观察到横纹肌肉瘤和平滑肌肉瘤。图4C显示该动物组中的肿瘤分布。如预期的那样，最常见的肿瘤是淋巴瘤，发生淋巴瘤的相对频率是87％，且发生腺瘤的相对频率为13％。
我们进一步调查了在p53+/-C57BL/6小鼠施用75mg/kg MNU组的不同器官中的淋巴瘤发病率。结果表明，肿瘤主要存在于淋巴样器官中，包括胸腺(100％)，脾(100％)，骨髓(93％)，肠系膜淋巴结(57％)，腹股沟淋巴结(57％)和下颌淋巴结(29％)。也在一些非淋巴样器官如肾、肺和肝中发现了淋巴瘤(图4D)。
与37.5mg/kg MNU的杂合p53+/-小鼠组(图3D)进行比较，75mg/kg MNU的杂合p53+/-小鼠组的淋巴系统显示出大量病变，并且淋巴瘤发生率从37.5mg/kg MNU的杂合p53+/-小鼠组中的65％上升到100％。
表4中汇总了施用75mg/kg MNU组和柠檬酸盐缓冲液对照组的观察结果。通过解剖检查频繁观察到器官增大，其中胸腺和脾的肿块和增大高于其他器官的发生率。
表4 75mg/kg MNU施用动物和柠檬酸盐缓冲液对照动物的观察结果
注:*通过显微发现肿瘤发生的动物数；
进一步调查了野生型C57BL/6小鼠缓冲液组、p53+/-C57BL/6小鼠缓冲液组、p53+/-C57BL/6小鼠施用75mg/kg MNU组的脾和胸腺的重量和相对重量(每组n＝7只)。如图5所示，与缓冲液对照组相比，75mg/kg MNU组中脾和胸腺的绝对重量和相对器官重量较重(P<0.05)。
实施例7：施用75mg/kg MNU的p53+/-C57BL/6小鼠的淋巴瘤中的淋巴母细胞谱系分析
为了确定施用75mg/kg MNU的p53+/-C57BL/6小鼠恶性淋巴瘤的细胞起源，对所述淋巴瘤进行了组织病理学特征和免疫组织化学分析。
图6A显示了来自施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠的变大的胸腺。图6B显示了来自接受柠檬酸盐缓冲液的p53+/-小鼠的胸腺。图6C显示了来自野生型C57BL/6小鼠的正常胸腺。
图6D-G分别显示了脾、胸腺、骨髓和肠系膜淋巴结组织切片的苏木精和伊红(HE)染色的显微照片结果。在图6D-G中，显微镜放大倍率为x100，条＝100μm。
将免疫组织化学(IHC)染色应用于MNU处理组中患有胸腺恶性淋巴瘤的每个性别五只动物的胸腺的福尔马林固定、石蜡包埋切片；和应用于接受柠檬酸盐缓冲液的两只p53+/-小鼠雄性对照和两只p53+/-小鼠雌性对照的胸腺切片。将小鼠胸腺组织固定在10％中性缓冲的福尔马林中，包埋在石蜡中，并切片(5μm)。使用针对CD3(T淋巴细胞标志物)、CD20(B-淋巴细胞标志物)和CD68(巨噬细胞标志物)的抗体对胸腺中赘生细胞的谱系进行分类。具体而言，通过在96℃于柠檬酸盐缓冲液(中山金桥生物公司，中国北京)中在pH 6在微波炉中孵育10分钟来预处理用于CD3、CD20和CD68染色的胸腺恶性淋巴瘤切片或胸腺切片。用于CD3染色的切片在37℃用正常山羊血清封闭60分钟后，与1：150稀释的抗CD3抗体(克隆LN10，中山金桥生物公司，北京，中国)在4℃孵育过夜。用于CD20染色的切片在37℃用正常山羊血清封闭60分钟后，与1:200稀释的抗CD20抗体(克隆EP7，中山金桥生物公司，中国北京)在4℃孵育过夜。用于CD68染色的切片在37℃用正常山羊血清封闭60分钟后，与1:200稀释的抗CD68抗体(克隆PG-M1，中山金桥生物公司，北京，中国)在4℃孵育过夜。使用生物素化兔抗大鼠二级抗体结合CD3、CD20和/或CD68，随后通过形成抗亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合体，用二氨基联苯胺显色来检测CD3、CD20和CD68的免疫反应性。用苏木精复染所有免疫组织化学切片，用分级浓度的乙醇脱水，并常规使用永久封固剂封盖玻片。
类似地，对脾进行免疫组织化学(IHC)染色
图6H-J显示了使用抗CD3、CD20和CD68抗体染色的脾淋巴瘤的显微照片。由图6H可见，脾淋巴瘤对T淋巴细胞标志物CD3染色呈阳性；由图6I可见，脾淋巴瘤对B淋巴细胞标志物CD20染色呈阴性；由图6J可见，脾淋巴瘤对巨噬细胞标志物CD68染色呈阴性，表明恶性淋巴瘤为T淋巴细胞起源。
图6K-M显示了使用抗CD3、CD20和CD68抗体染色的胸腺淋巴瘤的显微照片。由图6K可见，胸腺淋巴瘤对CD3染色呈阳性；由图6L可见，胸腺淋巴瘤对CD20染色呈阴性；和由图6M可见，胸腺淋巴瘤对CD68染色呈阴性，表明恶性淋巴瘤为T淋巴细胞起源。
由此可见，p53+/-C57BL/6小鼠中75mg/kg MNU诱导的淋巴瘤小鼠模型中的淋巴瘤呈CD3阳性；以及CD20和CD68阴性，是T细胞谱系(图6)。本模型与临床T细胞淋巴瘤类型相似，所述临床T细胞淋巴瘤在人患者中的预后是最差的，因此，该模型对于研究淋巴瘤发生机制或用于治疗的药物选择是有用的。
实施例8：施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠的体重、血液学和血液生物化学分析
为了检查施用75mg/kg MNU的p53+/-小鼠淋巴瘤模型的特征，我们监测了从MNU施用到死亡或濒死时的临床特征和体重变化。我们还测量了六个月结束时血液学和血液生物化学参数。
将小鼠分成三组，野生型C57BL/6对照组、不使用75mg/kg MNU处理的雄性和雌性p53+/-C57BL/6小鼠柠檬酸盐缓冲液对照组、使用75mg/kg MNU处理的雄性和雌性p53+/-C57BL/6小鼠组(n＝10只/组)。
在第2-3周和第12-13周分别观察到使用MNU处理的小鼠体重的两个低谷，其中第二个低谷与动物的濒死或死亡一致。即，与施用柠檬酸盐缓冲液的小鼠相比，施用75mg/kgMNU的小鼠在施用后2-3周显示体重的显著降低。这种体重减轻可能是由化学物质MNU的急性毒性引起[Sun-Hoffman L和Winicov I.，MNU affects mouse erythroleukemia celldifferentiation at sub-cytotoxic doses.Chem Biol Interact.1996；100(3):241-254]。然后，施用MNU的小鼠体重逐渐恢复，但是在多数时间点，小鼠体重仍然低于柠檬酸盐缓冲液对照动物的体重。第二次体重下降发生在施用后12-13周(图7)，并观察到临床症状，如活动下降、驼背、疲倦、瘦弱和快呼吸模式。施用柠檬酸盐缓冲液的所有动物(对照)不显示任何临床迹象并且存活直到终端尸体剖检。
在六个月结束时进行了血液学分析。计数了WBC、NEU、LYM、MONO、EOS、BASO和RBC的总数，并计算了它们的相对百分数。结果表明，p53+/-MNU组的NEU细胞数高于柠檬酸盐缓冲液对照组(P<0.05)，而LYM数量及其相对百分数没有显著增加(P>0.05)(图8A)。NEU细胞增加可能是由于在肿瘤末期发生的全身炎性应答所致，因为通过组织病理学在多个器官中观察到细胞浸润。p53+/-MNU组中的RBC细胞数、HGB和总蛋白均显著降低(P<0.05)。实验结束时与柠檬酸盐缓冲液的组相比，MNU组的四种生物化学参数TG、UREA、TCHO和CA均升高，而ALB和CREA降低(图8)
实施例9：施用75mg/kg MNU的p53+/-C57BL/6小鼠淋巴瘤模型的非瘤微观结果
施用75mg/kg MNU的p53+/-C57BL/6小鼠淋巴瘤模型的非瘤微观结果包括回肠和空肠的腺瘤样增生、十二指肠的腺体增生和眼的视网膜变性(图9)。腺瘤样增生和腺体增生的特征包括隐窝长度的增加和每个隐窝细胞数的增加、加长的绒毛和隐窝直径增加，但不形成上皮的限制区域。施用MNU的小鼠100％具有视网膜变性，进一步表明该动物模型对视网膜变性具有高均一性。
本实施例的结果进一步表明了所构建的小鼠模型在表型上具有高一致性。不仅在肿瘤发生方面具有高发病率、个体之间差异小的特征，而且在眼睛视网膜变性这一表型上也具有高发病率、个体之间高一致性的特征。
实施例10：使用C57BL/6p53-/-纯合子小鼠和/或C57BL/6p53+/-杂合子小鼠筛选肿瘤标志物和/或肿瘤驱动基因
利用C57BL/6p53-/-纯合子小鼠高的淋巴瘤自发率和/或C57BL/6p53+/-杂合子小鼠高的淋巴瘤诱发率，在不同时间点取得小鼠组织，用于RNA-Seq测序，以寻找在肿瘤发生的不同阶段显著性地差异表达的基因。
从小鼠出生后，每隔四周取C57BL/6p53-/-纯合子小鼠和/或C57BL/6p53+/-杂合子小鼠胸腺(每个实验组取2只动物)，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行RNA-Seq测序，寻找在肿瘤发生的不同阶段差异表达的基因。
获得了诸多差异表达的基因，包括但不限于Bcl-2基因、Rn18s,Actb、Hprt、B2M、Rplp0、Gusb、Ctbp1基因等。
尽管已经出于说明本发明的目的显示了某些代表性实施方案和细节，但是本领域技术人员显而易见的是可以对它们进行多种变化和修改而不脱离主题发明的范围。在这个方面，本发明范围仅由以下权利要求限定。
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Claims (7)
1.获得100%诱发淋巴瘤的小鼠模型的方法，包括：
（a）提供C57BL/6小鼠ES细胞的群体；
（b）对所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体进行靶向的遗传修饰，使得其基因组在作为肿瘤抑制基因的p53基因中包含导致所述p53基因被异常表达的遗传修饰，其中所述异常表达是降低的表达或者不表达；
（c）鉴定包含靶向的p53基因遗传修饰的C57BL/6小鼠ES细胞克隆;
（d）将步骤（c）获得的C57BL/6小鼠ES细胞克隆导入BALB/C小鼠囊胚；和
（e）将包含C57BL/6小鼠ES细胞克隆的BALB/C小鼠囊胚转移到代孕鼠中妊娠，并产生包含靶向的p53基因遗传修饰的F0后代；
（f）将步骤（e）中鉴定的雄性F0小鼠与野生型C57BL/6雌性小鼠交配，以产生杂合的F1后代p53＋/-小鼠，
其中具有靶向遗传修饰的至少10％的F0小鼠将中靶遗传修饰传递到F1后代，
将F1后代p53＋/-小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配，获得F1后代的、靶向的p53基因遗传修饰杂合的后代p53＋/-小鼠；以及
（h）通过施用75mg/kg N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）至F1后代的、靶向的p53基因遗传修饰杂合的后代p53＋/-小鼠来获得100％诱发呈CD3阳性、CD20阴性和CD68阴性的淋巴瘤的小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤（e）是在代孕鼠KM小鼠或ICR小鼠中妊娠包含C57BL/6小鼠ES细胞克隆的BALB/C小鼠囊胚，从而由代孕鼠KM小鼠或ICR小鼠产生包含靶向遗传修饰的F0后代，且其中靶向的p53基因遗传修饰能够通过种系遗传而传递给后代。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体是雄性XY C57BL/6小鼠ES细胞的群体和／或是雌性XX C57BL/6小鼠ES细胞的群体。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述靶向的p53基因遗传修饰包括对p53基因的缺失、敲除、插入、点突变或它们的组合。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰步骤（b）包括向所述C57BL/6小鼠ES细胞的群体中引入包含选择标记的异源多核苷酸，所述选择标记与在所述小鼠ES细胞中有活性的启动子有效连接，所述选择标记赋予经遗传修饰的小鼠ES细胞对抗生素的抗性，且所述选择标记包括新霉素磷酸转移酶（neor）、潮霉素B磷酸转移酶（hygr）、嘌呤霉素-N-乙酰转移酶（puror）、杀稻瘟菌素S脱氨酶（bsrr）、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（gpt）和单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-tk）中的一种或者多种。
6.根据权利要求1－5中任一项所述获得的诱发淋巴瘤的小鼠模型的用途，用于筛选治疗淋巴瘤的化合物，包括
（a）将候选化合物施与权利要求1－5中任一项所述获得的诱发淋巴瘤的小鼠模型；和
（b）检测小鼠模型的淋巴瘤发病率的变化，
当与不施用候选化合物的所述诱发淋巴瘤的小鼠模型相比时，淋巴瘤发病率显著下降，则候选化合物是潜在的治疗淋巴瘤的化合物。
7.根据权利要求1－5中任一项所述获得的诱发淋巴瘤的小鼠模型的用途，用于筛选肿瘤标志物和／或肿瘤发生的潜在早期驱动物，包括：
（a）将来自权利要求1－5中任一项所述获得的诱发淋巴瘤的小鼠模型的组织和／或细胞样本与来自野生型C57BL/6小鼠的组织和／或细胞样本比较它们之间核酸和／或蛋白质的差异表达，
（b）将差异表达显著的核酸和／或蛋白质作为肿瘤标志物和／或肿瘤发生的潜在早期驱动物。
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-
2017
- 2017-12-12 CN CN201711320608.2A patent/CN108300737B/zh active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| New nanoformulation of rapamycin Rapatar extends lifespan in homozygous p53−/−mice by delaying carcinogenesis;Maria Comas;《Aging》;20121031;第4卷(第10期);第715–722页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108300737A (zh) | 2018-07-20 |
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