KR20200136978A - 치료제의 표적화된 전달을 위한 엑소좀의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에서는, 질환이 있거나 장애가 있는 세포에 치료제를 전달하기 위해 미니세포처럼 기능하는 엑소좀을 사용하는 방법이 제공된다. 특히, 엑소좀은 성장 인자 구배를 사용하여 신체의 특정 영역으로 표적화될 수 있다. 이러한 구배는 또한 원하는 표적에서 형질감염된 핵산으로부터 엑소좀 내부 단백질의 발현을 유발하는 역할을 한다.

Description

치료제의 표적화된 전달을 위한 엑소좀의 용도

관련 출원에 대한 참조

본 출원은 2018년 3월 28일자로 출원된 미국 가출원 제62/649,057호의 우선권 이익을 주장하며, 이의 전체 내용은 본원에 참조로 포함되어 있다.

서열 목록에 대한 참조

본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 형식으로 제출되고 그 전문이 본원에 참조로 포함된 서열 목록을 포함한다. 2019년 3월 21일자로 생성된 상기 ASCII 사본의 이름은 UTFC.P1363WO_ST25.txt이며, 크기는 3킬로바이트이다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 생물학, 의학 및 종양학 분야에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 질환이 있거나 장애가 있는 세포에 치료제의 전달을 표적화하기 위한 엑소좀(exosome)의 용도에 관한 것이다.

엑소좀은 메신저 RNA(mRNA), 비-코딩 RNA 및 이중-가닥 게놈 DNA를 포함하는 단백질 및 폴리뉴클레오티드를 함유하는 지질 이중층을 갖는 작은 세포외 소포(extracellular vesicle)(EV)이다(참조: Kalluri, 2016; Raposo and Stoorvogel, 2013). 망상적혈구 분화의 부산물로 처음 발견된 이후(참조: Harding et al., 1984; Raposo and Stoorvogel, 2013), 이제 엑소좀은 사실상 모든 포유동물 세포에서 분비되고 모든 체액에서 발견된다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다(참조: El-Andaloussi et al., 2013; Kalluri, 2016).

엑소좀은 미세소포 및 세포 사멸체를 또한 포함하는 더 큰 그룹의 세포외 소포의 일부이다(참조: Colombo et al., 2014). 세포외 소포 중에서, 엑소좀은 통상적으로 세포내이입 경로를 통한 독특한 생물발생을 통해 구별된다. 세포내이입 소포는 엔도솜 막의 함입을 통해 생성된 많은 세포내 소포(ILV)를 포함하는 다소포체라고도 알려진 후기 엔도솜으로 성숙한다. 이 다소포체와 원형질막의 융합 가능성을 통해 엑소좀은 세포외 공간으로 방출되어 순환으로 들어간다(참조: Bastos et al., 2017; Colombo et al., 2014). 세포내이입 기원의 결과로, 엑소좀 막은 세포막과 유사한 극성을 가지며, 세포내 도메인이 루멘을 향하고 세포외 도메인이 세포외 공간을 향하도록 고정된 막 단백질을 포함한다. 엑소좀의 단백질 함량은 세포 기원에 따라 다르지만, 여러 단백질이 일반적으로 풍부해 보인다. 여기에는 테트라스파닌 패밀리의 구성원, 및 Rab 단백질 및 ESCRT 복합체의 구성원과 같은 세포내이입 및 ILV 성숙 경로의 성분이 포함된다. 흥미롭게도, 많은 다양한 세포 유형에서 유래된 엑소좀으로 수행된 다양한 프로테오믹스 연구에 의해 진핵 개시 인자, ADP 리보실화 인자, 리보솜 단백질과 같은 단백질 번역 기구와 관련된 많은 구성 요소가 식별되었다(참조: Pisitkun et al., 2004; Valadi et al., 2007). 또한, 단백질체 분석에 의해 엑소좀에서 식별된 전사 및 번역 조절인자의 아집단이 수용 세포에 전달되어 유전자 및 단백질 발현 패턴을 변경시키는 것으로 제안되었다(참조: Ung et al., 2014).

엑소좀에서 일반적으로 식별된 단백질 중에는 상피 성장 인자 수용체(EGFR)와 같은 성장 인자 수용체가 있다. EGFR은 HER2, HER3 및 HER4를 또한 포함하는 ErbB 성장 인자 수용체 계열의 구성원이다(참조: Seshacharyulu et al., 2012). 상피 성장 인자(EGF)와 같은 이의 리간드 중 하나와 결합하면, 수용체는 이량체화되어 ErbB 계열의 다른 구성원과 동종이량체 또는 이종이량체를 형성한다(참조: Seshacharyulu et al., 2012). 이 이량체화는 수용체의 고유 키나제 활성을 활성화하여 세포질 도메인에 있는 다른 주요 티로신 잔기의 자가인산화를 유도한다. 이 자가인산화 반응은 Shc 및 GRB2와 같은 SH2 및 PTB(포스포티로신 결합) 도메인을 함유하는 다른 어댑터 단백질을 동원하며, 이는 관련 단백질의 합성을 포함하여 다른 다운스트림 시그널링 활성을 매개한다(참조: Normanno et al., 2006; Tomas et al., 2014). 인산화된 EGFR은 궁극적으로 유비퀴틴화되어 엔도솜 경로로 이동되며, 이 경로로부터 막으로 다시 재순환되거나 후기 엔도솜 경로에 남아 다소포체로 통합되거나 리소좀 분해로 이어질 것이다(참조: Tomas et al., 2014). 다소포체는 엑소좀에서 유래하기 때문에, EGFR(및 기타 성장 인자)의 인산화 후 재순환이 이러한 세포외 소포에서 막 국소화에 기여할 가능성이 높다.

EGFR 시그널링은 교모세포종, 폐암 및 유방암과 같은 상이한 악성 종양의 진행에 중요한 것으로 나타났다(참조: Lim et al., 2016; Liu et al., 2012; Masuda et al., 2012; Morgillo et al., 2016; Westphal et al., 2017; Zhang et al., 2013). 아마도 이러한 이유로 엑소좀에서 EGFR에 대한 대부분의 연구는 암 발생과 관련하여 수행되었다. EGFR 시그널링은 특히 상이한 기원의 엑소좀의 세포 흡수 및 분비 패턴에 연루되어 있다. 맨틀 세포 암종 세포에서 제피티닙(EGFR 억제제)과의 항온배양은 엑소좀 흡수율을 극적으로 감소시키는 것으로 나타났다(참조: Hazan-Halevy et al., 2015). 제피티닙으로 폐암 세포를 치료하면 엑소좀 분비가 증가하여 시스플라틴 내성의 수평 전달(horizontal transfer)을 매개한다(참조: Li et al., 2016). 암세포-유래 엑소좀을 통한 EGFR의 전달은 또한 내피세포 및 T 세포와 같은 미세환경의 성분에 변화를 일으키는 것으로 알려져 있다(참조: Al-Nedawi et al., 2009; Huang et al., 2013). 보다 최근에는, EGFR을 함유하는 위암 세포에서 유래된 엑소좀이 간의 간질 세포로 전달되어 전이를 매개하는 것으로 나타났다(참조: Zhang et al., 2017). 마지막으로, 유방암 세포에서 유래된 엑소좀은 기능적 인산화 형태의 EGFR을 함유하는 것으로 나타났으며, 이는 ERK 경로의 활성화를 통해 생존을 매개하는 단핵구로 전달될 수 있다(참조: Song et al., 2016).

엑소좀에 의한 EGFR 및 단백질 번역 기구의 구성원의 전달은 세포-세포 소통의 맥락에서 명백한 생물학적 중요성을 갖는 것으로 보이지만, 이러한 특성은 특정 조직에 치료제의 전달을 표적화하고 원하는 전달 부위에서 치료 단백질 생산을 유도하는 데 이용될 수 있다.

여기서, 성장 인자 자극을 통해 엑소좀에서 단백질 합성을 유도하였다. DNA, RNA 및 단백질을 함유하는 엑소좀은 생물학적 자극에 반응하고, 이동, 증식, 시그널링 네트워크/캐스케이드의 개시, 전사 및 단백질 번역과 같은 특성을 개시할 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 미니세포처럼 기능하는 능력을 갖는 엑소좀이 본원에 제공된다. 아래에 추가로 논의된 바와 같이, 이러한 미니세포-유사 엑소좀은 다양한 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 수많은 치료 수단에 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공되며, 상기 방법은 (a) 표면에 성장 인자 수용체를 갖는 엑소좀을 수득하는 단계; (b) 상기 엑소좀을 치료 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 단계; (c) 상기 형질감염된 엑소좀을 환자에게 투여하는 단계; (d) 상기 질환 또는 장애 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 상기 엑소좀을 그 부위로 유인하고 그 부위에서 치료 단백질의 생산을 자극하여 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 환자의 병든 세포에 치료 단백질을 투여하는 방법으로 추가로 정의된다. 일부 측면에서, 단계 (a)에서 수득된 엑소좀은 환자로부터 얻은 체액 샘플에서 수득된다. 일부 측면에서, 체액 샘플은 혈액, 림프, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인물, 눈 삼출물/누액, 또는 혈청이다. 일부 측면에서, 핵산은 mRNA, 플라스미드, 또는 cDNA이다.

일부 측면에서, 질환 또는 장애는 암, 손상, 자가면역 장애, 신경계 장애, 위장 장애, 감염성 질환, 신장 질환, 심혈관 장애, 안과 장애, 피부 질환 또는 장애, 비뇨생식기 장애, 또는 골 질환 또는 장애이다. 특정 측면에서, 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암(tracheal cancer), 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암이다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애 부위는 종양이다. 일부 측면에서, 상기 암은 전이성이다. 특정 측면에서, 질환 또는 장애 부위는 전이성 결절이다.

일부 측면에서, 치료 단백질은 키나제, 포스파타제 또는 전사 인자이다. 특정 측면에서, 치료 단백질은 질환 또는 장애 부위의 세포에서 돌연변이되거나 불활성화된 단백질의 야생형 버전에 해당한다. 특정 측면에서, 치료 단백질은 질환 또는 장애 부위의 세포에서 과활성을 보이는 단백질의 우성 음성(dominant negative) 버전에 해당한다. 특정 측면에서, 질환 또는 장애는 암이고, 여기서 치료 단백질은 종양 억제인자이다. 일부 측면에서, 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 포함한다. 일부 측면에서, 형질감염은 전기천공을 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 또는 면역요법을 포함한다.

일 구현예에서, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 (a) 표면에 성장 인자 수용체를 갖는 엑소좀을 수득하는 단계; (b) 상기 엑소좀을 치료제로 형질감염시키는 단계; (c) 상기 형질감염된 엑소좀을 환자에게 투여하는 단계; (d) 상기 질환 또는 장애 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 상기 엑소좀을 그 부위로 유인하고 상기 치료제를 그 부위로 전달하여 환자의 질환을 치료하는 단계를 포함한다.

일부 측면에서, 상기 방법은 환자의 병든 세포에 치료제를 투여하는 방법으로 추가로 정의된다. 일부 측면에서, 단계 (a)에서 수득된 엑소좀은 환자로부터 얻은 체액 샘플에서 수득된다. 특정 측면에서, 체액 샘플은 혈액, 림프, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인물, 눈 삼출물/누액, 또는 혈청이다.

일부 측면에서, 치료제는 치료 단백질, 항체, 억제 RNA, 유전자 편집 시스템, 또는 소분자 약물이다. 특정 측면에서, 항체는 세포내 항원과 결합한다. 특정 측면에서, 항체는 전장 항체, scFv, Fab 단편, (Fab)2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 미니바디(minibody)이다. 특정 측면에서, 억제 RNA는 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 사전-miRNA이다. 특정 측면에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이다. 특정 측면에서, 치료 단백질은 키나제, 포스파타제 또는 전사 인자이다. 특정 측면에서, 치료 단백질은 질환 또는 장애 부위의 세포에서 돌연변이되거나 불활성화된 단백질의 야생형 버전에 해당한다. 특정 측면에서, 치료 단백질은 질환 또는 장애 부위의 세포에서 과활성을 보이는 단백질의 우성 음성 버전에 해당한다. 일부 측면에서, 소분자 약물은 영상화제(imaging agent)이다.

일부 측면에서, 상기 질환 또는 장애는 암, 손상, 자가면역 장애, 신경계 장애, 위장 장애, 감염성 질환, 신장 질환, 심혈관 장애, 안과 장애, 피부 질환 또는 장애, 비뇨생식기 장애, 또는 골 질환 또는 장애이다. 특정 측면에서, 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암이다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애 부위는 종양이다. 일부 측면에서, 상기 암은 전이성이다. 일부 측면에서, 질환 또는 장애 부위는 전이성 결절이다. 일부 측면에서, 상기 질환 또는 장애는 암이고, 여기서 치료 단백질은 종양 억제인자이다. 일부 측면에서, 상기 질환 또는 장애는 암이고, 여기서 치료제는 종양유전자를 표적화하는 억제 RNA이다.

일부 측면에서, 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 포함한다. 일부 측면에서, 형질감염은 전기천공을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 또는 면역요법을 포함한다.

추가 측면에서, 본 구현예에 따라 사용하기 위한 엑소좀은 조직 스캐폴드 매트릭스에 포함된다. 예를 들어, 이러한 매트릭스는 조직에서 분해되거나 흡수될 수 있는 매트릭스와 같은 합성 매트릭스일 수 있다. 추가 측면에서, 상기 매트릭스는 생체 조직 매트릭스일 수 있다. 일부 측면에서, 본 구현예의 엑소좀은 매트릭스에서 배양된다.

본원에 사용된 바와 같이, 특정 성분과 관련하여 "본질적으로 없는"은 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재한다는 것을 의미하는 것으로 본원에 사용된다. 따라서 조성물의 의도하지 않은 임의의 오염으로 인한 특정 성분의 총량은 0.01% 미만이다. 가장 바람직한 것은 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원의 청구범위(들)에서 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"이라는 단어와 함께 사용될 때, 단어 "a" 또는 "an"은 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.

청구범위에서 용어 "또는"의 사용은, 본 개시내용이 오직 대안 및 "및/또는"을 지칭하는 정의를 지지하더라도, 대안만을 지칭하는 것으로 명시적으로 표시되거나 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐, 용어 "약"은 값이 장치에 대한 오류의 고유한 변동, 값을 결정하기 위해 사용되는 방법, 또는 연구 대상 사이에 존재하는 변동을 포함함을 나타내기 위해 사용된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 특정 실시예는, 본 발명의 바람직한 구현예를 나타내지만, 본 발명의 사상 및 범위 내에서 이 상세한 설명으로부터 다양한 변경 및 수정이 당업자에게 명백할 것이므로 단지 예시로서 제공되는 것으로 이해되어야 한다.

다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 발명의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 여기에 제시된 특정 구현예의 상세한 설명과 함께 하나 이상의 이러한 도면을 참조하여 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1e. 엑소좀에서 EGFR 인산화. 도 1a - 상이한 인간 및 뮤린 세포주에서 얻은 엑소좀에서 EGFR 발현의 면역블롯. 엑소좀 마커 CD81을 로딩 대조군으로서, 단백질 추출물의 엑소좀 기원을 확인하기 위해 사용한다. 도 1b - 37℃에서 15분 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양한 후 MCF10A 세포가 아닌 MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀에서 EGFR의 인산화를 보여주는 면역블롯. 인산화 수준은 EGFR의 Tyr1068 잔기에 특이적인 항체를 사용하여 검출된다. EGFR 수준은 인산화의 차이를 확인하기 위해 로딩 대조군으로 표시된다. 밴드 밀도 측정 정량화는 이미지제이(ImageJ) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 1c - 37℃에서 15분 동안 rhEGF 자극의 존재 및 부재하에 MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀에서 EGFR 어댑터 단백질 Shc 및 GRB2의 존재뿐만 아니라 인산화-ERK 단백질의 증가된 수준을 보여주는 면역블롯. 엑소좀 마커 CD81을 로딩 대조군으로서, 단백질 추출물의 엑소좀 기원을 확인하기 위해 사용한다. 도 1d - GRB 면역복합체는 GRB2 특이적 항체를 사용하여 37℃에서 15분 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양하거나 항온배양하지 않고 MDA-MB-231 엑소좀의 단백질 추출물로부터 수득되었다. 면역복합체의 면역블롯 분석은 rhEGF 자극시에만 GRB2와 EGFR의 연합을 보여준다. 비특이적 이소타입 대조군 IgG를 GRB2 풀다운(pulldown)에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 동일한 용적의 자극 및 미자극 추출물을 입력 대조군(input control)으로서 β-액틴에 대해 탐색하였다. 도 1e - 풀다운 실험을 위해 Shc 항체를 중복하여 사용하고, 또한 37℃에서 15분 동안 500ng/ml rhEGF로 자극한 후에만 EGFR과의 연합을 보여주는 유사한 실험. 비특이적 이소타입 대조군 IgG를 Shc 풀다운에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 동일한 용적의 자극 및 미자극 추출물을 입력 대조군으로서 b액틴에 대해 탐색하였다.
도 2a 내지 도 2g. EGFR 인산화는 엑소좀의 함량을 변화시킨다. 도 2a - 자극되지 않거나 37℃에서 15분 동안 rhEGF 자극 후 엑소좀에서 얻은 단백질 추출물에서 실행된 루시퍼라제-기반 ATP 측정 검정. 루시페린-유래 발광은 플레이트 판독기에서 측정되었고, 임의의 단위로 표시된다. 만-휘트니(Mann-Whitney) 검정으로 유의성을 결정하였다(n = 4). 도 2b - 37℃에서 48시간 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양된 MDA-MB-231 세포의 엑소좀에 대한 면역블롯 분석으로, 미자극 엑소좀과 비교하여 pEGFR 및 GRB2 수준 둘 다의 증가를 나타냄. 도 2c - 자극되지 않거나 37℃에서 48시간 동안 500ng/ml EGF와 함께 항온배양한 후 MDA-MB-231 엑소좀에 대해 얻은 질량 분석 데이터의 세포 성분 연합 분석. 자극 및 미자극 엑소좀에 대해 식별된 중요한 단백질 목록을 얻었고, 식별된 단백질의 세포하 기원을 확인하기 위해 오픈 액세스 펀리치(FunRich) 기능 농축 분석 툴의 입력으로 사용하였다. 도 2d - 대조군 MDA-MB-231 엑소좀 및 37℃에서 48시간 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양된 엑소좀에서 식별된 단백질의 중첩을 도시하는 벤다이어그램. 도 2e - 48시간 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양하거나 항온배양하지 않고 MDA-MB-231 엑소좀의 질량 분석법 분석으로부터 얻은 개별 EGFR 및 GRB2 단백질 점수. 도 2f - 대조군 MDA-MB-231 엑소좀 및 37℃에서 48시간 동안 500ng/ml rhEGF와 함께 항온배양된 엑소좀으로부터 얻은 단백질 추출물의 BCA 분석. 만-휘트니 검정으로 유의성을 결정하였다(n = 3). 도 2g - 대조군 MDA-MB-231 엑소좀 및 37℃에서 48시간 동안 500ng/ml 및 1000ng/ml rhEGF와 함께 항온배양된 엑소좀으로부터 얻은 단백질 추출물에 대한 β-액틴 발현의 면역블롯 분석. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, ****p < 0.0001).
도 3a 내지 도 3f. 엑소좀은 전사 및 번역을 위한 기능적 성분을 함유한다. 도 3a - 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(UPLCMS)을 사용하여 MCF10A-, MDA-MB-231-, HDF, E10-, 및 NIH-3T3-유래 엑소좀 중의 유리 아미노산을 검출하였다. 데이터는 정규화된 신호 강도(log10)를 사용하여 히트맵(HeatMap)으로 표현되며, 색상 범례에 표시된 것처럼 더 강렬한 색상은 더 높은 강도 수준에 해당한다. 도 3b - E10-, NIH-3T3-, MCF10A-, HDF-, 및 MDA-MB-231-유래 엑소좀으로부터 얻은 엑소좀의 단백질 추출물 중의 eIF4A1, eIF3A 및 eIF1A의 면역블롯. CD9를 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 3c - pEMT7-GFP cDNA 발현 플라스미드와 함께 항온배양된 MCF10A- 및 MDA-MB-231-유래 엑소좀의 단백질 용해물을 사용한 시험관내 번역 검정. 세포에서 얻은 단백질 용해물을 대조군으로 사용하였다. 도 3d - CD9가 로딩 대조군으로 표시된, 엑소좀 단백질 추출물 중의 RNA 폴리머라제 II의 면역블롯 분석. 도 3e - ³⁵S-메티오닌의 존재하에 배양된 MDA-MB-231 및 E10 세포에서 유래된 엑소좀의 자가 방사선 촬영(autoradiography). 엑소좀 단독, 및 ³⁵S-메티오닌 및 사이클로헥시미드의 존재하에 배양된 엑소좀을 대조군으로 사용하였다. 도 3f - 단리 직후 또는 24시간 및 48시간 동안 무세포 조건에서 항온배양한 후 엑소좀으로부터 얻은 단백질 추출물의 BCA 정량화. 유의성은 일원 ANOVA에 이어서 터키의 다중 비교 검정(Tukey's multiple comparisons test)으로 결정되었다(*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, ****p < 0.0001, n = 3).
도 4a 내지 도 4j. 엑소좀은 DNA 전사와 캡(cap)-의존적 mRNA 번역을 통해 새로운 단백질을 합성한다. 도 4a - MDA-MB-231 세포로부터 단리되고, α-아마니틴이 존재하거나 존재하지 않고 pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공되지 않거나, 모의 전기천공되거나 전기천공된 엑소좀 중의 GFP mRNA 수준의 qPCR 분석. 발현 수준은 GAPDH로 정규화되었다. 도 4b - GFP 플라스미드로 전기천공되고 48시간 동안 무세포 조건에서 항온배양된 엑소좀의 항-GFP 항체를 사용한 면역골드(immunogold) 표지의 투과전자현미경 이미지(하단 행). 2차 항체는 음성 대조군으로만 사용되었다(상단 행). 금 입자는 검정색 점으로 표시된다. 스케일 바(Scale bar), 100nm. 도 4c - pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공되고 37℃에서 12시간, 2일 또는 1주 동안 항온배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 엑소좀 단독 및 모의-전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. 엑소좀 마커 TSG101을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 4d - GFP 플라스미드로 전기천공되고 한 달까지 여러 기간 동안 항온배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 비-전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. 엑소좀 마커 CD63을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 4e - 단리 직후(0시간) 또는 무세포 조건에서 항온배양한 후(24시간) GFP 플라스미드로 전기천공되고, 이전에 기재된 대로 배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 모의 전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. 엑소좀 마커 TSG101을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 4f - pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공되고 번역 억제제 사이클로헥시미드와 함께 배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 엑소좀 단독 및 모의 전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. TSG101을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 밴드 밀도 측정은 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 4g - GFP 플라스미드로 전기천공되고 전사 억제제 α-아마니틴과 함께 배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 엑소좀 단독 및 모의 전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. TSG101을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 밴드 밀도 측정은 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 4h - 캡-의존적 또는 캡-독립적 번역을 위한 리포터로 사용되는 바이시스트로닉(bicistronic) 플라스미드(pCDNA3-rLuc-polIRESfLuc)의 개략도. 도 4i - 바이시스트로닉 플라스미드로 전기천공된 엑소좀의 48시간 항온배양 후 생물발광에 의해 측정된 레닐라(r-Luc) 및 반딧불이 루시퍼라제(f-Luc)의 활성. 비-전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. 도 4j - CMV 프로모터 하에 발현된 반딧불이 루시퍼라제를 갖는 플라스미드의 존재 또는 부재하에 전기천공 후 48시간 동안 항온배양된 엑소좀으로부터 측정된 발광 계수.
도 5a 내지 도 5e. 엑소좀의 단백질 번역은 기능성 단백질을 생성하며 성장 인자 자극에 의해 증가될 수 있다. 도 5a - 이전에 사이클로헥시미드로 처리되고, pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공된 MDA-MB-231-유래 엑소좀과 함께 항온배양되고, 48시간 동안 사전 항온배양된, MCF10A 전기천공된 세포 및 MCF10A 세포 중의 GFP의 존재를 보여주는 공초점 현미경검사법. 비-전기천공된 MDA-MB-231-유래 엑소좀으로 처리된 MCF10A 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 도 5b - p53-GFP 발현 플라스미드로 전기천공된 MDA-MB-231-유래 엑소좀의 단백질 용해물에 대한 GFP 발현의 면역블롯 분석. 비-전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. TSG101을 엑소좀의 존재에 대한 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 5c - 모의 전기천공된 MDA-MB-231-유래 엑소좀 또는 사이클로헥시미드가 존재하거나 존재하지 않고 p53-GFP 플라스미드로 전기천공된 엑소좀으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서 p21 mRNA 발현. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 GAPDH로 정규화되었다. 도 5d - MDA-MB-231 세포로부터 단리되고, 100㎍/ml의 번역 억제제 사이클로헥시미드와 함께 항온배양된 엑소좀의 면역블롯. 엑소좀 용해물은 β-액틴 및 GAPDH에 대해 탐색되었다. 밴드 밀도 측정 정량화는 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 도 5e - pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공된 다음 37℃에서 48시간 동안 상이한 농도의 rhEGF의 존재하에 항온배양된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 모의 전기천공된 엑소좀 및 rhEGF 항온배양이 없는 엑소좀을 음성 대조군으로 표시된다. 엑소좀 마커 CD81을 로딩 대조군으로 사용한다. 밴드 밀도 측정 정량화는 이미지제이 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
도 6a 내지 도 6c. MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀은 성장 인자의 구배에 대한 화학주성을 보여준다. 도 6a - 엑소좀 역행 이동 검정을 위한 설정을 보여주는 개략도. 요컨대, MDA-MB-231 세포로부터 단리된 10×10⁹ 엑소좀을 코닝 트랜스웰(Corning Transwell)® 시스템의 바닥 웰에 놓았다. 400nm 기공이 있는 HTS 트랜스웰® 삽입물을 PBS, 20% FBS, 또는 10,000ng/ml rhEGF를 함유하는 엑소좀 현탁액 위에 놓고 37℃에서 항온배양하였다. 상단 삽입물에 있는 엑소좀의 수는 엑소좀 운동성을 평가하기 위해 상이한 시점 후에 Nanosight NTA로 측정되었다. 도 6b 및 6c - Nanosight NTA에 의해 37℃에서 4시간(도 6b) 및 24시간(도 6c) 항온배양 후 역행 이동 검정의 상단 삽입물에서 MDA-MB-231 엑소좀의 정량화. 유의성은 일원 ANOVA에 이어서 뉴먼-쿨스 다중 비교 검정(Newman-Keuls multiple comparisons test)으로 결정되었다. (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.005, ****p < 0.0001, n = 3).
도 7a 내지 도 7d. 종양-보유 마우스는 전달된 엑소좀에서 증가된 단백질 합성을 보여준다. 도 7a - 생체내 번역 실험에 대한 실험 계획을 묘사하는 개략도. 요컨대, 암컷 Balb/C 마우스에 4T1 종양을 정위로 주사하고 종양을 500 mm³까지 성장시킨 후 마우스에 pCMV-mCherry 플라스미드로 전기천공된 300억 MDA-MB-231 엑소좀을 주사하였다. 엑소좀 주사 12시간 후 마우스를 안락사시키고 엑소좀 추출을 위해 혈청을 수거하였다. 도 7b - 유사한 성장 동력학을 보여주는, 4T1 종양 및 전기천공된 엑소좀, 또는 4T1 종양 단독으로 주사된 마우스의 종양 성장을 보여주는 그래픽. 도 7c - 전기천공된 엑소좀이 주사된 건강한 마우스, 뿐만 아니라 전기천공된 엑소좀이 주사된 4T1 종양-보유 마우스 및 엑소좀 주사가 없는 4T1 종양 보유 마우스의 혈청에서 추출된 엑소좀의 Nanosight NTA 분석. 모든 엑소좀은 약 100nm에서 비슷한 크기의 피크를 보여준다. 도 7d - 상이한 동물의 혈청으로부터 수득된 엑소좀 양에 유의한 차이가 없지만, MDA-MB-231 전기천공된 엑소좀이 주사된 4T1 종양-보유 마우스에서 더 많은 엑소좀에 대한 경향을 보여주는 도 7c에 나타낸 혈청 엑소좀의 Nanosight NTA 정량화.
도 8a 내지 도 8g. 엑소좀 특성화. 도 8a - Nanosight NTA 2.1 분석 소프트웨어를 사용하여 얻은 MDA-MB-231 세포에서 수거된 엑소좀의 나노입자 추적 분석. 왼쪽 그래프는 용액 내 입자의 크기 분포를 나타내며, 104nm의 평균 크기를 보여주고, 또한 보다 큰 크기에서는 피크가 없음을 보여준다. 오른쪽 그래프는 용액 내 입자의 크기 및 농도별 분포를 나타낸다. 도 8b - 엑소좀의 원자력 현미경 이미지(왼쪽 이미지). 오른쪽 그래프는 분석된 영역 내의 입자 분포를 나타낸다. 도 8c - MDA-MB-231 엑소좀의 투과전자현미경 사진. 스케일 바 - 100nm. 도 8d - 항-CD9 항체를 사용한 면역골드 표지된 MDA-MB-231 엑소좀의 투과전자현미경 사진. 금 입자는 검정색 점으로 표시된다. 스케일 바 - 100nm. 도 8e - 상이한 세포주에서 얻은 엑소좀의 단백질 추출물 중의 엑소좀 마커 CD9, CD63 및 TSG101의 면역블롯 분석. 도 8f - 마커 CD9, CD81, CD82 및 CD63에 대한 항체를 사용하여 0.4㎛ 비드에 결합된 MDA-MB-231 세포의 엑소좀의 이미징 유세포 계측 분석. 도 8g - 이. 콜 라이(E. coli ) 접종된 면에서 콜로니가 형성되고(왼쪽), 엑소좀 접종된 면에서 콜로니가 형성되지 않음(오른쪽)을 보여주는, 이. 콜라이 및 MDA-MB-231(상단) 또는 MCF10A(하단) 엑소좀과 함께 항온배양된 LB 배양 플레이트의 대표적 이미지.
도 9a 내지 도 9b. MDA-MB-231 세포의 엑소좀에서 EGFR 인산화 및 다운스트림 생물학적 활성. 도 9a - MDA-MB-231 세포에서 수득되고 p-EGFR 및 GRB2에 대해 탐색된 단백질 추출물의 면역블롯. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용한다. 도 9b - 37℃에서 15분 동안 500ng/ml로 항온배양하거나 항온배양하지 않은 MDA-MB-231 엑소좀의 단백질 용해물의 항-EGFR 항체 풀다운으로 얻은 면역복합체의 면역블롯. 면역복합체는GRB2에 대해 탐색되었다. 비특이적 이소타입 대조군 IgG를 GRB2 풀다운에 대한 음성 대조군으로 사용하였다. 동일한 용적의 자극 및 미자극 추출물을 입력 대조군으로서 β-액틴에 대해 탐색하였다.
도 10. 다양한 세포에서 유래된 엑소좀의 프로테오믹스 분석. 마우스 간세포(Valadi et al., 2007), 마우스 섬유아세포(Luga et al., 2012), 인간 결장직장암 세포(Choi et al., 2012), 인간 혈장(Kalra et al., 2013), 인간 흉선 조직(Skogberg et al., 2013), 및 인간 소변(Gonzales et al., 2009)에서 얻은 질량 분석 데이터에서 리액톰(Reactome)(Croft et al., 2014) 데이터베이스의 단백질 번역 경로에 포함된 모든 개별 단백질의 이진 식별을 나타내는 히트맵. 검정색은 각각의 데이터세트에서 각 단백질의 존재를 나타내고, 흰색은 각 단백질의 부재를 나타낸다. 요약 열은 분석된 모든 데이터세트에서 각 단백질이 편재된 상태를 나타내며, 보다 따뜻한 색은 상이한 유형의 엑소좀 간에 보다 광범위한 분포를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11b. 다양한 기원의 엑소좀의 프로테오믹스 분석. 도 11a - 리액톰(Croft et al., 2014) 데이터베이스에서 단백질 번역과 관련된 상이한 경로와 연관된 마우스 간세포(Valadi et al., 2007), 마우스 섬유아세포(Luga et al., 2012), 인간 결장직장암 세포(Choi et al., 2012), 인간 혈장(Kalra et al., 2013), 인간 흉선 조직(Skogberg et al., 2013), 및 인간 소변(Gonzales et al., 2009)에서 얻은 질량 분석 데이터에서 식별된 단백질 수를 나타내는 히트맵. 보다 따뜻한 색은 경로당 식별된 보다 많은 수의 단백질을 나타낸다. 도 11b - HDF, NIH 3T3, MDA-MB231, MCF10A, 및 E10 세포로부터 단리된 엑소좀에서 얻은 질량 분석법으로 식별된 단백질 번역과 관련된 단백질의 단백질 점수를 나타내는 히트맵. 보다 따뜻한 색은 보다 높은 단백질 점수를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12c. 엑소좀은 단백질 번역 기구와 관련된 핵산 및 단백질을 함유한다. 도 12a - NIH-3T3, E10, 67NR, 4T1, HDF, MCF10A, MCF7, 및 MDA-MB-231 세포주의 엑소좀에서 추출한 RNA를 사용하여 qPCR을 통해 18S 및 28S rRNA를 정량화하였다. rRNA의 발현 수준은 U6 snRNA 발현으로 정규화되었다. 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 NIH 3T3, E10, 67NR, 4T1, HDF, MCF10A, MCF7, 및 MDA-MB-231을 나타낸다. 도 12b - 4T1 엑소좀 및 세포에서 추출된 RNA를 사용하여 디지털 qPCR을 통해 tRNAMet, tRNAGly, tRNALeu, tRNASer, 및 tRNAVal의 존재를 식별하였다. 각 그룹의 막대는 왼쪽에서 오른쪽으로 Leu, Met, Val, Ser 및 Gly를 나타낸다. 도 12c - eIF3A MCF10A 및 MDA-MB-231-유래 엑소좀의 존재를 보여주는 eIF4A1의 면역침강. MB231 및 MCF10A 세포 용해물을 양성 대조군으로 사용하였다. 엑소좀 마커 CD82를 로딩 대조군으로 사용하였다.
도 13a 내지 도 13e. MCF10A 및 MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀의 DNA 전사 및 mRNA 번역. 도 13a - pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공되고 37℃에서 상이한 기간 동안 항온배양된, MCF10A 세포로부터 단리된 엑소좀 중의 GFP 단백질 발현의 면역블롯. 엑소좀 단독 및 모의 전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. CD63을 로딩 대조군으로서, 엑소좀의 존재를 확인하기 위해 사용하였다. 도 13b - GFP 플라스미드로 전기천공된 MCF10A-유래 엑소좀에서 Nanosight에 의해 검출된 녹색 엑소좀의 양을 나타내는 플롯. MCF10A-유래 엑소좀, MCF10A-유래 모의 전기천공된 엑소좀, 및 α-아마니틴 및 사이클로헥시미드로 전기천공된 엑소좀을 음성 대조군으로 사용하였다. 도 13c - 녹색 형광 신호가 있는 비드의 백분율을 보여주는, 증가하는 전압을 사용하여 GFP 플라스미드로 전기천공한 후 엑소좀에 부착된 비드의 유세포 계측 분석. 도 13d - pCMV-Ova 플라스미드로 전기천공되고 37℃에서 48시간 동안 항온배양된 MDA-MB-231 엑소좀 중의 난알부민 단백질 수준의 면역블롯. β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. 도 13e - 모의 전기천공된 MDA-MB-231-유래 엑소좀 또는 p53-GFP 플라스미드로 전기천공되고 즉시 세포에 첨가되거나(0시간) 처리 전 37℃에서 48시간 동안 세포 조건에서 항온배양되는(48시간) 엑소좀으로 처리된 MDA-MB-231 세포에서 p21 mRNA 발현. 엑소좀은 RNA 추출 전에 30분 또는 48시간 동안 세포에 첨가되었다. 발현 수준은 하우스키핑 유전자 GAPDH로 정규화되었다.

엑소좀을 포함하는 세포외 소포(EV)는 시토졸 유사 물질을 둘러싸는 지질 이중층을 갖는 나노 크기의 세포간 소통 비히클이다. 엑소좀은 여러 생리적 과정에 참여하며 DNA, RNA 및 단백질을 함유한다. 일반적으로 엑소좀 내 모든 내용물은 세포에서 유래한 것으로 다른 세포에 들어가 내용물을 축적할 때까지 엑소좀에 그대로 남아 있다고 가정한다. 엑소좀은 모든 세포에 의해 대량으로 방출되며 엑소좀 자체에 대한 임의의 생물학적 중요성 없이 세포 구성 요소를 세포외 공간으로 페이로드로 운반하는 쓰레기 봉투로 간주된다.

여기에는 미니세포처럼 행동하고 자극에 생물학적으로 반응하고 세포처럼 증식하고 이동하는 능력을 나타내지만, 정의된 핵은 없는 엑소좀이 제공된다. 이러한 엑소좀은 혈청 인자에 대한 화학주성을 나타내며, EGF와 같은 성장 인자로 자극하면, 이의 표면에서 EGFR 수용체를 인산화하고 새로운 단백질의 전사 및 번역으로 이어지는 시그널링 캐스케이드를 개시할 것이다. 이러한 엑소좀을 종양이 있는 마우스에 주사하면 우선적으로 종양에 축적된다. 종합적으로, 이러한 엑소좀에 의한 단백질 번역 및 성장 인자 반응 능력은 조직 항상성 및 질환 조절에서 기능적 역할을 제공한다.

I. 본 발명의 측면

세포외 소포, 특히 엑소좀은 DNA, RNA 및 단백질과 같은 여러 구성 요소의 동정으로 지난 몇 년 동안 많은 관심을 끌었다. 더욱이, 엑소좀은 그 내용물을 다른 조직의 수용 세포로 전달하고 독특한 형태의 세포-세포 소통을 촉진함으로써 여러 다양한 생물학적 과정에 영향을 미치는 데 연루되었다(참조: Bastos et al., 2017). 대안적으로, 특히 암 또는 신경 병리학의 맥락에서 치료제를 위한 전달 비히클로서의 엑소좀의 잠재력도 보고되었다(참조: El-Andaloussi et al., 2012; Kamerkar et al., 2017). 그러나, 엑소좀의 정확한 전신 분포 패턴과 기관 향성은 아직 완전히 이해되지 않았다.

그러나, 엑소좀의 핵 및 세포질 성분은 수용 세포로의 수동적 전달을 위해 사용될뿐만 아니라 외부 자극에 반응하여 EGFR과 같은 성장 인자 수용체를 인산화하고 활성 전사 및 번역을 통해 새로운 단백질을 생성할 수 있다. 엑소좀의 외부 자극은 역행 이동과 같은 새로운 생물학적 활동을 개시시킬 수 있다. 엑소좀은 외부 자극에 대한 반응으로 미세-조정된 작업과 관련하여 원시적이기는 하지만 미니 세포처럼 기능할 수 있다고 생각할 수 있다. 사실, 최근에 엑소좀은 잠재적으로 원시세포 리보솜의 현존하는 표현을 구성할 수 있으며, 이를 위해 rRNA를 함유해야 하며, 이는 이 연구에서 확인된다고 제안되었다(참조: Sinkovics, 2015). 엑소좀은 생물학적으로 반응하며 능동적으로 성장 인자 구배로 이동한다. 액틴 리모델링이 관련될 수 있다. 따라서 액틴 중합 패턴은 엑소좀 생체분포의 조절에서 흥미로운 표적이 될 수 있다.

상이한 종으로부터 수득된 프로스타좀과 같은 소포는 해당 경로의 상이한 성분을 함유하는 것으로 나타났으며, 이는 소포가 무세포 조건에서 ATP를 생산할 수 있게 한다(참조: Ronquist et al., 2013a; Ronquist et al., 2013b). 엑소좀에서의 직접 전사는 이전에 보고된 적이 없지만, 한 연구에서는 소 백혈병 바이러스에 감염된 소 우유의 엑소좀이 역전사효소 활성을 나타내는 것으로 밝혀졌음을 보여주었다(참조: Yamada et al., 2013). 또한 최근, 암세포에서 단리된 엑소좀에서 성숙한 miRNA의 독립적인 생산이 가능하다는 것이 입증되었다(참조: Melo et al., 2014). 여기서, 엑소좀은 mRNA 번역과 결합된 DNA 전사를 통해 기능성 단백질의 새로운 합성을 위한 고유한 능력을 보유하는 것으로 입증되었다. 혈소판은 거핵구 분화 후 그 안에 남아있는 mRNA 분자로부터 단백질을 번역할 수 있다(참조: Weyrich et al., 2004). 그럼에도, 혈소판에서 새로운 mRNA 분자를 생성하는 DNA 전사는 보고되지 않았다. 또한, 폴리리보솜 및 mRNA 결합 단백질과 관련된 mRNA 번역 활성의 초점(foci)은 주요 세포체에서 절단되는 경우에도 수지상극에서 관찰된다(참조: Aakalu et al., 2001; Smith et al., 2001; Steward and Levy, 1982). 따라서 일부 세포 구조는 특정 생물학적 기능을 신속하게 지원하기 위해 핵이 없을 때 단백질 생합성 능력을 보존하고 있음이 분명하다. 단백질 번역 외에도 엑소좀은 RNA 폴리머라제 II를 통해 DNA를 전사할 수 있다. 뉴클레오솜이 없는 영역에서 네이키드 DNA의 기본 전사는 전사 기구의 최소 성분, 즉 RNA Pol II 및 6개의 일반 전사 인자(GTF)의 칵테일만으로 가능한 것으로 잘 확립되어 있다(참조: Lorch et al., 2014; Nagai et al., 2017). 또한, 엑소좀은 단백질 발현 패턴을 변경하기 위해 세포에 전달될 수 있는 과다한 전사 인자를 함유하는 것으로 나타났다(참조: Ung et al., 2014). 따라서 엑소좀은 염색질에 의해 결합되지 않은 네이키드 DNA 잔기를 함유하고, 이러한 최소 전사 성분의 존재하에 전사를 겪을 수 있다고 생각할 수 있다.

이 연구에서는 또한, 전사/번역에 필요한 성분이 24시간 이내에 고갈될 가능성이 높으며, 그 결과 제한된 비율의 전사 및 번역이 발생함을 시사한다. 엑소좀의 다른 하위집단이 뚜렷한 분자 특성을 보유할 수 있다고 제안되었으므로(참조: Willms et al., 2016), 엑소좀의 작은 아집단만이 새로운 단백질 합성 능력을 보유할 가능성이 있다. 엑소좀에서 새로 합성된 단백질은 기능적으로 활성이며, 이는 적절한 단백질 형태를 암시한다. 엑소좀은 리보솜의 성분뿐만 아니라 Hsp60 및 Hsp70과 같은 여러 분자 샤페론을 함유하는 것으로 나타났다. 리보솜 자체는 공-번역 단백질 폴딩에 중요한 역할을 하며, 예를 들어, 새로 형성된 단백질에서 2차 구조의 형성을 촉진할 수 있다. 리보솜은 또한 초기 단백질의 적절한 폴딩을 도울 수 있는 샤페론 연합을 위한 플랫폼 역할을 한다(참조: Kramer et al., 2009). 이러한 엑소좀 성분이 새로 형성된 단백질의 안정화에 기여할 수 있다고 생각할 수 있다. 엑소좀의 내강에서처럼 물리적 구속은 또한 단백질 폴딩에 안정화 효과를 줄 수 있다(참조: Rao and Cruz, 2013). 그러나, 많은 단백질이 부적절한 형태 또는 미스-폴딩을 나타낼 수 있음을 배제할 수 없다. 이것은 알려지지 않은 구조 또는 본질적으로 무질서한 영역을 갖는 단백질이 중요한 생리적 기능을 가질 수 있음을 시사 한 "다크 프로테옴(dark proteome)"(참조: Perdigao et al., 2015)의 예상치 못한 특징이 최근 밝혀진 것처럼 여전히 중요한 생물학적 의미를 가질 수 있다.

이 과정의 생물학적 중요성을 완전히 이해하기 위해서는 엑소좀에서 자연적으로 합성되는 단백질의 세심하고 정량적인 식별이 필요하다. 그러나 이것이 진핵 생물학의 이해를 재평가하는 데 상당한 영향을 미칠 수 있다는 것은 분명하다. 최근 연구에서는 세포가 mRNA를 엑소좀에 선택적으로 통합할 수 있음을 시사한다(참조: Raposo and Stoorvogel, 2013). 이것은 엑소좀으로 선택적으로 패키징된 mRNA가 개념 증명으로 본 연구에서 밝혀진 바와 같이 기원 세포에서는 발현이 억제되는 단백질로 번역될 수 있을 가능성을 높인다. 번역 후 최대 1개월까지 엑소좀에서 새로 합성된 단백질을 확인한 결과, 엑소좀-매개 단백질 생산은 단백질 분해 효소 수준이 낮기 때문인지 단백질 반감기가 상당히 증가할 수 있음을 시사한다.

종합하면, 이러한 결과는 엑소좀이 신체 항상성 및 조직 발병에 잠재적으로 지대한 영향을 미치는 이전에 인식되지 않은 생물학적 활성을 가지고 있음을 종합적으로 입증한다. 성장 인자 구배가 체내 엑소좀의 전신적 향성에 역할을 할 수 있다고 추측할 수 있다. 자연적으로 발생하는 성장 인자 생산 패턴의 붕괴는 엑소좀의 재분배 및 전달 패턴 모두에 즉각적인 결과를 가져올 수 있다. 이러한 반응 패턴은 특히 먼 신체 부위 사이의 세포-세포 소통을 결정하는 데 잠재적인 영향을 미칠 수 있다. 이러한 세포외 신호에 대한 반응으로 단백질 발현 패턴을 변경할 수 있다는 사실은 엑소좀이 조직 손상에서 주요 반응체로 작용할 수 있음을 시사할 것이다. 결론적으로, 이러한 발견은 엑소좀의 기본 생물학에 대한 새로운 통찰력을 제공하고 유기체 항상성에서의 생물학적 기능과 질환 상태에 미치는 잠재적 영향에 대해 알려준다.

I. 지질-기반 나노입자

일부 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 리포좀, 엑소좀, 지질 제제, 또는 또 다른 지질-기반 나노입자, 예를 들어 지질-기반 소포(예를 들어, DOTAP:콜레스테롤 소포)이다. 지질-기반 나노입자는 양전하, 음전하 또는 중성일 수 있다. 지질-기반 나노입자는 전사 및 번역, 신호 전달, 화학주성 또는 기타 세포 기능을 가능하게 하는데 필요한 성분을 포함할 수 있다.

A. 리포좀

"리포좀"은 봉입된 지질 이중층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 다양한 단일 및 다층 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 일반적으로 인지질을 포함하는 이중층 막, 및 일반적으로 수성 조성물을 포함하는 내부 매질을 갖는 소포 구조를 갖는 것으로 특성화될 수 있다. 본원에 제공된 리포좀은 단층 리포좀, 다층 리포좀 및 다소포성 리포좀을 포함한다. 본원에 제공된 리포좀은 양전하, 음전하 또는 중성 전하를 띨 수 있다. 특정 구현예에서, 리포좀은 중성 전하이다.

다층 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이러한 리포좀은 인지질을 포함하는 지질이 과량의 수용액에 현탁될 때 자발적으로 형성된다. 지질 성분은 폐쇄 구조가 형성되기 전에 자기-재배열을 거쳐 지질 이중층 사이에 물과 용해된 용질을 포획한다. 친유성 분자 또는 친유성 영역을 갖는 분자는 또한 지질 이중층에 용해되거나 이와 결합될 수 있다.

특정 측면에서, 폴리펩티드, 핵산 또는 소분자 약물은, 예를 들어, 리포좀의 수성 내부에 캡슐화되거나, 리포좀의 지질 이중층 내에 산재되거나, 리포좀 및 폴리펩티드/핵산 둘 다와 결합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부착되거나, 리포좀에 포획되거나 리포좀과 복합체화 등이 될 수 있다.

본 구현예에 따라 사용되는 리포좀은 당업자에게 공지된 바와 같이 상이한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 인지질, 예를 들어 중성 인지질 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC)은 3급-부탄올에 용해된다. 이어서 지질(들)은 폴리펩티드, 핵산 및/또는 다른 성분(들)과 혼합된다. 트윈(Tween) 20이 조성물 중량의 약 5%가 되도록 지질 혼합물에 트윈 20을 첨가한다. 3급-부탄올의 용적이 적어도 95%가 되도록 과량의 3급-부탄올을 이 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 와동하고, 드라이아이스/아세톤 욕에서 냉동시키고, 밤새 동결건조한다. 동결건조된 제제는 -20℃에 보관되며 최대 3개월까지 사용될 수 있다. 필요한 경우 동결건조된 리포좀은 0.9% 염수로 재구성된다.

대안적으로, 리포좀은 용기, 예를 들어 복숭아형 유리 플라스크 내에서 용매에 지질을 혼합하여 제조될 수 있다. 용기는 예상되는 리포좀 현탁액의 용적보다 10배 더 큰 용적을 가져야 한다. 회전 증발기를 사용하여 용매를 약 40℃에서 음압(negative pressure) 하에 제거한다. 용매는 일반적으로 리포좀의 원하는 용적에 따라 약 5분에서 2시간 이내에 제거된다. 조성물은 진공하에 데시케이터에서 추가로 건조될 수 있다. 건조된 지질은 일반적으로 시간이 지남에 따라 저하되는 경향 때문에 약 1주 후에 폐기된다.

건조된 지질은 모든 지질 필름이 재현탁될 때까지 진탕시켜 멸균된 발열원이 없는 물에서 대략 25 내지 50mM 인지질로 수화될 수 있다. 이어서 수성 리포좀을 분취액으로 분리하고, 각각 바이알에 넣고, 동결건조하고 진공하에 밀봉한다.

상기 기재된 바와 같이 제조된 건조된 지질 또는 동결건조된 리포좀은 단백질 또는 펩티드 용액에서 탈수 및 재구성될 수 있으며, 적절한 용매, 예를 들어, DPBS를 사용하여 적절한 농도로 희석될 수 있다. 이어서 혼합물을 볼텍스 믹서에서 격렬하게 진탕시킨다. 호르몬, 약물, 핵산 작제물 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 작용제(agent)와 같은 캡슐화되지 않은 추가 물질은 29,000 × g에서 원심분리하여 제거되고, 리포좀 펠렛은 세척된다. 세척된 리포좀은 적절한 총 인지질 농도, 예를 들어, 약 50 내지 200mM로 재현탁된다. 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양은 표준 방법에 따라 결정될 수 있다. 리포좀 제제에 캡슐화된 추가 물질 또는 활성제의 양을 결정한 후 리포좀을 적절한 농도로 희석하고 사용할 때까지 4℃에서 보관할 수 있다. 리포좀을 포함하는 약제학적 조성물은 일반적으로 멸균된 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제, 예를 들어 물 또는 염수 용액을 포함할 것이다.

본 구현예에 유용할 수 있는 추가 리포좀은 양이온성 리포좀, 예를 들어, WO02/100435A1, 미국 특허 5,962,016, 미국 출원 2004/0208921, WO03/015757A1, WO04029213A2, 미국 특허 5,030,453, 및 미국 특허 6,680,068(이들 모두는 면책 조항 없이 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 양이온성 리포좀을 포함한다.

이러한 리포좀을 제조할 때, 본원에 기재되거나 당업자에게 공지된 임의의 프로토콜이 사용될 수 있다. 리포좀을 제조하는 추가의 비제한적 예는 미국 특허 4,728,578, 4,728,575, 4,737,323, 4,533,254, 4,162,282, 4,310,505, 및 4,921,706; 국제 출원 PCT/US85/01161 및 PCT/US89/05040(각각은 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.

특정 구현예에서, 지질-기반 나노입자는 중성 리포좀(예를 들어, DOPC 리포좀)이다. 본원에 사용된 "중성 리포좀" 또는 "비-하전 리포좀"은 본질적으로 중성, 순전하(실질적으로 비-하전)를 생성하는 하나 이상의 지질 성분을 갖는 리포좀으로 정의된다. "본질적으로 중성" 또는 "본질적으로 하전되지 않은"은 주어진 집단(예를 들어, 리포좀 집단) 내의 지질 성분이 존재한다면 극히 일부가 또 다른 성분의 반대 전하에 의해 상쇄되지 않는 전하를 포함함을 의미한다(즉, 10% 미만, 더 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 1% 미만의 성분은 상쇄되지 않은 전하를 포함한다). 특정 구현예에서, 중성 리포좀은 주로 생리적 조건하에(즉, 약 pH 7에서) 자체로 중성인 지질 및/또는 인지질을 포함할 수 있다.

본 구현예의 리포좀 및/또는 지질-기반 나노입자는 인지질을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 종류의 인지질이 리포좀 생성에 사용될 수 있다(예를 들어, DOPC와 같은 중성 인지질이 중성 리포좀을 생성하는 데 사용될 수 있음). 다른 구현예에서, 한 종류 이상의 인지질을 사용하여 리포솜을 생성할 수 있다. 인지질은 천연 또는 합성 공급원에서 유래할 수 있다. 인지질은, 예를 들어, 포스파티딜콜린, 포스파티딜글리세롤 및 포스파티딜에탄올아민을 포함하고; 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜콜린은 생리적 조건하에(즉, 약 pH 7에서) 하전되지 않기 때문에, 이러한 화합물은 중성 리포좀 생성에 특히 유용할 수 있다. 특정 구현예에서, 인지질 DOPC는 하전되지 않은 리포좀을 생성하는 데 사용된다. 특정 구현예에서, 인지질이 아닌 지질(예를 들어, 콜레스테롤)이 사용될 수 있다.

인지질은 글리세로인지질 및 특정 스핑고지질을 포함한다. 인지질은 디올레오일포스파티딜콜린("DOPC"), 계란 포스파티딜콜린("EPC"), 디라우릴오일포스파티딜콜린("DLPC"), 디미리스토일포스파티딜콜린("DMPC"), 디팔미토일포스파티딜콜린("DPPC"), 디스테아로일포스파티딜콜린("DSPC"), 1-미리스토일-2-팔미토일 포스파티딜콜린("MPPC"), 1-팔미토일-2-미리스토일 포스파티딜콜린("PMPC"), 1-팔미토일-2-스테아로일 포스파티딜콜린("PSPC"), 1-스테아로일-2-팔미토일 포스파티딜콜린("SPPC"), 디라우릴오일포스파티딜글리세롤("DLPG"), 디미리스토일포스파티딜글리세롤("DMPG"), 디팔미토일포스파티딜글리세롤("DPPG"), 디스테아로일포스파티딜글리세롤("DSPG"), 디스테아로일 스핑고미엘린("DSSP"), 디스테아로일포스파티딜에탄올아민("DSPE"), 디올레오일포스파티딜글리세롤("DOPG"), 디미리스토일 포스파티드산("DMPA"), 디팔미토일 포스파티드산("DPPA"), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민("DMPE"), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민("DPPE"), 디미리스토일 포스파티딜세린("DMPS"), 디팔미토일 포스파티딜세린("DPPS"), 뇌 포스파티딜세린("BPS"), 뇌 스핑고미엘린("BSP"), 디팔미토일 스핑고미엘린("DPSP"), 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC"), 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DAPC"), 1,2-디아라키도일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DBPC"), 1,2-디에이코세노일-sn-글리세로-3-포스포콜린("DEPC"), 디올레오일포스파티딜에탄올아민("DOPE"), 팔미토일로에오일(palmitoyloeoyl) 포스파티딜콜린("POPC"), 팔미토일로에오일 포스파티딜에탄올아민("POPE"), 리소포스파티딜콜린, 리소포스파티딜에탄올아민, 및 디리놀레오일포스파티딜콜린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

B. 엑소좀

본원에 사용된 용어 "미세소포" 및 "엑소좀"은 직경(또는 입자가 회전타원체가 아닌 경우 가장 긴 치수)이 약 10nm 내지 약 5000nm, 더 통상적으로 30nm 내지 1000nm, 가장 통상적으로 약 50nm 내지 750nm인 막 입자를 나타내며, 여기서 엑소좀 막의 적어도 일부는 세포로부터 직접 얻어진다. 가장 일반적으로, 엑소좀은 공여 세포 크기의 최대 5% 크기(평균 직경)를 가질 것이다. 따라서, 특히 고려되는 엑소좀은 세포로부터 흘러나온 엑소좀이 포함된다.

엑소좀은, 예를 들어, 체액과 같은 임의의 적합한 샘플 유형에서 검출되거나 이로부터 단리될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "단리된"은 자연 환경으로부터의 분리를 나타내고, 적어도 부분적인 정제를 포함하는 것을 의미하고, 실질적인 정제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "샘플"은 본 발명에 의해 제공되는 방법에 적합한 임의의 샘플을 나타낸다. 샘플은 검출 또는 단리에 적합한 엑소좀을 포함하는 임의의 샘플일 수 있다. 샘플 공급원으로는 혈액, 골수, 흉수, 복막액, 뇌척수액, 소변, 타액, 양수, 악성복수, 기관지-폐포 세척 유체, 활액, 모유, 땀, 누액, 관절액, 및 기관지 세척액이 포함된다. 일 측면에서, 샘플은 예를 들어 전혈 또는 이의 임의의 분획 또는 성분을 포함하는 혈액 샘플이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 혈액 샘플은 정맥, 동맥, 말초, 조직, 탯줄 등과 같은 혈액 세포 또는 이의 성분을 포함하는 임의의 알려진 공급원으로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 잘 알려진 일상적인 임상 방법(예를 들어, 전혈 채취 및 처리 절차)을 사용하여 샘플을 얻고 처리할 수 있다. 일 측면에서, 예시적인 샘플은 암에 걸린 대상체로부터 채취한 말초 혈액일 수 있다.

엑소좀은 또한 수술 샘플, 생검 샘플, 조직, 대변 및 배양된 세포와 같은 조직 샘플로부터 단리될 수 있다. 조직 공급원에서 엑소좀을 단리할 때 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 조직을 균질화한 다음 세포를 용해시켜 엑소좀을 방출하는 것이 필요할 수 있다. 조직 샘플에서 엑소좀을 단리할 때 엑소좀을 파괴하지 않는 균질화 및 용해 절차를 선택하는 것이 중요하다. 본원에서 고려되는 엑소좀은 바람직하게는 생리학적으로 허용되는 용액, 예를 들어, 완충 염수, 성장 배지, 다양한 수성 배지 등에서 체액으로부터 단리된다.

엑소좀은 새로 수집된 샘플 또는 동결 또는 냉동 보관된 샘플에서 단리될 수 있다. 일부 구현예에서, 엑소좀은 세포 배양 배지에서 단리될 수 있다. 필수적이지는 않지만, 샘플에서 임의의 잔해물을 제거하기 위해 용적-제외 중합체로 침전시키기 전에 유체 샘플을 정화하면 더 높은 순도의 엑소좀을 얻을 수 있다. 정화 방법으로는 원심분리, 초원심분리, 여과 또는 한외여과가 포함된다. 가장 통상적으로, 엑소좀은 당해 분야에 잘 알려진 수많은 방법에 의해 단리될 수 있다. 한 가지 바람직한 방법은 체액 또는 세포 배양 상청액으로부터의 분별 원심분리이다. 엑소좀의 예시적인 단리 방법은 문헌(참조: Losche et al., 2004; Mesri and Altieri, 1998; Morel et al., 2004)에 기재되어 있다. 대안적으로, 엑소좀은 문헌(참조: Combes et al., 1997)에 기재된 바와 같이 유세포 분석을 통해 단리될 수 있다.

엑소좀의 단리를 위해 허용되는 한 가지 프로토콜은 종종 상대적으로 저밀도 엑소좀을 부유시키기 위해 수크로스 밀도 구배 또는 수크로스 쿠션과 조합된 초원심분리를 포함한다. 순차적 분별 원심분리에 의한 엑소좀의 단리는 다른 미세소포 또는 거대분자 복합체와 크기 분포가 겹칠 가능성으로 인해 복잡하다. 또한, 원심분리는 이의 크기에 따라 소포를 분리하는 수단으로 불충분할 수 있다. 그러나, 순차적 원심분리는, 수크로스 구배 초원심분리와 조합될 때, 높은 엑소좀 농축을 제공할 수 있다.

초원심분리 경로에 대한 대안을 사용한 크기에 따른 엑소좀의 분리는 또 다른 옵션이다. 초원심분리보다 시간이 덜 걸리고 특수 장비를 사용할 필요가 없는 한외여과 절차를 사용한 엑소좀의 성공적인 정제가 보고되었다. 마찬가지로, 하나의 마이크로필터에서 세포, 혈소판 및 세포 잔해물을 제거하고 양압을 사용하여 유체를 구동시키는 두 번째 마이크로필터에서 30nm보다 큰 소포를 포획할 수 있는 상용 키트(엑소미르(EXOMIR)™, 비오 사이언티픽(Bioo Scientific))가 이용 가능하다. 그러나, 이 과정에서 엑소좀은 회수되지 않고, 두 번째 마이크로필터에서 포착된 물질에서 RNA 내용물을 직접 추출하여 PCR 분석에 사용할 수 있다. HPLC-기반 프로토콜을 사용하면 잠재적으로 고순도 엑소좀을 얻을 수 있지만, 이러한 과정은 전용 장비가 필요하고 확장하기가 어렵다. 중요한 문제는 혈액 및 세포 배양 배지 모두 엑소좀과 동일한 크기 범위의 많은 수의 나노입자(일부 비-소포성)를 포함한다는 것이다. 예를 들어, 일부 miRNA는 엑소좀이 아닌 세포외 단백질 복합체 내에 포함될 수 있지만; 프로테아제(예를 들어, 프로테이나제 K)를 사용한 처리는 "엑스트라엑소좀" 단백질에 의한 모든 가능한 오염을 제거하기 위해 수행될 수 있다.

또 다른 구현예에서, 암세포 유래 엑소좀은 면역특이적 상호작용(예를 들어, 면역자기 포획)을 포함하는 것과 같이, 엑소좀에 대해 샘플을 농축시키기 위해 일반적으로 사용되는 기술에 의해 포획될 수 있다. 면역자기 세포 분리라고도 알려진 면역자기 포획은 통상적으로 특정 세포 유형에서 발견되는 단백질에 대한 항체를 작은 상자성 비드에 부착하는 것을 포함한다. 항체-코팅된 비드가 혈액과 같은 샘플과 혼합되면, 이는 특정 세포에 부착되어 주변을 둘러싼다. 이어서 샘플을 강한 자기장에 배치하여 비드가 한쪽으로 펠렛화되도록 한다. 혈액을 제거한 후 포획된 세포는 비드와 함께 유지된다. 이러한 일반적인 방법의 많은 변형은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 엑소좀을 단리하는 데 사용하기에 적합하다. 일 예로, 엑소좀은 자기 비드(예를 들어, 알데하이드/설페이트 비드)에 부착될 수 있고, 이어서 항체가 혼합물에 첨가되어 비드에 부착된 엑소좀의 표면상의 에피토프를 인식한다. 암세포 유래 엑소좀에서 발견되는 것으로 알려진 단백질의 예는 ATP-결합 카세트 서브-패밀리 A 구성원 6(ABCA6), 테트라스파닌-4(TSPAN4), SLIT 및 NTRK-유사 단백질 4(SLITRK4), 추정 프로토카드헤린 베타-18(PCDHB18), 골수 세포 표면 항원 CD33(CD33) 및 글리피칸-1(GPC1)을 포함한다. 예를 들어, 이들 단백질 중 하나 이상에 대한 항체 또는 압타머를 사용하여 암세포 유래 엑소좀을 단리할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 분석은 엑소좀의 직접 또는 간접 시각화를 허용하는 모든 방법이 포함되며, 생체내 또는 생체외일 수 있다. 예를 들어, 분석은 고체 기질에 결합된 엑소좀의 생체외 현미경 또는 혈구 계측 검출 및 시각화, 유세포 분석, 형광 이미징 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 측면에서, 암세포 유래 엑소좀은 ATP-결합 카세트 서브-패밀리 A 구성원 6(ABCA6), 테트라스파닌-4(TSPAN4), SLIT 및 NTRK-유사 단백질 4(SLITRK4), 추정 프로토카드헤린 베타-18(PCDHB18), 골수 세포 표면 항원 CD33(CD33), 글리피칸-1(GPC1), 히스톤 H2A 유형 2-A(HIST1H2AA), 히스톤 H2A 유형 1-A(HIST1H1AA), 히스톤 H3.3(H3F3A), 히스톤 H3.1(HIST1H3A), 아연 핑거 단백질 37 동족체(ZFP37), 라미닌 서브유닛 베타-1(LAMB1), 요세관간질성신염 항원-유사(TINAGL1), 페록시레데옥신(Peroxiredeoxin)-4(PRDX4), 콜라겐 알파-2(IV) 사슬(COL4A2), 추정 단백질 C3P1(C3P1), 헤미센틴-1(HMCN1), 추정 로필린-2-유사 단백질(RHPN2P1), 안키린 반복 도메인-함유 단백질 62(ANKRD62), 트리파타이트 모티프-함유 단백질 42(Tripartite motif-containing protein 42; TRIM42), 결합 플라코글로빈(Junction plakoglobin; JUP), 튜불린 베타-2B 사슬(TUBB2B), 엔도리보뉴클레아제 다이서(DICER1), E3 유비퀴틴-단백질 리가아제 TRIM71(TRIM71), 카타닌 p60 ATPase-함유 서브유닛 A-유사 2(KATNAL2), 단백질 S100-A6(S100A6), 5'-뉴클레오티다아제 도메인-함유 단백질 3(NT5DC3), 발린-tRNA 리가아제(VARS), 카즈린(KAZN), ELAV-유사 단백질 4(ELAVL4), RING 핑거 단백질 166(RNF166), FERM 및 PDZ 도메인-함유 단백질 1(FRMPD1), 78 kDa 글루코스-조절 단백질(HSPA5), 트래피킹 단백질 입자 복합체 서브유닛 6A(Trafficking protein particle complex subunit 6A; TRAPPC6A), 스쿠알렌 모노옥시게나아제(SQLE), 종양 감수성 유전자 101 단백질(TSG101), 공포 단백질 분류 28 동족체(Vacuolar protein sorting 28 homolog; VPS28), 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절인자(PTGFRN), 이소부티릴-CoA 데하이드로게나아제, 미토콘드리아(ACAD8), 26S 프로테아제 조절 서브유닛 6B(PSMC4), 연장 인자 1-감마(EEF1G), 티틴(TTN), 티로신-단백질 포스파타아제 유형 13(PTPN13), 트리오스포스페이트 이소머라아제(TPI1), 또는 카복시펩티다아제 E(CPE) 중 하나 이상에 대한 항체를 사용하여 검출되고, 이어서 고체 기질에 결합되고/되거나 현미경 또는 혈구 계측 검출을 사용하여 시각화된다.

세포에서 발현되는 모든 단백질이 그 세포에 의해 분비되는 엑소좀에서 발견되는 것은 아니라는 점에 유의해야 한다(도 11 참조). 예를 들어, 칼넥신, GM130 및 LAMP-2는 모두 MCF-7 세포에서 발현되는 단백질이지만 MCF-7 세포에서 분비되는 엑소좀에서는 발견되지 않는다(참조: Baietti et al., 2012). 또 다른 예로서, 한 연구에서는 190/190 췌관 선암 환자가 건강한 대조군보다 GPC1+ 엑소좀 수치가 더 높았음을 발견하였다(참조: Melo et al., 2015, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨). 특히 건강한 대조군의 평균 2.3%만이 GPC1+ 엑소좀을 가졌다.

1. 세포 배양으로부터 엑소좀을 수집하기 위한 예시적인 프로토콜

1일에, 10% FBS를 함유하는 배지 중에서 T225 플라스크에 충분한 세포(예를 들어, 약 5백만 개의 세포)를 접종하여 다음날 세포가 약 70% 융합될 수 있도록 한다. 2일에, 세포 상의 배지를 흡인하고, PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 25 내지 30mL 기본 배지(즉, PenStrep 또는 FBS 없음)를 세포에 첨가한다. 세포를 24 내지 48시간 동안 항온배양한다. 48시간 항온배양이 선호되지만, 일부 세포주는 무혈청 배지에 더 민감하므로 항온배양 시간을 24시간으로 줄여야 한다. FBS에는 NanoSight 결과를 크게 왜곡할 수 있는 엑소좀이 포함되어 있다는 점에 유의한다.

3/4일에, 800×g에서 5분 동안 실온에서 배지와 원심 분리기를 수집하여 죽은 세포와 큰 잔해물을 펠렛화한다. 상청액을 새로운 코니칼 튜브로 옮기고 배지를 다시 2000×g에서 10분 동안 원심분리하여 다른 큰 잔해물과 큰 소포를 제거한다. 0.2㎛ 필터를 통해 배지를 통과시킨 다음 튜브당 35mL를 사용하여 초원심분리기 튜브(예를 들어, 25×89mm 벡크만 울트라-클리어(Beckman Ultra-Clear))에 분취한다. 튜브당 배지의 용적이 35mL 미만인 경우, 35mL에 도달하도록 튜브의 나머지 부분을 PBS로 채운다. SW 32 Ti 로터(k-인자 266.7, RCF 최대 133,907)를 사용하여 4℃에서 28,000rpm으로 2 내지 4시간 동안 배지를 초원심분리한다. 약 1인치의 액체가 남을 때까지 상청액을 조심스럽게 흡인한다. 튜브를 기울이고 나머지 매질이 흡인기 피펫에 천천히 들어갈 수 있도록 한다. 원하는 경우, 엑소좀 펠렛을 PBS에 재현탁시키고, 28,000rpm에서 1 내지 2시간 동안 초원심분리를 반복하여 엑소좀 집단을 추가로 정제할 수 있다.

마지막으로, 210㎕ PBS에서 엑소좀 펠렛을 재현탁시킨다. 각 샘플에 대해 여러 개의 초원심분리기 튜브가 있는 경우, 동일한 210㎕ PBS를 사용하여 각 엑소좀 펠렛을 연속적으로 재현탁시킨다. 각 샘플에 대해, 10㎕를 취하고 990㎕ H₂O에 첨가하여 나노입자 추적 분석에 사용한다. 나머지 200㎕ 엑소좀-함유 현탁액을 다운스트림 공정에 사용하거나 즉시 -80℃에 보관한다.

2. 혈청 샘플에서 엑소좀을 추출하기 위한 예시적인 프로토콜

먼저, 혈청 샘플을 얼음에서 해동시킨다. 이어서, 11mL PBS에 250㎕의 무세포 혈청 샘플을 희석하고; 0.2㎛ 기공 필터를 통해 여과한다. 희석된 샘플을 150,000×g에서 밤새 4℃에서 초원심분리한다. 다음날, 조심스럽게 상청액을 버리고 11mL PBS에서 엑소좀 펠렛을 세척한다. 2시간 동안 4℃에서 150,000×g에서 두 번째 초원심분리를 수행한다. 마지막으로, 상청액을 조심스럽게 버리고 분석을 위해 100㎕ PBS에 엑소좀 펠렛을 재현탁한다.

C. 엑소좀 및 리포좀의 전기천공을 위한 예시적인 프로토콜

400㎕의 전기천공 완충액(1.15mM 인산칼륨, pH 7.2, 25mM 염화칼륨, 21% 옵티프렙(Optiprep))에서 1×10⁸ 엑소좀(Nanosight 분석으로 측정) 또는 100nm 리포좀(예를 들어, 엔캡슐라 나노 사이언시즈(Encapsula Nano Sciences)에서 구입함) 및 siRNA(퀴아젠(Qiagen)) 또는 shRNA 1㎍을 혼합한다. 4mm 큐벳을 사용하여 엑소좀 또는 리포좀을 전기천공한다(예를 들어, Alvarez-Erviti et al., 2011; El-Andaloussi et al., 2012 참조). 전기천공 후, 엑소좀 또는 리포좀을 프로테아제가 없는 RNAse로 처리한 다음 10배 농축된 RNase 억제제를 첨가한다. 마지막으로, 상기 기재된 초원심분리 방법으로 엑소좀 또는 리포좀을 PBS로 세척한다.

II. 질환의 진단, 예후 및 치료

본 발명의 특정 측면은 치료제 또는 진단제를 발현시키거나 포함하는 엑소좀으로 환자를 치료하는 것을 제공한다. 본원에 사용된 "치료제"는 암 또는 다른 상태의 치료에 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 치료제의 예로는 약물, 화학요법제, 치료 항체 및 항체 단편, 독소, 방사성 동위원소, 효소, 뉴클레아제, 호르몬, 면역조절제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 킬레이터, 붕소 화합물, 광활성제 및 염료가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 "진단제"는 질환을 진단, 검출 또는 시각화하는 데 유용한 원자, 분자 또는 화합물이다. 본원에 기재된 구현예에 따르면, 진단제는 방사성 물질(예를 들어, 방사성 동위원소, 방사성 핵종, 방사성 표지 또는 방사성 추적자), 염료, 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 생물발광 화합물 또는 분자, 효소 및 강화제(enhancing agent)(예를 들어, 상자성이온)가 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 측면에서, 치료용 재조합 단백질은 환자의 세포에서 활성이 상실된 단백질, 원하는 효소 활성을 갖는 단백질, 원하는 억제 활성을 갖는 단백질 등일 수 있다. 예를 들어, 단백질은 전사 인자, 효소, 단백질성 독소, 항체, 모노클로날 항체 등일 수 있다. 모노클로날 항체는 세포내 항원에 특이적으로 또는 선택적으로 결합할 수 있다. 모노클로날 항체는 세포내 항원의 기능을 억제하고/하거나 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수 있다. 본 발명의 다른 측면은 환자 샘플에서 암세포-유래 엑소좀의 존재를 기반으로 질환을 진단하는 것을 제공한다.

엑소좀은 mRNA 전사 및 단백질 번역을 완료하는 데 필요한 기구를 포함하는 것으로 알려져 있으므로(전문이 본원에 참조로 포함된 PCT/US2014/068630 참조), 치료 단백질을 인코딩하는 mRNA 또는 DNA 핵산이 엑소좀으로 형질감염될 수 있다. 대안적으로, 치료 단백질 자체는 엑소좀으로 전기천공되거나 리포솜에 직접 통합될 수 있다. 예시적인 치료 단백질은 종양 억제 단백질, 펩티드, 돌연변이 단백질의 야생형 단백질 대응물, DNA 복구 단백질, 단백질 분해효소, 단백질성 독소, 세포내 단백질 활성을 억제할 수 있는 단백질, 세포내 단백질의 활성을 활성화할 수 있는 단백질, 또는 기능 상실이 복원되어야 하는 모든 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 치료 단백질의 구체적인 예로는 123F2, Abcb4, Abcc1, Abcg2, Actb, Ada, Ahr, Akt, Akt1, Akt2, Akt3, Amhr2, Anxa7, Apc, Ar, Atm, Axin2, B2m, Bard1, Bcl2l1, Becn1, Bhlhal5, Bin1, Blm, Braf, Brca1, Brca2, Brca3, Braf, Brcata, Brinp3, Brip1, Bub1b, Bwscr1a, Cadm3, Casc1, Casp3, Casp7, Casp8, Cav1, Ccam, Ccnd1, Ccr4, Ccs1, Cd28, Cdc25a, Cd95, Cdh1, Cdkn1a, Cdkn1b, Cdkn2a, Cdkn2b, Cdkn2c, Cftr, Chek1, Chek2, Crcs1, Crcs10, Crcs11, Crcs2, Crcs3, Crcs4, Crcs5, Crcs6, Crcs7, Crcs8, Crcs9, Ctnnb1, Cts1, Cyp1a1, Cyp2a6, Cyp2b2, Cyld, Dcc, Dkc1, Dicer1, Dmtf1, Dnmt1, Dpc4, E2f1, Eaf2, Eef1a1, Egfr, Egfr4, Erbb2, Erbb4, Ercc2, Ercc6, Ercc8, Errfi1, Esr1, Etv4, Faslg, Fbxo10, Fcc, Fgfr3, Fntb, Foxm1, Foxn1, Fus1, Fzd6, Fzd7, Fzr1, Gadd45a, Gast, Gnai2, Gpc1, Gpr124, Gpr87, Gprc5a, Gprc5d, Grb2, Gstm1, Gstm5, Gstp1, Gstt1, H19, H2afx, Hck, Lims1, Hdac, Hexa, Hic1, Hin1, Hmmr, Hnpcc8, Hprt, Hras, Htatip2, Il1b, Il10, Il2, Il6, Il8rb Inha, Itgav, Jun, Jak3, Kit, Klf4, Kras, Kras2, Kras2b, Lig1, Lig4, Lkb1, Lmo7, Lncr1, Lncr2, Lncr3, Lncr4, Ltbp4, Luca1, Luca2, Lyz2, Lzts1, Mad1l1, Mad2l1, Madr2/Jv18, Mapk14, Mcc, Mcm4, Men1, Men2, Met, Mgat5, Mif, Mlh1, Mlh3, Mmac1, Mmp8, Mnt, Mpo, Msh2, Msh3, Msh6, Msmb, Mthfr, Mts1, Mutyh, Myh11, Nat2, Nbn, Ncoa3, Neil1, Nf1, Nf2, Nfe2l1, Nhej1, Nkx2-1, Nkx2-9, Nkx3-1, Nprl2, Nqo1, Nras, Nudt1, Ogg1, Oxgr1, p16, p19, p21, p27, p27mt, p57, p14ARF, Palb2, Park2, Pggt1b, Pgr, Pi3k, Pik3ca, Piwil2, Pl6, Pla2g2a, Plg, Plk3, Pms1, Pms2, Pold1, Pole, Ppard, Pparg, Ppfia2, Ppm1d, Prdm2, Prdx1, Prkar1a, Ptch, Pten, Prom1, Psca, Ptch1, Ptf1a, Ptger2, Ptpn13, Ptprj, Rara, Rad51, Rassf1, Rb, Rb1, Rb1cc1, Rb12, Recgl4, Ret, Rgs5, Rhoc, Rint1, Robo1, Rpl38, S100a4, SCGB1A1, Skp2, Smad2, Smad3, Smad4, Smarcb1, Smo, Snx25, Spata13, Srpx, Ssic1, Sstr2, Sstr5, Stat3, St5, St7, St14, Stk11, Suds3, Tap1, Tbx21, Terc, Tnf, Tp53, Tp73, Trpm5, Tsc2, Tsc1, Vhl, Wrn, Wt1, Wt2, Xrcc1, Xrcc5, Xrcc6, 및 Zac1이 포함된다.

병든 세포의 세포내 공간으로 도입하는 것이 바람직할 수 있는 하나의 특정 유형의 단백질은 항체(예를 들어, 모노클로날 항체)이다. 이러한 항체는 세포내 단백질의 기능을 방해하고/하거나 세포내 단백질-단백질 상호작용을 방해할 수 있다. 이러한 모노클로날 항체의 예시적인 표적은 RNAi 경로에 관여하는 단백질, 텔로머라제, 질환 과정을 조절하는 전사 인자, 키나제, 포스파타제, DNA 합성에 필요한 단백질, 단백질 번역에 필요한 단백질을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 치료 항체 표적의 구체적인 예는 다음 유전자에 의해 인코딩된 단백질을 포함한다: Dicer, Ago1, Ago2, Trbp, Ras, raf, wnt, btk, Bcl-2, Akt, Sis, src, Notch, Stathmin, mdm2, abl, hTERT, c-fos, c-jun, c-myc, erbB, HER2/Neu, HER3,VEGFR, PDGFR, c-kit, c-met, c-ret, flt3, API, AMLl, axl, alk, fins, fps, gip, lck, Stat, Hox, MLM, PRAD-I, 및 trk. 모노클로날 항체 이외에, 임의의 이의 항원 결합 단편, 예를 들어 scFv, Fab 단편, Fab', F(ab')2, Fv, 펩티바디(peptibody), 디아바디, 트리아바디, 또는 미니바디가 또한 고려된다. 이러한 임의의 항체 또는 항체 단편은 글리코실화되거나 비글리코실화될 수 있다.

엑소좀이 DICER 및 활성 RNA 처리 RISC 복합체를 포함하는 것으로 알려져 있으므로(전문이 본원에 참조로 포함된 PCT 공보 WO 2014/152622 참조), 엑소좀으로 형질감염된 shRNA는 엑소좀 자체와 함께 RISC-복합체 결합 siRNA로 성숙할 수 있다. 대안적으로, 성숙한 siRNA 자체가 엑소좀 또는 리포좀으로 형질감염될 수 있다. 따라서, 예로서, 다음은 표적 유전자 발현을 조절하거나 약화시키기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 가능한 표적 유전자의 부류이다: 발생 유전자의 야생형 또는 돌연변이 버전(예를 들어, 부착 분자, 사이클린 키나제 억제제, Wnt 계열 구성원, Pax 계열 구성원, Winged 나선 계열 구성원, Hox 계열 구성원, 사이토카인/림포킨 및 이들의 수용체, 성장 또는 분화 인자 및 이들의 수용체, 신경전달물질 및 이들의 수용체), 종양 억제 유전자(예를 들어, APC, CYLD, HIN-1, KRAS2b, p16, p19, p21, p27, p27mt, p53, p57, p73, PTEN, Rb, Uteroglobin, Skp2, BRCA-1, BRCA-2, CHK2, CDKN2A, DCC, DPC4, MADR2/JV18, MEN1, MEN2, MTS1, NF1, NF2, VHL, WRN, WT1, CFTR, C-CAM, CTS-1, zac1, ras, MMAC1, FCC, MCC, FUS1, Gene 26 (CACNA2D2), PL6, Beta* (BLU), Luca-1 (HYAL1), Luca-2 (HYAL2), 123F2 (RASSF1), 101F6, Gene 21 (NPRL2), 또는 SEM A3 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자), 프로-아폽토시스(pro-apoptotic) 유전자(예를 들어, CD95, caspase-3, Bax, Bag-1, CRADD, TSSC3, bax, hid, Bak, MKP-7, PARP, bad, bcl-2, MST1, bbc3, Sax, BIK, 및 BID), 사이토카인(예를 들어, GM-CSF, G-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32 IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, TNF-β, PDGF, 및 mda7), 종양유전자(예를 들어, ABLI, BLC1, BCL6, CBFA1, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETS1, ETS1, ETV6, FGR, FOX, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN, MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, NRAS, PIM1, PML, RET, SRC, TAL1, TCL3 및 YES), 및 효소(예를 들어, ACP 디새튜라제 및 하이드록실라제, ADP-글루코스 피로포릴라제, ATP아제, 알코올 데하이드로게나제, 아밀라제, 아밀로글루코시다제, 카달라제, 셀룰라제, 사이클로옥시게나제, 데카복실라제, 덱스트리나제, 에스테라제, DNA 및 RNA 폴리머라제, 갈락토시다제, 글루카나제, 글루코스 옥시다제, GTP아제, 헬리카제, 헤미셀룰라제, 인테그라제, 인버타제, 이소머라제, 키나제, 락타제, 리파제, 리폭시게나제, 리소자임, 뉴클레아제, 펙틴에스테라제, 퍼옥시다제, 포스파타제, 포스포리파제, 포스포릴라제, 폴리갈락투로나제, 프로테이나제 및 펩티다제, 풀라나제(pullanase), 리콤비나제, 역전사효소, 토포이소머라제, 크실라나제). 일부 경우에, sh/siRNA는 상응하는 야생형 버전의 발현에 영향을 주지 않으면서 암세포에서 발현되는 유전자의 돌연변이 버전을 특이적으로 표적화하도록 설계될 수 있다. 실제로, 임의의 억제 핵산은, 이러한 억제 핵산이 임의의 공급원에 의해 관심 단백질의 검증된 하향조절인자인 것으로 밝혀진다면 본 발명의 조성물 및 방법에 적용될 수 있다.

RNAi를 설계할 때, siRNA의 성질, 침묵 효과의 지속성 및 전달 시스템의 선택과 같이 고려해야 할 몇 가지 요소가 있다. RNAi 효과를 생성하기 위해 유기체에 도입되는 siRNA는 통상적으로 엑손 서열을 함유할 것이다. 또한, RNAi 과정은 상동성에 의존적이므로 유전자 특이성을 최대화하는 동시에 유전자-특이적 서열이 아닌 상동성 서열 간의 교차 간섭 가능성을 최소화하기 위해 서열을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는 siRNA는 siRNA의 서열과 억제될 유전자 사이에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상 또는 심지어 100%의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와 약 80% 미만 동일한 서열은 실질적으로 덜 효과적이다. 따라서, siRNA와 억제될 유전자 사이의 상동성이 클수록 관련없는 유전자 발현이 영향을 받을 가능성이 낮아진다.

엑소좀은 또한 CRISPR/Cas 시스템과 같은 유전자 편집 시스템을 포함하도록 조작될 수 있다. 일반적으로, "CRISPR 시스템"은, Cas 유전자, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트(mate) 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "동향 반복(direct repeat)" 및 tracrRNA-처리된 부분 동향 반복을 포함함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체를 인코딩하는 서열을 포함하는, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 기타 요소를 총칭한다. 일부 측면에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물 포함)가 세포에 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에 있는 표적 부위는 상보적 염기쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, 유전자로 표적화한다. 표적 부위는 통상적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 바로 5' 위치를 바탕으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개 뉴클레오티드를 변형시켜 원하는 서열로 표적화된다. 일반적으로 CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 통상적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 일으키고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다. 이러한 시스템을 포함하도록 조작된 엑소좀의 CRISPR 시스템은 표적 세포 내부의 게놈 DNA를 편집하는 기능을 할 수 있거나 시스템이 엑소좀 자체 내부의 DNA를 편집할 수 있다.

단백질-기반 및 핵산-기반 치료제에 더하여, 엑소좀은 단독으로 또는 임의의 단백질-기반 또는 핵산-기반 치료제와 함께 소분자 약물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 구현예에 사용하기 위해 고려되는 예시적인 소분자 약물로는 독소, 화학요법제, 세포내 단백질의 활성을 억제하는 작용제, 세포내 단백질의 활성을 활성화하는 작용제, 재협착 예방제, 신장 질환 치료제, 간헐성 파행증에 사용되는 작용제, 저혈압 및 쇼크의 치료에 사용되는 작용제, 안지오텐신 전환 효소 억제제, 항협심증제, 항부정맥제, 항고혈압제, 안지오텐신 ii 수용체 길항제, 항혈소판 약물, b-차단제 b1 선택적, 베타 차단제, 심혈관 적응증을 위한 식물성 제품, 칼슘 채널 차단제, 심혈관/진단제, 중앙 알파-2 작용제, 관상혈관 확장제, 이뇨제 및 세뇨관 억제제, 중성 엔도펩티다제/안지오텐신 전환 효소 억제제, 말초혈관 확장제, 칼륨 채널 개방제, 칼륨염, 항경련제, 항구토제, 구역질약, 항파킨슨제, 강직방지제, 대뇌 자극제, 외상 치료에 적용될 수 있는 작용제, 알츠하이머병 또는 치매 치료에 적용될 수 있는 작용제, 편두통 치료에 적용될 수 있는 작용제, 신경퇴행성 질환 치료에 적용될 수 있는 작용제, 카포시 육종 치료에 적용될 수 있는 작용제, AIDS 치료에 적용될 수 있는 작용제, 암 화학요법제, 면역 장애의 치료에 적용될 수 있는 작용제, 정신과 장애의 치료에 적용될 수 있는 작용제, 진통제, 경막외 및 경막내 마취제, 전신, 국소, 부위별 신경근 차단제 진정제, 전마취제 부신/부신피질자극호르몬(acth), 단백동화 스테로이드, 당뇨병 치료에 적용될 수 있는 작용제, 도파민 작용제, 성장 호르몬 및 유사체, 혈당상승제, 혈당저하제, 경구 인슐린, 대용량 주사제(large volume parenteral; lvp), 지질-변경제(lipid-altering agent), 대사 연구 및 선천적 대사 오류, 영양소/아미노산, 영양 lvp, 비만 약물(식욕억제제), 소마토스타틴, 갑상선제(thyroid agent), 바소프레신, 비타민, 코르티코스테로이드, 점액용해제, 폐 항염증제, 폐 계면활성제, 제산제, 항콜린제, 지사제, 항구토제, 담석용해제, 염증성 장질환 약물, 과민성 대장증후군 약물, 간 작용제, 금속 킬레이터, 다양한 위 분비제, 췌장염 약물, 췌장 효소, 프로스타글란딘, 프로스타글란딘, 양성자 펌프 억제제, 경화제, 수크랄페이트(sucralfate), 항-프로게스틴, 피임약, 경구 도파민 작용제가 아닌 경구 피임약, 에스트로겐, 성선자극호르몬, GNRH 작용제, GHRH 길항제, 자궁수축제, 프로게스틴, 자궁-작용제, 항-빈혈 약물, 항응고제, 항피브린용해제, 항혈소판제, 항트롬빈 약물, 응고제, 피브린용해제, 혈액학, 헤파린 억제제, 금속 킬레이터, 프로스타글란딘, 비타민 K, 항-안드로겐, 아미노글리코시드, 항세균제, 설폰아미드, 세팔로스포린, 클린다마이신, 피부과약(dermatologics), 세정제, 에리트로마이신, 구충제, 항진균제, 항말라리아제, 항마이코박테리아제, 항기생충제, 항원충제, 항트리코모나드(antitrichomonad), 항결핵제, 면역조절제, 면역자극제, 마크롤라이드, 항기생충제, 코르티코스테로이드, 사이클로옥시게나제 억제제, 효소 차단제, 류마티스 질환용 면역조절제, 메탈로프로테이나제 억제제, 비스테로이드성 항염증제, 진통제, 해열제, 알파 아드레날린 작용제/차단제, 항생제, 항바이러스제, 베타 아드레날린 차단제, 탄산무수화효소 억제제, 코르티코스테로이드, 면역계 조절제, 비만세포 억제제, 비스테로이드성 항염증제, 및 프로스타글란딘이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

엑소좀은 또한 진단제를 전달하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 진단제로는 자기공명 영상 향상제, 양전자 방출 단층촬영 제품, 방사성 진단제, 방사성 치료제, 방사선-불투과성 조영제, 방사성 의약품, 초음파 영상화제 및 혈관 조영 진단제가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "대상체"는 본 방법이 수행되는 임의의 개인 또는 환자를 나타낸다. 일반적으로 대상체는 인간이지만, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 대상체는 동물일 수 있다. 따라서 설치류(마우스, 랫트, 햄스터 및 기니피그 포함), 고양이, 개, 토끼, 농장 동물(소, 말, 염소, 양, 돼지 등 포함) 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)와 같은 포유류를 포함한 다른 동물이 대상체의 정의 내에 포함된다.

"치료" 및 "치료하는"은 질환 또는 건강-관련 상태의 치료적 이점을 얻기 위한 목적으로 대상체에 치료제의 투여 또는 적용, 또는 대상체에 대한 시술 또는 양식(modality)의 수행을 나타낸다. 예를 들어, 치료는 화학요법, 면역요법 또는 방사선 요법의 투여, 수술의 수행, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.

본 출원 전반에 걸쳐 사용된 용어 "치료적 이점" 또는 "치료적으로 효과적인"은 이 상태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 촉진하거나 향상시키는 모든 것을 나타낸다. 여기에는 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도 감소가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 암 치료는, 예를 들어, 종양 침습성 감소, 암 성장률 감소 또는 전이 예방을 포함할 수 있다. 암 치료는 또한 암에 걸린 대상체의 생존을 연장하는 것을 나타낼 수 있다.

본원에 사용된 용어 "암"은 고형 종양, 전이성 암 또는 비-전이성 암을 기재하는 데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 암은 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 결장, 식도, 십이지장, 소장, 대장, 결장, 직장, 항문, 잇몸, 머리, 신장, 간, 폐, 비인두, 목, 난소, 췌장, 전립선, 피부, 위, 고환, 혀 또는 자궁에서 비롯될 수 있다.

암은 구체적으로 다음과 같은 조직학적 유형일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다: 신생물, 악성; 암종; 암종, 미분화; 거대 및 방추 세포 암종; 소세포 암종; 유두모양 암종; 편평세포 암종; 림프상피성 암종; 기저세포 암종; 모발기질 암종; 이행세포 암종; 유두모양 이행세포 암종; 선암종; 가스트린종, 악성; 담관암종; 간세포 암종; 복합 간세포 암종 및 담관암종; 섬유주 선암종(trabecular adenocarcinoma); 샘낭암종; 선종폴립 내 선암종; 선암종, 가족성 대장폴립증; 고형 암종; 카르시노이드 종양, 악성; 세기관지-폐포 선암종; 유두모양 선암종; 혐색소성 암종; 호산성 암종; 호산세포 선암종; 호염기 암종; 투명세포 선암종; 과립상세포 암종; 여포상 선암종; 유두모양 및 여포상 선암종; 비캡슐화 경화성 암종; 부신피질 암종; 자궁내막양 암종; 피부 부속기관 암종; 아포크린 선암종; 피지 선암종; 귀지 선암종; 점막표피모양 암종; 낭샘암종; 유두모양 낭샘암종; 유두모양 장액 낭샘암종; 점액 낭샘암종; 점액 선암종; 인환세포 암종; 침윤성 관상 암종; 수질 암종; 소엽 암종; 염증형 암종; 파제트병, 유방; 샘꽈리세포 암종; 샘평편상피 암종; 선암종 w/편평상피화생; 흉선종, 악성; 난소 기질 종양, 악성; 협막세포종, 악성; 과립막세포종양, 악성; 남성아세포종, 악성; 세르톨리세포 암종; 라이디히세포종양, 악성; 지질세포종양, 악성; 부신경절종, 악성; 유방외 부신경절종, 악성; 갈색세포종; 사구맥관육종; 악성 흑색종; 멜라닌결핍 흑색종; 표재확산 흑색종; 거대색소 모반 내 악성 흑색종; 유상피세포 흑색종; 청색모반, 악성; 육종; 섬유육종; 섬유성 조직구증, 악성; 점액육종; 지방육종; 평활근육종; 횡문근육종; 배아 횡문근육종; 포상 횡문근육종; 간질 육종; 혼합 종양, 악성; 뮐러 혼합 종양; 신장모세포종; 간모세포종; 암육종; 중간엽종, 악성; 브레너 종양, 악성; 엽상 종양, 악성; 활막 육종; 중피종, 악성; 난소고환종; 배아 암종; 기형종, 악성; 난소갑상선종, 악성; 융모막암종; 중신종, 악성; 혈관육종; 혈관내피종, 악성; 카포시 육종; 혈관주위세포종, 악성; 림프관육종; 골육종; 뼈막 골육종(juxtacortical osteosarcoma); 연골육종; 연골아세포종, 악성; 간엽성 연골육종; 골거대세포종양; 유잉 육종; 치원성 종양, 악성; 법랑아세포성 치아육종; 법랑모세포종, 악성; 법랑아세포성 섬유육종; 송과체부종양, 악성; 척삭종; 신경교종, 악성; 상의세포종; 성상세포종; 원형질 성상세포종; 원섬유 성상세포종; 성아세포종; 교모세포종; 핍지교종; 희소돌기아교모세포종; 원시신경외배엽; 소뇌육종; 신경절아세포종; 신경아세포종; 망막모세포종; 후신경원성 종양; 수막종, 악성; 신경섬유육종; 신경집종, 악성; 과립상세포 종양, 악성; 악성 림프종; 호지킨병; 호지킨; 파라육아종; 악성 림프종, 소형림프구성; 악성 림프종, 대세포, 미만성; 악성 림프종, 여포상; 균상식육종; 다른 특정된 비-호지킨 림프종; 악성 조직구증; 다발성 골수종; 비만세포 육종; 면역증식성 소장 질환; 백혈병; 림프성 백혈병; 형질세포 백혈병; 적백혈병; 림프육종세포 백혈병; 골수성 백혈병; 호염기성 백혈병; 호산구성 백혈병; 단핵구성 백혈병; 비만세포 백혈병; 거대모구성 백혈병; 골수성 육종; 및 모발세포 백혈병.

세포에 적용될 때 용어 "접촉된" 및 "노출된"은 본원에서 치료제가 표적 세포에 전달되거나 표적 세포와 직접 병치되는 과정을 설명하기 위해 사용된다. 예를 들어, 세포 사멸을 달성하기 위해, 하나 이상의 작용제는 세포를 사멸시키거나 세포 분열을 방지하는 데 효과적인 양으로 세포에 전달된다.

치료에 대한 환자의 효과적인 반응 또는 환자의 "반응성"은 질환 또는 장애에 걸릴 위험이 있거나 이를 앓고 있는 환자에게 부여되는 임상적 또는 치료적 이점을 나타낸다. 이러한 이점에는 세포 또는 생물학적 반응, 완전 반응, 부분 반응, 안정한 질환(진행 또는 재발 없음) 또는 나중에 재발하는 반응이 포함될 수 있다. 예를 들어, 효과적인 반응은 암 진단을 받은 환자의 종양 크기 감소 또는 무진행 생존일 수 있다.

치료 결과를 예측하고 모니터링할 수 있고/있거나 이러한 치료로부터 이익을 얻는 환자가 본원에 기재된 방법을 통해 식별되거나 선택될 수 있다.

신생물 상태(neoplastic condition) 치료와 관련하여, 신생물 상태의 단계에 따라, 신생물 상태 치료는 다음 요법 중 하나 또는 조합을 포함한다: 신생물 조직 제거 수술, 방사선 요법 및 화학요법. 다른 치료 요법은 항암제, 예를 들어, 치료 조성물 및 화학요법제의 투여와 조합될 수 있다. 예를 들어, 이러한 항암제로 치료될 환자는 또한 방사선 요법을 받을 수 있고/있거나 수술을 받을 수 있다.

질환의 치료를 위해, 치료 조성물의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 환자의 임상 이력 및 작용제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다. 작용제는 한 번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다.

치료 및 예방 방법 및 조성물은 원하는 효과를 달성하는 데 효과적인 조합된 양으로 제공될 수 있다. 조직, 종양 또는 세포는 하나 이상의 작용제를 포함하는 하나 이상의 조성물 또는 약리학적 제형(들)과 접촉되거나, 조직, 종양 및/또는 세포를 2개 이상의 별개의 조성물 또는 제형과 접촉시킴으로써 접촉될 수 있다. 또한, 이러한 병용 요법은 화학요법, 방사선 요법, 외과적 요법 또는 면역 요법과 함께 사용될 수 있음이 고려된다.

병용 투여는 동일한 투여형으로 2개 이상의 작용제의 동시 투여, 별도의 투여형으로 동시 투여 및 개별 투여를 포함할 수 있다. 즉, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제는 동일한 투여형으로 함께 제형화되고 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제가 동시에 투여될 수 있으며, 여기서 두 작용제는 별개의 제형으로 존재한다. 또 다른 대안으로, 치료제는 다른 치료제가 바로 뒤이어 투여되거나 또는 그 반대로 투여될 수 있다. 별도의 투여 프로토콜에서, 본 치료 조성물 및 또 다른 치료제는 몇 분 간격으로, 또는 몇 시간 간격으로, 또는 며칠 간격으로 투여될 수 있다.

제1 항암 치료(예를 들어, 재조합 단백질을 발현시키는 엑소좀 또는 엑소좀에서 단리된 재조합 단백질)는 제2 항암 치료에 비해 전, 동안, 후에 또는 다양한 조합으로 투여될 수 있다. 투여는 동시에부터 몇 분 내지 며칠 내지 몇 주까지의 간격으로 이루어질 수 있다. 제1 치료가 제2 치료와 별도로 환자에게 제공되는 구현예에서, 일반적으로 두 화합물이 여전히 환자에게 유리하게 조합된 효과를 발휘할 수 있도록 각 전달 시간 사이에 상당한 기간이 만료되지 않도록 보장할 것이다. 이러한 예에서, 환자에게 제1 요법 및 제2 요법을 서로 약 12 내지 24 또는 72시간 내에, 더 구체적으로는 서로 약 6 내지 12시간 내에 제공할 수 있는 것으로 고려된다. 일부 상황에서는 각 투여 사이에 며칠(2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일)에서 몇 주(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8주)가 경과하는 경우 치료 기간을 상당히 연장하는 것이 바람직할 수 있다.

특정 구현예에서, 치료 과정은 1 내지 90일 이상 지속될 것이다(이러한 범위는 중간 일을 포함함). 하나의 작용제가 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있고, 또 다른 작용제가 1일 내지 90일 중 임의의 날(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 또는 이들의 임의의 조합에 제공될 수 있음이 고려된다. 하루(24시간) 내에 환자에게 작용제(들)를 한 번 또는 여러 번 투여할 수 있다. 더욱이, 치료 과정 후에, 항암 치료가 투여되지 않는 기간이 있는 것으로 고려된다. 이 기간은 환자의 상태, 예를 들어 예후, 힘(strength), 건강 등에 따라 1 내지 7일 및/또는 1 내지 5주 및/또는 1 내지 12개월 이상(이러한 범위는 중간 일을 포함함) 지속될 수 있다. 치료 주기는 필요에 따라 반복될 것으로 예상된다.

다양한 조합이 사용될 수 있다. 아래의 예에서 제1 항암 요법은 "A"이고 제2 항암 요법은 "B"이다:

A/B/A B/A/B B/B/A A/A/B A/B/B B/A/A A/B/B/B B/A/B/B

B/B/B/A B/B/A/B A/A/B/B A/B/A/B A/B/B/A B/B/A/A

B/A/B/A B/A/A/B A/A/A/B B/A/A/A A/B/A/A A/A/B/A

환자에게 본 발명의 임의의 화합물 또는 요법을 투여하는 것은, 존재한다면, 작용제의 독성을 고려하여, 이러한 화합물의 투여를 위한 일반적인 프로토콜을 따를 것이다. 따라서, 일부 구현예에서는 병용 요법에 기인하는 독성을 모니터링하는 단계가 있다.

1. 화학요법

본 발명에 따라 매우 다양한 화학요법제가 사용될 수 있다. 용어 "화학요법"은 암을 치료하기 위한 약물의 사용을 나타낸다. "화학요법제"는 암 치료에 투여되는 화합물 또는 조성물을 의미하기 위해 사용된다. 이러한 작용제 또는 약물은 세포 내 활동 모드, 예를 들어, 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지 여부 및 어느 단계에서 이들이 세포 주기에 영향을 미치는지에 따라 분류된다. 대안적으로, 작용제는 DNA를 직접 교차 결합하거나, DNA에 삽입되거나, 핵산 합성에 영향을 줌으로써 염색체 및 유사분열 이상을 유도하는 능력에 따라 특성화될 수 있다.

화학요법제의 예에는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 사이클로포스파미드; 알킬 설포네이트, 예를 들어 부설판, 임프로설판, 및 피포설판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도파, 카보퀴온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드, 및 트리메틸올로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌(특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신(합성 유사물질 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065(이의 아도젤레신, 카젤레신 및 비젤레신 합성 유사물질 포함); 크립토피신(특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 두오카마이신(합성 유사물질, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕티인(sarcodictyin); 스퐁기스타틴; 질소 머스터드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 및 우라실 머스터드; 니트로스우레아, 예를 들어 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라님누스틴(ranimnustine); 항생제, 예를 들어 에네디인(enediyne) 항생제(예를 들어, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마lI 및 칼리케아미신 오메가I1); 디네마이신(dynemicin) A를 포함하는 디네마이신; 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 에네디인 항생제 발색단, 아클라시노마이신(aclacinomysin), 악티노마이신, 오트라르나이신(authrarnycin), 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르치노필린, 크로모미시니스(chromomycinis), 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신(모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예를 들어 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라르나이신(nogalarnycin), 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 켈라마이신(quelamycin), 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 및 조루비신; 대사길항물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사물질, 예를 들어 데노프테린, 프테로프테린, 및 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 및 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모퍼(carmofur), 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 및 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 및 테스토락톤; 항-부신(anti-adrenals), 예를 들어 미토탄 및 트리로스탄; 엽산 보충제, 예를 들어 프로린산(frolinic acid); 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트랙세이트(edatraxate); 데포파민; 데메콜신; 디아지퀴온(diaziquone); 엘포르미틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌(lonidainine); 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰(mopidanmol); 니트라에린(nitraerine); 펜토스타틴; 페나멧; 피라루비신; 로소산트론; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK폴리사카라이드 복합체; 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센(특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안가이딘(anguidine)); 우레탄; 빈데신; 데카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신(gacytosine); 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 백금 배위 착물, 예를 들어 시스플라틴, 옥살리플라틴, 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; 이리노테칸(예를 들어, CPT-11); 토포이소머라아제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노이드, 예를 들어 레티노산; 카페시타빈; 카보플라틴, 프로카바진, 플리코마이신, 젬시타빈(gemcitabien), 나벨빈, 파네실-단백질 트랜스페라아제 억제제, 트랜스플라티넘, 및 상기 중 어느 하나의 약제학적으로 허용되는 염, 산, 또는 유도체가 포함된다.

2. 방사선 요법

DNA 손상을 유발하고 광범위하게 사용되는 다른 요인으로는 일반적으로 γ-선, X-선, 및/또는 종양 세포로의 방사성 동위원소의 직접 전달이라고 알려진 것이 포함된다. 마이크로파, 양성자 빔 조사(미국 특허 5,760,395 및 4,870,287) 및 UV-조사와 같은 다른 형태의 DNA 손상 요인도 고려된다. 이러한 모든 요인은 DNA, DNA의 전구체, DNA의 복제 및 복구, 및 염색체의 조립 및 유지에 대한 광범위한 손상에 영향을 미칠 가능성이 높다. X-선의 투여 범위는 장기간(3 내지 4주) 동안 50 내지 200 뢴트겐의 1일 선량부터 2000 내지 6000 뢴트겐의 단일 선량에 이르기까지 다양하다. 방사성 동위원소의 투여 범위는 매우 다양하며, 동위원소의 반감기, 방출되는 방사선의 강도 및 유형, 신생물 세포의 흡수에 따라 달라진다.

3. 면역요법

숙련가는 추가적인 면역요법이 본 발명의 방법과 병용하여 또는 함께 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 암 치료의 맥락에서, 면역요법은 일반적으로 암세포를 표적으로 하고 파괴하기 위해 면역 효과기 세포와 분자의 사용에 의존한다. 리툭시맙(Rituximab)(리툭산(Rituxan)®)이 이러한 예이다. 면역 효과기는, 예를 들어, 종양 세포 표면상의 일부 마커에 특이적인 항체일 수 있다. 항체는 단독으로 치료 효과기 역할을 할 수 있거나 다른 세포를 동원하여 실제로 세포 사멸에 영향을 미칠 수 있다. 항체는 또한 약물 또는 독소(화학요법, 방사성 핵종, 리신 A 사슬, 콜레라 독소, 백일해 독소 등)에 접합될 수 있으며, 단지 표적화제로 작용할 수 있다. 대안적으로, 효과기는 종양 세포 표적과 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 표면 분자를 운반하는 림프구일 수 있다. 다양한 효과기 세포에는 세포독성 T 세포 및 NK 세포가 포함된다.

면역요법의 한 측면에서, 종양 세포는 표적화 가능한, 즉, 대부분의 다른 세포에 존재하지 않는 일부 마커를 보유해야 한다. 많은 종양 마커가 존재하며 이들 중 임의의 마커는 본 발명의 맥락에서 표적화에 적합할 수 있다. 일반적인 종양 마커에는 CD20, 암배아 항원, 티로시나아제(p97), gp68, TAG-72, HMFG, 시알릴 루이스 항원, MucA, MucB, PLAP, 라미닌 수용체, erb B 및 p155가 포함된다. 면역요법의 대안적인 측면은 항암 효과와 면역 자극 효과를 결합하는 것이다. 사이토카인, 예를 들어, IL-2, IL-4, IL-12, GM-CSF, 감마-IFN, 케모카인, 예를 들어 MIP-1, MCP-1, IL-8, 및 성장 인자, 예를 들어 FLT3 리간드를 포함하는 면역 자극 분자도 존재한다.

현재 연구중이거나 사용중인 면역요법의 예로는 면역 보조제, 예를 들어, 마이코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis ), 플라스모디움 팔시파룸 (Plasmodium falciparum), 디니트로클로로벤젠, 및 방향족 화합물(미국 특허 5,801,005 및 5,739,169; Hui and Hashimoto, 1998; Christodoulides et al., 1998); 사이토카인 요법, 예를 들어, 인터페론 α, β, 및 γ, IL-1, GM-CSF, 및 TNF(참조: Bukowski et al., 1998; Davidson et al., 1998; Hellstrand et al., 1998); 유전자 요법, 예를 들어, TNF, IL-1, IL-2, 및 p53(참조: Qin et al., 1998; Austin-Ward and Villaseca, 1998; 미국 특허 5,830,880 및 5,846,945); 모노클로날 항체, 예를 들어, 항-CD20, 항-강글리오사이드 GM2, 및 항-p185(참조: Hollander, 2012; Hanibuchi et al., 1998; 미국 특허 5,824,311)가 있다. 하나 이상의 항암 요법이 본원에 기재된 항체 요법과 함께 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

일부 구현예에서, 면역요법은 면역 체크포인트 억제제일 수 있다. 면역 체크포인트는 신호(예를 들어, 공-자극 분자)를 높이거나 신호를 낮춘다. 면역 체크포인트 차단에 의해 표적화될 수 있는 억제 면역 체크포인트로는 아데노신 A2A 수용체(A2AR), B7-H3(CD276으로도 공지됨), B 및 T 림프구 감쇠물(BTLA), 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4, CD152로도 공지됨), 인돌아민 2,3-디옥시게나아제(IDO), 살해-세포 면역글로불린(KIR), 림프구 활성화 유전자-3(LAG3), 예정된 사멸 1(PD-1), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM-3) 및 T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제 인자(VISTA)가 포함된다. 특히, 면역 체크포인트 억제제는 PD-1 축 및/또는 CTLA-4를 표적화한다.

면역 체크포인트 억제제는 약물 예를 들어 소분자, 리간드 또는 수용체의 재조합 형태일 수 있거나, 특히 항체, 예를 들어 인간 항체이다(예를 들어, 국제 특허 공보 WO2015016718; Pardoll, Nat Rev Cancer, 12(4): 252-64, 2012; 둘 다 본원에 참조로 포함됨). 면역 체크포인트 단백질 또는 이의 유사체의 공지된 억제제가 사용될 수 있으며, 특히 키메라화, 인간화 또는 인간 형태의 항체가 사용될 수 있다. 숙련가가 알고 있는 바와 같이, 본 개시내용에 언급된 특정 항체에 대한 대안적인 및/또는 동등한 명칭이 사용될 수 있다. 이러한 대안적 및/또는 동등한 명칭은 본 개시내용의 맥락에서 상호교환 가능하다. 예를 들어, 람브롤리주맙(lambrolizumab)은 MK-3475 및 펨브롤리주맙의 대안적인 및 동등한 명칭으로도 공지되어 있음이 알려져 있다.

일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 PD-1이 이의 리간드 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PD-1 리간드 결합 파트너는 PDL1 및/또는 PDL2이다. 또 다른 구현예에서, PDL1 결합 길항제는 PDL1이 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PDL1 결합 파트너는 PD-1 및/또는 B7-1이다. 또 다른 구현예에서, PDL2 결합 길항제는 PDL2가 이의 결합 파트너와 결합하는 것을 억제하는 분자이다. 구체적인 측면에서, PDL2 결합 파트너는 PD-1이다. 길항제는 항체, 이의 항원 결합 단편, 면역접합체(immunoadhesin), 융합 단백질 또는 올리고펩티드일 수 있다. 예시적인 항체는 미국 특허 제8,735,553호, 제8,354,509호 및 제8,008,449호에 기재되어 있으며, 모두 본원에 참조로 포함되어 있다. 본원에 제공된 방법에 사용하기 위한 다른 PD-1 축 길항제는 미국 특허 공보 제20140294898호, 제2014022021호 및 제20110008369호(모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지되어 있다.

일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 항-PD-1 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체)이다. 일부 구현예에서, 항-PD-1 항체는 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 및 CT-011로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 면역접합체(예를 들어, 불변 영역(예를 들어, 면역글로불린 서열의 Fc 영역)에 융합된 PDL1 또는 PDL2의 세포외 또는 PD-1 결합 부분을 포함하는 면역접합체)이다. 일부 구현예에서, PD-1 결합 길항제는 AMP- 224이다. MDX-1106-04, MDX-1106, ONO-4538, BMS-936558, 및 OPDIVO^®로도 공지된 니볼루맙은 WO2006/121168에 기재된 항-PD-1 항체이다. MK-3475, 머크(Merck) 3475, 람브롤리주맙, 키트루다(KEYTRUDA)^®, 및 SCH-900475로도 공지된 펨브롤리주맙은 WO2009/114335에 기재된 항-PD-1 항체이다. hBAT 또는 hBAT-1로도 공지된 CT-011은 WO2009/101611에 기재된 항-PD-1 항체이다. B7-DCIg로도 공지된 AMP-224는 WO2010/027827 및 WO2011/066342에 기재된 PDL2-Fc 융합 가용성 수용체이다.

본원에 제공된 방법에서 표적화될 수 있는 또 다른 면역 체크포인트는 CD152로도 공지된 세포독성 T-림프구-관련 단백질 4(CTLA-4)이다. 인간 CTLA-4의 완전한 cDNA 서열은 젠뱅크(Genbank) 수탁 번호가 L15006이다. CTLA-4는 T 세포의 표면에서 발견되며, 항원-제시 세포의 표면에서 CD80 또는 CD86에 결합될 때 "오프(off)" 스위치 역할을 한다. CTLA4는 헬퍼 T 세포의 표면에서 발현되고 억제 신호를 T 세포에 전송하는 면역글로불린 수퍼패밀리의 일원이다. CTLA4는 T-세포 공-자극 단백질인 CD28과 유사하며, 두 분자 모두 항원-제시 세포에서 각각 B7-1 및 B7-2라고도 하는 CD80 및 CD86에 결합한다. CTLA4는 T 세포에 억제 신호를 전송하는 반면, CD28은 자극 신호를 전송한다. 세포내 CTLA4는 또한 조절 T 세포에서 발견되며, 이의 기능에 중요할 수 있다. T 세포 수용체와 CD28을 통한 T 세포 활성화는 B7 분자에 대한 억제 수용체인, CTLA-4의 발현을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 면역 체크포인트 억제제는 항-CTLA-4 항체(예를 들어, 인간 항체, 인간화 항체, 또는 키메라 항체), 이의 항원 결합 단편, 면역접합체, 융합 단백질, 또는 올리고펩티드이다.

본 방법에 사용하기에 적합한 항-인간-CTLA-4 항체(또는 이로부터 유래된 VH 및/또는 VL 도메인)는 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 당해 분야에서 인정된 항-CTLA-4 항체가 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,119,129호, WO 01/14424, WO 98/42752; WO 00/37504(CP675,206, 트레멜리무맙으로도 공지됨; 이전에 티실리무맙(ticilimumab)), 미국 특허 제6,207,156호; 문헌(참조: urwitz et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95(17): 10067-10071; Camacho et al. (2004) J Clin Oncology 22(145): Abstract No. 2505 (antibody CP-675206); 및 Mokyr et al. (1998) Cancer Res 58:5301-5304)에 개시된 항-CTLA-4 항체가 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 각각의 상기 언급된 간행물의 교시는 본원에 참조로 포함된다. CTLA-4와의 결합에 대해 이러한 당해 분야에서 인정된 임의의 항체와 경쟁하는 항체도 사용될 수 있다. 예를 들어, 인간화 CTLA-4 항체는 국제 특허 출원 제WO2001014424호, 제WO2000037504호, 및 미국 특허 제8,017,114호에 기재되어 있으며; 모두 본원에 참조로 포함되어 있다.

예시적인 항-CTLA-4 항체는 이필리무맙(10D1, MDX- 010, MDX- 101, 및 여보이(Yervoy)®로도 공지됨) 또는 이의 항원 결합 단편 및 변이체이다(예를 들어, WO 01/14424 참조). 다른 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 중쇄 및 경쇄 CDR 또는 VR을 포함한다. 따라서, 일 구현예에서, 항체는 이필리무맙의 VH 영역의 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인, 및 이필리무맙의 VL 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 도메인을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 동일한 CTLA-4 상의 에피토프와 결합에 대해 경쟁하고/하거나 이에 결합한다. 또 다른 구현예에서, 항체는 상기 언급된 항체와 적어도 약 90% 가변 영역 아미노산 서열 동일성(예를 들어, 이필리무맙과 적어도 약 90%, 95%, 또는 99% 가변 영역 동일성)을 갖는다.

CTLA-4를 조절하기 위한 다른 분자로는 미국 특허 제5844905호, 제5885796호 및 국제 특허 출원 제WO1995001994호 및 제WO1998042752호(모두 본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 CTLA-4 리간드 및 수용체; 및 미국 특허 제8329867호(본원에 참조로 포함됨)에 기재된 바와 같은 면역접합체가 포함된다.

일부 구현예에서, 면역 요법은 생체외에서 생성된 자가 항원-특이적 T 세포의 전달을 포함하는 입양 면역요법일 수 있다. 입양 면역요법에 사용된 T 세포는 항원 특이적인 T 세포의 확장 또는 유전 공학을 통한 T 세포의 방향변경(redirection)에 의해 생성될 수 있다(참조: Park, Rosenberg et al. 2011). 종양 특이적 T 세포의 단리 및 전달은 흑색종 치료에 성공적인 것으로 나타났다. T 세포의 새로운 특이성은 형질전환 T 세포 수용체 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 유전적 전달을 통해 성공적으로 생성되었다(참조: Jena, Dotti et al. 2010). CAR은 단일 융합 분자로 하나 이상의 시그널링 도메인과 결합된 표적화 모이어티로 구성된 합성 수용체이다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 가요성 링커에 의해 결합된 모노클로날 항체의 가벼운 및 가변 단편을 포함하는 단일-사슬 항체(scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성된다. 수용체 또는 리간드 도메인에 기반한 결합 모이어티도 성공적으로 사용되었다. 1세대 CAR에 대한 시그널링 도메인은 CD3제타 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역에서 유래한다. CAR은 림프종 및 고형 종양을 포함하는 다양한 악성 종양의 종양 세포 표면에서 발현되는 항원에 대해 T 세포가 성공적으로 방향변경되도록 하였다(참조: Jena, Dotti et al. 2010).

일 구현예에서, 본 출원은 암 치료를 위한 병용 요법을 제공하며, 여기서 병용 요법은 입양 T-세포 요법 및 체크포인트 억제제를 포함한다. 일 측면에서, 입양 T-세포 요법은 자가 및/또는 동종 T 세포를 포함한다. 또 다른 측면에서, 자가 및/또는 동종 T 세포는 종양 항원에 대해 표적화된다.

4. 수술

암 환자의 대략 60%는 예방, 진단 또는 병기결정, 치유 및 완화 수술을 포함하는 일부 유형의 수술을 받게 될 것이다. 치유 수술은 암 조직의 전부 또는 일부가 물리적으로 제거, 절제 및/또는 파괴되는 절제술을 포함하며, 본 발명의 치료, 화학요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 유전자 요법, 면역요법 및/또는 대체 요법과 같은 다른 요법과 함께 사용될 수 있다. 종양 절제술은 종양의 적어도 일부를 물리적으로 제거하는 것을 나타낸다. 종양 절제술 외에도, 수술 치료는 레이저 수술, 냉동수술, 전기수술, 및 현미경-제어 수술(모스 수술(Mohs' surgery))을 포함한다.

암성 세포, 조직 또는 종양의 일부 또는 전부를 절제하면, 체내에 공동이 형성될 수 있다. 치료는 관류, 직접 주사, 또는 추가 항암 요법으로 부위의 국소 적용에 의해 달성될 수 있다. 이러한 치료는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일마다, 또는 1, 2, 3, 4, 및 5주마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월마다 반복될 수 있다. 이러한 치료는 투여량도 다양할 수 있다.

5. 기타 작용제

치료의 치료 효능을 개선하기 위해 본 발명의 특정 측면과 조합하여 다른 작용제를 사용할 수 있음이 고려된다. 이러한 추가 작용제로는 세포 표면 수용체 및 GAP 접합의 상향조절에 영향을 미치는 작용제, 세포증식 억제제 및 분화제, 세포 부착 억제제, 아폽토시스 유도제에 대한 과증식 세포의 민감도를 증가시키는 작용제, 또는 기타 생물 작용제가 포함된다. GAP 접합의 수를 증가시킴으로써 세포간 시그널링의 증가는 인접한 과증식 세포 집단에 대한 항-과증식 효과를 증가시킬 것이다. 다른 구현예에서, 세포증식 억제제 또는 분화제는 치료의 항-과증식 효능을 개선하기 위해 본 발명의 특정 측면과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 효능을 개선하기 위해 세포 부착 억제제가 고려된다. 세포 부착 억제제의 예로는 초점 부착 키나아제(FAK) 억제제 및 로바스타틴이 있다. 치료 효능을 개선하기 위해 항체 c225와 같은 아폽토시스에 대한 과증식 세포의 민감도를 증가시키는 다른 작용제가 본 발명의 특정 측면과 조합하여 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.

III. 약제학적 조성물

치료 단백질, 억제 RNA 및/또는 소분자 약물을 발현시키거나 포함하는 엑소좀은 종양 세포 성장을 억제하고, 가장 바람직하게는 국소 진행성 또는 전이성 암을 앓고 있는 암 환자의 암세포를 죽이기 위해 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있는 것으로 고려된다. 상기 엑소좀은 정맥내, 경막내 및/또는 복강내로 투여될 수 있다. 상기 엑소좀은 단독으로 또는 항-증식 약물과 함께 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 엑소좀은 수술 또는 다른 시술 전에 환자의 암 부하를 줄이기 위해 투여된다. 대안적으로, 상기 엑소좀은 남은 모든 암(예를 들어, 수술로 제거하지 못한 암)이 생존하지 않도록 하기 위해 수술 후에 투여될 수 있다.

본 발명은 치료 제제의 특정 성질에 의해 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 예를 들어, 이러한 조성물은 생리적으로 허용되는 액체, 겔, 고체 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 제형으로 제공될 수 있다. 이러한 치료 제제는 다른 치료제와 유사한 방식으로 가축에서의 사용과 같은 수의학적 용도, 및 인간의 임상 용도를 위해 포유동물에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 치료 효능에 필요한 투여량은 사용 유형 및 투여 방식, 뿐만 아니라 개별 대상체의 특정 요구사항에 따라 달라질 것이다.

임상 적용이 고려되는 경우, 의도된 적용에 적합한 형태로 재조합 단백질 및/또는 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 것이 필요할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 용해되거나 분산된 유효량의 하나 이상의 재조합 단백질 및/또는 엑소좀 또는 추가 작용제를 포함할 수 있다. "약제학적 또는 약리적으로 허용되는"이라는 어구는 동물, 예를 들어, 적절한 경우 인간에게 투여될 때 유해한, 알레르기성 또는 기타 불리한 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티(entity) 및 조성물을 나타낸다. 본원에 개시된 바와 같은 재조합 단백질 및/또는 엑소좀, 또는 추가 활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조는 본원에 참조로 포함된 문헌(참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990)에 예시된 바와 같이, 본 개시내용에 비추어 당업자에게 공지될 것이다. 더욱이, 동물(예를 들어, 인간) 투여의 경우, 제제는 FDA 생물 표준 사무국(FDA Office of Biological Standards)에서 요구하는 무균성, 발열원성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다는 것이 이해될 것이다.

추가로 본 발명의 특정 측면에 따르면, 투여에 적합한 조성물은 불활성 희석제와 함께 또는 불활성 희석제 없이 약제학적으로 허용되는 담체로 제공될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 담체"는, 당업자에게 알려진 바와 같이, 임의의 및 모든 수성 용매(예를 들어, 물, 알코올/수성 용액, 에탄올, 염수 용액, 비경구 비히클, 예를 들어 염화나트륨, 링거의 덱스트로스 등), 비-수성 용매(예를 들어, 지방, 오일, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 식물성 오일, 및 주사 가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸올레에이트), 지질, 리포좀, 분산 매질, 코팅물(예를 들어, 레시틴), 계면활성제, 산화방지제, 보존제(예를 들어, 항박테리아제 또는 항진균제, 항-산화제, 킬레이트제, 불활성 기체, 파라벤(예를 들어, 메틸파라벤, 프로필파라벤), 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 또는 이들의 조합), 등장화제(예를 들어, 당 및 염화나트륨), 흡수 지연제(예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴), 염, 약물, 약물 안정화제, 겔, 수지, 충전제, 결합제, 부형제, 붕해제, 윤활제, 감미제, 향미제, 염료, 액체 및 영양 보충제, 이와 유사한 물질 및 이들의 조합을 포함한다. 담체는 동화될 수 있어야 하며 액체, 반고체, 즉, 페이스트 또는 고체 캐리어를 포함한다. 또한, 원하는 경우, 조성물은 습윤제 또는 유화제, 안정화제 또는 pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다. 약제학적 조성물에서 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅물의 사용, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다.

약제학적으로 허용되는 담체는 특히 인간에게 투여되도록 제형화되지만, 특정 구현예에서는 비-인간 동물에게 투여되도록 제형화되지만 인간에게 투여하는 데 허용되지 않을(예를 들어, 정부 규제로 인해) 약제학적으로 허용되는 담체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 임의의 통상적인 담체가 활성 성분과 양립될 수 없는(예를 들어, 수용자 또는 그 안에 함유된 조성물의 치료 효과에 해로운) 경우를 제외하고, 치료 또는 약제학적 조성물에서의 이의 사용이 고려된다. 본 발명의 특정 측면에 따르면, 조성물은 임의의 편리하고 실용적인 방식으로, 즉, 용해, 현탁, 유화, 혼합, 캡슐화, 흡수 등에 의해 담체와 배합된다. 이러한 절차는 당업자에게 일상적이다.

본 발명의 특정 구현예는 그것이 고체, 액체 또는 에어로졸 형태로 투여되어야 하는지, 및 주사와 같은 투여 경로를 위해 멸균되어야 하는지에 따라 상이한 유형의 담체를 포함할 수 있다. 조성물은 정맥내, 피내, 경피, 경막내, 동맥내, 복강내, 비강내, 질내, 직장내, 근육내, 피하, 점막, 경구, 국소, 국부, 흡입(예를 들어, 에어로졸 흡입), 주사, 주입, 연속 주입에 의해, 지질 조성물(예를 들어, 리포좀)에서 카테터를 통해, 세척을 통해 표적 세포를 직접 국소 관류 배싱(bathing)함에 의해, 또는 당업자에게 알려진 다른 방법 또는 전술한 것의 임의의 조합에 의해 투여될 수 있다(참조: 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., 1990, 참조로 본원에 포함됨).

활성 화합물은 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있으며, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 또는 심지어 복강내 경로를 통한 주사를 위해 제형화될 수 있다. 통상적으로, 이러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며; 주사 전에 액체를 첨가하여 용액 또는 현탁액을 제조하는 데 사용하기에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있으며; 제제는 또한 유화될 수 있다.

주사 용도에 적합한 약제학적 형태는 멸균 수성 용액 또는 분산액; 참깨유, 낙화생유 또는 수성 프로필렌 글리콜을 포함하는 제형; 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우에 형태는 멸균되어야 하며, 쉽게 주사될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 또한, 제조 및 보관 조건하에 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.

치료제는 유리 염기, 중성 또는 염 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 산부가 염, 예를 들어, 단백질성 조성물의 유리 아미노 그룹으로 형성된 염, 또는 예를 들어, 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산 또는 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화철; 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘 또는 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화되면, 용액은 투여 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 제형은 주사용 용액, 또는 폐로 전달하기 위한 에어로졸과 같은 비경구 투여를 위해 제형화되거나, 약물 방출 캡슐 등과 같이 소화기 투여를 위해 제형화되는 것과 같이 다양한 투여형으로 쉽게 투여된다.

본 발명의 특정 구현예에서, 조성물은 반고체 또는 고체 담체와 완전히 배합되거나 혼합된다. 혼합은 분쇄와 같은 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 치료 활성의 손실, 즉, 위 내에서의 변성으로부터 조성물을 보호하기 위해 안정화제를 혼합 공정에 첨가할 수도 있다. 조성물에 사용하기 위한 안정화제의 예로는 완충액, 아미노산, 예를 들어 글리신 및 리신, 탄수화물, 예를 들어 덱스트로스, 만노스, 갈락토스, 프럭토스, 락토스, 수크로스, 말토스, 소르비톨, 만니톨 등이 포함된다.

추가 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 지질 및 수성 용매를 포함하는 약제학적 지질 비히클 조성물의 사용에 관한 것일 수 있다. 본원에 사용된 용어 "지질"은 특징적으로 물에 불용성이고 유기 용매로 추출할 수 있는 임의의 광범위한 물질을 포함하는 것으로 정의될 것이다. 이러한 광범위한 종류의 화합물은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 용어 "지질"이 본원에 사용된 바와 같이, 임의의 특정 구조에 제한되지 않는다. 예로는 장쇄 지방족 탄화수소 및 이의 유도체를 포함하는 화합물이 포함된다. 지질은 자연적으로 발생하거나 합성될 수 있다(즉, 사람에 의해 설계되고 생산됨). 그러나, 지질은 일반적으로 생물학적 물질이다. 생물학적 지질은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 중성 지방, 인지질, 포스포글리세라이드, 스테로이드, 테르펜, 리소지질(lysolipid), 글리코스핑고지질, 당지질, 설파타이드, 에테르- 및 에스테르-결합 지방산을 갖는 지질, 중합성 지질, 및 이들의 조합을 포함한다. 물론, 지질로 당업자에 의해 이해되는 본원에 구체적으로 기재된 화합물 이외의 화합물도 조성물 및 방법에 포함된다.

당업자는 지질 비히클에 조성물을 분산시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 기술에 익숙할 것이다. 예를 들어, 치료제는 지질을 함유하는 용액에 분산되거나, 지질과 함께 용해되거나, 지질과 함께 유화되거나, 지질과 혼합되거나, 지질과 배합되거나, 지질에 공유 결합되거나, 지질에 현탁액으로 함유되거나, 미셀 또는 리포솜에 함유되거나 이와 복합체화되거나, 또는 달리 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 지질 또는 지질 구조와 결합될 수 있다. 분산액은 리포솜의 형성을 초래할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다.

용어 "단위 용량" 또는 "투여량"은 대상체에서 사용하기에 적합한 물리적으로 분리된 단위를 나타내며, 각각의 단위는 이의 투여, 즉, 적절한 경로 및 치료 요법과 관련하여 상기 논의된 원하는 반응을 초래하도록 계산된 치료 조성물의 미리 결정된 양을 포함한다. 치료 횟수와 단위 용량에 따라, 투여될 양은 원하는 효과에 좌우된다. 환자 또는 대상체에게 투여되는 본 발명의 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리적 요인, 예를 들어 대상체의 체중, 연령, 건강 및 성별, 치료할 질환의 유형, 질환 침투 정도, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발증, 투여 경로, 특정 치료 물질의 효능, 안정성 및 독성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 또한 투여당 약 1㎍/kg/체중 내지 약 1000mg/kg/체중(이러한 범위는 중간 용량을 포함함) 이상, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비제한적인 예로, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 100mg/kg/체중, 약 5㎍/kg/체중 내지 약 500mg/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 수 있다.

동물 환자에게 투여되는 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리적 요인, 예를 들어 체중, 상태의 중증도, 치료할 질환의 유형, 이전 또는 동시 치료적 개입, 환자의 특발증, 및 투여 경로에 의해 결정될 수 있다. 투여량 및 투여 경로에 따라, 바람직한 투여량 및/또는 유효량의 투여 횟수는 대상체의 반응에 따라 달라질 수 있다. 투여 담당 의사는 어떠한 경우에도 개별 대상체에 대한 조성물 내 활성 성분(들)의 농도 및 적절한 용량(들)을 결정할 수 있다.

특정 구현예에서, 약제학적 조성물은, 예를 들어, 적어도 약 0.1%의 활성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 활성 화합물은 단위 중량의 약 2% 내지 약 75%, 또는 예를 들어, 약 25% 내지 약 60%, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은 적절한 투여량이 화합물의 임의의 주어진 단위 용량으로 얻어질 수 있는 방식으로 준비될 수 있다. 용해도, 생체이용률, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 수명과 같은 인자, 및 기타 약리학적 고려사항은 이러한 약제학적 제형을 제조하는 당업자에 의해 고려될 것이며, 따라서, 다양한 투여량 및 치료 요법이 바람직할 수 있다.

다른 비제한적인 예로, 용량은 또한 투여당 약 1 마이크로그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중, 약 10 마이크로그램/kg/체중, 약 50 마이크로그램/kg/체중, 약 100 마이크로그램/kg/체중, 약 200 마이크로그램/kg/체중, 약 350 마이크로그램/kg/체중, 약 500 마이크로그램/kg/체중, 약 1 밀리그램/kg/체중, 약 5 밀리그램/kg/체중, 약 10 밀리그램/kg/체중, 약 50 밀리그램/kg/체중, 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 200 밀리그램/kg/체중, 약 350 밀리그램/kg/체중, 약 500 밀리그램/kg/체중부터 약 1000 밀리그램/kg/체중 이상까지, 및 그 안에서 유도 가능한 임의의 범위를 포함할 수 있다. 본원에 열거된 수치로부터 유도 가능한 범위의 비제한적인 예로, 상기 기재된 수치에 기초하여, 약 5 밀리그램/kg/체중 내지 약 100 밀리그램/kg/체중, 약 5 마이크로그램/kg/체중 내지 약 500 밀리그램/kg/체중 등의 범위가 투여될 수 있다.

IV. 핵산 및 벡터

본 발명의 특정 측면에서, 치료 단백질 또는 치료 단백질을 함유하는 융합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 개시될 수 있다. 사용되는 발현 시스템에 따라 핵산 서열은 통상적인 방법에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 유전자 또는 이의 변이체는 특정 시스템에서의 발현을 위해 최적화된 코돈일 수 있다. 관심 단백질을 발현시키기 위해 다양한 벡터가 또한 사용될 수 있다. 예시적인 벡터로는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 트랜스포존(transposon) 또는 리포솜-기반 벡터가 포함되지만, 이에 제한되지 않는다.

V. 재조합 단백질, 억제 RNA, 및 유전자 편집 시스템

A. 재조합 단백질

일부 구현예는 재조합 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다. 특정 구현예는 적어도 하나의 치료 활성을 나타내는 재조합 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 재조합 단백질 또는 폴리펩티드는 치료 항체일 수 있다. 일부 측면에서, 치료 항체는 세포내 단백질에 특이적으로 또는 선택적으로 결합하는 항체일 수 있다. 추가 측면에서, 단백질 또는 폴리펩티드는 혈청 안정성을 증가시키기 위해 변형될 수 있다. 따라서, 본 출원이 "변형된 단백질" 또는 "변형된 폴리펩티드"의 기능 또는 활성을 지칭할 때, 당업자는 이것이, 예를 들어, 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 추가적인 이점을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다는 것을 이해할 것이다. "변형된 단백질"에 관한 구현예는 "변형된 폴리펩티드"와 관련하여 구현될 수 있고, 그 반대의 경우도 가능하다는 것이 구체적으로 고려된다.

재조합 단백질은 아미노산의 결실 및/또는 치환을 가질 수 있으며; 따라서, 결실이 있는 단백질, 치환이 있는 단백질, 및 결실 및 치환이 있는 단백질이 변형된 단백질이다. 일부 구현예에서, 이들 단백질은, 예를 들어, 융합 단백질 또는 링커를 갖는 단백질과 같이, 삽입 또는 첨가된 아미노산을 추가로 포함할 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 천연 단백질의 하나 이상의 잔기가 결핍되어 있지만, 천연 단백질의 특이성 및/또는 활성을 가질 수 있다. "변형된 결실 단백질"은 또한 감소된 면역원성 또는 항원성을 가질 수 있다. 변형된 결실 단백질의 예는 적어도 하나의 항원성 영역, 즉 변형된 단백질이 투여될 수 있는 유기체 유형과 같이 특정 유기체에서 항원성으로 결정된 단백질 영역으로부터 결실된 아미노산 잔기를 갖는 것이다.

치환 또는 대체 변이체는 통상적으로 단백질 내의 하나 이상의 부위에서 한 아미노산의 또 다른 아미노산으로의 교환을 포함하고, 폴리펩티드의 하나 이상의 특성, 특히 이의 효과기 기능 및/또는 생체이용률을 조절하도록 설계될 수 있다. 치환은 보존적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있고, 즉, 하나의 아미노산이 유사한 형상 및 전하 중 하나로 대체된다. 보존적 치환은 당해 분야에 익히 공지되어 있으며, 예를 들어, 다음의 변화를 포함한다: 알라닌에서 세린; 아르기닌에서 리신; 아스파라긴에서 글루타민 또는 히스티딘; 아스파르테이트에서 글루타메이트; 시스테인에서 세린; 글루타민에서 아스파라긴; 글루타메이트에서 아스파르테이트; 글리신에서 프롤린; 히스티딘에서 아스파라긴 또는 글루타민; 이소류신에서 류신 또는 발린; 류신에서 발린 또는 이소류신; 리신에서 아르기닌; 메티오닌에서 류신 또는 이소류신; 페닐알라닌에서 티로신, 류신, 또는 메티오닌; 세린에서 트레오닌; 트레오닌에서 세린; 트립토판에서 티로신; 티로신에서 트립토판 또는 페닐알라닌; 및 발린에서 이소류신 또는 류신.

결실 또는 치환에 더하여, 변형된 단백질은 통상적으로 폴리펩티드 내에 적어도 하나의 잔기의 첨가를 포함하는 잔기의 삽입을 가질 수 있다. 여기에는 표적화 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 단순히 단일 잔기의 삽입이 포함될 수 있다. 융합 단백질이라고 하는 말단 첨가는 아래에서 논의된다.

용어 "생물학적으로 기능적 등가물"은 당해 분야에서 잘 이해되고 본원에 추가로 상세하게 정의된다. 따라서, 대조 폴리펩티드의 아미노산과 동일하거나 기능적으로 동등한 아미노산의 약 70% 내지 약 80%, 또는 약 81% 내지 약 90%, 또는 심지어 약 91% 내지 약 99%를 갖는 서열이, 단백질의 생물학적 활성을 유지하는 경우, 포함된다. 재조합 단백질은 특정 측면에서 이의 천연 단백질과 생물학적으로 기능적으로 동등할 수 있다.

또한, 아미노산 및 핵산 서열은 추가의 N- 또는 C-말단 아미노산 또는 5' 또는 3' 서열과 같은 추가 잔기를 포함할 수 있지만, 여전히 단백질 발현과 관련된 생물학적 단백질 활성의 유지를 포함하여, 서열이 상기 제시된 기준을 충족하는 한, 본원에 개시된 서열 중 하나에 기재된 바와 같음을 이해할 것이다. 말단 서열의 첨가는 특히, 예를 들어, 코딩 영역의 5' 또는 3' 부분 중 하나에 인접하는 다양한 비-코딩 서열을 포함할 수 있거나 유전자 내에서 발생하는 것으로 알려진 다양한 내부 서열, 즉, 인트론을 포함할 수 있는 핵산 서열에 적용된다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질 또는 펩티드는 일반적으로 유전자로부터 번역된 전장 서열까지 약 200개 이상의 아미노산으로 구성된 단백질; 약 100개 이상의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드; 및/또는 약 3개 내지 약 100개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 지칭하지만, 이에 제한되지 않는다. 편의상, 용어 "단백질", "폴리펩티드" 및 "펩티드는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기"는 임의의 자연 발생 아미노산, 임의의 아미노산 유도체, 또는 당해 분야에 공지된 임의의 아미노산 모방체를 나타낸다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기는 아미노산 잔기의 서열을 방해하는 임의의 비-아미노산 없이 순차적이다. 다른 구현예에서, 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 또는 펩티드의 잔기 서열은 하나 이상의 비-아미노산 모이어티에 의해 중단될 수 있다.

따라서, 용어 "단백질 또는 펩티드"는 자연 발생 단백질에서 발견되는 20개의 공통 아미노산 중 적어도 하나, 또는 적어도 하나의 변형되거나 통상적이지 않은 아미노산을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 특정 구현예는 융합 단백질에 관한 것이다. 이러한 분자는 N- 또는 C-말단에서 이종 도메인에 연결된 치료 단백질을 가질 수 있다. 예를 들어, 융합물은 또한 이종 숙주에서 단백질의 재조합 발현을 허용하기 위해 다른 종의 리더 서열을 사용할 수 있다. 또 다른 유용한 융합물은 융합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 바람직하게는 절단 가능한, 단백질 친화성 태그, 예를 들어 혈청 알부민 친화성 태그 또는 6개의 히스티딘 잔기, 또는 면역학적 활성 도메인, 예를 들어 항체 에피토프의 첨가를 포함한다. 비제한적인 친화성 태그에는 폴리히스티딘, 키틴 결합 단백질(CBP), 말토스 결합 단백질(MBP) 및 글루타티온-S-트랜스퍼라아제(GST)가 포함된다.

특정 구현예에서, 치료 단백질은 XTEN 폴리펩티드(참조: Schellenberger et al., 2009), IgG Fc 도메인, 알부민 또는 알부민 결합 펩티드와 같은 생체내 반감기를 증가시키는 펩티드에 연결될 수 있다.

융합 단백질을 생성하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 완전한 융합 단백질의 새로운 합성에 의해, 또는 이종 도메인을 인코딩하는 DNA 서열의 부착에 이어서 온전한 융합 단백질의 발현에 의해 생성될 수 있다.

모 단백질의 기능적 활성을 회복하는 융합 단백질의 생산은 나란히 연결된 폴리펩티드 사이에 스플라이싱되는 펩티드 링커를 인코딩하는 브리징 DNA 절편과 유전자를 연결함으로써 촉진될 수 있다. 링커는 생성된 융합 단백질의 적절한 폴딩을 허용하기에 충분한 길이일 것이다.

B. 억제 RNA

siNA(예를 들어, siRNA)는 당해 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, siRNA 및 이중 가닥 RNA는 미국 특허 제6,506,559호 및 제6,573,099호, 뿐만 아니라 미국 특허 출원 제2003/0051263호, 제2003/0055020호, 제2004/0265839호, 제2002/0168707호, 제2003/0159161호, 및 제2004/0064842호에 기재되어 있으며, 이들 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.

siNA 내에서, 핵산의 성분은 전체적으로 동일한 유형이거나 동종일 필요가 없다(예를 들어, siNA는 뉴클레오티드 및 핵산 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다). 통상적으로, siNA는 이중 가닥 구조를 형성하고; 이중 가닥 구조는 부분적으로 또는 완전히 상보적인 2개의 별개의 핵산에서 발생할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, siNA는 단일 핵산(폴리뉴클레오티드) 또는 핵산 유사체만을 포함할 수 있으며, 그 자체로 보완함으로써(예를 들어, 헤어핀 루프를 형성함으로써) 이중 가닥 구조를 형성할 수 있다. siNA의 이중 가닥 구조는 16, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 이상의 인접 핵염기를, 그 안의 모든 범위를 포함하여 포함할 수 있다. siNA는 이중 가닥 구조를 형성하기 위해 상보적 핵산(이는 동일한 핵산의 또 다른 부분 또는 별도의 상보적 핵산일 수 있음)과 혼성화되는 17개 내지 35개의 인접 핵염기, 더 바람직하게는 18개 내지 30개의 인접 핵염기, 더 바람직하게는 19개 내지 25개의 핵염기, 더 바람직하게는 20개 내지 23개의 인접 핵염기, 또는 20개 내지 22개의 인접 핵염기, 또는 21개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법을 실행하는 데 유용한 본 발명의 작용제는 siRNA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 통상적으로, 본원에서 작은 간섭 RNA(siRNA)로 대안적으로 지칭될 수 있는 이중 가닥 RNA(dsRNA)의 도입은 RNA 간섭 또는 RNAi라고 불리는 현상인, 강력하고 특이적인 유전자 침묵을 유도한다. RNA 간섭은 "공억제(cosuppression)", "전사 후 유전자 침묵", "센스 억제" 및 "켈링(quelling)"으로도 지칭되었다. RNAi는 특정 유전자의 활성을 녹아웃하는 수단을 제공하기 때문에 매력적인 생명공학 툴이다.

RNAi를 설계할 때, siRNA의 성질, 침묵 효과의 지속성 및 전달 시스템의 선택과 같이 고려해야 할 몇 가지 요소가 있다. RNAi 효과를 생성하기 위해 유기체에 도입되는 siRNA는 통상적으로 엑손 서열을 함유할 것이다. 또한, RNAi 과정은 상동성에 의존적이므로 유전자 특이성을 최대화하는 동시에 유전자-특이적 서열이 아닌 상동성 서열 간의 교차 간섭 가능성을 최소화하기 위해 서열을 신중하게 선택해야 한다. 바람직하게는 siRNA는 siRNA의 서열과 억제될 유전자 사이에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상 또는 심지어 100%의 동일성을 나타낸다. 표적 유전자와 약 80% 미만 동일한 서열은 실질적으로 덜 효과적이다. 따라서, siRNA와 억제될 유전자 사이의 상동성이 클수록 관련없는 유전자 발현이 영향을 받을 가능성이 낮아진다.

또한, siRNA의 크기는 중요한 고려사항이다. 일부 구현예에서, 본 발명은 적어도 약 19개 내지 25개의 뉴클레오티드를 포함하고 유전자 발현을 조절할 수 있는 siRNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 맥락에서, siRNA는 바람직하게는 길이가 500, 200, 100, 50 또는 25개 뉴클레오티드 미만이다. 더 바람직하게는, siRNA는 길이가 약 19개 뉴클레오티드 내지 약 25개 뉴클레오티드이다.

표적 유전자는 일반적으로 폴리펩티드를 인코딩하는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 복제, 전사 또는 번역 또는 폴리펩티드의 발현에 중요한 다른 과정을 조절하는 폴리뉴클레오티드 영역, 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 영역 및 발현을 조절하는 이에 작동 가능하게 연결된 영역 모두를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 세포에서 발현되는 모든 유전자가 표적화될 수 있다. 바람직하게는, 표적 유전자는 질환에 중요하거나 연구 대상으로서 특히 관심이 있는 세포 활동의 진행에 관여하거나 이와 관련된 유전자이다.

siRNA는 상업적 공급원, 천연 공급원으로부터 얻을 수 있거나, 당업자에게 잘 알려진 수많은 기술 중 어느 것을 사용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, 미리 설계된 siRNA의 상업적 공급원 중 하나는 텍사스주 오스틴 소재의 앰비온(Ambion)®이다. 또 다른 하나는 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아젠®이다. 본 발명의 조성물 및 방법에 적용될 수 있는 억제 핵산은 임의의 공급원에 의해 관심 단백질의 검증된 하향조절인자인 것으로 밝혀진 임의의 핵산 서열일 수 있다. 과도한 실험 없이 그리고 본 발명의 개시내용을 사용하여, 추가의 siRNA가 본 발명의 방법을 실행하기 위해 설계되고 사용될 수 있음이 이해된다.

siRNA는 또한 하나 이상의 뉴클레오티드의 변경을 포함할 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 19개 내지 25개의 뉴클레오티드 RNA의 말단(들)에 또는 내부에(RNA의 하나 이상의 뉴클레오티드에서) 비-뉴클레오티드 물질의 첨가를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, RNA 분자는 3'-하이드록실 그룹을 함유한다. 본 발명의 RNA 분자 내의 뉴클레오티드는 또한 비-천연 발생 뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 비표준 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 변형된 백본, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 또는 당해 분야에 공지된 다른 변형된 백본을 함유할 수 있거나, 비-천연 뉴클레오시드간 연결을 함유할 수 있다. siRNA의 추가 변형(예를 들어, 2'-O-메틸 리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 리보뉴클레오티드, "보편적인 염기(universal base)" 뉴클레오티드, 5-C-메틸 뉴클레오티드, 하나 이상의 포스포로티오에이트 뉴클레오티드간 연결, 및 역 데옥시무염기(deoxyabasic) 잔기 편입)은 미국 출원 공보 2004/0019001 및 미국 특허 제6,673,611호(각각 그 전문이 참조로 포함됨)에서 확인할 수 있다. 종합적으로, 상기 기재된 이러한 모든 변경된 핵산 또는 RNA는 변형된 siRNA로 지칭된다.

C. 유전자 편집 시스템

일반적으로, "CRISPR 시스템"은, Cas 유전자, tracr(트랜스-활성화 CRISPR) 서열(예를 들어 tracrRNA 또는 활성 부분 tracrRNA), tracr-메이트 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "동향 반복" 및 tracrRNA-처리된 부분 동향 반복을 포함함), 가이드 서열(내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서 "스페이서"로도 지칭됨), 및/또는 CRISPR 유전자좌의 다른 서열 및 전사체를 인코딩하는 서열을 포함하는, CRISPR-관련("Cas") 유전자의 발현에 관여하거나 이의 활성을 지시하는 전사체 및 기타 요소를 총칭한다.

CRISPR/Cas 뉴클레아제 또는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템은 DNA에 서열-특이적으로 결합하는 비-코딩 RNA 분자(가이드) RNA, 및 뉴클레아제 기능성(예를 들어, 2개의 뉴클레아제 도메인)을 갖는 Cas 단백질(예를 들어, Cas9)을 포함할 수 있다. CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소는 예를 들어, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)와 같은 내인성 CRISPR 시스템을 포함하는 특정 유기체로부터 유래된 I형, II형 또는 III형 CRISPR 시스템으로부터 유래할 수 있다.

일부 측면에서, Cas 뉴클레아제 및 gRNA(표적 서열에 특이적인 crRNA 및 고정된 tracrRNA의 융합물 포함)가 세포에 도입된다. 일반적으로, gRNA의 5' 말단에 있는 표적 부위는 상보적 염기쌍을 사용하여 Cas 뉴클레아제를 표적 부위, 예를 들어, 유전자로 표적화한다. 표적 부위는 통상적으로 NGG 또는 NAG와 같은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열의 바로 5' 위치를 바탕으로 선택될 수 있다. 이와 관련하여, gRNA는 표적 DNA 서열에 상응하도록 가이드 RNA의 처음 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 14, 12, 11 또는 10개 뉴클레오티드를 변형시켜 원하는 서열로 표적화된다. 일반적으로 CRISPR 시스템은 표적 서열의 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하는 요소를 특징으로 한다. 통상적으로, "표적 서열"은 일반적으로 가이드 서열이 상보성을 갖도록 설계된 서열을 지칭하며, 여기서 표적 서열과 가이드 서열 간의 혼성화는 CRISPR 복합체의 형성을 촉진한다. 혼성화를 일으키고 CRISPR 복합체의 형성을 촉진하기에 충분한 상보성이 있다면 완전한 상보성이 반드시 필요한 것은 아니다.

CRISPR 시스템은 표적 부위에서 이중 가닥 절단(DSB)을 유도한 후 본원에 논의된 바와 같은 붕괴를 유도할 수 있다. 다른 구현예에서, "닉카아제"로 간주되는 Cas9 변이체는 표적 부위에서 단일 가닥을 닉킹하는 데 사용된다. 쌍을 이룬 닉카아제는, 예를 들어, 닉을 동시에 도입할 때 5' 오버행이 도입되도록 한 쌍의 상이한 gRNA 표적화 서열에 의해 각각 지시되는 특이성을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 촉매적으로 불활성인 Cas9는 유전자 발현에 영향을 미치기 위해 전사 억제인자 또는 활성인자와 같은 이종 효과기 도메인에 융합된다.

표적 서열은 임의의 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 DNA 또는 RNA 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 표적 서열은 세포의 핵 또는 세포질, 예를 들어 세포의 소기관 내에 위치할 수 있다. 일반적으로, 표적 서열을 포함하는 표적화된 유전자좌로의 재조합에 사용될 수 있는 서열 또는 주형은 "편집 주형" 또는 "편집 폴리뉴클레오티드" 또는 "편집 서열"로 지칭된다. 일부 측면에서, 외인성 주형 폴리뉴클레오티드는 편집 주형으로 지칭될 수 있다. 일부 측면에서, 재조합은 상동성 재조합이다.

통상적으로, 내인성 CRISPR 시스템의 맥락에서, CRISPR 복합체(표적 서열에 혼성화되고 하나 이상의 Cas 단백질과 복합체화된 가이드 서열을 포함함)의 형성은 표적 서열 내 또는 그 근처에서(예를 들어 표적 서열로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50개 이상의 염기쌍 이내) 하나 또는 두 가닥의 절단을 초래한다. 야생형 tracr 서열의 전부 또는 일부(예를 들어, 야생형 tracr 서열의 약 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85개 또는 그 이상의 뉴클레오티드)를 포함하거나 이로 구성될 수 있는 tracr 서열은 또한, 예를 들어 tracr 서열의 적어도 일부를 따라 가이드 서열에 작동 가능하게 연결된 tracr 메이트 서열의 전체 또는 일부에 혼성화함으로써 CRISPR 복합체의 일부를 형성할 수 있다. tracr 서열은 최적으로 정렬될 때 tracr 메이트의 길이를 따라 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%의 서열 상보성과 같이, 혼성화되어 CRISPR 복합체의 형성에 참여하기에 충분한 tracr 메이트 서열에 대한 상보성을 갖는다.

CRISPR 시스템의 하나 이상의 요소의 발현을 유도하는 하나 이상의 벡터는 CRISPR 시스템의 요소의 발현이 하나 이상의 표적 부위에서 CRISPR 복합체의 형성을 지시하도록 세포 내로 도입될 수 있다. 성분은 또한 단백질 및/또는 RNA로서 세포에 전달될 수 있다. 예를 들어, Cas 효소, tracr-메이트 서열에 연결된 가이드 서열 및 tracr 서열은 각각 별도의 벡터 상의 개별 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 대안적으로, 동일하거나 상이한 조절 요소로부터 발현된 2개 이상의 요소는 단일 벡터에서 조합될 수 있으며, 하나 이상의 추가 벡터에서는 제1 벡터에 포함되지 않은 CRISPR 시스템의 임의의 성분이 제공된다. 벡터는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열("클로닝 부위"로도 지칭됨)과 같은 하나 이상의 삽입 부위를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 삽입 부위는 하나 이상의 벡터의 하나 이상의 서열 요소의 업스트림 및/또는 다운스트림에 위치한다. 다수의 상이한 가이드 서열이 사용되는 경우, 단일 발현 작제물을 사용하여 CRISPR 활성을 세포 내의 다수의 상이한 상응하는 표적 서열에 표적화할 수 있다.

벡터는 Cas 단백질과 같은 CRISPR 효소를 인코딩하는 효소-코딩 서열에 작동 가능하게 연결된 조절 요소를 포함할 수 있다. Cas 단백질의 비제한적인 예로는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (Csn1 및 Csx12로도 공지됨), Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csfl, Csf2, Csf3, Csf4, 이의 동족체 또는 이의 변형된 버전이 포함된다. 이러한 효소는 공지되어 있으며: 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9 단백질의 아미노산 서열은 수탁 번호 Q99ZW2로 스위스프로트(SwissProt) 데이터베이스에서 확인할 수 있다.

CRISPR 효소는 Cas9(예를 들어, 에스. 피오게네스 또는 에스. 뉴모니아(S. pneumonia) 유래 Cas9)일 수 있다. CRISPR 효소는 표적 서열의 위치에서, 예를 들어 표적 서열 내 및/또는 표적 서열의 보체 내에서 하나 또는 두 가닥의 절단을 지시할 수 있다. 벡터는 돌연변이된 CRISPR 효소가 표적 서열을 함유하는 표적 폴리뉴클레오티드의 하나 또는 두 가닥을 절단하는 능력이 결여되도록 상응하는 야생형 효소에 대해 돌연변이된 CRISPR 효소를 인코딩할 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 유래 Cas9의 RuvC I 촉매 도메인에서의 아스파테이트-대-알라닌 치환(D10A)은 Cas9를, 두 가닥을 절단하는 뉴클레아제에서 닉카아제(단일 가닥을 절단함)로 전환한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카아제는 DNA 표적의 센스 및 안티센스 가닥을 각각 표적화하는 가이드 서열(들), 예를 들어, 2개의 가이드 서열과 함께 사용될 수 있다. 이 조합은 두 가닥 모두가 닉킹되고, NHEJ 또는 HDR을 유도하는 데 사용될 수 있도록 한다.

일부 구현예에서, CRISPR 효소를 인코딩하는 효소 코딩 서열은 진핵 세포와 같은 특정 세포에서의 발현을 위해 최적화된 코돈이다. 진핵 세포는 인간, 마우스, 랫트, 토끼, 개 또는 비인간 영장류를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 포유동물과 같은 특정 유기체의 세포이거나 이로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 코돈 최적화는 천연 서열의 적어도 하나의 코돈을, 천연 아미노산 서열을 유지하면서 관심 숙주 세포의 유전자에서 보다 빈번하게 또는 가장 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하여 관심 숙주 세포에서 향상된 발현을 위해 핵산 서열을 변형시키는 과정을 지칭한다. 다양한 종은 특정 아미노산의 특정 코돈에 대해 특정 편향을 나타낸다. 코돈 편향(유기체 간 코돈 사용의 차이)은 종종 메신저 RNA(mRNA)의 번역 효율과 관련이 있으며, 이는 결국, 무엇보다도, 번역되는 코돈의 특성 및 특정 전달 RNA(tRNA) 분자의 이용 가능성에 따라 달라지는 것으로 여겨진다. 세포에서 선택된 tRNA의 우세는 일반적으로 펩티드 합성에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈을 반영한 것이다. 따라서, 유전자는 코돈 최적화를 기반으로 주어진 유기체에서 최적의 유전자 발현을 위해 조정될 수 있다.

일반적으로, 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화되어 표적 서열에 대한 CRISPR 복합체의 서열-특이적 결합을 지시하도록 표적 폴리뉴클레오티드 서열과 충분한 상보성을 갖는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 구현예에서, 적절한 정렬 알고리즘을 사용하여 최적으로 정렬될 때 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성의 정도는 약 50%, 60%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97.5%, 99% 또는 그 이상이다.

최적의 정렬은 비제한적인 예로 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘, 니들만-분치(Needleman-Wunsch) 알고리즘, 버로우즈-휠러 변환(Burrows-Wheeler Transform)에 기반한 알고리즘(예를 들어 버로우즈 휠러 얼라이너(Burrows Wheeler Aligner)), 클러스탈(Clustal) W, 클러스탈 X, BLAT, 노보얼라인(Novoalign)(노보크래프트 테크놀로지스, 이랜드(Novocraft Technologies, ELAND)(캘리포니아주 샌디에이고, 일루미나(Illumina)), SOAP(soap.genomics.org.cn에서 이용 가능), 및 Maq(maq.sourceforge.net에서 이용 가능)를 포함하는, 서열 정렬을 위한 임의의 적합한 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다.

CRISPR 효소는 하나 이상의 이종 단백질 도메인을 포함하는 융합 단백질의 일부일 수 있다. CRISPR 효소 융합 단백질은 임의의 추가 단백질 서열, 및 임의로 임의의 두 도메인 사이의 링커 서열을 포함할 수 있다. CRISPR 효소에 융합될 수 있는 단백질 도메인의 예는, 제한 없이, 에피토프 태그, 리포터 유전자 서열, 및 다음 활성 중 하나 이상을 갖는 단백질 도메인을 포함한다: 메틸라제 활성, 데메틸라제 활성, 전사 활성화 활성, 전사 억제 활성, 전사 방출 인자 활성, 히스톤 변형 활성, RNA 절단 활성 및 핵산 결합 활성. 에피토프 태그의 비제한적인 예는 히스티딘(His) 태그, V5 태그, FLAG 태그, 인플루엔자 혈구응집소(HA) 태그, Myc 태그, VSV-G 태그 및 티오레독신(Trx) 태그를 포함한다. 리포터 유전자의 예로는 글루타티온-5-트랜스퍼라제(GST), 호스래디시 퍼옥시다제(HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 베타 갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 녹색 형광 단백질(GFP), HcRed, DsRed, 청록색 형광 단백질(CFP), 황색 형광 단백질(YFP), 및 청색 형광 단백질(BFP)을 포함한 자가형광 단백질이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다. CRISPR 효소는 말토스 결합 단백질(MBP), S-태그, Lex A DNA 결합 도메인(DBD) 융합물, GAL4A DNA 결합 도메인 융합물 및 단순 포진 바이러스(HSV) BP16 단백질 융합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는 DNA 분자와 결합하거나 다른 세포 분자와 결합하는 단백질 또는 단백질 단편을 인코딩하는 유전자 서열에 융합될 수 있다. CRISPR 효소를 포함하는 융합 단백질의 일부를 형성할 수 있는 추가 도메인은 본원에 참조로 포함된 US 20110059502에 기재되어 있다.

VI. 키트 및 진단법

본 발명의 다양한 측면에서, 체액 또는 조직 배양 배지에서 엑소좀을 정제하는 데 필요한 성분을 함유하는 키트가 구상된다. 다른 측면에서, 엑소좀을 단리하고, 이를 치료 핵산, 치료 단백질 또는 그 안에 치료 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염하는 데 필요한 성분을 함유하는 키트가 구상된다. 키트는 이러한 성분 중 어느 것을 함유하는 하나 이상의 밀봉된 바이알을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 키트는 또한 에펜도르프 튜브, 검정 플레이트, 주사기, 병 또는 튜브와 같은 키트의 구성 요소와 반응하지 않을 용기인 적절한 용기 수단을 포함할 수 있다. 용기는 플라스틱 또는 유리와 같은 멸균 가능한 재료로 만들어질 수 있다. 키트는 본원에 기재된 방법의 절차 단계를 개괄적으로 설명하는 지침 시트를 추가로 포함할 수 있으며, 본원에 기재되거나 숙련가에게 알려진 것과 실질적으로 동일한 절차를 따를 것이다. 지침 정보는, 컴퓨터를 사용하여 실행될 때, 샘플에서 엑소좀을 정제하고, 그 안에 치료 핵산을 형질감염시키고, 그 안에 재조합 단백질을 발현시키거나 그 안에 재조합 단백질을 전기천공하는 실제 또는 가상 절차를 표시하는 기계-판독 가능한 명령을 함유하는 컴퓨터 판독 가능한 매체에 있을 수 있다.

VII. 실시예

하기 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예를 입증하기 위해 포함된다. 다음 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에서 잘 기능하기 위해 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 이의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있음을 당업자는 인식해야 한다. 그러나, 당업자는 본 개시내용에 비추어 볼 때, 개시된 특정 구현예에서 많은 변경이 이루어질 수 있고, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 여전히 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.

재료 및 방법

세포 배양. MCF7, MDA-MB231, E10, HDF, 및 BJ 인간 세포주, 및 NIH 3T3 뮤린 세포주는 10% FBS가 포함된 DMEM에서 배양되었다. 4T1 및 67NR 뮤린 세포주는 10% FBS가 포함된 RPMI에서 배양되었다. MCF10A 인간 유방 상피 세포주는 5% 말 혈청, 20ng/ml EGF, 0.5mg/ml 하이드로코르티손, 100ng/ml 콜레라 독소, 및 10㎍/ml 인슐린이 포함된 DMEM/F12 배지에서 배양되었다. 모든 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection; ATCC)에서 유래되었다.

엑소좀의 단리 및 정제.

엑소좀은 이전에 기재된 바와 같이 분별 원심분리에 의해 정제되었다(참조: Luga et al., 2012; Thery et al., 2006). 48시간 동안 배양된 세포의 상청액은 800g 및 2000g의 순차적인 원심분리 단계를 거쳤다. 생성된 상청액을 0.2㎛ 필터를 사용하여 여과하였다. SW40Ti 스윙잉 버킷 로터(swinging bucket rotor)에서 100,000g로 3시간 동안 초원심분리한 후 펠렛을 회수하였다(벡크만-코울터(Beckman-Coulter)). 상청액을 제거하고, 펠렛을 PBS에 재현탁하고, 이어서 100,000g에서 3시간 동안 두 번째 초원심분리하였다. 생성된 펠렛은 엑소좀 함량에 대해 분석되었다. RNA 추출에 사용된 엑소좀은 트리졸(Trizol) 500㎕에 재현탁되고; 단백질 추출에 사용된 엑소좀은 우레아/SDS 용해 완충액(8M 우레아, 2.5% SDS, 5㎍/mL 류펩틴, 1㎍/mL 펩스타틴 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)에 재현탁되고; 세포로의 전달에 사용된 엑소좀은 무혈청 DMEM 배양 배지에 재현탁되었다. 다른 용도를 위해, 단리된 엑소좀은 남은 실험 절차에 기재된 대로 처리되었다.

이미징 유세포 계측 분석( 이미지스트림 ( ImageStream )). 엑소좀을 NaCl 0.9% 염수 용액(비. 브라운 메디칼 인코포레이티드(B. Braun Medical Inc, 미국 펜실베이니아주 베슬리헴 소재) 중에서 4㎛ 알데히드/설페이트 라텍스 비드(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼즈배드 소재)에 부착시켰다. 반응을 100mM 글리신 및 염수 중의 2% BSA로 중지하고 실온에서 30분 동안 회전하면서 10% BSA로 차단하였다. 염수/2% BSA로 세척한 후, 비드-결합된 엑소좀을 10,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 4℃에서 30분 회전하는 동안 1:200 항-CD63(산타 크루즈(Santa Cruz)), 항-CD9(에이비캠(Abcam)), 항-CD81(에이비캠), 항-CD82(에이비캠), 및 항-FLOT1(산타 크루즈)과 함께 항온배양하였다. 비드를 10,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고, 염수/2% BSA로 세척하고, 4℃에서 30분 회전하는 동안 1:400 알렉사(Alexa)-488 2차 항체(라이프 테크놀로지스(Life Technologies), 뉴욕주 14072)와 함께 항온배양하였다. 3회 세척 후 비드를 염수 용액에 재현탁하고 이미지스트림®(머크 밀리포어(Merck Millipore))에서 분석하였다. 이미지 획득 이득(image acquisition gain)(%)은 픽셀 포화를 피하기 위해 양의 샘플을 사용하여 설정되었다. 이미지 처리는 아이디어스(IDEAS)®(머크 밀리포어) 소프트웨어를 사용하여 수행되었다. 초점에서 벗어난 비드를 제외하고 단일 비드를 선택하도록 게이트(gate)를 정의하였다. 알렉사-488 양성 비드 게이트는 음성 대조군 샘플에서 정의되었다. 양성 비드의 백분율은 샘플당 분석된 사건의 수에 비례한다.

면역골드 표지 및 전자현미경. 펠렛화된 엑소좀을 0.1M 인산염 완충액 중의 2.5% 글루타르알데히드에 재현탁하여 고정시켰다. 최적의 농도로 고정된 시험편을 300 메시 탄소/포름바(formvar) 코팅된 그리드 위에 놓고 최소 1분 동안 포름바에 흡수되도록 하였다. 면역골드 염색을 위해 그리드를 1시간 동안 차단/투과화 단계를 위한 차단 버퍼에 넣었다. 세정하지 않고, 그리드를 4℃에서 밤새 적절한 희석으로 1차 항체에 즉시 넣었다(폴리클로날 항-GFP 1:10, 에이비캠). 대조군으로서, 일부 그리드는 1차 항체에 노출되지 않았다. 다음날 모든 그리드를 PBS로 세정하고 실온에서 2시간 동안 10nm 금 입자(오리온(AURION), 펜실베이니아주 하트필드 소재)가 부착된 적절한 2차 항체 점적 위에 부유되었다. 그리드를 PBS로 세정하고 0.1M 인산염 완충액 중의 2.5% 글루타르알데히드에 15분 동안 두었다. PBS와 증류수로 세정한 후, 격자를 건조시키고 대조를 위해 우라닐 아세테이트를 사용하여 염색하였다. 샘플을 테크나이 바이오 트윈(Tecnai Bio Twin) 투과전자현미경(FEI, 오리건주 힐스버러 소재)으로 관찰하고 이미지를 AMT CCD 카메라(어드밴스드 마이크로스코피 테크닉스(Advanced Microscopy Techniques), 메사추세츠주 댄버스 소재)로 촬영하였다.

엑소좀의 EGF 자극. 상기 기재된 바와 같이 MBA-MB-231 세포로부터 엑소좀을 수집하였다. 1-3×10⁹ 엑소좀을 1mL PBS에 재현탁하고, 상이한 농도의 rEGF를 첨가하였다. EGF가 있거나 없는 엑소좀 현탁액을 37℃에서 5% CO₂로 15분 동안 항온배양한 다음 얼음 위에 두었다. 3개의 복제물을 풀링하고, PBS를 11mL의 총 용적까지 첨가하고, 앞서와 같이 SW40Ti 스윙잉 버킷 로터에서 100,000g로 3시간 동안 초원심분리하여 자극된 엑소좀을 수거하였다. 단백질 추출물은 면역블롯 분석을 위한 우레아/SDS 용해 완충액(100mM NaF 및 1mM NaOV₄가 포함됨) 또는 면역침전 검정을 위한 트리톤(Triton) X-100 완충액(150mM NaCl, 1%(v/v) 트리톤 X-100, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4, pH 7.4, 50mM 6-아미노헥산산, 10mM EDTA, 5mM N-에틸말레이미드, 5mM 벤즈아미딘, 5㎍/mL 류펩틴, 1㎍/mL 펩스타틴, 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 100mM NaF, 및 1mM NaOV₄)에서 펠렛화된 자극 엑소좀으로부터 수거되었다.

단백질 웨스턴 블롯 및 항체. 엑소좀 단백질 추출물을 비신코닌산(Bicinchoninic Acid; BCA) 단백질 검정 키트(피어스(Pierce), 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))에 따라 아크릴아미드 겔 위에 로딩하고 습식 전기영동 이동에 의해 PVDF 막(이모빌론피(ImmobilonP))으로 옮겼다. 블롯을 TBS/0.05% 트윈 20 중의 5% 무지분유로 1시간 동안 차단하고, 4℃에서 다음의 1차 항체와 함께 항온배양하였다: 1:300 항-CD9 ab92726(에이비캠); 1:300 항-TSG101 ab83(에이비캠); 1:1000 항-EGFR 4267S(CST); 1:300 항-CD63 sc-365604(산타 크루즈); 1:200 항-CD81 cs-166029(산타 크루즈); 1:1000 항-pEGFR Tyr1068 3777S(CST); 1:2000 항-GRB2 610111(비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences)); 1:1000 항-Shc 06-203(밀리포어); 1:5000 항-GFP ab13970(에이비캠); 1:1000 GAPDH ab9483(에이비캠); 1:10,000 HRP접합된 β-액틴 a3854(시그마(Sigma)); 1:400 항-RNA PolII cat#39097(액티브 모티프(Active Motif)); 1:500 항-Hsp90 ab1429(에이비캠); 1:500 항-eIF3A ab86146(에이비캠); 1:500 항-eIF4A1 ab31217(에이비캠). HRP-접합된 2차 항체(시그마, 1:2000)를 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 항체 항온배양 후 세척은 1× TBS 0.05% 트윈20을 사용하여 오비탈 진탕기에서 10분 간격으로 4번 수행되었다. 블랏은 피어스의 화학발광 시약으로 현상되었다.

면역침전. 엑소좀 및 세포 단백질 추출물을 4℃에서 2시간 동안 가볍게 흔들었다. 용해물을 사전 냉각된 원심분리기에서 14,000g로 15분 동안 원심분리하고 펠렛을 버렸다. 단백질 A 또는 G 아가로스/세파로스 비드를 PBS로 2번 세척하고 PBS를 사용하여 50% 슬러리로 복원하였다. 비드/슬러리 혼합물(100㎕)을 엑소좀 단백질 추출물 100㎍ 또는 세포 단백질 추출물 20㎍에 첨가하고, 4℃에서 10분 동안 항온배양하였다. 4℃에서 14,000g로 10분 동안 원심분리하여 비드를 제거하고 펠렛을 버렸다. 항-eIF4A1 항체 10㎍을 엑소좀 용해물 100㎕에 첨가하고, 오비탈 진탕기에서 4℃에서 밤새 항온배양하였다. 단백질 A 또는 G 아가로스/세파로스 비드 슬러리 100㎕를 첨가하고 4℃에서 밤새 두었다. 원심분리 후 상청액을 버리고 비드를 얼음-냉각된 우레아/SDS 완충액으로 3번 세척하였다. 아가로스/세파로스 비드를 5분 동안 비등하여 비드로부터 면역복합체를 해리하였다. 비드를 원심분리로 수거하고 상청액에 대해 면역블롯을 수행하였다.

UPLC -MS를 사용한 아미노산의 식별. 엑소좀을 내부 표준 트립토판-d5가 스파이킹된 메탄올 200㎕와 혼합하고, -20℃에서 1시간 동안 항온배양하였다. 4℃에서 16,000g로 15분 동안 원심분리한 후, 상청액 190㎕를 수거하고 용매를 제거하였다. 건조된 추출물을 메탄올 15㎕로 재구성하고, 이중 10㎕를 마이크로튜브로 옮기고 유도체화하였다. 이용된 크로마토그래피 분리 및 질량 분석법 검출 조건은 표 1에 요약되어 있다. 50 내지 1000m/z의 질량 범위는 포름산나트륨의 클러스터 이온으로 보정되었다. 실행 과정 동안 LC/MS 시스템의 체류 시간 안정성 및 감도를 조사하기 위해 전체 세트의 무작위 중복 샘플 주입 전후에 표준 화합물의 적절한 시험 혼합물을 분석하였다.

매스린엑스(MassLynx) 4.1 소프트웨어용 타겟린엑스(TargetLynx) 애플리케이션 매니저(워터스 코포레이션(Waters Corp.), 미국 밀퍼드 소재)를 사용하여 데이터를 처리하였다. 분석에 포함된 대사물에 상응하는 사전 정의된 체류 시간, 질량-대-전하 비율 쌍의 세트, Rt-m/z가 프로그램에 입력된다. 그 다음 관련 추출된 이온 크로마토그램(질량 허용오차 윈도우(mass tolerance window) = 0.05Da)은 LC 및 MS 도메인 모두에서 피크가 감지되고 노이즈가 감소되어 실제 대사물 관련 기능만을 소프트웨어에서 처리한다. 그 다음 Rt-m/z 데이터 쌍(체류 시간 허용오차 = 6초)을 식별자로 사용하여 각 샘플 주입에 대한 크로마토그래피 피크 면적의 목록이 생성된다. 정규화 인자는 각 샘플의 강도를 동일한 샘플의 내부 표준의 기록된 강도로 나누어 각 대사물에 대해 계산되었다.

디지털 qPCR. 디지털 RNA 반응은 제조 권장사항에 따라 3ng의 cDNA, 탭맨(TaqMan)® 범용 마스터 믹스 및 퀀트스튜디오(QuantStudio)™ 3D 디지털 PCR 마스터 믹스 v1(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))을 사용하여 수행되었다. 퀀트스튜디오™ 3D 디지털 PCR 칩 로더(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 총 14.5㎕의 혼합물을 퀀트스튜디오™ 3D 디지털 PCR 20K 칩 키트 v1(어플라이드 바이오시스템즈)에 로딩하였다. PCR 반응은 제조 프로토콜에 따라 진앰프(GeneAmp)® 9700(어플라이드 바이오시스템즈)에서 수행되었다. 퀀트스튜디오™ 3D 디지털 PCR 기기(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 칩을 영상화하였다.

엑소좀의 [ ³⁵ S]메티오닌 표지. 엑소좀을 이전에 설명한 대로 분리하고, 0.1 내지 1.0mCi/ml 트랜스 라벨[³⁵S]-L-메티오닌(아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Biosciences))과 함께 FBS 없이 메티오닌-비함유 배양 배지에 재현탁하고, 밤새 항온배양하였다. 대안적으로 엑소좀을 사이클로헥시미드(시그마, 100㎍/mL)의 존재하에 항온배양하였다. 엑소좀을 펠렛화하고, 얼음-냉각된 PBS에서 세척하고, 이전에 설명된 대로 우레아/SDS 용해 완충액에 재현탁하였다. 단백질 추출물을 BCA 단백질 검정 키트를 사용하여 정량화하고, 아크릴아미드 겔에서 실행시키고, 습식 전기영동 이동에 의해 PVDF 막(이모빌론피)으로 옮긴 후 막을 제조자의 지침에 따라 EN3HANCE® 자가 방사선 촬영 증강자를 사용하여 자가 방사선 촬영으로 분석하였다(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer)).

실시간 PCR 분석. DNase 처리된 RNA는 트리졸(인비트로겐)을 사용한 총 엑소좀 RNA 정제 후 멀티스크라이브 역전사효소(MultiScribe Reverse Transcriptase)(어플라이드 바이오시스템즈) 및 올리고-d(T) 프라이머로 역전사되었다. SYBR 그린 마스터 믹스(Green Master Mix)(어플라이드 바이오시스템즈) 및 β-액틴을 대조군으로 사용하여 에이비아이 프리즘(ABI PRISM) 7300HT 서열 검출 시스템 기기에서 실시간 PCR을 수행하였다. 28S rRNA 프라이머 쌍(QF00318857) 및 18S rRNA 프라이머 쌍(QF00530467)은 퀴아젠의 기존 특정 프라이머 쌍으로 구입하였다. 다른 프라이머는 아래에 열거되어 있다. 각 측정은 세 번 수행되었다. 증폭된 표적의 양이 고정된 역치에 도달하는 부분 사이클 수인 역치 사이클(참조: Rothstein et al.)을 결정하고, 이전에 보고한 대로 2-ΔCt 공식을 사용하여 발현을 측정하였다(참조: Livak and Schmittgen, 2001).

시험관내 전사 및 번역을 위한 용해물 준비. 엑소좀 및 세포 펠렛을 얼음-냉각된 PBS로 1회 세척하고 동일한 양의 얼음-냉각된 20mM HEPES(pH 7.5), 100mM 아세트산칼륨, 1mM 아세트산마그네슘, 2mM 디티오트레이톨 및 100㎍/mL 리소레시틴에 재현탁하였다. 얼음 위에서 1분 후, 이를 다시 펠렛화하고, 동일한 양의 얼음-냉각된 저장성(hypotonic) 추출 완충액에 재현탁하였다. 얼음 위에서 5분 후, 1mL 주사기에 부착된 26-게이지 바늘을 통해 10회 통과시켜 용해물을 파괴하였다. 생성된 균질물을 4℃에서 1000g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수거하고, 분취액을 액체 질소에서 동결시키고, 시험관내 번역 검정에 사용하기 위해 -80℃에서 보관하였다.

시험관내 결합된 전사 및 번역. 이전에 기재된 세포 및 엑소좀에서 얻은 용해물을 12㎕의 반응 용적으로 시험관내 번역에 사용하였다. 표준 반응 조건은 다음과 같았다: 세포 용해물(최종 단백질 농도 10㎍) 또는 엑소좀 용해물(최종 농도 100㎍), 1㎍ pEMT7-GFP cDNA 발현 플라스미드, 20mM HEPES-KOH(pH 7.6), 80mM 아세트산칼륨, 1mM 아세트산마그네슘, 1mM ATP, 0.12mM GTP, 17mM 크레아틴 포스페이트, 0.1mg/mL 크레아틴 포스포키나제, 2mM 디티오트레이톨, 20가지 아미노산 각각 40μM, 0.15mM 스퍼미딘, 및 400U/mL RNAsin(프로메가). 항온배양은 37℃에서 3시간 동안 수행되었다.

전기천공 및 엑소좀 배양. 엑소좀을 펠렛화하고, 20㎍의 플라스미드(pCMV-GFP, pEGFP-p53 애드진(Addgene) 플라스미드 12091, pcDNA3-RLUC-POLIRES-FLUC 및 pcDNA-FLUC)와 함께 400㎕의 전기천공 완충액(1.15mM 인산칼륨 pH 7.2, 25mM 염화칼륨, 21% 옵티프렙)에 현탁하였다. 엑소좀은 이전에 기재된 바와 같이 진 펄서 엑스셀 전기천공 시스템(Gene Pulser Xcell Electroporation System)(바이오래드(BioRad))을 사용하여 4mm 큐벳을 사용하여 전기천공되었다(참조: Alvarez-Erviti et al., 2011). 적절한 경우, 엑소좀은 각각 번역 및 전사의 억제를 위해 사이클로헥시미드(시그마, 100㎍/mL) 또는 α-아마니틴(시그마, 30㎍/mL)의 존재하에 전기천공되었다. 전기천공된 엑소좀을 37℃에서 지시된 시점 동안 무혈청 DMEM에서 배양하였다.

전기천공된 엑소좀의 유세포 분석. 엑소좀 제제(5 내지 10㎍)를 5㎕의 4㎛ 직경 알데히드/설페이트 라텍스 비드(인터페이셜 다이나믹스(Interfacial Dynamics), 오리건주 포틀랜드 소재)와 함께 항온배양하고, 600㎕에 재현탁하였다. 엑소좀-코팅된 비드를 팩스 칼리버(FACS Calibur) 유세포 분석기(비디 바이오사이언시즈)에서 분석하고 녹색 형광에 대해 분석하였다.

엑소좀 전달 및 공초점 현미경. MCF10A 세포를 삽입된 커버슬립 상의 12웰 플레이트에 적절한 컨플루언시(confluency)로 플레이팅하고 밤새 배양하였다. 다음날 세포를 무혈청 배양 DMEM에서 2시간 동안 재현탁된 MDA-MB-231 엑소좀과 함께 항온배양하고, 차가운 PBS 1X로 세척하고, 4% PFA/PBS로 실온에서 20분 동안 고정시켰다. 슬라이드를 PBS 0.5% 트리톤 X-100으로 RT에서 10분 동안 투과화시키고 DAPI로 대조염색하였다. 동일한 설정을 유지하기 위해 리사이클 툴(recycle tool)을 사용하는 자이스 LSM510 업라이트 공초점 시스템(Zeiss LSM510 Upright Confocal System)을 사용하여 이미지를 얻었다. 데이터 분석을 위해, 적어도 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 풀(pool)에서 이미지를 선택하였다. 도면은 대표 필드를 보여준다.

역 트랜스웰 검정. 이전에 기재된 바와 같이 MDA-MB-231 세포로부터 엑소좀을 단리하고 PBS에 재현탁하고 Nanosight NTA를 사용하여 정량화하였다. 150㎕ PBS 중의 10×10⁹ 엑소좀을 96웰 코닝™ HTS트랜스웰® 시스템의 각각의 바닥 웰에 첨가하였다. 음성 대조군으로서 PBS만을 바닥 웰에 첨가하였다. 40nm 기공이 있는 폴리카보네이트 막을 함유하는 삽입물을 각 웰에 첨가하고, 100㎕의 PBS 단독, 20% FBS가 포함된 PBS, 또는 10,000ng/ml의 EGF가 포함된 PBS를 삽입물에 첨가하였다. 트랜스웰 플레이트를 5% CO₂로 37℃에서 항온배양하고, Nanosight NTA를 사용한 엑소좀 정량화를 위해 4시간 및 24시간 항온배양 후 상부 삽입물로부터 샘플을 수거하였다.

통계. 오차 막대(error bar)는 생물학적 반복 간의 ±s.d를 나타낸다. 각 실험의 기술적 및 생물학적 삼중 반복을 수행하였다. 통계적 유의성은 스튜던츠 t-검정(Student's t-test), ANOVA 또는 만-휘트니 검정에 의해 적절하게 계산되었고 도면의 설명에 명시되어 있다.

실시예 1 - EGFR 인산화는 MDA -MB-231, 삼중 음성 인간 유방암 세포로부터 유래된 엑소좀에서 검출된다

확립된 초원심분리 기술을 사용하여 상이한 뮤린 및 인간 세포주로부터 엑소좀을 단리하였다(참조: Melo et al., 2015; Melo et al., 2014). 단리된 엑소좀은 불균질 혼합물을 나타내며, 동일한 크기 분포가 제제들 간에 일관되게 관찰된다. Nanosight 나노입자 추적 분석(NTA) 및 원자력 현미경 관찰(AFM)에 의해 직경이 평균 104±1.5nm이고, 대략 30 내지 200nm 범위인 크기 분포를 갖는 입자가 밝혀졌다. 이는 지질 이중층으로 둘러싸인 세포외 소포를 보여주는 투과전자현미경(TEM)에 의해 확인되었다(도 8a 내지 도 8c). 단리된 엑소좀은 면역골드/TEM 이미징, 면역블롯 분석 및 이미징 유세포 분석에 의해 공지된 엑소좀 마커를 보유하는 것으로 추가로 나타났다(참조: Raposo and Stoorvogel, 2013)(도 8d 내지 도 8f). 순도를 추가로 확인하기 위해, 엑소좀 샘플을 응고된 LB 플레이트에 접종하여 구강 면봉에서 얻은 박테리아 대조군과 비교할 때 콜로니 형성이 없음을 보여주었다. 이는 단리된 엑소좀에서 박테리아 오염이 없음을 입증한다(도 8g).

상이한 세포주에서 얻은 엑소좀을 면역블롯팅에 의해 이의 EGFR 함량에 대해 탐색하였다. 모든 세포주의 엑소좀은 낮은 수준의 EGFR 발현을 나타내는 반면, BJ 섬유아세포 세포주 및 MDA-MB-231 삼중 음성 유방암 세포주에서 유도된 엑소좀은 수용체의 강한 발현을 나타냈다. 로딩 대조군으로서 공지된 엑소좀 마커 CD81이 제시되어 있다(도 1a). 삼중 음성 유방암의 진행에 대한 EGFR의 중요성을 감안할 때(참조: Lim et al., 2016; Liu et al., 2012; Nakai et al., 2016), MDA-MB-231 유래 엑소좀에서 이의 기능적 역할이 추가로 조사되었다. 엑소좀은 MDA-MB-231 및 MCF10A 세포에서 유래되었고, 10억 개의 엑소좀을 무혈청 배양 배지에서 37℃에서 15분 동안 500ng/ml의 재조합 인간 EGF(rhEGF)와 함께 항온배양하였다. EGFR의 Tyr1068 잔기에 특이적인 항체를 사용하여 이들 엑소좀에서 수득된 단백질 추출물의 면역블롯팅 결과, MDA-MB-231에서 유래된 엑소좀에서 이 수용체의 인산화 수준이 증가한 것으로 나타났지만, 비-종양형성 MCF10A 유방 상피 세포에서는 아니었다(도 1b). EGFR의 기준선 수준은 어떤 샘플에서도 변하지 않았으며, 관찰된 인산화 증가의 특이성이 확인되었다. 재조합 인간 EGF(rhEGF) 자극은 또한 인산화된 ERK 수준을 증가시키며, 이는 관찰된 EGFR 인산화가 엑소좀 내에서 다운스트림 시그널링 사건을 유발함을 시사한다(도 1c). MDA-MB-231 엑소좀의 단백질 함량을 추가로 탐색한 결과 EGFR의 다운스트림 효과기, 즉 GRB2 및 Shc도 포함되어 있음을 보여주었다(도 1c).

이어서, rhEGF 자극시, 엑소좀 EGFR이 이의 다운스트림 어댑터와 관여(engage)될 수 있는지를 조사하였다. 엑소좀을 37℃에서 15분 동안 rhEGF로 자극하였다. 엑소좀 단백질 추출물은 GRB2 및 Shc에 특이적인 항체를 사용하여 풀다운 검정이 수행되었고, EGF 자극시 EGFR과의 공동-면역침전이 증가하는 것으로 확인되었다(도 1d, 1e). 이소타입 IgG는 풀다운에 대한 음성 대조군으로 사용되었고, EGFR 공동-면역침전을 나타내지 않았다. 또한, 검정을 역전시키고 EGFR을 풀다운함으로서 EGF 자극된 엑소좀에서만 공동면역침전된 GRB2를 검출하는 것도 가능하였다(도 8b). 종합하면 이러한 결과는, MDA-MB-231 세포의 엑소좀이 무세포 조건에서 이의 리간드와 함께 항온배양하여 인산화될 수 있는 EGFR을 포함하며, 이는 엑소좀 내에서 추정 다운스트림 시그널링 사건을 유발한다는 것을 보여준다.

실시예 2 - 엑소좀의 EGF 자극은 이의 단백질 함량을 변경시킨다

수용체 티로신 키나제는 이의 키나제 활성을 위한 기질로서 ATP를 필요로 하고, 전립선-유래 엑소좀은 ATP를 생성하는 능력을 갖는 것으로 나타났다(참조: Ronquist et al., 2013a). 세포가 부재할 때 인산화 활성의 존재를 추가로 확인하기 위해, rhEGF 자극의 존재 또는 부재하에 엑소좀에 대해 ATP 정량 검정을 수행하였다. 발광 기반 키트를 사용하여, ATP는 MDA-MB-231 세포와 MCF10A 세포 모두의 엑소좀에서 검출되었지만, 후자에서는 소량이었다. MCF10A 세포가 아닌 MDA-MB-231 세포로부터의 엑소좀은 EGF로 자극했을 때 ATP 양이 약간 감소하였다(도 2a). 엑소좀에 대한 EGF 자극의 영향을 추가로 조사하기 위해, 이를 48시간 동안 무세포 조건에서 항온배양하였다. GRB2 단백질 수준의 수준은 미자극 대응물과 비교하여 48시간 동안 EGF로 자극된 엑소좀에서 지속적으로 더 높았다(도 2b). 이는 성장 인자 자극시 엑소좀의 단백질 함량이 변할 수 있다는 흥미로운 가능성을 제기했다. 이러한 가능성을 추가로 조사하기 위해, rhEGF 미자극 또는 자극된 엑소좀에서 얻은 단백질 추출물에 대해 질량 분석법 분석을 수행하였다. 단백질 추출물을 트립신 분해하고, ESI-TRAP 질량 분석기를 사용하여 평가하여 각 샘플에 대한 MS/MS 펩티드 스펙트럼을 얻었다. 이어서 입수된 스펙트럼은 각 엑소좀 샘플에 대한 단백질 목록을 얻기 위해 펩티드 식별을 위한 스위스프로트 데이터베이스에 대해 평가되었다. 오픈 액세스 펀리치 기능 농축 분석 툴(참조: Pathan et al., 2015)을 사용하여 미자극 및 자극된 엑소좀 모두에서 식별된 히트의 대부분이 엑소좀에서 이전에 식별된 단백질과 일치한다는 것이 관찰되었다(베시클페디아(Vesiclepedia) 데이터베이스)(도 2c). 미자극 엑소좀에 비해 rhEGF로 자극된 엑소좀에서 더 많은 수의 단백질이 식별되었다(491개 대 371개, 도 2d). 이들 단백질의 대부분은 자극된 엑소좀과 미자극 엑소좀 모두에 공통적이었지만, 491개 단백질 중 224개는 rhEGF 자극시에만 검출되었다. 두 샘플 모두에서 EGFR이 식별되었지만 GRB2는 rhEGF 자극된 엑소좀에서만 식별되었다(도 2e). 그러나 이는 GRB2가 미자극 엑소좀에 존재하지 않는다는 것을 의미하지는 않지만, 이러한 유형의 분석에 대해 검출 가능한 역치 미만의 수준에 존재할 수 있다는 것을 강조할 것이다. 관찰 가능한 펩티드 일치를 기반으로 단백질 함량의 상대적 변화를 표지 없이 정량화할 수 있는 지수적으로 조정된 단백질 풍부 지수(Exponentially Modified Protein Abundance Index; emPAI)가 사용되었다(참조: Ishihama et al., 2005). 미자극 대응물에 비해 rhEGF 자극된 엑소좀의 더 강한 증가를 보여준 상위 15개 단백질에는 액틴 리모델링 및 막 역학에 참여하는 여러 인자, 예를 들어 a-액티닌, MARCKS, 에즈린(ezrin), 모에신(moesin) 및 인테그린 알파-2가 포함되었다(표 4 및 5). 그 다음 PANTHER 과대 표현 검정(PANTHER overrepresentation test)을 사용하여 유전자 온톨로지(gene ontology; GO) 분석을 수행하였다. 흥미롭게도, rhEGF 자극된 엑소좀이 풍부한 최고 GO 생물학적 과정 중 몇몇은 액틴 리모델링 및 이동과 관련이 있었다(20개 상위 경로 중 5개, 표 6).

종합하면, 이러한 질량 분석 데이터는 MDA-MB-231 엑소좀이 rhEGF 자극시 단백질 함량을 변경시킬 수 있음을 시사한다. 이 데이터는 또한 rhEGF로 자극된 동일한 엑소좀이 rhEGF 자극에 대한 반응으로 운동성 표현형을 나타내는 액토미오신 리모델링 및 이동을 겪을 수 있음을 시사한다. 단백질 정량화를 위한 비신코닌산(BCA) 검정에서는 미자극 대조군과 비교할 때 rhEGF로 자극된 엑소좀의 단백질 함량 증가가 확인되었다(도 2f). β-액틴에 대한 면역블롯팅은 또한 대조군 미자극 엑소좀과 비교할 때 상이한 양의 rhEGF로 자극된 엑소좀에서 중합된 액틴 수준의 증가를 보여준다(도 2g). 종합적으로, 이러한 관찰은 엑소좀에서 예상치 못한 정도의 생물학적 활성을 나타낸다. 따라서, 엑소좀이 허용 조건하에 새로운 단백질을 합성할 수 있는 가능성을 추가로 조사하고 성장 인자 자극시 엑소좀 운동성의 잠재적 유도를 탐구하였다.

실시예 3 - 상이한 세포 유형에서 유래된 엑소좀은 전사 및 번역에 필요한 기능적 구성 요소를 함유한다

상이한 세포 기원의 엑소좀으로부터의 프로테오믹스 데이터의 분석은 진핵 개시 인자, ADP 리보실화 인자 및 리보솜 단백질과 같은 단백질 합성 기구의 여러 구성 요소의 존재를 밝혀냈다(참조: Choi et al., 2012; Melo et al., 2015; Pisitkun et al., 2004; Valadi et al., 2007)(도 10, 11a, 11b). mRNA와 이의 상응하는 단백질이 엑소좀에서 발견된다는 지식과 함께, 이 정보는 단리된 엑소좀이 mRNA를 단백질로 번역하는 능력을 가질 수 있음을 추가로 시사하였다.

정량적 PCR(qPCR) 분석을 사용하여 모든 분석된 엑소좀에서 18S 및 28S rRNA뿐만 아니라 메티오닌, 글리신, 류신, 세린 및 발린에 대한 tRNA의 존재를 확인하였다(도 12a, 12b). 또한, 엑소좀의 초고성능 액체 크로마토그래피-질량 분석법(UPLC-MS) 분석 결과 모든 유리 아미노산이 존재한다는 것이 밝혀졌다(도 3a). 면역블롯팅 분석에서 eIF4A, eIF3A 및 eIF1A를 포함하여, 엑소좀에서 번역 개시 복합체의 다른 구성원의 존재가 확인되었고(도 3b), 이는 질량 분석법 분석을 통해 관찰된 결과를 입증하였다. 또한, 개시 인자 eIF4A 및 eIF3A는 엑소좀에서 얻은 단백질 추출물에서 공동-면역침전한다(참조: Morino et al., 2000)(도 12c).

엑소좀에 존재하는 단백질 생산을 위한 구성 요소의 적절성(relevance)을 기능적으로 해결하기 위해, MCF10A 및 MDA-MB-231 세포에서 단리된 엑소좀의 총 단백질 추출물을 녹색 형광 단백질에 대한 cDNA 발현 플라스미드(GFP 플라스미드)와 함께 항온배양하고 결합된 시험관내 전사 및 번역 검정을 수행하였다. GFP 인코딩 플라스미드와 함께 항온배양한 후 추출물의 웨스턴 블롯 분석은 GFP 단백질 생산을 보여주었다(도 3c). MDA-MB-231 및 MCF10A 세포 모두의 엑소좀 용해물이 GFP 발현 플라스미드로부터 단백질 합성을 가능하게 한다는 사실은 상이한 세포에서 유래된 엑소좀이 DNA 전사 및 mRNA 번역 둘 다에 필요한 모든 기능 성분을 함유할 가능성이 있음을 입증한다. DNA 전사 가능성과 일치하게, 상이한 세포 공급원에서 단리된 엑소좀으로부터의 단백질 추출물의 추가 면역블롯 분석 결과 인산화 및 비-인산화 형태 모두에서 RNA 폴리머라제 II 서브유닛의 존재가 확인되었다(도 3d).

실시예 4 - 엑소좀은 세포-독립적 단백질 합성이 가능하다

엑소좀이 신규 mRNA 번역에 대한 자율적 능력을 갖는다는 발견을 추가로 검증하기 위해, MDAMB-231 세포 및 뮤린 폐암 E10 세포주에서 얻은 단리된 엑소좀을 ³⁵S-메티오닌과 함께 항온배양하여 엑소좀에 의해 새로 합성된 단백질의 표지를 가능하게 하였다. 추정 생합성 과정과 잠재적 자가분비 자극을 활성화하기 위해 37℃에서 검정을 수행하였다. ³⁵S-메티오닌의 존재하에 72시간 동안 항온배양된 엑소좀으로부터의 단백질 추출물의 자가 방사선 촬영에 의해 방사성 아미노산이 40 내지 300kDa 범위의 몇몇 단백질에 통합된다는 것이 밝혀졌다. 이는 엑소좀이 ³⁵S-메티오닌과 함께 단백질 번역 억제제인 사이클로헥시미드와 함께 항온배양될 때 크게 억제되었다(도 3e). 상이한 암세포에서 유래된 엑소좀을 ³⁵S-메티오닌과 함께 항온배양했을 때 표지된 단백질의 뚜렷한 패턴이 관찰되었다. 추가로, 총 단백질 함량은 무세포 배양 배지에서 항온배양된 갓 분리된 엑소좀으로부터 정량화되었다. 48시간의 항온배양 후, 총 엑소좀 단백질 함량은 유의하게 증가하였다(도 3f).

다음으로, 전사 및 번역이 단지 이의 용해물이 아닌 온전한 엑소좀에서 일어날 수 있는지는 엑소좀 시험관내 번역의 프로토콜을 설정함으로써 확인되었다. pCMV-GFP 발현 플라스미드를 MDA-MB-231 세포에서 유래한 엑소좀으로 직접 전기천공하고(참조: Borges et al., 2013; El-Andaloussi et al., 2012; Kamerkar et al., 2017), 전기천공된 엑소좀을 무혈청 배양 배지에서 37℃에서 48시간 동안 항온배양하였다. DNAse로 분해한 후 단리된 엑소좀 RNA의 qPCR 분석 결과 pCMV-GFP 발현 플라스미드로 전기천공된 엑소좀에서 GFP mRNA의 존재가 밝혀졌다(도 4a). 투과전자현미경에서는 pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공된 엑소좀의 구조가 손상되지 않았음을 보여주며, 항-GFP 항체를 사용한 면역골드 표지에서는 GFP 플라스미드-함유 엑소좀에서만 단백질이 검출될 수 있음을 보여주었다(도 4b). GFP 항체를 사용한 엑소좀 단백질 추출물의 면역블롯 분석 결과 전기천공 후 이미 12시간에 pCMV-GFP 플라스미드 전기천공된 엑소좀에서 GFP의 존재가 관찰되었음을 추가로 확인하였다(도 4c). GFP는 24시간에 관찰된 수준에 비해 어떠한 증가도 없었지만, 1주 후 및 최대 1개월까지 발현 플라스미드로 전기천공된 엑소좀에서 관찰될 수 있었다(도 4c, 4d). MCF10A 세포에서 유래된 엑소좀에서도 동일한 패턴이 관찰되었으며, 이는 종양형성뿐만 아니라 다른 세포에서 유래된 엑소좀이 필요한 모든 구성 요소를 함유하고 새로운 단백질 합성 능력을 가지고 있음을 확인하였다(도 13a).

GFP 플라스미드로 전기천공된 엑소좀의 면역블롯 분석 결과 단백질 번역 억제제인 사이클로헥시미드의 존재하에 항온배양했을 때 GFP 수준이 약 80% 감소한 것으로 나타났다(도 4e). GFP 생산은 또한 RNA 폴리머라제 II의 전사 억제제인, α-아마니틴의 존재하에도 감소하였다(도 4e, 4f). 488nm 레이저를 사용하여 전기천공된 엑소좀의 Nanosight NTA로 또한 pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공된 엑소좀에서 녹색 형광이 감지되었지만 모의-전기천공된 엑소좀 또는 플라스미드 및 사이클로헥시미드 또는 α-아마니틴으로 전기천공된 엑소좀에서는 감지되지 않았다(도 13b). 또한, 다른 전기천공 조건을 사용한 플라스미드-함유 엑소좀의 비드 기반 유세포 계측 분석으로 GFP의 존재가 감지되었다(도 13c). 다음으로, pCMV-GFP 플라스미드로 전기천공하기 전에 생물학적 과정을 개시하기 위해 37℃에서 24시간 동안 엑소좀을 항온배양하였다. 면역블롯팅에 의해 감지된 GFP 생산은 손상되었으며, 이는 37℃에서 사전 항온배양된 엑소좀에서 전사 및 번역에 필요한 성분이 고갈되었음을 시사한다. (도 4g).

이러한 결과가 GFP에만 특이적이 아니라는 것을 확인하기 위해, 포유동물 세포에서도 발현되지 않는 단백질인 난알부민 발현 플라스미드(pCMV-Ova)를 사용하였다. GFP와 같이, 전기천공 및 37℃에서 48시간 동안 항온배양 후 엑소좀의 면역블롯팅 분석 결과 pCMV-Ova 플라스미드로 전기천공된 엑소좀에서만 난알부민이 생성되었음을 보여주었다(도 13d).

진핵생물에서 대부분의 mRNA의 단백질 번역 개시는 eIF4F 복합체에 의한 5' 캡 구조의 인식을 포함한다(참조: Merrick, 2004). 엑소좀의 단백질 번역이 캡-의존적인지를 결정하기 위해, 내부 리보솜 진입 부위에 의해 분리된 2개의 상이한 루시퍼라제 시스트론으로 구성된 cDNA 바이시스트로닉 작제물을 사용하였다(도 4h)(참조: Poulin et al., 1998). 이 시스템에서, 레닐라 루시퍼라제의 번역은 캡-의존적인 반면, 반딧불이 루시퍼라제의 번역은 폴리오바이러스 IRES에 의해 지시되므로 캡-독립적이다(도 4h). 플라스미드를 엑소좀으로 직접 전기천공하면 반딧불이 루시퍼라제 활성에 명백한 변화 없이 레닐라 루시퍼라제 활성이 증가하였고(도 4i) (참조: Poulin et al., 1998), 이는 엑소좀에서 단백질 번역이 캡-의존적 방식으로 발생함을 시사한다. 반딧불이 및 레닐라 루시퍼라제 효소는 활성 요건이 다르기 때문에, CMV 프로모터의 제어하에 반딧불이 루시퍼라제가 발현되는 플라스미드를 사용하여 이 검정을 반복하였다. 루시퍼라제 활성은 pCMV-Fluc 전기천공된 엑소좀에서도 관찰되었다(도 4j).

실시예 5 - 엑소좀의 mRNA 번역은 기능성 단백질을 생성하고 성장 인자에 의해 자극될 수 있다

사이클로헥시미드로 전처리된 MCF10A 세포를 pCMV-GFP 플라스미드로 직접 전기천공된 MDA-MB-231 엑소좀과 함께 항온배양하였다. 공초점 현미경검사법으로 영상화하여 MCF10A 세포에서 녹색 형광이 감지되었으며, 이는 MDAMB-231 엑소좀에 의해 전달된 GFP 단백질(전사 및 번역 후)에 기여했을 가능성이 높다(도 5a, 상단 및 하단 패널). 흥미롭게도, pCMV-GFP 플라스미드로 직접 전기천공된 세포는 엑소좀을 함유하는 pCMV-GFP 플라스미드와 함께 항온배양된 세포에서 관찰된 형광 패턴과 구별되는 GFP 형광 패턴을 보여준다(도 5a, 중간 및 하단 패널).

MDA-MB-231 세포는 종양 억제 단백질인 p53의 비활성 돌연변이 형태를 과발현시키므로 p21 프로모터를 활성화할 수 없다(참조: Gartel et al., 2003). 야생형(wt) p53은 통상적으로 p21의 직접 유도에 의해 DNA 손상에 반응하여 세포주기 정지를 촉진한다(참조: Zilfou and Lowe, 2009). MDA-MB-231 세포로부터 단리된 엑소좀은 GFP에 융합된 wt p53을 인코딩하는 플라스미드로 전기천공되었다. 전기천공된 엑소좀은 전사 및 번역을 통해 wt p53 단백질을 생성할 수 있도록 48시간 동안 배양 배지에서 항온배양되었다(도 5b). 이어서, 새로 형성된 wt p53을 함유하는 엑소좀을 사이클로헥시미드의 영향하에 수용 MDA-MB-231 세포와 함께 항온배양하였다. 수용 MDA-MB-231 세포는 p21 발현의 상당한 증가를 나타냈으며(도 5c), 이는 엑소좀에 의해 배타적으로 합성된 wt p53 단백질의 기능성을 입증하였다(도 5b). p21 발현의 이러한 증가가 실제로 플라스미드의 전달 때문이 아니라 엑소좀에 의해 새로 번역된 wt p53 단백질 때문임을 추가로 입증하기 위해, MDA-MB-231 유래 엑소좀을 p53-GFP 플라스미드로 전기천공하고, 수용 MDA-MB-231 세포와 함께 항온배양하기 전에 wt p53 단백질을 합성하기 위해 48시간 동안 항온배양하거나(48시간), wt p53 단백질을 생성시키지 않고 수용 MDA-MB-231 세포에 즉시 전달하였다(0시간, 도 13e). 전달하기 48시간 전에 wt p53 단백질을 능동적으로 합성하도록 허용된 엑소좀은 엑소좀 항온배양 후 이미 30분에, 대조군 MDA-MB-231 세포에서 관찰된 동일한 기준선 p21 발현을 나타내는 플라스미드만 있는 엑소좀과 비교할 때보다 더 높은 수용 MDA-MB-231 세포에서의 p21 발현을 유도하였다(도 13e).

MDA-MB-231 세포로부터의 엑소좀이 고유 단백질 합성에 대한 기준선 용량을 나타낸다는 것을 추가로 입증하기 위해, 엑소좀을 사이클로헥시미드의 존재 및 부재하에 37℃에서 항온배양하였다. 이 엑소좀으로부터의 단백질 추출물의 면역블롯팅 결과 사이클로헥시미드와 함께 항온배양시 작은 세포질 단백질인 β-액틴 및 GAPDH의 발현 수준이 지속적으로 감소하는 것으로 나타났으며, 이는 다시 이 엑소좀에서 단백질 합성의 기준선 수준의 존재를 입증한다(도 5d).

외부 자극이 없는 상태에서 MDA-MB-231 엑소좀에 의해 생성되는 단백질을 결정하기 위해, 배양 중 아미노산을 사용한 안정한 동위원소 표지(stable isotope labeling with amino acids in culture; SILAC)의 변경된 버전을 수행하였다. MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀을 중(heavy) 표지된 ¹³C-리신 및 ¹⁵N-아르기닌이 보충된 SILAC 배지에서 항온배양하였다. MDA-MB-231 엑소좀을 중 표지된 SILAC 배지에서 5일 동안 항온배양하고, 단백질 추출물을 수득하고, 트립신 소화하고, 질량 분석법 분석에 적용하였다. 단지 소수의 중-표지된 펩티드만이 획득한 MS/MS 스펙트럼과 일치하지만, 중-표지된 아미노산을 함유하는 1개 또는 2개의 펩티드와 각각 일치하는 11개의 단백질을 식별할 수 있었다(표 7). 이는 비록 낮은 수준이기는 하지만, 기준선 mRNA 번역이 엑소좀에서 발생하여 매우 적은 양의 새로 합성된 단백질을 형성한다는 것을 입증한다.

다음으로, 전기천공된 pCMV-GFP 플라스미드가 포함된 MDA-MB-231 세포에서 유래된 엑소좀을 사용하여 단백질 번역 검정을 반복하였다. 엑소좀을 rhEGF로 자극하거나 자극하지 않고 37℃에서 48시간 동안 무혈청 배양 배지에서 항온배양하였다. 미자극 엑소좀은 기준선 수준의 GFP 생산을 나타냈지만, GFP 수준은 다른 농도의 rhEGF로 항온배양시 증가하였다(도 5e). 이는 모든 엑소좀이 단백질을 합성할 수 있지만, 성장 인자 자극은 단백질 합성 수준을 증가시켜 생산 속도를 변경할 수 있음을 다시 입증하였다.

실시예 6 - 엑소좀은 rhEGF 및 혈청 인자에 의한 자극에 반응하여 능동적으로 이동한다

성장 인자가 엑소좀에서 운동성 표현형을 유도할 수 있는지를 결정하기 위해, rhEGF 및 혈청 인자를 포함하는 보이든(Boyden) 챔버 시스템에 기반한 역 이동 검정(reverse migration assay)이 설계되었다. MDA-MB-231 세포에서 단리된 100억 개의 엑소좀을 400nm 기공을 함유하는 폴리카보네이트 표면 삽입물로 덮인 96웰 플레이트의 배양 웰에 넣었다. 삽입물에는 PBS, 10μM rhEGF가 포함된 PBS, 또는 20% 엑소좀-고갈된 FBS가 포함된 PBS가 포함되었다(도 6a). 엑소좀-고갈된 FBS가 여전히 미량의 엑소좀을 함유할 수 있기 때문에(데이터는 표시되지 않음), 20% FBS를 대조군으로서 바닥 웰에 엑소좀이 없는 상단 삽입물에 넣었다. 37℃에서 항온배양 후, 다른 시점에 상단 삽입물에서 샘플을 입수하고 Nanosight NTA를 사용하여 엑소좀을 정량화하였다.

4시간 항온배양 후, 상단 삽입물에 있는 엑소좀의 수준은 모든 실험 그룹에 대해 비슷했다(도 6b). 24시간 항온배양 후, 20% FBS는 엑소좀의 하단에서 상단으로의 이동을 크게 증가시켰으며, 이는 더 높은 혈청 성장 인자 구배를 향한 MDA-MB-231 엑소좀에 대한 지속적인 화학주성 영향을 시사한다(도 6c). 엑소좀이 없는 웰 위에 20% FBS가 있는 삽입물은 24시간 후 엑소좀이 매우 적었고, 이는 이동하는 엑소좀의 신원이 MDA-MB-231 세포에서 유래한 것임을 입증하였다(도 6c). PBS는 무시할 수 있는 양의 엑소좀 이동을 초래했지만, rhEGF 단독은 완전한 혈청 관련 성장 인자와 비교하여 더 낮은 수준이지만 엑소좀의 운동성을 또한 유도하였다(도 6c). 종합하면, 이 결과는 엑소좀이 성장 인자에 의해 유도될 수 있는 기능적 화학주성 능력을 나타낸다는 것을 시사한다.

실시예 7 - 엑소좀은 특히 종양 보유 마우스에서 향상된 단백질 생산을 나타낸다

종양에 의해 유도된 성장 인자 구배에 반응하는 엑소좀의 능력이 기능적 중요성을 갖는 새로운 단백질의 내재적 생산과 관련되어 있는지를 다루기 위해, 기준 마우스 모델을 생성하였다. 확립된 4T1 유방 종양이 있는 마우스에 GFP 또는 난알부민 발현 플라스미드로 전기천공된 50억 개의 MDA-MD 231/CD63-mCherry 엑소좀을 주사하였다. 이 연구의 대조군 실험군에는 플라스미드가 없는 CD63-mCherry 엑소좀 및 플라스미드 및 사이클로헥사미드로 전기천공된 CD63-mCherry 엑소좀이 포함되었다. 종양-보유 마우스 또는 비-종양-보유 마우스에게 엑소좀을 I.P. 주사하고 24시간 후, 종양, 혈청 및 기타 여러 기관을 수거하였다. 엑소좀은 CD63 mCherry 태그를 사용하여 단리된 FACS이며, GFP 또는 난알부민 단백질에 대해 평가되었다. GFP 및 난알부민은 종양이 있는 마우스의 종양, 폐, 뼈, 뇌 및 혈청에서 주로 검출되었지만, 비-종양 보유 마우스의 조직 및 사이클로헥사미드-함유 엑소좀이 주사된 종양 보유 마우스에서는 매우 낮은 수준만이 발견되었다. 이 결과는 엑소좀이 비-종양 보유 마우스의 간, 폐 및 뇌에서 검출될 수 있지만, 엑소좀은 종양 조직을 포함하여 이들 기관에 더 강력하게(아마도 강화된 운동성을 통해) 진입하고, 새로운 단백질을 생성하여 생물학적으로 반응한다는 것을 입증한다. 또한, 종양 보유 마우스로부터의 혈청-유래 엑소좀은 단백질 생산을 나타내며, 이는 종양이 전신 수준으로 엑소좀에 생물학적 영향을 미친다는 것을 시사한다.

본원에 개시되고 청구된 모든 방법은 본 개시내용에 비추어 과도한 실험 없이 만들어지고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 구현예의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 사상 및 범위를 벗어나지 않으면서 본원에 기재된 방법 및 방법의 단계 또는 단계의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 작용제가 본원에 기재된 작용제를 대체할 수 있는 한편 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 청구범위에 의해 정의된 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.

참조문헌

하기 참조문헌은, 본원에 기재된 것들에 보충적인 예시적인 절차적 또는 다른 세부사항을 제공하는 범위 내에서 구체적으로 본원에 참조로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> Board of Regents, The University of Texas System <120> USE OF EXOSOMES FOR TARGETED DELIVERY OF THERAPEUTIC AGENTS <130> UTFC.P1363WO <140> unknown <141> 2019-03-28 <150> US 62/649,057 <151> 2018-03-28 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 1 agtaggtagc gcgtcagtct cataatctga aggtcgtgag ttcgatcctc acacggggca 60 <210> 2 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 2 aggcgctgga ttaaggctcc agtctcttcg gaggcgtggg ttcgaatccc accgctgcca 60 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 3 agtggttatc acgttcgcct aacacgcgaa aggtccccgg ttcgaaaccg ggcggaaaca 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 4 ggcgatggac tagaaatcca ttggggtttc cccgcgcagg ttcgaatcct gccgactacg 60 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 5 tacccttgtg cctcgctcag 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 6 gagaagatca gccggcgttt 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 7 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 8 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 9 ggctgtattc ccctccatcg 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 10 ccagttggta acaatgccat gt 22

Claims (46)

1. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
   (a) 표면에 성장 인자 수용체를 갖는 엑소좀을 수득하는 단계;
   (b) 상기 엑소좀을 치료 단백질을 인코딩하는 핵산으로 형질감염시키는 단계;
   (c) 상기 형질감염된 엑소좀을 환자에게 투여하는 단계;
   (d) 상기 질환 또는 장애 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 상기 엑소좀을 그 부위로 유인하고 그 부위에서 상기 치료 단백질의 생산을 자극하여 환자의 질환을 치료하는 단계
   를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 환자의 병든 세포에 치료 단백질을 투여하는 방법으로 추가로 정의되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 수득된 엑소좀은 환자로부터 얻은 체액 샘플에서 수득되는, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 체액 샘플은 혈액, 림프, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인물, 눈 삼출물/누액, 또는 혈청인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 mRNA인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 플라스미드인, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 cDNA인, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암, 손상, 자가면역 장애, 신경계 장애, 위장 장애, 감염성 질환, 신장 질환, 심혈관 장애, 안과 장애, 피부 질환 또는 장애, 비뇨생식기 장애, 또는 골 질환 또는 장애인, 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암(tracheal cancer), 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암인, 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 질환 또는 장애 부위는 종양인, 방법.
11. 제8항에 있어서, 상기 암은 전이성인, 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 질환 또는 장애 부위는 전이성 결절인, 방법.
13. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 키나제, 포스파타제 또는 전사 인자인, 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 질환 또는 장애 부위의 세포에서 돌연변이되거나 불활성화된 단백질의 야생형 버전에 해당하는, 방법.
15. 제1항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 질환 또는 장애 부위의 세포에서 과활성을 보이는 단백질의 우성 음성(dominant negative) 버전에 해당하는, 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암이고, 상기 치료 단백질은 종양 억제인자인, 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 포함하는, 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 형질감염은 전기천공을 포함하는, 방법.
19. 제1항에 있어서, 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 또는 면역요법을 포함하는, 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 엑소좀은 조직 스캐폴드 매트릭스에 포함되는, 방법.
22. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서,
    (a) 표면에 성장 인자 수용체를 갖는 엑소좀을 수득하는 단계;
    (b) 상기 엑소좀을 치료제로 형질감염시키는 단계;
    (c) 상기 형질감염된 엑소좀을 환자에게 투여하는 단계;
    (d) 상기 질환 또는 장애 부위에 성장 인자 구배를 제공하여 상기 엑소좀을 그 부위로 유인하고 그 부위로 상기 치료제를 전달하여 환자의 질환을 치료하는 단계
    를 포함하는, 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 환자에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 방법은 환자의 병든 세포에 치료 단백질을 투여하는 방법으로 추가로 정의되는, 방법.
24. 제22항에 있어서, 단계 (a)에서 수득된 엑소좀은 환자로부터 얻은 체액 샘플에서 수득되는, 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 체액 샘플은 혈액, 림프, 타액, 소변, 뇌척수액, 골수 흡인물, 눈 삼출물/누액, 또는 혈청인, 방법.
26. 제22항에 있어서, 상기 치료제는 치료 단백질, 항체, 억제 RNA, 유전자 편집 시스템, 또는 소분자 약물인, 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 항체는 세포내 항원과 결합하는, 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 항체는 전장 항체, scFv, Fab 단편, (Fab)2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 또는 미니바디(minibody)인, 방법.
29. 제26항에 있어서, 상기 억제 RNA는 siRNA, shRNA, miRNA, 또는 사전-miRNA인, 방법.
30. 제26항에 있어서, 상기 유전자 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템인, 방법.
31. 제26항에 있어서, 상기 치료 단백질은 키나제, 포스파타제 또는 전사 인자인, 방법.
32. 제26항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 질환 또는 장애 부위의 세포에서 돌연변이되거나 불활성화된 단백질의 야생형 버전에 해당하는, 방법.
33. 제26항에 있어서, 상기 치료 단백질은 상기 질환 또는 장애 부위의 세포에서 과활성을 보이는 단백질의 우성 음성 버전에 해당하는, 방법.
34. 제26항에 있어서, 상기 소분자 약물은 영상화제(imaging agent)인, 방법.
35. 제22항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암, 손상, 자가면역 장애, 신경계 장애, 위장 장애, 감염성 질환, 신장 질환, 심혈관 장애, 안과 장애, 피부 질환 또는 장애, 비뇨생식기 장애, 또는 골 질환 또는 장애인, 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 두경부암, 전립선암, 식도암, 기관암, 뇌암, 간암, 방광암, 위암, 췌장암, 난소암, 자궁암, 자궁경부암, 고환암, 결장암, 직장암 또는 피부암인, 방법.
37. 제35항에 있어서, 상기 질환 또는 장애 부위는 종양인, 방법.
38. 제35항에 있어서, 상기 암은 전이성인, 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 질환 또는 장애 부위는 전이성 결절인, 방법.
40. 제22항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암이고, 상기 치료 단백질은 종양 억제인자인, 방법.
41. 제22항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암이고, 상기 치료제는 종양유전자를 표적화하는 억제 RNA인, 방법.
42. 제22항에 있어서, 상기 엑소좀은 이의 표면에 CD47을 포함하는, 방법.
43. 제22항에 있어서, 상기 형질감염은 전기천공을 포함하는, 방법.
44. 제22항에 있어서, 환자에게 적어도 제2 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 제2 요법은 외과적 요법, 화학요법, 방사선 요법, 한냉요법, 호르몬 요법, 또는 면역요법을 포함하는, 방법.
46. 제22항에 있어서, 상기 엑소좀은 조직 스캐폴드 매트릭스에 포함되는, 방법.

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