KR20240026435A - 엑소좀을 이용한 생식세포 내 물질 전달 및 유전자 편집 시스템 - Google Patents
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Abstract
엑소좀을 이용한 생식세포 내 물질 전달 및 유전자 편집 시스템에 관한 것으로, 일 양상에 따른 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)이 내부에 삽입된 엑소좀은, 생체 외 및 생체 내의 생식세포 내 목적 물질 전달 및 유전자 편집을 가능하게 하므로, 동물로부터 원시생식세포 등의 생식세포를 분리하고 배양하는 과정 없이 형질전환 또는 유전자 편집 동물을 제조하기 위한 시스템에 활용될 수 있다.
Description
엑소좀을 이용한 생식세포 내 물질 전달 및 유전자 편집 시스템에 관한 것이다.
생식세포는 유전정보를 다음 세대로 전달할 수 있는 중요한 세포 자원이다. 특히 원시생식세포는 생식세포의 발달 및 분화를 연구하는 기초 연구뿐만 아니라 난임 연구, 생식세포 유래 질병 연구 등의 의학적 기초 연구 등을 수행 할 수 있는 유용한 자원이며, 국가 생명 자원 및 멸종 위기 종의 보존 및 복원을 위한 유전자원으로써 중요한 가치를 지닌다. 특히, 최근에는 급속도로 발전하고 있는 생명공학 기술이 조류의 생식세포에 적용되어 변화하는 서식지에 적응할 수 있는 질병 저항성 모델, 열 저항성 모델과 같은 유전자 편집 조류들이 개발되고 있다. 그러나, 대부분 조류 종의 경우 원시생식세포 등의 생식세포의 분리 및 배양 조건이 확립되어 있지 않아 충분한 세포 자원을 확보하기 어려워 연구 및 활용에 제한이 있고, 조류 생식세포는 특히 비교적 트렌스펙션이 어려운 세포로 알려져 있다. 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0054119호는 생식세포 특이적 유전자 발현 조절 서열을 이용한 형질전화 조류 생산에 관한 것으로 NANOG 프로모터 또는 DAZL 프로모터-목적 단백질 코딩 서열을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 체외 배양된 조류 원시생식세포에 트렌스펙션시키는 것을 개시하고 있으나, 트렌스펙션 효율은 낮은 수준이다. 이에 따라 원시생식세포 등의 생식세포의 분리 및 배양 없이 생식세포로 외래 유전자를 트렌스펙션시켜 형질전환 조류를 생산하기 위해 리포좀 또는 바이러스 매개의 생체 내 유전자 편집이 시도되었으나 이 또한 효율이 매우 낮아 새로운 방법의 개발이 요구되고 있다.
한편, 세포에서 분비되는 나노입자 크기의 물질 중 하나인 엑소좀은 특정 세포의 정보를 다른 세포에 전달하는 전달체로서 우수한 세포 흡수 효과를 가진다. 다만, 엑소좀을 이용한 생체 외 및 생체 내의 생식계열 세포 내 외래 물질 전달 및 유전자 편집, 및 이를 이용한 유전자 편집 동물의 개발에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있는 실정이다.
이런 배경 하에서, 본 발명자들은 조류 세포로부터 엑소좀을 분리하여 생체 내 유전자 편집 시스템 개발에 활용하고자 하였고, 그 결과, 상기 엑소좀을 이용하는 경우, 생체 외 및 생체 내의 생식세포 내로 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)을 고효율로 전달하여, 생체 외 및 생체 내의 생식세포의 유전자를 고효율로 편집할 수 있음을 확인하였고, 이로 인해, 상기 엑소좀은, 동물로부터 원시생식세포 등의 생식세포의 분리 및 배양 없이 형질전환 또는 유전자 편집 동물을 개발하는데 활용될 수 있음을 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
일 양상은 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 포함하는 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 포함하는 생식세포 내 유전자 편집용 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 이용하는 생식세포로 목적 물질을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 이용하는 생식세포의 유전자를 편집하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입된 생식세포를 이용하는 유전자 편집 동물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 생식세포로 목적 물질을 전달하기 위한 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 생식세포 내 유전자를 편집하기 위한 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물을 제조하기 위한 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 생식세포 내 유전자 편집용 조성물을 제조하기 위한 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 (exosome)을 포함하는 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물를 제공한다.
상기 엑소좀은 세포로부터 분리되거나 단리된 세포 유래 엑소좀일 수 있다. 상기 세포 유래 엑소좀은 내재적 (endogenous) 엑소좀일 수 있다.
상기 엑소좀은 인간 또는 인간을 제외한 동물의 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 인간을 제외한 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 상기 엑소좀은 조류 세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 메추리, 꿩, 또는 칠면조 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 엑소좀은 인간 또는 인간을 제외한 동물의 줄기세포, 체세포, 생식세포, 또는 암세포로부터 분리된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 엑소좀은 조류의 줄기세포, 체세포, 생식세포, 또는 암세포로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 줄기세포는 배아 (또는 배자) 줄기세포, 성체 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 (iPS)를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 줄기세포는 전능 (totipotency) 줄기세포, 만능 (pluripotency) 줄기세포, 다능 (multipotent) 줄기세포, 협능 (oligopotent) 줄기세포, 이분화성 (bipotent) 줄기세포, 또는 단일 분화성 (unipotent) 줄기세포 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 체세포는 혈관내피 세포, 백혈구, 면역세포, 상피세포, 섬유아세포, 근육세포, 골수세포, 표피세포, 골아세포, 간세포, 심장세포, 소장세포, 대장세포, 췌장세포, 또는 신경세포 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "생식세포 (germ cells)"는 생식에 참여하는 세포로 유성생식으로 번식하는 생물의 배우자인 정자와 난자 및 이들을 발생시키는 모든 단계에 있는 조상 세포들을 포함한다. 상기 생식세포는 원시생식세포, 정원줄기세포, 난원줄기세포, 정원세포, 난원세포, 정모세포, 난모세포, 정세포, 난포세포, 정자, 또는 난자 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 암세포는 유방암, 폐암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 바람직하게는, 상기 암세포는 간암세포일 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀은 인간 또는 인간을 제외한 동물의 원시생식세포 (primordial germ cell) 또는 간세포 (hepatocyte)로부터 분리된 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 엑소좀은 조류의 원시생식세포 또는 간세포로부터 분리된 것일 수 있다.
용어 "원시생식세포 (primordial germ cells)"는 개체 발생의 초기에 일반 체세포에서 갈라져 장래 생식세포가 되기 위해 분화하는 세포를 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 원시생식세포는 동물 (예컨대, 조류)의 생식반월 (germinal crescent), 혈액, 원시 생식기, 또는 배자 (embryo)로부터 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "간세포 (hepatocyte)"는 간을 구성하는 구성세포를 의미한다. 일 구체예에 따르면, 상기 간세포는 간암세포 (Hepatocellular carcinoma cell)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 엑소좀은 막 구조의 작은 소낭의 형태를 가질 수 있다. 상기 엑소좀은 약 50 내지 250 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 엑소좀은 약 50 내지 200 nm, 약 50 내지 150 nm, 약 60 내지 200 nm, 약 60 내지 150 nm, 약 70 내지 200 nm, 약 70 내지 150 nm, 약 80 내지 200 nm, 약 80 내지 150 nm, 약 80 내지 130 nm, 약 80 내지 120 nm, 약 90 내지 200 nm, 약 90 내지 150 nm, 약 90 내지 130 nm, 약 90 내지 120 nm, 또는 약 90 내지 110 nm의 직경을 가지는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀의 직경이 상기 수치범위를 벗어나는 경우, 엑소좀 내부로 목적 물질의 삽입 효율, 엑소좀의 생식세포 내로의 트렌스펙션 (즉, 도입) 효율, 엑소좀의 생식세포 내로의 목적 물질 전달 효율, 또는 엑소좀의 생식세포 내 유전자 편집 효율이 저하될 수 있다.
상기 엑소좀은 Beta (β)-actin (ACTB) 단백질, CD9 단백질, CD81 (Cluster of Differentiation 81) 단백질, 및 Hsp70 (70 kilodalton heat shock proteins) 단백질로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 포함 또는 발현하는 것일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 엑소좀은 상기 단백질을 포함 또는 발현함으로써, 우수한 생식세포 (예컨대, 조류의 생식세포) 내 목적 물질 전달 또는 유전자 편집 효과를 나타내는 것일 수 있다.
상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀에 있어서, 상기 목적 물질은 생식세포 내로 전달하고자 하는 물질을 의미하고, 구체적으로는, 세포 생리 활성 조절 물질일 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다.
용어, "세포 생리 활성 조절 물질 (cell-bioactivity modulator)"은 세포에 작용하여, 생물학적 반응을 조절하며, 생리 작용에 영향을 주는 활성 물질을 지칭한다.
예컨대, 상기 목적 물질은, 핵산, 단백질, 항체, 및 약물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 목적 물질이 핵산인 경우, 상기 핵산은, 세포 내로 전달되어 세포 내에서 발현되는 것을 목적으로 하는 유전자를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산은 DNA, RNA 등의 유전자, 또는 상기 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 벡터의 형태를 가지는 것일 수 있다. 상기 플라스미드 또는 벡터는 세포 내로 전달하고자 하는 유전자가 세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 발현 조절 요소 또는 발현 카세트를 더 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 플라스미드 또는 벡터는, 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 상기 플라스미드 또는 벡터를 함유하는 세포를 선택하기 위한 하나 이상의 선택 마커, 복제원점, 제한효소 부위 (예컨대, 다중 클로닝 부위) 등을 포함할 수 있다. 상기 플라스미드 또는 벡터는, 세포 내에서 세포 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수도 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질은 세포 내 유전자 조절 물질일 수 있다. 구체적으로, 상기 세포 내 유전자 조절 물질은, 세포 내에서 유전자 중 일부를 삭제 또는 치환하거나, 세포 내 유전체에 외래 유전자를 삽입하거나, 세포 내 유전자를 분해 또는 변형하거나, 세포 내 유전자의 발현을 조절하는 등, 세포 내에서 유전자를 편집, 조작, 교정, 재배열, 조절, 변형, 분해, 또는 재조합할 수 있는 물질이라면, 제한없이 사용될 수 있다.
예컨대, 상기 목적 물질은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템은 RNA-가이드 뉴클레아제 (RNA-guided nuclease, RGEN) 또는 CRISPR/Cas 시스템으로도 불릴 수 있다. 상기 CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR/Cpf1 시스템을 포함할 수 있다. 상기 Cas (CRISPR associated) 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템에 이용되는 Cas 단백질을 말한다. 상기 Cas 뉴클레아제는 가이드 RNA (guide RNA)와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제로서 표적 핵산의 절단, 삽입, 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분은, Cas 단백질, 가이드 RNA, 상기 Cas 단백질 및/또는 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산 (예컨대, DNA), 및 상기 핵산을 포함하는 플라스미드 또는 벡터로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 플라스미드 또는 벡터는, 상기 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 각각 포함하는 2종 이상의 플라스미드 또는 벡터이거나, 하나의 플라스미드 또는 벡터에 상기 Cas 단백질을 암호화하는 핵산 및 상기 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 모두 포함하는 플라스미드 또는 벡터일 수 있다.
용어, "Cas 단백질"은 CRISPR 뉴클레아제 시스템을 구성하는 단백질로서, 이용하고자 하는 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 절단하고 편집할 수 있는 단백질을 지칭한다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 게놈의 목적 장소에 특정 유전자를 삽입하거나 특정 유전자의 활동을 정지시키는 등의 유전자 조작이 가능한 유전자 가위 역할을 하는 단백질일 수 있다. 각각의 야생형 Cas 단백질은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 (가장 전형적으로 가이드 RNA)와 상호작용하여 Cas 단백질-RNA 혼성체를 형성할 수 있다.
상기 Cas 단백질은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 또는 이의 상동체 또는 변형물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는 CRISPR-연합 단백질을 지칭할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질 (CRISPR associated protein 9)일 수 있다. 상기 Cas9 단백질은 Cas9 기능과 관련된 서열을 최소 서열로 포함하며 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있고, 바람직하게는 당업계에 공지된 서열로 구성될 수 있다.
용어, "가이드 RNA (guide RNA)"는 표적 DNA 특이적인 RNA (예컨대, DNA의 표적 부위와 혼성화 가능한 RNA)를 의미하고, Cas 단백질과 혼성체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 지칭한다.
상기 가이드 RNA는, 목적하는 유전자 교정을 위하여, 두 개의 가이드 RNA, 즉, 유전자의 표적 부위와 혼성화 가능한 뉴클레오티드 서열을 갖는 CRISPR RNA (crRNA)와 추가적인 trans-activating crRNA (tracrRNA)를 포함할 수 있고, crRNA와 tracrRNA가 부분적으로 결합된 crRNA-tracrRNA 복합체인 이중 가이드 RNA (dual guide RNA) 형태, 또는 상기 이중 가이드 RNA처럼 crRNA-tracrRNA 복합체를 형성하면서 동시에 crRNA의 말단과 tracrRNA의 말단이 연결된 단일 가이드 RNA (single guide RNA: sgRNA)의 형태일 수 있다.
상기 가이드 RNA는 표적 유전자와 상보적인 염기서열을 가지는 것으로, 표적 유전자에 따라 다양한 가이드 RNA가 사용될 수 있다.
상기 엑소좀은 상기 목적 물질이 엑소좀 내부에 삽입되어 있는 것일 수 있다. 본 명세서에서 상기 삽입은 봉입, 도입, 형질감염, 또는 형질도입의 용어와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 엑소좀 내부에 상기 목적 물질을 삽입하기 위한 방법은 당업계에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예컨대, 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 (lipofection), 또는 미량주입 (microinjection) 등의 방법에 따라 상기 엑소좀 내부에 상기 목적 물질이 삽입될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 상기 엑소좀은, 생식세포 내로 상기 목적 물질을 고효율로 전달할 수 있다. 따라서, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 상기 엑소좀은, 생식세포로 상기 목적 물질을 전달하기 위한 용도를 가진다.
수여자 세포인 상기 생식세포는 인간 또는 인간을 제외한 동물의 생식세포일 수 있고, 구체적으로는, 상기 생식세포는 원시생식세포, 정원줄기세포, 난원줄기세포, 정원세포, 난원세포, 정모세포, 난모세포, 정세포, 난포세포, 정자, 난자, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 인간을 제외한 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 메추리, 꿩, 또는 칠면조 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
용어, "수여자 세포"는 상기 목적 물질 (예컨대, 핵산)이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀이 도입되는 세포로서, 상기 목적 물질 (예컨대, 핵산)을 세포 내로 전달받거나, 이로 인해 유전자 편집되는 세포를 의미할 수 있다.
수여자 세포인 상기 생식세포는, 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo), 또는 생체 내 (in vivo)의 생식세포일 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 상기 엑소좀은, 시험관 내 또는 생체 외에 존재하는 분리된 생식세포 내로 상기 목적 물질을 고효율로 전달할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내로 주입되는 것에 의해 생체 내에 존재하는 생식세포로도 상기 목적 물질을 고효율로 전달할 수 있다.
또한 일 구체예에 따르면, 수여자 세포인 상기 시험관 내 또는 생체 외의 생식세포는, 배아 (또는 배자)로부터 분리된 생식세포 (예컨대, 원시생식세포)이거나 성체 (인간 또는 인간을 제외한 동물 (성축))로부터 분리된 생식세포 (예컨대, 정원줄기세포, 난원줄기세포, 정원세포, 난원세포, 정모세포, 난모세포, 정세포, 난포세포, 정자, 또는 난자 등)일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
용어, "성체"는 개체발생이 완성되어 생식이 가능하게 된 개체 (인간 또는 인간을 제외한 동물)를 의미하고, 상기 개체가 인간을 제외한 동물인 경우 상기 성체는 "성축"으로 불려질 수 있다.
또한 일 구체예에 따르면, 수여자 세포인 상기 생체 내의 생식세포는, 배아 (또는 배자) (embryo) 또는 성체 (또는 성축) 내의 생식세포일 수 있다. 구체적으로는, 수여자 세포인 상기 생체 내의 생식세포는, 배아 (또는 배자) 또는 성체 (또는 성축)의 생식선 내의 생식세포일 수 있다. 상기 배아 (또는 배자)는 갓 수정된 수정란, 발생 초기 배아, 또는 수용체 배자 (recipient embryo)를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 포함하는 생식세포 내 유전자 편집용 조성물을 제공한다.
상기 핵산은 유전자 편집에 이용되는 핵산일 수 있다. 구체적으로, 상기 핵산은 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분을 포함하는 것일 수 있다.
상기 엑소좀, 핵산, 삽입, CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분, 및 유전자 편집의 대상이 되는 생식세포 (즉, 수여자 세포인 생식세포)는 상술한 바와 같다.
일 구체예에 따르면, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀에 있어서, 상기 핵산이 특정한 유전자를 표적하는 상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분인 경우, 상기 엑소좀은, 상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분을 생체 외 또는 생체 내의 생식세포 내로 전달할 수 있고, 상기 생식세포 내로 전달된 상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분은 상기 생식세포 내 표적 유전자를 편집할 수 있다 (도 1). 즉, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀은 생체 외 또는 생체 내의 생식세포 내 유전자를 고효율로 편집할 수 있다. 따라서, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀은 생체 외 또는 생체 내의 생식세포 내 유전자를 편집하기 위한 용도를 가진다.
용어, "유전자 편집"은 유전자를 재배합하거나, 돌연변이를 일으켜서 유전자의 성질을 바꾸어 놓는 일을 총칭하고, 구체적으로는, 유전자 조작 기술을 총칭한다. 상세하게는, 생물의 유전체에서 특정 유전자 (예컨대, 표적 유전자)를 편집하는 것으로, 특정 염기 또는 염기서열을 인식하여 절단하고, 그 부위에 새로운 염기 또는 염기서열을 더하거나 기존의 염기 또는 염기서열을 빼거나 교체하는 방법 (즉, 유전자의 결실, 삽입, 대체, 또는 변형하는 유전자 조작 방법)으로 특정 유전자를 편집하는 것을 의미할 수 있다. 또한 생물의 유전체에서 특정 유전자 (예컨대, 표적 유전자)를 편집하는 것에 의해서 기존 유전체의 특정 부위에서 수정 또는 변경이 발생하는 것이므로, 용어 "유전자 편집"은 용어 "유전체 편집"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한 용어, "유전자 편집"은 특정 유전자를 편집하는 의미 뿐만 아니라, 재조합 유전자 기술 등을 이용하여 외래 유전자를 삽입하거나 기존의 유전자를 삭제 또는 변형시키는 유전자 조절, 유전자 조작, 유전자 교정, 유전자 재배열, 유전자 재조합 등의 의미를 모두 포함하며, 본 명세서에서 상기 용어들과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 목적 물질 (예컨대, 핵산)이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀은, 상기 엑소좀이 조류의 세포 (구체적으로, 조류의 체세포 (예컨대, 간세포) 또는 생식세포 (예컨대, 원시생식세포))로부터 분리된 엑소좀인 경우, 상기 엑소좀이 다른 세포 유래 엑소좀인 경우 대비 더욱 우수한 효율로 생식세포로 목적 물질을 전달하거나, 더욱 우수한 효율로 생식세포 내 유전자를 편집할 수 있다.
상기 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 대상체에게 투여하기에 적절한 조성물로 제조될 수 있다. 구체적으로 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 캐리어를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 캐리어에는 생리학적으로 양립될 수 있는 임의의 모든 용매, 분산매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등이 포함된다. 상기 약학적으로 허용가능한 캐리어의 예에는 하나 이상의 물, 염류액, 인산완충식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 뿐만 아니라 이들의 조합이 포함된다. 또한 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 상기 조성물을 개체에 투여하는 방식으로 사용하는 경우, 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형 (예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형 (예, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다.
상기 조성물은 일 양상에 따른 목적 물질 (예컨대, 핵산)이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 상기 목적 물질이 투여되는 세포 또는 개체에게 상기 목적 물질의 효과 (예컨대, 예방 또는 치료, 또는 유전자 편집 효과)를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 질환의 중증도, 개체의 연령, 체중, 건강, 성별, 개체의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 조성물 당 약 0.0001 ㎍ 내지 약 2 g, 약 0.001 ㎍ 내지 약 1 g, 약 0.01 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 0.1 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 1 ㎍ 내지 약 50 mg일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 상기 조성물을 개체에 투여하는 방식으로 사용하는 경우, 상기 조성물은 경구, 정맥내, 종양내, 근육내, 경피, 점막, 코안, 기관내, 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다. 이 경우, 상기 조성물의 투여량은 예를 들어, 개체 무게를 기준으로 약 0.00001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.
상기 개체는 인간 또는 인간을 제외한 동물일 수 있다. 상기 인간을 제외한 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 메추리, 꿩, 또는 칠면조 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
또 다른 양상은 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, 분리된 생식세포 또는 유기체 내 생식세포로 목적 물질을 전달하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, 분리된 생식세포 또는 유기체 내 생식세포의 유전자를 편집하는 방법을 제공한다.
또 다른 양상은 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입 (예컨대, 형질도입 또는 형질감염)된 생식세포를 인간을 제외한 동물의 배자 (embryo) (또는 배자 내 혈관)에 주입하는 단계를 포함하는 유전자 편집 동물을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 엑소좀, 상기 목적 물질, 상기 핵산, 상기 삽입, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀, 상기 생식세포 (즉, 수여자 세포인 생식세포), 및 상기 유전자 편집은 상술한 바와 같다.
상기 유기체는 인간 또는 인간을 제외한 동물 개체, 또는 배아 (또는 배자)를 포함할 수 있다.
상기 인간을 제외한 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고, 상기 조류는 닭, 오리, 거위, 메추리, 꿩, 또는 칠면조 등을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 배아 (또는 배자)는 갓 수정된 수정란, 발생 초기 배아, 또는 수용체 배자 (recipient embryo)를 포함하고, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 유기체는 조류 또는 조류의 배자 (예컨대, 수용체 배자)일 수 있다.
상기 투여는 처리, 접촉, 주입, 도입 등의 의미를 포함한다.
상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 방식은 당업계에 공지된 일반적인 방식에 의해 수행될 수 있고 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 경우, 상기 엑소좀은 추가적인 인위적 과정을 거치지 않고도 상기 분리된 생식세포 또는 상기 유기체 내의 생식세포로 자발적 또는 자연적으로 도입 또는 흡수될 수 있다. 이로 인해, 상기 엑소좀은 상기 분리된 생식세포 또는 상기 유기체 내의 생식세포로 목적 물질 또는 핵산을 고효율로 전달할 수 있고, 그 결과 상기 분리된 생식세포 또는 상기 유기체 내의 생식세포의 유전자를 고효율로 편집할 수 있다.
또한, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포에 투여 (예컨대 처리)하는 경우, 상기 엑소좀의 상기 분리된 생식세포로의 도입 또는 흡수 효율을 높이기 위해 당업계에 알려진 일반적인 트렌스펙션 과정 (예컨대, 전기천공법 (electroporation), 리포펙션 (lipofection), 미량주입 (microinjection) 등)을 추가로 수행할 수 있다.
또한, 상기 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 유기체에 투여하는 경우, 상기 투여는 혈관내, 정맥내, 종양내, 경구, 경피, 피하, 직장, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 피내, 또는 이들의 조합의 경로로 투여되는 것일 수 있다.
상기 유전자 편집 동물을 제조하는 방법에서, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀이 도입된 생식세포는, 상술한 바와 같이, 상기 엑소좀을 분리된 생식세포에 투여 (예컨대 처리)함으로써 (또는 처리 후 상술한 당업계에 알려진 일반적인 트렌스펙션 과정을 추가로 거침으로써) 상기 생식세포 내로 상기 엑소좀을 트렌스펙션 (transfection)시키는 방식에 의해 제조될 수 있다.
상기 유전자 편집 동물을 제조하는 방법에서, 상기 배자는 구체적으로 수용체 배자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 수용체 배자는 원시생식세포가 혈관을 따라 이동하는 발달 시기의 배자를 의미할 수 있다.
상기 유전자 편집 동물을 제조하는 방법에서, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입된 생식세포를 인간을 제외한 동물의 배자 (또는 배자 내 혈관)에 주입하는 단계는, 당업계에 알려진 일반적인 주입 방식 (예컨대, 미량주입 (microinjection) 등)에 의해 수행될 수 있다.
상기 유전자 편집 동물을 제조하는 방법에서, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 인간을 제외한 동물의 배자 (또는 배자 내 혈관)에 주입하는 경우, 상기 엑소좀은 배자 내 생식세포로 상기 핵산을 전달하고, 전달된 핵산에 의해서 배자 내 생식세포의 유전자가 편집되며, 유전자 편집된 배자로부터 유전자 편집된 동물이 발생될 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 유전자 편집 동물을 제조하는 방법은 유전자 편집 조류를 제조하는 방법일 수 있다. 이 경우, 상기 유전자 편집 조류를 제조하는 방법은 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입된 생식세포를 조류의 배자 (또는 배자 내 혈관)에 주입하는 단계 후에, 상기 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입된 생식세포가 주입된 배자를 포함하는 난을 배양 및 부화하여 유전자 편집 조류를 생산하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 유전자 편집 조류를 생산하는 단계는 예를 들어, 상기 배자를 포함하는 난을 밀봉한 다음 적절한 시간 동안 배양하여 실시될 수 있다. 그런 다음, 상기 배자를 포함하는 난을 배양 및 부화하고, 성성숙에 이른 수용체를 검정교배를 통해 유전자 편집된 조류를 생산할 수 있다. 또한, 상기 유전자 편집 조류를 생산하는 단계는 당업계에 알려진 일반적인 방식에 의해 수행될 수 있다. 추가로, 유전자 편집 조류의 확인은 예를 들어, 혈액으로부터 얻은 유전체 DNA를 주형으로 이용하여 PCR (polymerase-chain reaction), 실시간 PCR 방법, 또는 염기서열분석법으로 서열이 편집되어 있는 지 여부를 검사하여 실시할 수 있다.
상기 유전자 편집 동물에는 형질전환 동물도 포함되며, 용어 "유전자 편집 동물"은, 용어 "형질전환 동물"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 생식세포로 목적 물질을 전달하기 위한 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 생식세포 내 유전자를 편집하기 위한 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물을 제조하기 위한 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 생식세포 내 유전자 편집용 조성물을 제조하기 위한 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀의 용도를 제공한다.
상기 용도에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 상기 방법에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 상기 방법에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)이 내부에 삽입된 엑소좀은, 생체 외 및 생체 내의 생식세포 내 목적 물질 전달 및 유전자 편집을 가능하게 하므로, 동물로부터 원시생식세포 등의 생식세포를 분리하고 배양하는 과정 없이 형질전환 또는 유전자 편집 동물을 제조하기 위한 시스템에 활용될 수 있다.
따라서, 일 양상에 따른 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)이 내부에 삽입된 엑소좀에 따르면, 형질전환 또는 유전자 편집 동물 생산을 위한 리포좀 및 바이러스 매개 생식세포 내 유전자 전달 기술의 낮은 효율을 극복하고, 원시생식세포 등의 생식세포의 분리 및 배양의 한계가 있었던 기존 기술의 문제점을 해소하여, 형질전환 또는 유전자 편집 동물 (예컨대, 형질전환 또는 유전자 편집 조류)을 효율적으로 제조할 수 있으므로, 야생종 및 멸종 위기 종을 보존 및 복원하는 데 이바지할 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)이 내부에 삽입된 엑소좀은, 인간의 생식세포를 대상으로 하는 치료 목적의 전달체 또는 유전자 편집 도구로서 활용될 수 있다.
도 1은 일 실시예에 따른 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체의 제조 과정, 및 상기 복합체를 이용한 체외 배양된 생식세포 및 동물 생체 내 목적 물질 전달 및 유전자 편집 과정을 개략적으로 나타내는 모식도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀에 대하여 Cryo-EM 이미징을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 3은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀에 대하여 western blot 분석을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4는 일 실시예에 따른 조류 간세포를 현미경으로 관찰한 이미지 (A) 및 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀을 Cryo-EM으로 관찰한 이미지 (B)를 나타내는 도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀에 대하여 NTA 분석을 수행한 결과로서 엑소좀의 사이즈 분포를 나타내는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 조류 간세포로부터 엑소좀을 분리하는 방법에 의해 수득된 최종 농축물 (즉, 엑소좀을 포함하는 총 단백질)에 포함된 엑소좀 입자의 농도를 분석한 NTA 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀에 대하여 western blot 분석을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 (PGC-Exo) 및 조류 간세포 유래 엑소좀 (LMH-Exo)의 조류 원시생식세포 내로의 흡수능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (Mock: 미처리군; Dio-labeled PGC-Exo: Dio lipophilic dye가 부착된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 처리군; Dio-labeled LMH-Exo: Dio lipophilic dye가 부착된 조류 간세포 유래 엑소좀 처리군; x축: 형광 세기; y축: 세포의 개수).
도 9는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 원시생식세포에 처리한 후, EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 원시생식세포를 촬영한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 10은 도 9의 촬영 이미지를 바탕으로 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 원시생식세포의 비율 (%)을 수치적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에 처리한 후, EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 성축 유래 생식세포를 촬영한 결과를 나타내는 이미지이다 (NC: 미처리군; LIPO: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약 및 목적 물질의 처리군; EXO: 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질이 삽입된 복합체 처리군).
도 12는 도 11의 촬영 이미지를 바탕으로 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 성축 유래 생식세포의 비율 (%)을 수치적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (NC: 미처리군; LIPO: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약 및 목적 물질의 처리군; EXO: 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질이 삽입된 복합체 처리군).
도 13은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 원시생식세포에 처리한 후, 상기 처리된 원시생식세포에서의 유전자 편집 결과를 나타내는 도이다 (A: 조류 원시생식세포에서의 유전자 편집을 위한 표적 부위 (Hoxb13 유전자의 엑손 2 부위) 및 프라이머의 결합 부위를 나타냄; B: 상기 표적 부위에서의 유전자 편집 결과를 나타냄 (B의 Edited sequence에서 연회색 처리된 부위는 삭제된 서열을 의미함)).
도 14는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 조류 수용체 배자의 혈관 내로 주입한 후, 상기 배자의 생식선 내에서 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 세포를 촬영한 이미지이다.
도 2는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀에 대하여 Cryo-EM 이미징을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 3은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀에 대하여 western blot 분석을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 4는 일 실시예에 따른 조류 간세포를 현미경으로 관찰한 이미지 (A) 및 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀을 Cryo-EM으로 관찰한 이미지 (B)를 나타내는 도이다.
도 5는 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀에 대하여 NTA 분석을 수행한 결과로서 엑소좀의 사이즈 분포를 나타내는 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 조류 간세포로부터 엑소좀을 분리하는 방법에 의해 수득된 최종 농축물 (즉, 엑소좀을 포함하는 총 단백질)에 포함된 엑소좀 입자의 농도를 분석한 NTA 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀에 대하여 western blot 분석을 수행한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 8은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 (PGC-Exo) 및 조류 간세포 유래 엑소좀 (LMH-Exo)의 조류 원시생식세포 내로의 흡수능을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (Mock: 미처리군; Dio-labeled PGC-Exo: Dio lipophilic dye가 부착된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 처리군; Dio-labeled LMH-Exo: Dio lipophilic dye가 부착된 조류 간세포 유래 엑소좀 처리군; x축: 형광 세기; y축: 세포의 개수).
도 9는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 원시생식세포에 처리한 후, EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 원시생식세포를 촬영한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 10은 도 9의 촬영 이미지를 바탕으로 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 원시생식세포의 비율 (%)을 수치적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 일 실시예에 따른 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에 처리한 후, EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 성축 유래 생식세포를 촬영한 결과를 나타내는 이미지이다 (NC: 미처리군; LIPO: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약 및 목적 물질의 처리군; EXO: 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질이 삽입된 복합체 처리군).
도 12는 도 11의 촬영 이미지를 바탕으로 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 조류 성축 유래 생식세포의 비율 (%)을 수치적으로 분석한 결과를 나타내는 그래프이다 (NC: 미처리군; LIPO: Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약 및 목적 물질의 처리군; EXO: 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질이 삽입된 복합체 처리군).
도 13은 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 체외 배양된 조류 원시생식세포에 처리한 후, 상기 처리된 원시생식세포에서의 유전자 편집 결과를 나타내는 도이다 (A: 조류 원시생식세포에서의 유전자 편집을 위한 표적 부위 (Hoxb13 유전자의 엑손 2 부위) 및 프라이머의 결합 부위를 나타냄; B: 상기 표적 부위에서의 유전자 편집 결과를 나타냄 (B의 Edited sequence에서 연회색 처리된 부위는 삭제된 서열을 의미함)).
도 14는 일 실시예에 따른 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, EGFP 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 조류 수용체 배자의 혈관 내로 주입한 후, 상기 배자의 생식선 내에서 EGFP를 발현하여 형광을 나타내는 세포를 촬영한 이미지이다.
이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.
실시예 1. 조류 세포로부터 엑소좀의 분리 및 분리된 엑소좀의 특성 확인
조류의 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하고, 분리된 엑소좀의 특성을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 조류 (구체적으로, 닭)의 원시생식세포 (primordial germ cell)를 혈청과 항생제가 제거된 배지에서 배양한 후, ExoQuick® ULTRA EV Isolation Kit를 사용하여 키트 제조사의 지시에 따라 세포 배양액으로부터 엑소좀을 분리하였다. 구체적으로, 조류 원시생식세포를 20% FBS, 2% chicken serum, 1× nucleosides, 2 mM l-glutamine, 1× nonessential amino acids, β-mercaptoethanol, 10 mM sodium pyruvate, 1× antibiotic-antimycotic, human basic fibroblast growth factor (10 ng/ml)을 보충한 knockout DMEM 배지 (Gibco)에서 배양하였다. 그 후, 배양된 조류 원시생식세포를 FBS가 없는 배지에서 배양하여 세포 배양액을 수확하였고, 상기 세포 배양액을 300 xg의 속도로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터 (Merck Millipore)를 이용하여 차례로 여과하여 마이크로베지클을 제거하였다. 그 후, 마이크로베지클이 제거된 상층액을 ExoQuick® ULTRA EV Isolation Kit (System Biosciences)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 원심분리하여 펠렛을 수득하였고, 수득된 펠렛을 PBS에 재현탁하고, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter (100 kDa)를 사용하여 순수한 엑소좀으로 농축시켜 조류 원시생식세포로부터 분리된 엑소좀을 수득하였다.
또한, 조류 (구체적으로, 닭)의 간세포 (Hepatocellular carcinoma cell line, LMH; 도 4의 A)를 10% FBS를 보충한 Waymouth's Medium (Gibco)에서 배양하였고, 이때 상기 배양은 0.1% gelatin으로 코팅한 culture dish에서 수행되었다. 상기 배양된 조류 간세포를 FBS가 없는 배지에서 배양한 후 세포 배양액을 수확하였고, 상기 세포 배양액을 300 xg의 속도로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 0.45 ㎛ 필터와 0.22 ㎛ 필터 (Merck Millipore)를 이용하여 차례로 여과하여 마이크로베지클을 제거하였다. 그 후, 마이크로베지클이 제거된 상층액을 ExoQuick-TC™ Exosome Precipitation Solution (System Biosciences)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 원심분리하여 펠렛을 수득하였고, 수득된 펠렛을 PBS에 재현탁하고, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter (100 kDa)를 사용하여 순수한 엑소좀으로 농축시켜 조류 간세포로부터 분리된 엑소좀을 수득하였다.
분리된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀의 형태 및 크기를 확인하기 위하여 Cryogenic Electron Microscopy (Cryo-EM) 이미징을 수행하였고, 엑소좀 특이적 마커를 이용하여 western blot 분석을 수행하여 분리된 엑소좀의 특성을 확인하였다. 더하여 분리된 조류 간세포 유래 엑소좀에 대하여도 엑소좀의 형태 및 크기를 확인하기 위하여 Cryogenic Electron Microscopy (Cryo-EM) 이미징을 수행하였고, Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) 분석을 수행하여 엑소좀의 사이즈 분포 및 농도를 확인하였으며, 엑소좀 특이적 마커를 이용한 western blot 분석을 수행하여 분리된 엑소좀의 특성을 확인하였다.
그 결과, 도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 조류 원시생식세포로부터 분리된 엑소좀은, 세포막의 구조와 동일 또는 유사한 인지질 이중막을 가지며 직경의 길이는 약 50 내지 150 nm 또는 약 80 내지 120 nm (구체적으로는, 약 100 nm)이며 (도 2), Beta (β)-actin (ACTB) 단백질 및 CD9 단백질을 포함함을 확인하였다 (도 3).
또한, 도 4 내지 도 7에 나타낸 바와 같이, 조류 간세포로부터 분리된 엑소좀은, 세포막의 구조와 동일 또는 유사한 인지질 이중막을 가지며 (도 4의 B), 직경의 길이는 약 50 내지 250 nm, 약 60 내지 200 nm, 약 70 내지 150 nm, 약 80 내지 130 nm, 또는 약 90 내지 110 nm 이고 (도 5), 상술한 조류 간세포로부터 엑소좀을 분리하는 방법에 의해 수득된 최종 농축물 (즉, 엑소좀을 포함하는 총 단백질)에 포함된 엑소좀 입자의 농도는 약 6x107 particles/μg protein 이며 (도 6), CD81 (Cluster of Differentiation 81) 단백질 및 Hsp70 (70 kilodalton heat shock proteins) 단백질을 포함함을 확인하였다 (도 7).
실시예 2. 조류 세포 유래 엑소좀의 동물 생식세포 내 흡수능 확인
상기 실시예 1에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 및 조류 간세포 유래 엑소좀 각각에 대하여, 체외 배양된 동물 (예컨대, 조류) 생식세포 내로의 흡수 여부를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 및 조류 간세포 유래 엑소좀 각각에 녹색 형광 염료인 Dio lipophilic dye를 부착하고, 상기 형광 염료가 부착된 2종의 엑소좀 각각을 체외 배양된 조류 (닭) 원시생식세포에 처리한 후 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 유세포 분석 (Flow cytometry)을 통해 상기 2종 엑소좀 각각의 조류 (닭) 원시생식세포 내 흡수를 확인하였다. 또한, 엑소좀을 처리하지 않은 조류 (닭) 원시생식세포를 대조군 (Mock)으로 사용하였다. 구체적으로, 상기 엑소좀 미처리 대조군 (Mock)에서 형광 발현 세포의 비율이 0%인 형광 세기 범위 (도 8의 그래프의 중앙에 bar로 표시된 형광 세기 구간)을 도출하고, Dio lipophilic dye가 부착된 상기 2종의 엑소좀 각각을 처리한 조류 (닭) 원시생식세포에서 형광 세기가 상기 도출된 범위에 속하는 형광을 나타내는 조류 (닭) 원시생식세포의 비율을 측정하여, 상기 2종의 엑소좀 각각의 조류 (닭) 원시생식세포 내로의 흡수능을 분석하였다 (도 8 참고).
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 1에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 및 조류 간세포 유래 엑소좀은 유사한 수준으로 체외 배양된 조류 원시생식세포 내로 고효율로 흡수됨을 확인하였다 (조류 원시생식세포 유래 엑소좀의 흡수능: 약 10.5%; 조류 간세포 유래 엑소좀의 흡수능: 약 10.3%).
본 실시예를 통해, 조류 원시생식세포, 간세포 등과 같은 조류 세포 유래 엑소좀은 동물 (예컨대, 조류) 생식세포 내로 고효율로 흡수되므로, 상기 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자 등)을 삽입하여 이용하는 경우 목적 물질을 동물 (예컨대, 조류) 생식세포 내로 고효율로 전달할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. 조류 세포 유래 엑소좀 및 목적 물질의 복합체 제조
조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체를 제조하였다. 본 명세서에서 사용된 용어 "복합체"는 엑소좀 내부에 목적 물질이 삽입되어 있는 상태의 엑소좀을 의미한다.
구체적으로, Exofect™ 용액 (System Biosciences), 상기 실시예 1에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 또는 조류 간세포 유래 엑소좀, 목적 물질인 EGFP (Enhanced green fluorescent protein) 발현 플라스미드 DNA, 그리고 PBS를 상기 Exofect™ 용액 제조사의 지시에 따라 혼합한 후 37℃ 온도에서 10분간 배양하여 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 또는 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 수득하였다.
또한, Exofect™ 용액 (System Biosciences), 상기 실시예 1에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 또는 조류 간세포 유래 엑소좀, 목적 물질인 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA, 그리고 PBS를 상기 Exofect™ 용액 제조사의 지시에 따라 혼합한 후 37℃ 온도에서 10분간 배양하여 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 또는 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 수득하였다. 상기 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA는, Hoxb13 유전자의 엑손 2를 표적하는 CRISPR/Cas9 시스템 (가이드 RNA 및 Cas9 단백질)을 발현하고 서열번호 1의 염기서열을 포함한다. 즉, 상기 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA는, Hoxb13 유전자의 엑손 2를 표적으로 하는 가이드 RNA를 암호화하는 염기서열 (서열번호 2) 및 Cas9 단백질을 암호화하는 염기서열 (서열번호 3)을 포함한다.
실시예 4. 조류 세포 유래 엑소좀 및 목적 물질의 복합체의 동물 생식세포로의 목적 물질 전달 효과 확인
조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체의 체외 배양된 동물 (예컨대, 조류) 생식세포로의 목적 물질 전달 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제조된, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질인 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 약 15 μg/2x105 cells 또는 약 30 μg/2x105 cells의 농도로, 체외 배양된 조류 (닭) 원시생식세포에 처리한 후 2일 뒤에 EGFP를 발현하는 세포를 형광현미경 하에서 관찰하였고, 유세포 분석 (Flow cytometry)을 통해 상기 엑소좀 복합체가 처리된 전체 세포 중에서 EGFP를 발현하는 세포의 비율을 측정하였다.
그 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체의 처리 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 체외 배양된 조류 원시생식세포에서 EGFP의 발현 수준이 증가함을 확인하였고, 이를 통해, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질인 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체는, 체외 배양된 조류 원시생식세포에 고효율로 트렌스펙션되어 목적 물질인 플라스미드 DNA를 고효율로 전달함을 확인하였다.
또한, 상기 실시예 3에서 제조된, 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질인 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 약 1 μg/1x105 cells, 약 5 μg/1x105 cells, 또는 약 10 μg/1x105 cells의 농도로, 체외 배양된 조류 (닭) 성축 유래 생식세포 (구체적으로는, 정원줄기세포 (Spermatogonial stem cells))에 처리한 후 4일 뒤에 EGFP를 발현하는 세포를 형광현미경 하에서 관찰하였고, 유세포 분석 (Flow cytometry)을 통해 상기 엑소좀 복합체가 처리된 전체 세포 중에서 EGFP를 발현하는 세포의 비율을 측정하였다. 또한, 상기 엑소좀 복합체를 처리하지 않은 조류 (닭) 성축 유래 생식세포 (NC) 및 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약과 함께 EGFP 발현 플라스미드 DNA를 처리한 조류 (닭) 성축 유래 생식세포 (LIPO)를 대조군으로 사용하였다.
그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이, 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체의 처리에 의해 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에서 EGFP의 발현 수준이 증가함을 확인하였고, 특히 상기 복합체의 처리 농도가 약 2 내지 9 μg/1x105 cells, 약 3 내지 7 μg/1x105 cells, 약 4 내지 6 μg/1x105 cells, 또는 약 5 μg/1x105 cells인 경우, 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에서 EGFP의 발현 수준이 현저히 증가함을 확인하였다. 이를 통해, 조류 간세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질인 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체는, 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에 고효율로 트렌스펙션되어 목적 물질인 플라스미드 DNA를 고효율로 전달함을 확인하였다. 또한, Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약 및 EGFP 발현 플라스미드 DNA를 함께 체외 배양된 조류 성축 유래 생식세포에 처리한 경우 (대조군; LIPO), 상기 성축 유래 생식세포에서 EGFP가 거의 발현되지 않음을 확인하였다. 상기 Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 시약은 당업계에서 일반적으로 사용되는 형질감염 시약으로서, 목적 물질 (핵산)을 리포좀화하여 세포내로 전달하는 기능을 한다. 따라서, 목적 물질 (예컨대, 플라스미드 DNA)을 생식세포 내로 전달함에 있어서, 당업계에서 가장 일반적으로 사용되는 리포좀화 방식은 그 전달 효율이 현저히 낮음을 알 수 있었다.
본 실시예를 통해, 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자)이 삽입된 복합체는, 동물 (예컨대, 조류) 생식세포로 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자)을 고효율로 전달할 수 있음을 확인하였다. 특히, 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 외래 유전자가 삽입된 복합체는, 기존의 리포좀화 방식 대비 현저히 우수한 효율로 동물 (예컨대, 조류) 생식세포로 외래 유전자를 전달할 수 있어, 생식세포로 외래 유전자를 전달하는데 한계가 있었던 기존 기술의 문제점을 해소할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 5. 조류 세포 유래 엑소좀 및 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA의 복합체의 동물 생식세포에서의 유전자 편집 효과 확인
조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체의 체외 배양된 동물 (예컨대, 조류) 생식세포에서의 유전자 편집 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제조된, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (Hoxb13 유전자의 엑손 2를 표적하는 가이드 RNA (도 13의 A) 및 Cas9 단백질을 발현하는 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA)가 삽입된 복합체를, 체외 배양된 조류 (닭) 원시생식세포에 처리한 후 2일 뒤에, 상기 엑소좀 복합체가 처리된 세포로부터 genomic DNA를 추출하여 유전자 편집 여부를 확인하였다. Genomic DNA PCR을 위해, Hoxb13 유전자의 인트론 1과 엑손 2에 각각 결합하는 프라이머를 디자인하였다 (Forward primer: CCTCACGTTGGTGGTCGTTA (서열번호 4); Reverse primer; CACCCTCCTGTTCTGGAACC (서열번호 5); 도 13의 A). 상기 프라이머를 이용하여 상기 추출된 genomic DNA에 대하여 PCR을 수행한 후 증폭된 PCR 산물을 T vector에 삽입하여 DNA 시퀀싱을 통해 유전자 편집 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 상기 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체는, 체외 배양된 조류 원시생식세포 내로 트렌스펙션되어 상기 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA를 전달하고, 이로 인해 체외 배양된 조류 원시생식세포 내 표적 유전자인 Hoxb13 유전자의 엑손 2 부위의 일부 염기 또는 일부 염기서열이 삭제됨으로써 표적 부위의 유전자가 편집되었음을 확인하였다 (도 13의 B).
본 실시예를 통해, 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 CRISPR/Cas9 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체는, 동물 (예컨대, 조류) 생식세포에서 표적 유전자를 고효율로 편집할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 6. 조류 세포 유래 엑소좀 및 목적 물질의 복합체의 동물 생체 내 (in vivo) 생식세포로의 목적 물질 전달 효과 확인
조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (구체적으로는, 플라스미드 DNA)이 삽입된 복합체의 동물 (예컨대, 조류) 생체 내 (in vivo) 생식세포로의 목적 물질 전달 효과를 확인하였다.
구체적으로, 원시생식세포가 혈관을 따라 이동하는 발달 시기의 조류 (닭) 수용체 배자 (recipient embryo)를 수득한 후, 상기 실시예 3에서 제조된 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질인 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 마이크로인젝션 (microinjection)을 통해 상기 수용체 배자의 혈관 내로 주입하였다. 그 후, 3 내지 4일 뒤에 상기 수용체 배자로부터 생식선 조직을 수확하여 형광현미경 하에서 생식선 조직 내 형광 발현 세포를 확인하였다.
그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, 조류 원시생식세포 유래 엑소좀 내부에 EGFP 발현 플라스미드 DNA가 삽입된 복합체를 조류 수용체 배자의 혈관 내로 주입하는 경우, 상기 복합체는 조류 수용체 배자의 혈관 내에 존재하는 원시생식세포 내로 도입되어 EGFP 발현 플라스미드 DNA를 전달하고, 상기 플라스미드 DNA가 도입된 원시생식세포는 조류 수용체 배자의 생식선 내로 이동하여 EGFP를 발현하는 것임을 확인하였다.
본 실시예를 통해, 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자)이 삽입된 복합체는, 동물 (예컨대, 조류) 생체 (예컨대, 배자) 내 생식세포로 목적 물질을 고효율로 전달할 수 있음을 확인하였고, 이로 인해, 동물 (예컨대, 조류) 생체 (예컨대, 배자) 내 생식세포에서 유전자 편집 또한 가능할 수 있음을 알 수 있었다. 이를 통해, 조류 세포 유래 엑소좀 내부에 목적 물질 (예컨대, 외래 유전자)이 삽입된 복합체는, 동물 (예컨대, 조류) 생체 (예컨대, 배자) 내로 바로 주입되는 것에 의하여 동물 생체 내의 생식세포 내 목적 물질 전달 및 유전자 편집을 가능하게 하므로, 동물로부터 원시생식세포 등의 생식세포를 분리하고 배양하는 과정 없이 형질전환 또는 유전자 편집 동물 (예컨대, 형질전환 또는 유전자 편집 조류)을 제조하기 위한 시스템에 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (15)
- 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 포함하는 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 조류 세포로부터 분리된 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 줄기세포, 체세포, 생식세포, 또는 암세포로부터 분리된 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 원시생식세포 (primordial germ cell) 또는 간세포 (hepatocyte)로부터 분리된 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 50 내지 250 nm의 직경을 가지는 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 엑소좀은 Beta (β)-actin (ACTB), CD9, CD81, 및 Hsp70으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질을 발현하는 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 목적 물질은 핵산, 단백질, 항체, 및 약물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 목적 물질은 CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분을 포함하는 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생식세포는 원시생식세포, 정원줄기세포, 난원줄기세포, 정원세포, 난원세포, 정모세포, 난모세포, 정세포, 난포세포, 정자, 난자, 또는 이들의 조합인 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 생식세포는 시험관 내 (in vitro), 생체 외 (ex vivo), 또는 생체 내 (in vivo)의 생식세포인 것인, 생식세포로의 목적 물질 전달용 조성물.
- 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 포함하는 생식세포 내 유전자 편집용 조성물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 핵산은 CRISPR 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성 성분을 포함하는 것인, 생식세포 내 유전자 편집용 조성물.
- 목적 물질이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, 분리된 생식세포 또는 유기체 내 생식세포로 목적 물질을 전달하는 방법.
- 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀을 분리된 생식세포 또는 유기체에 투여하는 단계를 포함하는, 분리된 생식세포 또는 유기체 내 생식세포의 유전자를 편집하는 방법.
- 핵산이 내부에 삽입되어 있는 엑소좀 또는 상기 엑소좀이 도입된 생식세포를 인간을 제외한 동물의 배자 (embryo)에 주입하는 단계를 포함하는 유전자 편집 동물을 제조하는 방법.
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