KR20190083237A - 세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

Abstract

일 양상에 따른 세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 유전체 편집 방법을 제공한다. 이에 따르면, 엑소좀의 유주활성기능을 이용하여, 핵산을 생체 내로 유효하고 특이적으로 전달할 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 위한 핵산을 암세포 유래 엑소좀에 캡슐화하여 개체에 투여할 경우, 상기 핵산은 암세포 또는 암조직으로 유효하거나 특이적으로 전달되어, 표적 핵산이 아닌 핵산을 돌연변이시키는 오프-타겟 효과(off target effect)를 감소시킬 수 있다.

Description

세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법{Composition and kit for delivering target nucleic acid containing cell-derived exosome and use thereof}

세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 유전체 편집 방법에 관한 것이다.

유전자 가위는 유전자에 결합하여 특정 DNA 부위를 절단하여 사용하는 효소 또는 이를 이용한 유전체 편집(genome editing) 기법을 말한다. 유전자 가위를 이용하여 줄기세포 또는 체세포에서 유전병의 원인이 되는 돌연변이 교정, 항암 세포 치료제와 같이 다양한 분야에서 활용할 수 있다. 유전자 가위로서, ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcriptional activator-like effector nuclease), 및 제2형 CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced repeats/CRISPR-associated) 원핵생물 획득 면역 시스템 유래 RGEN(RNA-guided engineered nuclease) 등이 알려져 있다. Cas9 뉴클레아제와 적절한 가이드 RNA를 세포 내로 전달함으로써, 세포의 유전체는 원하는 위치에서 절단되고 기존 유전자를 제거하고 새로운 유전자를 삽입할 수 있다. 유전자 가위를 이용하여 특정 DNA를 절단할 때, Cas9 뉴클레아제는 가이드(Guide) RNA의 서열에 의해 특정된 DNA 표적 서열을 절단한다. 유전자 가위를 이용하여 유전체를 편집하는 방법은 한국 공개 번호 10-2015-0101476 (2015.09.03) 등에 다수의 문헌을 통해 알려져 있다.

시험관 내에서 CRISPR/Cas9 기법을 이용하면 손쉽게 유전자를 조작할 수 있다. 반면에, 생체 내에서 치료제의 전달의 문제로 아직 유전자 편집이 어려운 편이므로, CRISPR/Cas9 기법을 이용한 치료제의 개발은 생체 외 전달 방법으로 이루어지고 있는 실정이다.

따라서, CRISPR/Cas9 기법을 생체 내 전달하기 위한 기반 기술을 개발할 필요가 있다.

세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.

세포 유래 엑소좀 및 핵산을 포함하는 핵산 전달용 키트를 제공한다.

유전체 편집 방법에 이용되는 핵산을 내부에 포함한 세포 유래 엑소좀을 이용한 유전체 편집 방법을 제공한다.

일 양상은 세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.

상기 세포는 포유동물 유래 세포일 수 있다. 상기 포유동물은 예를 들어 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소 또는 고양이이다.

상기 세포는 암세포, 줄기세포, 혈관내피 세포, 백혈구, 면역 세포, 상피 세포, 생식 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 골수 세포, 표피 세포, 골아세포, 및 신경세포로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 암세포이다. 상기 암세포는 유방암, 폐암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된 세포일 수 있다.

상기 엑소좀(exosome)은 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 약 30 nm 내지 약 500 nm, 약 30 nm 내지 약 400 nm, 약 30 nm 내지 약 300 nm, 약 30 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 200 nm, 약 50 nm 내지 약 180 nm, 약 75 nm 내지 약 180 nm, 또는 약 50 nm 내지 약 150 nm일 수 있다. 상기 엑소좀은 원형질막(plasma membrane) 또는 다낭체(multivesicular bodies: MVBs)으로부터 기원하여 세포밖으로 방출 또는 분비될 수 있다.

상기 세포 유래 엑소좀은 상기 세포로부터 분리되거나 단리된 엑소좀일 수 있다. 상기 세포 유래 엑소좀은 내재적(endogenous) 엑소좀일 수 있다. 상기 세포 유래 엑소좀은 유주활성기능(tropism)을 가질 수 있다. 예를 들어, 암세포 유래 엑소좀은 상피 세포 유래 엑소좀에 비해 암세포에 대해 친화도가 높아서, 암세포 유래 엑소좀이 암세포에 의해 더 쉽게 세포내 흡수(uptake)된다. 상기 암세포 유래 엑소좀은 생체 내 투여시 암세포 또는 암조직에 유효하게 또는 특이적으로 전달될 수 있다. 상기 엑소좀은 면역원성이 없거나 거의 없을 수 있다. 상기 엑소좀이 세포 또는 조직에 전달될 경우, 엑소좀의 내부에 함유되거나 적재(loading)된 물질(예, 핵산)은 세포 또는 조직에 유효하게 또는 특이적으로 전달될 수 있다.

상기 조성물 중 엑소좀의 양은 약 1 ㎍ 내지 약 1000 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 750 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 80 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 70 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 60 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 2.5 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 5 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 7.5 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 또는 약 10 ㎍ 내지 약 30 ㎍일 수 있다.

상기 핵산은 내재적(endogenous) 핵산 DNA), 또는 인위적(artificial) 핵산일 수 있다. 상기 핵산은 플라스미드, 바이러스 벡터, 비암호화(non-coding) RNA 분자, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 핵산은 발현 벡터일 수 있다. 상기 플라스미드는 포유동물의 세포에서 단백질을 발현시킬 수 있는 구성요소, 예를 들어, 프로모터, 단백질을 암호화하는 열린해독틀(open reading frame: ORF) 뉴클레오티드 서열, 비암호화 RNA 분자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 종결자(terminator), 핵 위치 신호(nuclear localization), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentivius: LV), 아데노바이러스 부속 바이러스(adenoassociated virus: AAV), 및 아데노바이러스(adenovirus)로 이루어진 군으로부터 선택된 바이러스 유래 벡터일 수 있다. 상기 비암호화 RNA 분자는 마이크로RNA(microRNA), 작은 간섭 RNA(small interfering RNA: siRNA), 작은 인 RNA(small nucleolar RNA: snoRNA), 작은 핵 RNA(small nuclear ribonucleic acid: snRNA), 긴 비암호화 RNA(long non-coding RNA: long ncRNA 또는 lncRNA), 가이드(guide) RNA, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 핵산은 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 뉴클레아제 시스템의 유전체 편집(genome editing)에 이용되는 구성성분일 수 있다. 상기 유전체 편집(genome editing)은 유전자 편집(gene editing) 또는 유전자 가위(genetic scissor) 기술로도 불린다. 유전체 편집은 뉴클레아제(nuclease)를 이용하여 유전체 상의 원하는 위치에 특정한 이중가닥 절단을 일으키고, DNA가 삽입, 대체, 또는 결실되어 표적 핵산을 돌연변이시키는 기법을 말한다.

상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템은 RNA-가이드 뉴클레아제(RNA-guided nuclease, RGEN) 또는 CRISPR/Cas 시스템으로도 불릴 수 있다. 상기 CRISPR/Cas 시스템은 CRISPR/Cpf1 시스템을 포함할 수 있다. 상기 Cas(CRISPR-associated) 뉴클레아제는 CRISPR/Cas 시스템에 이용되는 단백질을 말한다. Cas 뉴클레아제는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스-활성화 crRNA(trans-activating crRNA, tracrRNA)로 불리는 두 RNA와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제로서 표적 핵산의 절단, 삽입, 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다. 상기 Cas 뉴클레아제는 Cas9 폴리펩티드 또는 Cpf1 폴리펩티드일 수 있다. 상기 Cas 뉴클레아제는 비상동적 말단 결합 또는 상동 재조합에 의해 표적 핵산의 절단, 삽입, 또는 이들의 조합을 유도할 수 있다.

상기 CRISPR 뉴클레아제 시스템은 Cas 단백질 및 가이드 RNA(guide RNA)을 포함할 수 있다. 상기 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 시스템에서 표적 핵산을 인식하여 삽입 또는 결실을 유도하는 RNA 단편을 말한다. 상기 가이드 RNA는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cas 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cas 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다. 상기 가이드 RNA는 CRISPR RNA(crRNA) 및 트랜스활성화 crRNA(transactivating crRNA: tracrRNA)를 포함한 단일 사슬 RNA(single-chain RNA: sgRNA)일 수 있다. crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다

상기 핵산은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한 벡터, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함한 벡터, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 엑소좀은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터 및 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터가 각각 또는 함께 포함 또는 적재된 것일 수 있다.

상기 조성물 중 핵산의 양은 약 0.1 ㎍ 내지 약 500 ㎍, 약 0.25 ㎍ 내지 약 250 ㎍, 약 0.5 ㎍ 내지 약 100 ㎍, 약 0.75 ㎍ 내지 약 90 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 80 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 70 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 60 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 50 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 40 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 30 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 20 ㎍, 약 1 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 약 2.5 ㎍ 내지 약 10 ㎍, 또는 약 5 ㎍ 내지 약 10 ㎍일 수 있다.

상지 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo), 생체 내(in vivo), 또는 이들의 조합으로 전달되기 위한 것일 수 있다.

상기 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다. 상기 항암제는 백금 기반 약물일 수 있다. 상기 백금 기반 약물은 예를 들어, 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 트리플라틴 테트라니트레이트(triplatin tetranitrate), 페난트리플라틴(phenanthriplatin), 피코플라틴(picoplatin), 및 사트라플라틴(satraplatin)이다. 상기 조성물은 단일 또는 별개의 조성물일 수 있다.

상기 표적 핵산 전달용 조성물은 질병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다. 상기 질병은 유전질환, 암, 감염성 질환, 대사이상질환, 및 자가면역질환으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 용어 "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질병의 발생을 억제하거나 그의 발병을 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 용어 "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 질병의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 부형제, 희석제 또는 보조제를 포함하는 의미로 사용된다. 상기 담체는 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리트리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 생리식염수, PBS와 같은 완충액, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네랄 오일로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 풍미제, 유화제, 보존제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 임의의 제형으로 준비될 수 있다. 상기 조성물은 예를 들면, 경구 투여 제형(예, 분말, 정제, 캡슐, 시럽, 알약, 또는 과립), 또는 비경구 제형(예, 주사제)으로 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 전신 제형 또는 국부 제형으로 제조될 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 정맥내, 종양내, 근육내, 경구, 경피, 점막, 코안, 기관내, 피하, 또는 이들의 조합으로 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 일 양상에 따른 세포 유래 엑소좀 또는 이를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 용어 "유효한 양"은 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에게 투여되는 경우 예방 또는 치료의 효과를 나타내기에 충분한 양을 말한다. 상기 유효한 양은 당업자가 선택되는 세포 또는 개체에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 사용된 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 0.1 ㎍ 내지 약 2 g, 약 0.5 ㎍ 내지 약 1 g, 약 1 ㎍ 내지 약 500 mg, 약 10 ㎍ 내지 약 100 mg, 또는 약 100 ㎍ 내지 약 50 mg일 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내 일 수 있다. 상기 투여는 1일 1회, 1일 다회, 또는 1주일에 1회, 2주일에 1회, 3주일에 1회, 또는 4주일에 1회 내지 1년에 1회 투여될 수 있다.

다른 양상은 세포 유래 엑소좀 및 핵산을 포함하는 핵산 전달용 키트를 제공한다.

상기 키트는 항암제를 더 포함할 수 있다.

상기 세포, 엑소좀, 세포 유래 엑소좀, 핵산, 및 항암제는 전술한 바와 같다.

상기 키트는 핵산을 엑소좀에 전달하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 유전체 편집 방법에 이용되는 핵산을 내부에 포함한 세포 유래 엑소좀을 세포 또는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유전체 편집 방법을 제공한다.

상기 세포, 엑소좀, 세포 유래 엑소좀, 핵산, 및 항암제는 전술된 바와 같다.

상기 투여는 정맥내, 종양내, 경구, 경피, 피하, 직장, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 피내, 또는 이들의 조합의 경로로 투여되는 것일 수 있다. 상기 투여는 예를 들어, 정맥내 또는 종양내 투여이다.

상기 방법은 상기 개체에 항암제를 더 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 항암제는 세포 유래 엑소좀의 투여 전, 투여 후, 또는 동시에 투여될 수 있다.

상기 방법은 세포 유래 엑소좀에 유전체 편집 방법에 이용되는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 도입은 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 미량주입(microinjection), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다. 상기 도입은 공-형질주입(co-transfection) 또는 단계적 형질주입(serial-tranfection)일 수 있다.

도 1a에서, PARP-1을 표적으로 하는 CRISPR/Cas9으로 적재된 PARP-1종양 유래 엑소좀과 항암제(시스플라틴)을 병용 투여한 경우 암세포 증식을 저해하는 활성을 나타낸다. 또한, 종양-유래 엑소좀(SKOV3-Exo)는 유주활성기능(tropism) 때문에 상피세포-유래 엑소좀(HEK293-Exo)과 비교하여 SKOV3 종양 활성 내에 축적이 가속될 수 있다.

일 양상에 따른 세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 유전체 편집 방법에 따르면, 엑소좀의 유주활성기능을 이용하여, 핵산을 생체 내로 유효하고 특이적으로 전달할 수 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 위한 핵산을 암세포 유래 엑소좀에 캡슐화하여 개체에 투여할 경우, 상기 핵산은 암세포 또는 암조직으로 유효하거나 특이적으로 전달되어, 표적 핵산이 아닌 핵산을 돌연변이시키는 오프-타겟 효과(off target effect)를 감소시킬 수 있다.

도 1a은 난소암 세포에 Cas9:sgRNA 시스템 및 시스플라틴의 조합 요법의 모식도이고, 도 1b는 인간 PARP-1을 표적으로 하는 sgRNA 서열 및 cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.
도 2는 SKOV3 세포에서 Cas9:sgRNA-매개 PARP-1의 변형을 나타내는 결과이다(A: 표적 서열 a 및 표적 서열 b, B: T7E1 분석 결과, C: 면역블로팅 결과, D: PARP-1 유전자자리에서 Indel 돌연변이 위치).
도 3은 HEK293-유래 엑소좀(HEK293-Exo) 및 SKOV3-유래 엑소좀(SKOV3-Exo)의 특징을 나타낸 그래프 또는 이미지이다(A: DLS 분석 그래프, B: TEM 분석 이미지, C: AFM 분석 결과, D: 엑소좀 마커 CD63 및 TSG10의 면역블로팅 검출 이미지).
도 4는 분리된 엑소좀의 면역원성을 나타내는 그래프이다(A: 5 μg의 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo로 형질감염시 방출된 TNF-α의 양(pg/ml), B: 5 μg의 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo로 형질감염시 방출된 INF-α의 양(pg/ml), C: SKOV3-Exo의 양에 따라 방출된 TNF-α 및 INF-α의 양(pg/ml)).
도 5는 엑소좀의 세포내 흡수 및 생체내 분포를 나타내는 결과이다(A: 시험관내에서 SKOV3 세포에 흡수된 엑소좀의 공초첨 현미경 이미지, B: 시험관내에서 SKOV3 세포에 흡수된 엑소좀의 유세포분석 그래프, C: SKOV3 이종이식 마우스의 바이오형광 이미지, D: 종양에서 Cy5.5-표지된 엑소좀의 형광 강도, E: 각 장기의 바이오형광 이미지).
도 6은 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo를 형질감염시킨 SKOV3 세포의 면역블로팅 결과 및 T7E1 분석 결과이다(A: 사용된 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 SKOV3-Exo의 양에 따른 면역블로팅 이미지, B: 10 ug의 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 30 ug의 SKOV3-Exo를 사용한 경우 면역블로팅 이미지, C: Indel 돌연변이의 검출).
도 7은 CRISPR/Cas9-매개 PARP-1 저해와 시스플라틴의 조합 요법에 의한 세포 생존능 및 세포자살 유도를 나타낸 그래프이다(A: 세포 생존능(%), B: 세포자살 유도를 나타내는 유세포 분석 결과).
도 8은 SKOV3 이종이식 마우스에서 CRISPR/Cas9-적재된 엑소좀의 생체 내 항암 효과를 나타낸 결과이다(A: 절제된 종양 조직의 이미지, B: 투여 후 시간에 따른 종양의 부피(㎣), C: 종양의 무게(mg), D: 절제된 종양 조직에서 PARP-1의 면역블로팅 이미지, E: 절제된 종양 조직에서 PARP-1의 면역형광염색 이미지).

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. Cas9:sgRNA 시스템 전달용 엑소좀의 기능

1. PARP -1을 표적으로 하는 cas9 - 및 sgRNA - 발현 벡터의 준비

Cas9:sgRNA 시스템을 전달하기 위해, PARP-1을 표적으로 하는 cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 디자인하고 (주)툴젠에 의뢰하여 준비하였다. cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터, PARP-1 게놈 유전자자리(locus), 표적 서열 a, 표적 서열 b, 및 PAM 서열을 도 1b에 나타내었다.

표적 서열 a: 5'-CGAGTCGAGTACGCCAAGAGCGG-3' (서열번호 1)

표적 서열 b: 5'-ACCCTGACGTTGAGGTGGATGGG-3' (서열번호 2)

서열번호 1 및 2에서 PAM(protospacer adjacent motifs) 서열은 밑줄로 표시하였다.

Cas9은 특정 표적 위치에서 비상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ)-유래 작은 삽입/결실(insertion/deletion: indel)을 매개하고, 이에 의해 프레임시프트 돌연변이가 야기된다. Cas9:sgRNA 시스템에 의한 프레임시프트 돌연변이를 검출하기 위해, 시험관 내 T7 엔도뉴클레아제 1(T7 endonuclease 1: T7E1) 분석법을 sgRNA/Cas9-형질감염된 난소암 세포에 수행하였다.

구체적으로, 난소암 세포 SKOV3(Korean Cell Line Bank: KCLB)은 10%(v/v) FBS(Wellgen, Korea), 및 1%(w/v) 페니실린 및 스트렙토마이신 용액(Wellgen, Korea)을 보충한 RPMI1640 배지에서 배양하였다. Cas9 발현 벡터와 sgRNA 벡터를 준비된 SKOV3에 가하고, 전기천공법 또는 LF2000(Invitrogen) 형질감염 시약을 사용하여 48 시간 동안 적재(loading)하였다. 그 후, 암세포의 게놈 DNA를 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)를 사용하여 분리하였다. 각 sgRNA 게놈 표적 위치는 하기 프라이머쌍((주)마크로젠)을 사용하여 PCR 증폭하였다.

정방향 프라이머: 5'-TGTTCGGTGGCGGCT-3' (서열번호 3)

역방향 프라이머: 5'-ATGGTACCAGCGGTCAAT-3' (서열번호 4).

증폭 산물을 정제하고, 그 중 100 ng을 열적순환기(thermocycler)를 사용하여 변성 및 어닐링하였다. 그 후, 반응물에 T7E1(New England Biolabs)을 가하고 제조자의 지시에 따라 DNA를 절단하였다. 절단된 DNA를 Gel-Doc(Bio-Rad) 시스템으로 분석하고, 밴드 강도는 ImageLab 소프트웨어(Bio-Rad)를 이용하여 정량하여 Indel의 비율을 산출하였다. T7E1 분석 결과 및 산출된 Indel 비율(%)을 도 2의 B에 나타내었다(Mock: 음성 대조군, Cas9 only: 비교군, PARP-1a: PARP-1의 표적 서열 a에 대한 sgRNA 형질감염, PARP-1b: PARP-1의 표적 서열 b에 대한 sgRNA 형질감염). 도 2의 B에 나타난 바와 같이, PARP-1 양성 SKOV3 세포에서 효율적으로 유전자편집이 일어났다. 특히, 표적 서열 a를 표적으로 하는 sgRNA의 경우 55% indel로 돌연변이가 나타났고, 표적 서열 b를 표적으로 하는 sgRNA의 경우 17% Indel로 돌연변이가 나타났다. 반면에, Cas9 단독-처리된 세포에서는 indel이 검출되지 않았다.

또한, 통상적인 형질감염 시약으로서 리포펙타민2000(LF2000)을 사용하여 형질감염시킨 경우, SKOV3 세포의 단백질을 수득하고, 항-PARP-1 항체(Cell signaling, 1:200) 및 항-튜불린 항체(AbCam)에 대해 면역블로팅을 수행하였다. 음성 대조군으로 Cas9:sgRNA 시스템을 가하지 않은 SKOV3 세포를 사용하였고, 비교군으로 cas9 발현벡터만을 형질감염시킨 SKOV3 세포를 사용하였다. 면역블로팅 이미지를 도 2의 C에 나타내었다(Mock: 음성 대조군, Cas9 only: 비교군, PARP-1a: PARP-1의 표적 서열 a에 대한 sgRNA 형질감염, PARP-1b: PARP-1의 표적 서열 b에 대한 sgRNA 형질감염). 도 2의 C에 나타난 바와 같이, PARP-1a-전달 세포에서 PARP-1의 단백질 수준은 PARP-1b-전달 세포의 단백질 수준에 비해 더 많이 감소되었다. 이 결과는 T7E1 분석법에서의 결과와 일치하였다.

다음으로, PARP-1a-형질감염된 세포에서 돌연변이 빈도를 측정하기 위해, 차세대 게놈 서열분석(next genome sequencing: NGS)을 수행하고, 그 결과를 도 2의 D에 나타내었다. 도 2의 D에 나타난 바와 같이, Cas9 절단 위치에서 indel이 22%의 빈도로 검출되었다. 따라서, 효율적인 게놈 편집을 위해 2개의 sgRNA 중 PARP-1a 서열을 선별하였다.

2. 종양세포-유래 엑조좀 및 정상세포-유래 엑소좀의 준비 및 특성 확인

난소암 세포에서 CRISPR/Cas9-매개 유전자편집을 위한 효과적인 전달 물질을 조사하기 위해, HEK293 또는 SKOV3로부터 내생적(endogeneous) 엑소좀을 분리하였다.

구체적으로, 난소암 세포 SKOV3는 1.에 기재된 바와 같이 준비하였다. 인간 상피세포주 HEK293 세포(KCLB)는 10%(v/v) FBS, 및 1%(w/v) 페니실린 및 스트렙토마이신 용액을 보충한 DMEM 배지(Wellgen, Korea)에서 배양하였다. 엑소좀 분리를 위해, 세포를 FBS가 없는 배지에서 배양한 후 세포를 수확하였다. 세포를 300x g의 속도 및 4℃의 온도에서 10 분 동안 원심분리한 후, 상층액을 3000x g의 속도 및 4℃의 온도에서 10 분 동안 원심분리하고, 0.22 ㎛ 필터(Merck Millipore)로 여과하여 세포자설성 세포 및 마이크로베지클을 제거하였다. 상층액을 ExoQuickTM(System Biosciences)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 원심분리하였다. 펠렛을 PBS에 재현탁하고, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter(100 kDa)를 사용하여 순수한 엑소좀으로 농축시켰다.

분리된 HEK293-유래 엑소좀(HEK293-Exo) 및 SKOV3-유래 엑소좀(SKOV3-Exo)을 100배 희석하고, 희석된 엑소좀은 Zetasizer Nano ZS90 (Malvern)을 사용하여 동적 광 산란법(dynamic light scattering: DLS)으로 크기를 분석하였다. DLS 분석 결과를 도 3의 A에 나타내었다. 도 3의 A에 나타난 바와 같이, 약 50 내지 150 nm의 크기 분포를 갖고 두 타입의 엑소좀이 검출되었다.

또한, 투과 전자 현미경(transmission electron microscopy: TEM)(TECNAI, Phillips)으로 분석한 결과를 도 3의 B에 나타내었다. 도 3의 B에 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀은 모두 직경이 75 내지 180 nm인 막으로 둘러싸인 둥근 형태의 나노베지클이었고, 두 엑소좀은 비슷한 크기 분포 및 형태인 것으로 나타났다.

다음으로, 분리된 엑소좀의 동종성을 확인하기 위해, XE-100 AFM(Park Systems)과 PARK 시스템 XEI 소프트웨어 프로그램을 사용하여 원자력 현미경(atomic force microscopy: AFM) 분석을 수행하였다. AFM 분석 결과를 도 3의 C에 나타내었다. 도 3의 C에 나타난 바와 같이, 다양한 크기 분포의 엑소좀이 검출되었음에도 불구하고, 두 엑소좀 모두에서 균일한 형태가 나타났다.

또한, 분리된 엑소좀에서 엑소좀 마커 CD63 및 TSG101를 면역블로팅으로 분석하였다. 면역블로팅에서 항-CD63 항체(Santa Cruz) 및 항-TSG 항체(Santa Cruz)를 사용하고, 면역블로팅 이미지를 도 3의 D에 나타내었다. 도 3의 D에 나타난 바와 같이, 분리된 엑소좀에서 엑소좀 마커가 검출되었다.

3. 엑소좀의 면역원성의 확인

게놈 편집 물질을 치료학적으로 적용하기 위해서는 전달물질이 면역원성이 아니어야 한다. 엑소좀을 유전자 편집의 전달물질로 이용하기 위해, 2.에서 준비된 엑소좀이 면역원성을 자극할 수 있는지 여부를 시험하였다.

우선, 표준 Ficoll-Paque 밀도구배 원심분리법을 이용하여 신선하게 제공된 혈액으로부터 인간 말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC)를 분리하였다. 분리된 PBMC를 웰당 2 x 10⁴ 세포로 접종하고, 10%(v/v)가 보충된 RMPI1640에 현탁하였다.

5 ㎍의 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo을 각각 PBMC에 가하였다. 1시간 또는 5시간 후, TNF-α 및 INF-α를 의 양을 각각 샌드위치 ELISA 키트(Abcam) 및 VeriKine 인간 인터페론 알파 ELISA 키트(PBL Biomedical)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 측정하였다. 음성 대조군으로 엑소좀 대신에 PBS를 사용하였고, 양성 대조군으로 엑소좀 대신에 50 ng/㎖의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide: LPS) 또는 5 μM의 CpG 올리고뉴클레오티드(CpG OND)를 사용하였다. 또한, 비교군으로 PBMC를 Cas9:sgRNA 시스템을 LF2000으로 형질감염시켰다. PBMC로부터 방출된 TNF-α 및 INF-α의 양을 각각 도 4의 A 및 B에 나타내었다. 도 4의 A 및 B에 나타난 바와 같이, 내생적 엑소좀의 처리는 LPS 또는 CpG OND의 처리에 비해 면역원성을 적게 야기하였다. 그러나, LF2000의 처리는 그의 양이온성 지질 조성 때문에, TNF-α 및 INF-α 둘다의 생산을 유도하였다.

또한, 용량 의존적 방식으로 5 ㎍ 내지 20 ㎍의 SKOV3-Exo을 5 h 동안 처리한 후, TNF-α 및 INF-α의 양을 측정하고, 그 결과를 도 4의 C에 나타내었다. 도 4의 C에 나타난 바와 같이, SKOV3-Exo의 처리는 사이토카인의 경미한 유도를 야기하였다. 따라서, 양이온성 리포좀에 비하여, 천연 엑소좀의 조성이 인체의 세포막과 비슷하기 때문에, 천연 엑소좀이 생체 내 전달에 더 적합함을 확인하였다.

4. 엑소좀의 종류에 따른 세포내 및 생체내 흡수

(1) 시험관 내 세포내 흡수율

SKOV3 세포에서 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo의 세포내 내재화(internalization)를 조사하기 위해, 공초점 현미경 및 유세포 분석법을 이용하여 친지성 염료-표지된 엑소좀을 분석하였다.

우선, 3.에서 준비된 5 ㎍의 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo과, 10 μM의 Dio(녹색) 또는 Did(적색)의 친지성 형광 염료(Invitrogen)를 혼합하였다. 혼합물을 2 h 동안 4℃의 어두운 곳에 인큐베이션하여 엑소좀을 라벨링하였다. Dio 및 Did 염료는 각각 공초점 현미경 및 유세포분석을 위해 이용하였다. 혼합물을 90,000 rpm에서 40 분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 염료를 제거하고, PBS로 세척하였다. 이 단계를 2회 반복한 후 펠렛을 PBS에 재현탁하였다.

SKOV3 세포와 Dio-표지된 엑소좀을 혼합하고, 1 h 또는 3 h 동안 인큐베이션하였다. 그 후, LSM710 레이저-스캐닝 공초점 현미경 및 ZEN 소프트웨어(Carlzeiss, Germany)를 사용하여 확인하였다. 공초점 현미경 사진을 도 5의 A에 나타내었다. 도 5의 A에 나타난 바와 같이, Dio-표지된 SKOV3-Exo는 HEK293-Exo에 비해 SKOV3 세포 내에서 반점의 신호가 더 많았다.

SKOV3 세포와 Did-표지된 엑소좀을 혼합하고, 3 h 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 유세포분석기(Millipore, USA)를 사용하여 확인하였다. 유세포분석 그래프를 도 5의 B에 나타내었다. 음성 대조군으로 Cas9:sgRNA 시스템을 가하지 않은 SKOV3 세포를 사용하였다.

도 5의 B에 나타난 바와 같이, Did-표지된 SKOV3-Exo가 도입된 세포의 비율은 약 79%인 반면에, HEK293-Exo가 도입된 세포의 비율은 약 67%에 불과하였다. 또한, SKOV3 세포와 Did-표지된 엑소좀을 1 h동안 인큐베이션한 경우에도, Did-표지된 SKOV3-Exo가 도입된 세포의 비율은 약 48.97%인 반면에, HEK293-Exo가 도입된 세포의 비율은 약 15.5%에 불과하였다.

따라서, SKOV3-Exo가 HEK293-Exo에 비해 SKOV3 세포에 더 쉽게 세포내 흡수되고, 이것은 엑소좀이 그의 세포 기원에 따라 특이적인 유주활성기능(tropism)을 갖는다는 결과를 뒷받침한다.

(2) 생체내 흡수 분포

100 ㎍의 엑소좀과 10 mM의 Cy5.5 NHS 에스테르(Abcam)를 혼합하고, 2 h 동안 어두운 곳에 인큐베이션하여 엑소좀을 라벨링하였다. 4.(1)에 기재된 바와 같이 결합하지 않은 염료를 제거하였다.

HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo가 생체 내에서 암을 표적으로 할 수 있는지 여부를 결정하기 위해, 1 x 10⁷ 개의 SKOV3 세포를 마우스(암컷 BALB/C 누드 마우스, 7주령, Orient bio(Korea))의 오른쪽 옆구리에 피하주사하여 SKOV3 이종이식 마우스를 준비하였다. 종양의 크기가 약 100 ㎣에 도달할 때, 10 mg/kg의 Cy5.5-표지된 HEK293-Exo 또는 SKOV3-Exo을 마우스의 꼬리 정맥으로 정맥내 투여하였다. 바이오형광 이미지를 IVIS 이미징 시스템(PerkinElmer)을 사용하여 수득하고, 종양에서 Cy5.5-표지된 엑소좀의 형광 강도를 산출하였다. 또한, 마우스를 희생시킨 후, 생체외 바이오형광 이미지를 수득하였다. 마우스의 바이오형광 이미지, 형광 강도, 및 각 장기의 바이오형광 이미지를 각각 도 5의 C, D, 및 E에 나타내었다.

도 5의 C, D, 및 E에 나타난 바와 같이, 시험관 내 흡수 실험과 유사하게, Cy5.5-표지된 SKOV3-Exo는 생체내에서 종양 위치에 현저하게 축적되었고, 반면에 일부는 폐 및 기타 조직에서 검출되었다. 반면에, Cy5.5-표지된 HEK293-Exo는 Cy5.5-표지된 SKOV3-Exo와 비교하여 종양에서 적게 검출되었다. 또한, 엑소좀은 간 조직에서 강하게 축적되었기는 하였지만, HEK293-Exo는 HEK293-Exo에 비해 종양에서 강하게 축적되었다. 따라서, 종양-유래 엑소좀은 암세포의 막 구조를 모방할 수 있고, 암으로 그의 흡수를 촉진할 수 있음을 확인하였다.

5. 천연 전달체로서 종양-유래 엑소좀의 기능

(1) 엑소좀 내 Cas9 - 및 sgRNA - 발현 벡터의 적재

Cas9:sgRNA 시스템의 전달 물질로서 기능하는 종양-유래 엑소좀의 능력을 시험하기 위해, 플라스미드 벡터를 암호화하는 플라스미드 벡터를 전기천공법으로 종양-유래 엑소좀에 적재하였다.

구체적으로, 1.에 기재된 바와 같이 준비된 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 Neon 키트 (Invitrogen)의 R 완충액 중 엑소좀과 혼합하였다. 혼합물에 1000 V, 10 ms, 및 2 펄스의 전기를 가하여, 전기천공법으로 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 엑소좀에 적재하였다. 엑소좀을 PBS로 여러번 세척하였다. 적재 효율을 산출하기 위해, 엑소좀에 DNase Ι(NEB)를 처리하여 과량의 결합되지 않은 플라스미드를 제거하였고, 20 mM의 EDTA를 가하여 DNase Ι을 불활성화시켰다. 그 후, 엑소좀은 3,000x g의 속도로 4℃의 온도에서 10 분 동안 원심분리를 3회 반복하여 분해된 DNA를 제거하였다.

엑소좀 내의 DNA는 High Pure Plasmid Isolation kit (Roche)를 사용하여 정제하고, DNA 농도를 산출하고, DNA를 아가로스 겔 전기영동법으로 확인하였다. 1,000 ng의 DNA를 SKOV3-Exo에 도입시킨 경우, 적재 효율은 약 1.75%였다.

(2) CRISPR / Cas9 -적재된 SKOV3 - Exo 에 의한 PARP -1의 저해

CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo에 의한 PARP-1의 저해를 평가하기 위해, 면역블로팅 분석을 수행하였다.

구체적으로, 5 ㎍ 또는 10 ㎍의 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 10 ug 또는 30 ug의 SKOV3-Exo을 혼합하고, 5.(1)에 기재된 바와 같이 전기천공법으로 적재하였다. 4.(1)에 기재된 바와 같이 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo를 SKOV3 세포에 형질감염시키고, SKOV3 세포의 단백질을 수득하였다. 항-PARP-1 항체(Cell signaling) 및 항-액틴 항체(AbCam)를 사용하여 면역블로팅하였다. 한편, 형질 감염에 따른 차이를 확인하기 위해, 10 ㎍의 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 30 ㎍의 SKOV3-Exo를 사용하여 SKOV3 세포에 형질감염시켰다. 음성 비교군으로 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 가하지 않은 경우를 이용하였고, 비교군으로 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터를 LF2000을 사용하여 형질감염시킨 SKOV3 세포를 이용하였다.

면역블로팅 결과를 도 6의 A 및 B에 나타내었다(A: 사용된 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 SKOV3-Exo의 양에 따른 면역블로팅 이미지, B: 10 ㎍의 Cas9- 및 sgRNA- 발현 벡터와 30 ㎍의 SKOV3-Exo를 사용한 경우 면역블로팅 이미지).

도 6의 A 및 B에 나타난 바와 같이, CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo의 처리는 PARP-1 단백질 발현을 성공적으로 저해하였다. 그러나, SKOV3-Exo 단독은 PARP-1를 파괴하지 못했고, 이것은 종양-유래 엑소좀이 보호용(protective) 전달 물질로서 잠재력을 갖는다는 것을 보여준다. 화학적 형질감염 시약인 리포펙타민 2000에 의한 CRISPR/Cas9의 도입도 또한 PARP-1의 현저한 억제를 나타내었다. 암-유래 엑소좀 및 리포펙타민 둘다 비슷한 PARP-1 억제를 보였다.

(3) CRISPR / Cas9 에 의한 Indel 돌연변이의 확인

유전자편집을 더 평가하기 위해, SKOV3 세포에 SKOV3-Exo 또는 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo로 처리한 후, 1.에 기재된 바와 같이 T7E1 분석법을 수행하였다. T7E1 분석 결과를 도 6의 C에 나타내었다. 도 6의 C에 나타난 바와 같이, 10 ㎍의 DNA를 30 ㎍의 SKOV3-Exo에 전기천공하였을 경우, 약 27% Indel이 검출되었다. 따라서, 종양-유래 엑소좀은 플라스미드 DNA를 지질 이중막 내로 캡슐화를 통해 수신자 세포로 효과적으로 전달할 수 있고, 천연 전달체로서 이용할 수 있음을 확인하였다.

6. 시스플라틴 및 PARP -1 CRISPR / Cas9 -적재된 엑소좀의 조합 요법에 의한 상승적 세포 사멸 효과

시스플라틴(cisplatin)과 같은 백금-기반 항암제는 DNA 손상을 직접 유도할 수 있다. PARP-1 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo 및 백금 약물을 조합한 치료 요법의 치료적 잠재성을 조사하였다.

(1) 세포 생존능의 확인

SKOV3 세포의 세포 생존능에 대한 PARP-1 발현의 효과를 평가하기 위해, SKOV3 세포에 대해 CCK-8 분석법을 수행하였다.

구체적으로, 3 x 10⁴ 개의 SKOV3 세포를 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 접종하고, 세포가 부착되도록 밤새 배양하였다. 배양된 세포에 PARP-1 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo(SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9) 또는 SKOV3-Exo를 가하고, 10 μΜ의 시스플라틴(CDDP)을 가한 후, 48 h 동안 배양하였다. CCK-8 분석(Dojindo)을 사용하고, 마이크로플레이트 리더(Spectra MAX 340, Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 생존능을 산출하였다. 10 ㎍ 또는 30 ㎍의 농도의 엑소좀 단독을 양성 대조군으로 사용하였다. 산출된 세포 생존능을 도 7의 A에 나타내었다.

도 7의 A에 나타난 바와 같이, 시스플라틴 및 iPARP-1/SKOV3-Exo 단독에 의한 세포 생존율은 각각 약 21.6% 및 약 30%였다. 따라서, SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9의 단독 투여에 의해서도 SKOV3 세포의 생존능이 유의하게 감소하였다. 또한, SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9와 시스플라틴의 조합 투여는 SKOV3 난소암 세포의 증식을 약 57%까지 저해하여, 조합 투여에 의해 상승적인 항암 효과를 확인하였다.

(2) 시스플라틴 및 SKOV3 - Exo / PARP -1 sgR / Cas9 의 조합 요법에 의한 세포 사멸 유도

세포자살(apoptosis)의 유도를 평가하기 위해, 세포자살성 세포 및 세포괴사성 세포를 표지하는 FITC-아넥신 V/프로피디움 요오드화물(propidium iodide: PI)을 이용하여 세포자살성 세포를 검출하였다.

구체적으로, SKOV3 세포와 아넥신 V-FITC/PI(BD Pharmingen)를 혼합하고 제조자의 지시에 따라 염색하였다. 염색된 SKOV3 세포에 6.(1)에 기재된 바와 같은 엑소좀 제제를 처리하였다. 세포자살성 세포의 비율은 유세포분석법으로 분석하였다. 유세포분석 결과를 도 7의 B에 나타내었다.

도 7의 B에 나타난 바와 같이, 시스플라틴 및 SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9을 조합 투여한 세포의 세포자살율은 약 27.56%으로 가장 높았다. 그러나, 시스플라틴 단독 또는 SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9 단독으로 처리된 경우, 세포자살성 세포의 비율은 각각 약 11.06 및 약 11.9%에 불과하였다. 이러한 결과는 세포 생존능 시험 결과와 일치한다. 따라서, 시스플라틴 및 SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9를 이용한 조합 요법은 상승적인 종양 세포 사멸 효과가 있다는 것을 입증하였다.

7. SKOV3 이종이식 마우스에서 생체내 항암 효과

CRISPR/Cas9-적재된 엑소좀의 생체내 항암 치료 효과는 SKOV3 이종이식 마우스를 사용하여 평가하였다.

(1) 종양의 크기 및 무게의 변화

SKOV3 이종이식 마우스를 준비하기 위해, 0.5×10⁶ 개의 SKOV3 세포와 50% 마트리겔 용액(BD Biosciences)를 혼합하고, 혼합물을 마우스(암컷 BALB/C 누드 마우스, 7주령, Orient bio(Korea))의 왼쪽 옆구리에 피하주사하였다. 종양 부피가 약 200 ㎣에 도달한 후, SKOV3 이종이식 마우스에게 PARP-1 CRISPR/Cas9-적재된 SKOV3-Exo를 7.5 mg/kg의 용량으로 3일에 2회 간격으로 정맥내(i.v.) 또는 종양내(i.t.)로 투여하였다. 음성 대조군으로서, SKOV3-Exo 단독은 7.5 mg/kg의 용량으로 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.

종양의 크기는 최초 투여 후 4일마다 측정하였다. 최초 투여 후 20일에 마우스를 희생시키고, 종양을 절제하였다. 절제된 종양 조직의 이미지, 측정된 종양의 부피, 및 종양의 무게를 각각 도 8의 A, B, 및 C에 나타내었다. 도 8의 A, B, 및 C에 나타난 바와 같이, SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9의 생체내 투여에 의해 종양의 크기 및 무게가 감소하였다. 특히, SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9을 종양내 주사한 경우 정맥내 투여한 경우에 비해 종양의 크기 및 무게가 감소하였다.

(2) PARP -1의 발현 변화

PARP-1의 발현을 평가하기 위해, 두 개체의 이종이식 마우스로부터 절제된 종양 조직에 대해 면역블로팅 및 면역형광염색법을 수행하였다. 항-PARP-1 항체(Cell signaling) 및 항-액틴 항체(AbCam)를 사용하여 면역블로팅하고, 그 이미지를 도 8의 D에 나타내었다. 도 8의 D에 나타난 바와 같이, PARP-1의 수준은 각각의 이종이식 마우스들 간에 다르다는 것을 확인하였다.

또한, 절제된 종양 조직을 Optimal Cutting Technique(OCT) 화합물(Leica)에 포매하고, 조직 절편에 항-PARP-1 항체(Cell signaling) 및 알렉사 플루오르 488-접합된 염소 항-토끼 IgG(Thermo Fisher)를 사용하여 면역형광염색을 수행하고, 그 이미지를 도 8의 E에 나타내었다. 도 8의 E에 나타난 바와 같이, SKOV3-Exo/PARP-1 sgR/Cas9의 종양내 주사 뿐만아니라 정맥 내 주사는 이종이식 마우스에서 PARP-1의 발현이 억제되었다.

종합하면, 정맥내 또는 종양내로 투여된 CRISPR/Cas9-적재된 엑소좀은 종양 위치로 전달하되고 암세포의 PARP-1의 돌연변이를 유도하여 항암 효과를 야기할 수 있다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> Composition and kit for delivering target nucleic acid containing cell-derived exosome and use thereof <130> KI-119311-KR <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence a in single guide RNA sequence against human locus PARP-1 <400> 1 cgagtcgagt acgccaagag cgg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Target sequence b in single guide RNA sequence against human locus PARP-1 <400> 2 accctgacgt tgaggtggat ggg 23 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for amplifying target sequence a against human locus PARP-1 <400> 3 tgttcggtgg cggct 15 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for amplifying target sequence a against human locus PARP-1 <400> 4 atggtaccag cggtcaat 18

Claims (20)

1. 세포 유래 엑소좀을 포함하는 핵산 전달용 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 포유동물 유래 세포인 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것인 조성물.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 암세포는 유방암, 폐암, 뇌척수종양, 두경부암, 흉선종, 중피종, 식도암, 위암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종, 및 피부암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암으로부터 유래된 세포인 것인 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물 중 엑소좀의 양은 1 ㎍ 내지 1000 ㎍인 것인 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드, 바이러스 벡터, 비암호화(non-coding) RNA 분자, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 뉴클레아제 시스템에 이용되는 구성성분인 것인 조성물.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산은 Cas 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한 벡터, 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함한 벡터, 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물 중 핵산의 양은 0.1 ㎍ 내지 500 ㎍인 것인 조성물.
10. 청구항 1에 있어서, 상지 조성물은 시험관 내(in vitro), 생체 외(ex vivo), 생체 내(in vivo), 또는 이들의 조합으로 전달되기 위한 것인 조성물.
11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 항암제를 더 포함하는 것인 조성물.
12. 청구항 11에 있어서, 상기 조성물은 단일 또는 별개의 조성물인 것인 조성물.
13. 세포 유래 엑소좀 및 핵산을 포함하는 핵산 전달용 키트.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 키트는 항암제를 더 포함하는 것인 키트.
15. 유전체 편집 방법에 이용되는 핵산을 내부에 포함한 세포 유래 엑소좀을 세포 또는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 유전체 편집 방법.
16. 청구항 15에 있어서, 상기 투여는 정맥내, 종양내, 경구, 경피, 피하, 직장, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 피내, 또는 이들의 조합의 경로로 투여되는 것인 방법.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 개체에 항암제를 더 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
18. 청구항 17에 있어서, 상기 항암제는 세포 유래 엑소좀의 투여 전, 투여 후, 또는 동시에 투여되는 것인 방법.
19. 청구항 15에 있어서, 상기 방법은 세포 유래 엑소좀에 유전체 편집 방법에 이용되는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
20. 청구항 19에 있어서, 상기 도입은 전기천공법(electroporation), 리포펙션(lipofection), 미량주입(microinjection), 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것인 방법.

Images