KR20150090116A - 종양 전이를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측하며, 추정상의 전이 억제인자 물질을 확인하는 방법 - Google Patents
종양 전이를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측하며, 추정상의 전이 억제인자 물질을 확인하는 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 종양이 신경교종이 아니라는 조건하에 종양의 전이를 예방하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제 물질을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 종양의 전이를 예방하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제 물질 및 암의 발병 또는 진행과 관련된 세포 표면 수용체의 억제 물질을 그것을 필요로 하는 피험자에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 암을 치료하는 것을 포함한다.
Description
본 발명은 그것들의 몇몇 구현에 있어서 종양의 전이(metastasis)를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측(prognosing)하며, 추정상의 전이 억제인자(putative metastasis inhibitor) 물질(agent)을 확인하는 방법에 관한 것이다.
세포 운동성(cell motility)은 종양의 전이를 포함하는, 다양한 생리학적 및 병리학적 과정들을 지지한다(Ridley, 2011). 이동(migraion)의 시작은 액틴 중합(actin polymerization) 및 Rho-패밀리 GTP 가수분해효소(Rho-family GTPase)에 의해 촉발되며, 이는 층상 위족(lamellipodia) 및 사상 위족(filopodia)의 형성을 유발한다. 급증하는 증거들이 매트릭스 분해에 침투 위족(invadopodia)이라 불리는 다른 형태의 액틴-촉발성 돌출부(actin-driven protrusion)가 연루되어 있음을 보여준다(Murphy and Courtneidge, 2011). 전이를 파종(seed)하기 위하여, 이동성 유방암 세포(migratory breast cancer cell)는 침투 위족을 형성하고, 주변의 혈관 안으로 침투한다. 유방암 세포의 폐(Minn et al., 2005) 및 뇌(Bos et al., 2009)로의 전이와 연관된 유전자 발현 양상(gene expression signature)을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구들은 부위-특이적(site-specific) 전이의 기저를 이루고 있는 유전자 세트를 확인하였다. 흥미롭게도, 양쪽 세트 모두 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor, EGF) 패밀리의 구성원(member)을 포함하며, 이는 공유 수용체(shared receptor)인 EGFR에 의한 신호전달(signaling)이 전이성 파종(metastatic dissemination)을 지원한다는 것을 암시한다.
세포내 수송(intracellular trafficking)이 세포 이동과 종양 진행의 핵심 특징으로서 부상하였다(Mosesson et al., 2008). 예를 들면, 돌연변이(mutant) p53은 강화된 인테그린(integrin) 및 EGFR 수송을 통해 전이를 촉진하며, 이는 Rab-결합 단백질(Rab-coupling protein, RCP)에 의존한다는 것이 밝혀졌다(Muller et al., 2010). Rab 단백질과 마찬가지로, 포스포이노시티드(phosphoinositides)는 소포의 동일성(vesicles identity)을 결정함으로써 세포 구획화(cellular compartmentalization)에 있어서 중추적인 역할을 한다(Yuan and Cantley, 2008). 예를 들면, 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)에 의한 PI(4,5)P2(포스파티딜-이노시톨 4,5-비스포스페이트(phosphatidyl-inositol 4,5-bisphosphate))의 D3 위치에서의 인산화는 PI(3,4,5)P3를 생성하며, 그것은 침투 위족 형성을 위해 필요하다(Yamaguchi et al., 2011). 유사하게는, PI(4,5)P2는 세포 내 이입(endocytosis) 및 액틴 역동성(actin dynamics)을 제어하는 다중 단백질(multiple protein)을 조절하지만(Saarikangas et al., 2010), 그것의 레벨은 두 가지 추가적인 형태의 효소에 의해 엄격하게 제어된다: 포스포리파아제 C(phospholipase C, PLCγ)는 PI(4,5)P2 가수분해를 촉진하여, 이는 코필린(Cofilin)(액틴-절단(actin-severing) 단백질)을 활성화시키고, 유방의 세포 이동을 촉발한다(van Rheenen et al., 2007). 마찬가지로, 시냅토자닌 2(SYNJ2)와 같은 이노시톨 폴리포스페이트 5-포스파타아제(inositol polyphosphate 5-phosphatases)는 이노시톨 고리의 D5 위치를 탈인산화시키고, 신경교종 세포의 이동을 조절한다(Chuang et al., 2004; Malecz et al., 2000). 게다가, 어떤 전립선암 샘플에서는 동형의 돌연변이(homozygous mutation)가 확인되었다(Rossi et al., Cancer Genet Cytogenet. 2005 Sep; 161(2):97-103).
본 발명은 종양 전이를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측하며, 추정상의 전이 억제인자 물질을 확인하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
발명의 요약
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 종양이 신경교종(glioma)이 아니라는 전제하에 종양 전이를 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 종양 전이를 예방하는 것을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체(cell surface receptor)의 억제인자를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 암을 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 종양이 신경교종이 아니라는 전제하에 종양 전이를 예방하기 위한 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자를 제공한다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 암을 치료하기 위한 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자를 제공한다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체는 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)이다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 수용체 티로신 키나아제는 ErbB 수용체이다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 ErbB 수용체는 상피세포 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)이다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 종양 전이의 추정상의 억제인자를 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 시료 물질(test agent)의 존재하에 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱(SYNJ2-mediated processing)을 분석하는 것을 포함하며, 여기에서 시료 물질의 부재하에서 동일하게 비교했을 때 시료 물질의 존재하에서 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 감소된 프로세싱은 종양 전이의 추정상의 억제인자를 나타낸다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱을 분석하는 것은 경쟁 검정법(competition assay)에 의해 수행된다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 경쟁 검정법은 PI(3,4)P2에 결합되어 있는 PI(3,4)P2 결합 도메인(binding domain)을 포함하는 복합체(complex)로부터 PI(3,4)P2 결합 도메인의 이동(displacement)을 분석한다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 경쟁 검정법은 형광 편광(fluorescence polarization) 경쟁 검정법이다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 그것들을 필요로 하는 대상에서 암의 예후를 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상의 암세포에서 SYNJ2의 레벨 또는 활성을 측정하는 것을 포함하며, 여기에서 영향을 받지 않은 대조군 샘플의 세포에서 동일하게 측정한 것과 비교하여 대상의 암세포에서 SYNJ2 활성 레벨의 상향조절(upregulation)은 나쁜 예후(poor prognosis)를 나타낸다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 방법은 우수한 표준 기법(Gold standard method)을 사용하여 예후를 증강시키는 것(augmenting)을 더 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 우수한 표준 기법은 마커(marker)의 검출을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 마커는 HER-2 및 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 전이는 EGF 의존성이다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 암은 유방암이다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 SYNJ2의 억제인자는 소분자(small molecule), 항체(antibody), 펩티드(peptide) 및 핵산 침묵화 물질(nucleic acid silencing agent)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 소분자는 표 2에 열거된 분자들로부터 선택된다.
본 발명의 몇몇 구현들의 양상에 따르면, 본 발명은 암의 치료 또는 암 전이의 예방을 위한 제조물(article of manufacture)을 제공하며, SYNJ2의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자를 패키징(packaging)하는 패키징 물질(packaging material)을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자는 항체이다.
본 발명의 몇몇 구현들에 따르면, 상기 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자는 소분자 억제인자이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및/또는 과학 용어는 그 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법들 및 물질들이 본 발명의 구현들의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다 할지라도, 예시적 방법 및/또는 물질들을 아래에 설명한다. 갈등시, 정의들을 포함하여 본 특허 명세서는 조절될 것이다. 게다가, 물질들, 방법들 및 실시예들은 단지 예시적일 뿐이며, 반드시 한정하는 것으로 의도된 것이 아니다.
본 발명에 따르면 종양 전이를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측하며, 추정상의 전이 억제인자 물질을 확인하는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현들은 첨부된 도면들을 참조하여 단지 예의 형태로만 본원에 기술된다. 이제 특히 도면들을 상세하게 참조하여, 자세한 사항들은 사례를 들어, 발명의 구현들의 예시적 논의를 위한 것임이 강조된다. 이 점과 관련하여, 도면을 예로 들은 설명은 당업자들에게 본 발명의 구현들이 어떻게 실시될 수 있는지 명백하게 해준다.
도면에서:
도 1A-I는 EGF가 유방 세포의 침습성 성장(invasive growth)을 촉진하며, 특정 유전자 세트를 유도한다는 것을 보여준다. 도 1A - MCF10A 세포를 성장 인자의 부재하에 치상하고, 클러스터를 형성시켰다. 72시간 후, 세포를 표시된 성장 인자로 처리하여(각 10 ng/mL로), 위상차 이미지(phase contrast image)를 24시간 후에 획득하였다(기준자(scale bar), 50 μm). 도 1B - MCF10A 세포를 표시된 리간드의 존재하에(10 ng/mL), 나타나 있는 바와 같이, 이동 또는 침습 챔버에 치상하고, 18시간 후 아래 구획으로 이동한 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다(왼쪽 패널). EGF 처리의 효과에 대해 정규화된(normalized) 이동 및 침습 시그널의 정량을 나타내었다. 데이터는 2번 반복한 대표 실험으로부터의 세 개의 생물학적 샘플(biological triplicates)의 평균 ± S.D.를 나타낸다(오른쪽 패널). 도 1C - MCF10A 세포를 억제인자 AG-1478(1 μM), U0126(5 μM) 또는 보르트만닌(Wortmannin)(200 nM)을 포함하거나 포함하지 않는, EGF 함유 배지가 담긴 트랜스웰 인서트(transwell inserts)에 치상하고, 18시간 동안 이동하게 하였다. 데이터는 세 개 샘플의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 실험은 두 번 반복하였다. 도 1D - (혈청에 의해서가 아니라(Amit et al., 2007)) EGF에 의해 인간 유방 MCF10A 세포로 특이적으로 유도된 425개의 유전자 리스트는 MDA-MB-231 세포의 전이의 상황하에서 상향조절된 유전자들(1,597개)과 교차하였다(Minn et al., 2005). 23개의 중복된 유전자들 중 하나는 5'-포스파티딜이노시톨 리피드 포스파타아제(5'-phosphatidylinositol lipid phosphatase) 시냅토자닌-2(SYNJ2)를 암호화한다. 도 1E - MCF10A 세포를 LacZ(crtl) 또는 SYNJ2-GFP(SYNJ2-OX)를 암호화하는 렌티바이러스 입자(lentiviral particles)로 감염시켰다. 내재적 SYNJ2와 SYNJ2-GFP 융합 단백질의 발현 레벨을 면역학적 블로팅(immunoblotting)으로 검출하고, 튜불린(tubulin)에 대한 탐침(probing)으로 동일한 단백질 로딩(loading)을 확인하였다. 도 1F - MCF10A 세포의 Ctrl 및 SYNJ2-OX 클론을 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 챔버에 치상하고(5×104 세포/웰), 22시간 동안 이동하게 하였다. 필터의 다른 쪽에 도달한 이동 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 얻었다. 도 1G - MCF10A 세포를 siRNA 대조군(siCtrl) 또는 SYNJ2로 유도된 siRNA(siSYNJ2)로 형질감염시키고, SYNJ2의 단백질 레벨을 36시간 후에 면역학적 블로팅으로 검출하였다. Ras-GAP에 대한 면역학적 블로팅으로 동일한 단백질 로딩(loading)을 확인하였다. 도 1H - G에 존재하는 세포를 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 챔버에 치상하고(5×104 세포/웰), 22시간 동안 이동하게 하였다. 필터의 하부면(lower face)에 도달한 이동 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 캡처하였다. 도 1I - MCF10A 세포의 컨플루언트 배양물(confluent cultures)을 표시된 siRNA로 처리하였다. 일단 단일층(monolayer)이 형성되면, 그것들을 스크래치 완결(scratch closure) 속도를 관찰하는 자동화된 스크래칭 시스템에 넣었다.
도 2A-E는 EGF에 의한 SYNJ2의 전사적 유도(transcriptional induction)가 침습적 성장을 촉진한다는 것을 보여준다. 도 2A - 혈청에 굶주린(serum-starved) MCF10A 세포를 EGF(20 ng/mL) 또는 혈청(5%)으로 자극하고, SYNJ2 mRNA 발현을 마이크로어레이(microarray) 또는 RT-qPCR을 사용하여 분석하였다. 도 2B - MCF10A 세포를 EGF로 자극시키고, 지정된 바와 같이 추출하고 면역학적 블로팅을 하였다. 도 2C - GFP-SYNJ2(SYNJ2-OX)를 암호화하는 바이러스 또는 대조군으로서 LacZ(Ctrl)로 감염된 MCF10A 세포를 EGF의 부재 또는 존재하에 4일간 배양하였다. 팔로이딘(phalloidin) 및 DAPI를 이용하여 위상차(phase contrast) 이미지(상부, bar: 100 μm) 및 공초점(confocal) 이미지(하부, bar: 20 μm)를 얻었다. 도 2D-E - MCF10A 세포를 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 또는 침습 챔버에서(5-6 × 104 세포/웰) 22시간 동안 배양하였다. 필터의 하부에 도달한 세포를 염색하고, 필터의 피복률(coverage)을 정량하였다(평균 ± S.D.).
도 3A-G는 유방 세포의 이동 및 침습을 수반하는 리딩 에지(leading edge)에 대한 SYNJ2의 유도성 전위(inducible translocation)를 나타낸다. 도 3A - 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 SYNJ2에 대해 유도된 shRNA(shSYNJ2)와 마찬가지로, MDA-MB-231 세포를 LacZ(ctrl) 또는 V5로 태그된 SYNJ2(SYNJ2-V5)를 암호화하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. V5-SYNJ2 및 내생적(endogenous) SYNJ2의 단백질 레벨을 면역학적 블로팅으로 검출하였다. AKT에 대한 면역학적 블로팅으로 동일한 단백질의 로딩(loading)을 확인하였다. 도 3B - SYNJ2 또는 대조군으로서 LacZ를 안정하게 과발현하는 MDA-MB-231 세포의 위상 이미지(왼쪽 패널) 및 침습 이미지(오른쪽 패널). 침습 검정법(invasion assay)을 사용하여, 세 번 반복하여 침습 능력(invasive capacity)을 측정하였고, 침습 세포를 정량하여 대조군(Ctrl)에 대해 정규화시켰다. 기준자(Scale bar), 50 μm. 도 3C - MDA-MB-231 세포를 SYNJ2로 유도된 siRNA 올리고뉴클레오티드(또는 siCtrl)로 형질감염시켰다. 36시간 후, SYNJ2의 단백질 레벨을 면역학적 블로팅으로 검출하였다. Ras-GAP에 대한 면역학적 블로팅에으로 동일한 단백질의 로딩을 확인하였다. 도 3D - C로부터의 세포를 이동 또는 침습 챔버에 치상하고, 18시간 동안 배양하였다. 이동 및 침습 시그널을 정량하고, EGF로 처리된 siCtrl 세포에 대해 정규화시켰다. 나타낸 데이터는 세 번 반복 실험의 평균 ± S.D.이다. 도 3E - GFP-SYNJ2를 일시적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 유리 커버슬립에 치상하고, TGFα(10 ng/mL)로 자극하였다. 타임-랩스 현미경(time-lapse microscopy) 사진을 얻었다(매 10초마다). 보여지는 이미지는 반전(inverted)된 것이며, 검은 점들(spots)은 층상 위족의 기저에서의 SYNJ2 및 그것의 집합체(assembly)를 나타낸다. 기준자, 10 μm. 도 3F - MDA-MB-231 세포를 TRITC-팔로이딘을 사용하여 내재적 SYNJ2 및 F-액틴(F-actin)에 대해 면역염색하였다. 네모친 부분을 확대하였다. 기준자, 10 μm. 도 3G - MCF10A 세포를 EGF로 18시간 동안 자극시킨 후, TRITC-팔로이딘을 사용하여 내재적 SYNJ2에 대해 면역염색하고, F-액틴에 대해서는 대비염색을 하였다. 기준자, 10μm.
도 4A-F는 SYNJ2의 촉매 활성이 침습적 성장에 필수적이라는 것을 보여준다. 도 4A-B - 대조군 세포뿐만 아니라, SYNJ2(SYNJ2-OX) 또는 SYNJ2에 대한 shRNA(shSYNJ2)를 발현하는 MDA-MB-231도 5% 매트리겔(Matrigel)에 시딩하였다. 6일 후 이미지를 캡처하고, 침습성 스페로이드(invasive spheroids)를 정량하였다(평균 ± S.D.). 기준자, 50 μm. 도 4C-D - shSYNJ2-발현 MDA-MB-231 세포를 WT SYNJ2(shSYNJ2+SYNJ2WT) 또는 촉매활성에 장애를 가진(catalytically disabled) 변이체(shSYNJ2+SYNJ2CD)로 감염시켰다. 세포를 지정된 바와 같이 추출하고 면역학적 블로팅을하거나, 침습 챔버에서 18시간 동안 침습하게 하였다. 침습된 세포의 이미지 및 그것들의 정규화된 정량을 나타내었다(평균 ± S.D.). 도 4E - 피브로넥틴(fibronectin) 상에 성장시킨 shCtrl 및 shSYNJ2 세포의 주사전자현미경 사진(scanning electron micrograph)을 나타낸다. 기준자 2 μm. 도 4F - 팔로이딘 및 DAPI로 염색된 표시된 MDA-MB-231 세포에서 F-액틴의 이미지. Z-축 섹션(줄)과 확대된 부위를 나타내었다. 화살표는 팽윤된 구조(swollen structures)를 표시한다. 기준자, 10 μm.
도 5A-H SYNJ2의 세포 내 위치를 나타낸다. 도 5A - GFP-SYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RFP-클라트린(Clathrin)으로 형질감염시키고, 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 치상하였다. 스피닝 디스크 현미경(spinning-disc microscopy)을 사용하여, 매 5초마다 세포의 이미지를 만들었다. 화살표는 새롭게 형성된 리딩 에지를 표시한다. 기준자 5 μm. 도 5B - 리딩 에지 및 세포체(cell body)의 기저에서의 SYNJ2의 조립(assembly) 및 분해(disassembly)(상부의 두 개의 화살표)를 묘사한 대표적 시간 프레임(time frame). 아래 줄을 위하여, 세포를 mCherry-lifeACT 플라스미드로 형질감염시키고, 콜라겐에 치상하였다. 그 후, 1분 간격으로 세포의 이미지를 만들었다. 참조를 위해 화살표를 삽입하였다. 시간의 척도(time scale)가 다르다는 것에 유의하라. 기준자, 1 μm. 도 5C - TIRF 및 동시형광 현미경(epifluorescence microscopy)으로 동시에 세포의 이미지를 만들고, 시그널을 카이모그래프(kymograph)로 전환하였다(X-축). 화살표는 시그널 개시(initiation)를 표시한다. 기준자, 5 μm. 도 5D - 세포를 Dyngo-4a(30 μm; Dynamin-2 억제인자)로 처리하기 5분 전 그리고 처리 5분 후를 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미지로 만들었다. 기준자, 5 μm. 도 5E - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 Dyngo-4a(30 μm; 30분)와 함께 또는 용매(DMSO)와 함께 배양하였다. 세포 용해물(lysates)을 항-GFP 항체로 (또는 항체를 사용하지 않고; -Ab) 면역침강(immunoprecipitation)시킨 후, 표시된 항체를 사용하여 세포 용해물의 샘플(5%)과 함께 면역학적 블로팅을 하였다. 도 5F - 세포를 피브로넥틴에 치상하여 고정하고, 내재적 Rac1에 대해 면역염색하였다. 기준자, 10 μm. 도 5G - NSC-23766(5 μM)으로 30분간 처리하기 5분 전 그리고 처리 5분 후에 공초점 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 만들었다. 기준자, 5 μm. 도 5H - MDA-MB-231 세포를 표시된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포 추출물을 SYNJ2 및 Ras-GAP에 대해 블로팅하였다. ELISA-기반 검정법(ELISA-based assay)(세포골격(Cytoskeleton))을 사용하여 GTP-Rac1 레벨을 검출하였다.
도 6A-D는 리딩 에지에 대한 SYNJ2의 국소화가 카베올린(caveolins)의 분포와는 완전히 다르며, F-액틴, 콜레스테롤 및 PI3K에 의존한다는 것을 보여준다. 도 6A - GFP-SYNJ2를 발현하고 RFP-Cav1을 동시발현(co-expressing)하는 MDA-MB-231 세포를 시간에 따라 동시에 이미지를 만들고, 시그널을 카이모그래프로 전환하였다(X 및 Y축). SYNJ2 조립체의 일시적 특성과 카베올린 1의 안정적인 출현(appearance)에 주목하라. 기준자, 5 μm. 도 6B - 왼쪽 패널은 150개의 랜덤하게 선택된 SYNJ2 집합체의 분포(벽공(pits) 대 수명(lifetime)의 %)를 묘사하고 있고, 도 5A에서와 같이 이미지를 만들었다(5초 간격, 단일 면(single plane), 스피닝 디스크 공초점). 오른쪽 패널은 55초의 수명을 보여주는 집합체의 평균(± SEM) 상대적 세기를 묘사하고 있다. 도 6C - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 MβCD(10 mM, 15분) 또는 보르트만닌(Wortmannin)(500 nM, 15분)으로 처리하였다. 처리하기 이전 또는 처리한 후에 동일하게 선택된 세포의 이미지를 매 6초마다 캡처하고, 시그널을 (왼쪽 패널에서 네모난 삽도(inset)를 나타내는) 카이모그래프로 전환하였다. 기준자, 20 μm. 도 6D - GFP-SYNJ2와 lifeACT-mCherry를 안정하게 동시 발현하는 MDA-MB-231 세포를 라트룬쿨린B(LatrunculinB)으로 처리하였다(1 μM, 15분). 처리 이전 또는 처리 후에 이미지를 얻었다. 기준자, 5 μm.
도 7A-E는 SYNJ2의 고갈(depletion)이 세포 내 소포에서 EGFR을 차단시킴을 보여준다. 도 7A - shRNA 대조군(shCtrl) 또는 SYNJ2에 특이적인 shRNA(shSYNJ2)를 안정하게 발현하는 MCF10A 세포를 EGF-함유 배지에 치상한지 3일 후에 추출하였다. SYNJ2, EGFR, EGFR의 인산화된 티로신 1068(pEGFR), 인산화된 ERK(phosphorylated ERK, pERK) 및 로딩 대조군으로서 Ras-GAP을 찾기 위해 면역학적 블로팅을 하였다. 도 7B - MCF10A 세포를 EGF의 존재하에 siRNA 대조군 또는 SYNJ2에 대해 유도된 siRNA로 형질감염시켰다. EGFR 및 SYNJ2 항체를 이용하여 공초점 면역형광 분석(confocal immunofluorescence analysis)을 수행하였다. 단지 SYNJ2-결핍 세포(별표)만이 EGFR 수송 결함(trafficking defects)을 나타냄에 주목하라. 기준자, 10 μm. 도 7C - MDA-MB-231 세포의 세 가지 파생세포를 EGFR에 대해 면역염색하고, DAPI 및 F-액틴에 대해 대비염색하였다: (i) SYNJ2의 발현이 억제된(knocked-down) 세포(shSYNJ2; 왼쪽 컬럼), (ii) 촉매활성이 없는(catalytically-dead) 형태에 해당하는 렌티바이러스 유전자 도입(transfer)에 의해 감염된 동일한 세포(shSYNJ2+SYNJ2CD; 중간 컬럼), 및 (iii) SYNJ2의 발현이 억제되고, 야행형의 형태가 감염에 의해 도입된 세포(shSYNJ2+SYNJ2WT; 오른쪽 컬럼). 기준자, 20 μm. 도 7D - 유비퀴틴화된(ubiquitinated) EGFR 레벨(밀도측정(densitometry)). 도 7E - MDA-MB-231 파생세포(derivatives)를 488-Tfn으로 자극시켰다(5분, 10 μg/mL). 세포를 얼음으로 고정시키고, 산으로 세척한 후, 시그널 세기를 분석하였다.
도 8A-I는 SYNJ2가 EGFR 수송(trafficking) 및 화학주성(chemotaxis)을 조절함을 보여준다. 도 8A - 표시된 siRNA로 형질감염된 MDA-MB-231 세포의 전추출물(whole extracts)을 지정된 바와 같이 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8B - 표시된 MDA-MB-231 서브클론(subclones)에서 표면 EGFR의 FACS(왼쪽) 및 125I-EGF 결합(오른쪽; 세 번의 반복 실험에서) 분석. 도 8C - shCtrl 및 shSYNJ2 세포를 피브로넥틴 상에 성장시키고, EGFR 및 F-액틴에 대해 면역염색하였다. 자, 20 μm. 도 8D - EGF 구배(gradient)에 노출된 화학주성 챔버에서 이동된 shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포 경로(track)의 로즈 플롯(rose plots). 적색 경로는 EGF를 향해 이동하는 세포를 나타낸다. 도 8E - 굶주린 MDA-MB-231 파생세포를 EGF(10 ng/mL)로 처리하고, 세포 용해물에 대해 나타낸 바와 같이 면역침강 및 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8F - 세포를 C에서와 같이 배양하고, 활성 EGFR(pY1045) 및 F-액틴에 대해 면역염색하였다. 자, 10 μm. 도 8G - 표시된 MDA-MB-231 파생세포를 5시간 동안 EGF(10 ng/mL)로 처리하고, 추출물을 나타낸 바와 같이 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8H - 표시된 MDA-MB-231 파생세포를 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488)-Tfn(25 μg/ml; 5분)에 노출시키고, 표면에 결합된 리간드를 제거하기 위하여 산으로 세척하고, 표시된 간격으로 이미지를 얻었다. 정규화된 형광 시그널을 나타내었다. 자, 10 μm. 도 8I - siCtrl 또는 siSYNJ2로 전처리된(pre-treated) MDA-MB-231 세포를 알렉사 플루오르 488-EGF(20 μg/ml; 10분)로 자극하고, 산으로 세척하고, 표시된 간격 동안 37℃에서 배양하고, FACS로 분석하였다.
도 9A-D는 SYNJ2가 소포 수송 및 초점 부착부(focal adhesion)의 형성 양쪽 모두에 필요함을 보여준다. 도 9A- MDA-MB-231 파생세포(shCtrl 및 shSYNJ2)를 고정하고, EEA1, F-액틴 및 핵(nuclei)(DAPI)에 대해 염색하였다. 기준자, 10 μm. 도 9B - MDA-MB-231 파생세포, 즉 shCtrl 및 shSYNJ2 세포를 인테그린 베타-1(integrin beta-1), F-액틴 및 DAPI로 탐색하였다(기준자, 20 μm). 도 9C - MDA-MB-231 세포를 48시간 동안 siCtrl 및 siSYNJ2로 처리한 후, 엔테그린 베타-1 및 인산화된 EGFR에 대해 면역염색하였다. 도 9D - 팍실린(paxillin), 핵(DAPI) 및 F-액틴(TRITC-팔로이딘을 사용하여)에 대한 MDA-MB-231 파생세포의 면역형광 분석. 팍실린 시그널을 초점 부착부에 관하여 세포질 부분(cytoplasmic regions)에서 정량하고, 세포 당 초점 부착부의 수 또한 정량하였다. 또한, 초점 부착부의 형태는 완벽한 원(circle)으로부터의 편차(deviation)를 측정함으로써 정량하였다(편심률(eccentricity)). 기준자, 10 μm.
도 10A-F는 SYNJ2의 고갈이 포스포이노시티드 항상성(phosphoinositide homeostasis)을 교란시키고, 초기 엔도솜(early endosome)을 팽창시키고, 초점 부착부를 분해함을 보여준다. 도 10A - shCtrl 또는 shSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 GFP-Rab4 플라스미드로 형질감염시키고, 48시간 후에 세포를 고정시키고, TRITC-팔로이딘을 사용하여 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 도 10B - MDA-MB-231 파생세포를 Rab5, F-액틴 및 핵(DAPI)에 대해 면역염색하였다. 이미지를 평균 세포 면적(average cell area)뿐만 아니라, Rab5-양성 소포의 크기와 수에 대해서도 정량하였다. 기준자, 10 μm. 도 10C - 3H-포스포이노시톨로 표지된 MDA-MB-231 세포의 파생세포로부터 추출된 포스포이노시티드를 크로마토그래피로 분리하고, 그것들의 레벨을 세 가지 다른 실험으로 측정하였다(shCtrl 세포에 대해 정규화된 시그널). 도 10D - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 pY1068-EGFR, 팍실린 및 F-액틴으로 탐색하였다(동시 국소화(co-localization) 시그널은 흰색이다. 기준자, 10 μm). 도 10E - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 시딩하였다. 부착되지 않은 세포들을 20분 후에 제거하고, 부착된 세포들은 이미지를 만들고 표면적(surface area)에 대해 정량하였다. 도 10F - shCtrl 또는 shSYNJ2를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RTCA E-플레이트에 치상하고, 실시간 임피던스 측정값(real-time impedance measurements)을 80분 동안 5초 간격으로 기록한 후, 추가로 80분 동안 10분 간격으로 기록하였다. 2번 반복 실험한 평균(± S.D.)을 나타내었다.
도 11A-G는 SYNJ2가 프로테아제의 분비 및 침습 위족의 조립(assembly)을 조절함을 보여준다. 도 11A - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 5일간 매트리겔에서 배양하여 고정하고, MMP-9에 대해 면역염색하였다. 시그널 세기를 히트-맵(heat-map)으로 전환하고, 콜로니 중심으로부터의 거리에 대해 곡선으로 나타내었다. 화살표는 스페로이드의 경계(boundaries)를 나타낸다. 자, 50 μm. 도 11B - 대조군 MDA-MB-231 세포 및 SYNJ2를 안정적으로 과발현하는 세포로부터 얻은 상층액을 젤라틴 자이모그래피(gelain zymography)를 사용하여 MMP-2 및 MMP-9 활성에 대해 세 번 반복실험하여 분석하였다. 도 11C - GFP-SYNJ2를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 가교결합된 형광성 젤라틴(cross-linked fluorescent gelatin)으로 미리 코팅된 커버 슬립에 치상하였다. 3시간 후, 세포를 GFP 및 F-액틴으로 탐색하여 침습 위족성 구조(invadopodial structures)를 검출하였다(화살표 끝부분). 자, 10 μm. 도 11D - siCtrl 또는 siSYNJ2 올리고뉴클레오티드로 전처리된 세포뿐만 아니라, SYNJ2를 과발현하는 MDA-MB-231 세포(SYNJ2-OX) 또한 가교결합된 형광성 젤라틴으로 미리 코팅된 커버 슬립 상에 치상하고, 세 번의 독립적인 실험에서 침습 위족성 구조를 정량하였다. 도 11E - 표시된 siRNAs로 처리된 MDA-MB-231 세포의 칩습 위족성 구조를 F-액틴 또는 TKS5에 대한 염색뿐만 아니라 젤라틴 분해에 의해서도 검출하였다. 화살표 끝부분(Z-축 이미지)은 침습위족을 나타낸다. 자, 10 μm. 도 11F - siCtrl 또는 siSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 젤라틴이 코팅된 커버 슬립상에 치상하고, 팔로이딘 및 인산화된 형태의 EGFR에 대한 항체(티로신(tyrosine) 1068)를 사용하여 C에서와 같이 처리하였다. 기준자, 10 μm. 도 11G - 표시된 MDA-MB-231 파생세포에 의해 3일에 걸쳐 영향을 받은(conditioned) 배양액을 EGF-유사 리간드(EGF-like ligands)에 대한 ELISA-기반 검정법을 사용하여 검사하였다.
도 12A-G는 SYNJ2가 매트릭스 분해와 침습위족의 조립을 조절함을 보여준다. 도 12A - 표시된 siRNA-처리된 MDA-MB-231 세포를 세 번 반복 치상하고, 3일간 배양하여 그것의 영향을 받은 배양액을 젤라틴(0.1%)이 포매된(embedded) 겔을 사용하여 전기영동적으로 분리한 후, MMP-2 및 MMP-9 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 정량하기 위해 단백질을 염색하였다. 도 12B - GFP-접합 비드(GFP-conjugated beads) 및 GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포의 맑은(cleared) 추출물을 사용하는 동시 면역침강 분석(co-immunoprecipitation analysis). 도 12C - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RFP-코르탁틴(Cortactin) 플라스미드로 형질감염시키고, 콜라겐 플레이트 상에 치상하였다. 생세포(live cell) 이미지 분석을 48시간 후에 수행하고, 주변(peripheral) 및 중심(central) 세포 부위 모두의 대표적인 스냅샷 이미지를 캡처하였다. 기준자, 5 μm. 도 12D - 표시된 MDA-MB-231 세포의 파생세포를 Tapp1(PI(3,4)P2 바인더(binder))의 Myc-태그된 PH 도메인(Myc-tagged PH domain)을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고, 48시간 후에 그것들을 젤라틴이 코팅된 표면에 치상하였다. F-액틴, 응집된(aggregated) TKS5 및 PI(3,4)P2(Tapp1)의 동시 분포(co-distribution)를 시각화하고, 공초점 현미경을 사용하여 정량하였다. 기준자, 10 μm. 도 12E - siCtrl 또는 siSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 FITC-젤라틴 코팅된 유리 커버 슬립 위에 치상하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 고정시키고, CD44에 대해 면역염색하고, TRITC-팔로이딘을 사용하여 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화하고, FITC-젤라틴 매트릭스에서 구멍(holes)을 관찰함으로써 침습위족을 검출하였다. 프레임 부분을 확대하였다. 기준자, 10 μm. 도 12F - shCtrl 및 shSYNJ2에 의한 표면 발현의 FACS 분석을 위해 CD44에 대한 항체를 사용하였다. 표시된 것들은 프레임 영역에 해당하는 세포의 단편들이다. 도 12G - siCtrl 또는 siSYNJ2로 전처리된 MDA-MB-231 세포를 FITC-젤라틴 코팅된 유리 커버 슬립 위에 치상하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 고정시키고, MT1-MMP에 대해 면역염색하고, TRITC-팔로이딘으로 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 기준자, 10 μm.
도 13A-H는 SYNJ2의 효소 활성이 유방 종양 세포의 전이성 확산(metastatic spread)을 추진함을 보여준다. 도 13A - 표시된 RFP-발현 MDA-MB-231 세포의 파생세포(2×106/마우스)를 암컷 SCID 마우스(그룹당 10-11마리)의 지방 패드(fat pad)에 이식하였다. 종양의 크기(평균 ± S.D.)를 이식 후 2주 및 6주에 측정하였다. 도 13B-C - 액와(axillary) 및 원거리 림프절(distant lymph nodes)(도 13B), 또는 폐(도 13C)에서 이식 후 6주에 나타난 전이를 나타낸 것이다. 별표는 p 값을 표시한다: * < 0.05, ** < 0.01 및 *** < 0.001. 도 13D-F - 대조군(LacZ) 및 SYNJ2-과발현(SYNJ2-OX) RFP-표지된 MDA-MB-231 세포를 A에서와 같이 동물에 이식하고, 종양의 크기(도 13D)뿐만 아니라 림프절에의 전이(도 13E) 및 폐에의 전이(도 13F) 또한 이식 후 6주 및 8주에 정량하였다. 도 13G-H - 표시된 MDA-MB-231-RFP 파생세포를 5주령의 암컷 SCID 마우스의 정맥 안으로(마우스당 1.5×105; 꼬리 정맥) 또는 유방의 지방 패드(마우스당 2.5×106) 안으로 주입하였다. 4주 후, 꼬리 안으로 주입된 마우스로부터의 폐를 RFP 시그널에 대해 검사하였다(왼쪽 및 중간 패널). 피콜의 구배(gradient of ficoll)로 샘플을 정제하고, RFP-양성인 혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTC)의 수를 1×106 FACS 판독에 대해 점수를 매기고, 종양 무게에 대해 정규화하였다.
도 14는 국소 및 원거리 림프절 전이의 생체 내(in vivo) 영상이다. MDA-MB-231-RFP 세포가 접종되고 6주 후 분석된 마우스에서의 국소(동측(ipsilateral)) 및 원격(반대측(contralateral)) 림프절 전이의 대표적인 이미지(도 13b를 참조). 영상화 전에, 마우스를 마취시키고, 림프절에서의 전이의 시각화 및 정량화를 위해 마우스의 털을 제거하였다.
도 15는 세포 이동 및 침습에서의 SYNJ2의 통합된 작용(integrated action)을 나타내는 작동 모델(working model)이다. EGFR-로딩된 재활용 엔도솜(EGFR-loaded recycling endosomes)은 배측 막(ventral membrane)에서 활성 수용체에 배치되고, 그 후 PI3K의 국소 활성화가 뒤따른다. PI3K에 의한 막에 있는(membranal) PI(4,5)P2의 인산화는 PI(3,4,5)P3를 생성하고, 그것은 SYNJ2에 의해 PI(3,4)P2로 탈인산화된다. 후자는 코르탁틴을 고정시키고, 액틴 중합(actin polymerization)의 핵을 이루는 TKS5를 동원(recruit)한다. 동시에, SYNJ2는 세포 외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)를 분해하고 새로운 침습성 구조, 침습위족을 만들기 위해, CD44와 같은 접착성 분자(adhesion molecules)의 운반(delivery) 및 MT1-MMP와 같은 프로테아제를 조절한다. 유사한 방식으로, 세포 주변(cell periphery)으로의 EGFR의 운반은 SYNJ2 (및 포스포리파아제 C(phospholipase C))에 의한 PI(4,5)P2의 파괴(breakdown)를 초래하고, 다이나민(Dynamin) 및 외피 액틴 섬유(cortical actin fibres)를 분해시키기 위한 코필린(Cofilin)과 같은 액틴 절단 효소(actin severing enzymes)를 국소적으로 활성화시키며, 층상위족이라 불리는 액틴으로 가득 차고(actin-filled), 인테그린이 풍부한(integrin-rich) 돌출부를 수립한다. 수평의 화살표는 세포 이동의 방향을 나타낸다. 원형질막(plasma membrane)의 색이 입혀진(color-coded) 부분은 특정 PI 포스포리피드(phospholipids)를 나타낸다.
도 16A-C는 SYNJ2가 공격적인(aggressive) 유방 종양에서 높게 발현됨을 보여준다. 도 16A - SYNJ2의 존재비(abundance)(높음, 중간 및 낮음)에 따른 331개의 침습적 유방 암종(invasive breast carcinomas)을 계층별로 분류하기 위하여, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 조직 마이크로어레이(tissue microarray)를 사용하였다. 종양의 동류의 분획(relative fraction)은 임상학적 하위형태(subtypes)에 따라 나타내었다. 도 16B - (오른쪽 컬럼에 확대되어 있는) 동일성(identity) 및 패턴(pattern)을 보여주는 SYNJ2 염색의 대표적인 이미지는 내강형 사례(luminal case)(별표는 대조군으로서 내피세포(endothelial cells)에 의한 발현을 나타낸다)와 기저형(basal-like) 및 HER2-과발현성 유방 종양 모두에서 관찰되었다. 도 16C - 286명(왼쪽; GSE2034) 또는 99명(오른쪽; GSE19783)의 유방암 환자들의 집단에서 SYNJ2 mRNA 발현에 따라 계층별로 분류된 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve).
도 17A-B는 SYNJ2의 5'-포스파타아제 활성을 측정하기 위해 사용된 형광 편광분석 검정법의 원리를 보여준다. 도 17A는 비결합된 PI(3,4)P2 형광 프로브는 편광 판독을 저하시키는 반면, 결합된 PI(3,4)P2 형광 프로브는 편광 판독을 증가시키는 일반적인 원리를 보여주는 도식이다. 도 17B는 편광값(polarization value, mP)에 의해 측정된 것과 같은 SYNJ2 5'-포스파타아제 활성의 검출을 보여주는 대표적인 막대 그래프이다.
도 18은 pET28 플라스미드 안으로 클로닝되고, 대장균(E. coli)에서 발현된 Flag-TAPP1 PH 도메인-His의 아미노산 및 핵산 서열(각각 SEQ ID NO:13 및 14)을 나타낸다. 상기 TAPP1-PH 도메인은 노란색으로 표시하였다.
도면에서:
도 1A-I는 EGF가 유방 세포의 침습성 성장(invasive growth)을 촉진하며, 특정 유전자 세트를 유도한다는 것을 보여준다. 도 1A - MCF10A 세포를 성장 인자의 부재하에 치상하고, 클러스터를 형성시켰다. 72시간 후, 세포를 표시된 성장 인자로 처리하여(각 10 ng/mL로), 위상차 이미지(phase contrast image)를 24시간 후에 획득하였다(기준자(scale bar), 50 μm). 도 1B - MCF10A 세포를 표시된 리간드의 존재하에(10 ng/mL), 나타나 있는 바와 같이, 이동 또는 침습 챔버에 치상하고, 18시간 후 아래 구획으로 이동한 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하였다(왼쪽 패널). EGF 처리의 효과에 대해 정규화된(normalized) 이동 및 침습 시그널의 정량을 나타내었다. 데이터는 2번 반복한 대표 실험으로부터의 세 개의 생물학적 샘플(biological triplicates)의 평균 ± S.D.를 나타낸다(오른쪽 패널). 도 1C - MCF10A 세포를 억제인자 AG-1478(1 μM), U0126(5 μM) 또는 보르트만닌(Wortmannin)(200 nM)을 포함하거나 포함하지 않는, EGF 함유 배지가 담긴 트랜스웰 인서트(transwell inserts)에 치상하고, 18시간 동안 이동하게 하였다. 데이터는 세 개 샘플의 평균 ± S.D.를 나타낸다. 실험은 두 번 반복하였다. 도 1D - (혈청에 의해서가 아니라(Amit et al., 2007)) EGF에 의해 인간 유방 MCF10A 세포로 특이적으로 유도된 425개의 유전자 리스트는 MDA-MB-231 세포의 전이의 상황하에서 상향조절된 유전자들(1,597개)과 교차하였다(Minn et al., 2005). 23개의 중복된 유전자들 중 하나는 5'-포스파티딜이노시톨 리피드 포스파타아제(5'-phosphatidylinositol lipid phosphatase) 시냅토자닌-2(SYNJ2)를 암호화한다. 도 1E - MCF10A 세포를 LacZ(crtl) 또는 SYNJ2-GFP(SYNJ2-OX)를 암호화하는 렌티바이러스 입자(lentiviral particles)로 감염시켰다. 내재적 SYNJ2와 SYNJ2-GFP 융합 단백질의 발현 레벨을 면역학적 블로팅(immunoblotting)으로 검출하고, 튜불린(tubulin)에 대한 탐침(probing)으로 동일한 단백질 로딩(loading)을 확인하였다. 도 1F - MCF10A 세포의 Ctrl 및 SYNJ2-OX 클론을 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 챔버에 치상하고(5×104 세포/웰), 22시간 동안 이동하게 하였다. 필터의 다른 쪽에 도달한 이동 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 얻었다. 도 1G - MCF10A 세포를 siRNA 대조군(siCtrl) 또는 SYNJ2로 유도된 siRNA(siSYNJ2)로 형질감염시키고, SYNJ2의 단백질 레벨을 36시간 후에 면역학적 블로팅으로 검출하였다. Ras-GAP에 대한 면역학적 블로팅으로 동일한 단백질 로딩(loading)을 확인하였다. 도 1H - G에 존재하는 세포를 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 챔버에 치상하고(5×104 세포/웰), 22시간 동안 이동하게 하였다. 필터의 하부면(lower face)에 도달한 이동 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하고, 이미지를 캡처하였다. 도 1I - MCF10A 세포의 컨플루언트 배양물(confluent cultures)을 표시된 siRNA로 처리하였다. 일단 단일층(monolayer)이 형성되면, 그것들을 스크래치 완결(scratch closure) 속도를 관찰하는 자동화된 스크래칭 시스템에 넣었다.
도 2A-E는 EGF에 의한 SYNJ2의 전사적 유도(transcriptional induction)가 침습적 성장을 촉진한다는 것을 보여준다. 도 2A - 혈청에 굶주린(serum-starved) MCF10A 세포를 EGF(20 ng/mL) 또는 혈청(5%)으로 자극하고, SYNJ2 mRNA 발현을 마이크로어레이(microarray) 또는 RT-qPCR을 사용하여 분석하였다. 도 2B - MCF10A 세포를 EGF로 자극시키고, 지정된 바와 같이 추출하고 면역학적 블로팅을 하였다. 도 2C - GFP-SYNJ2(SYNJ2-OX)를 암호화하는 바이러스 또는 대조군으로서 LacZ(Ctrl)로 감염된 MCF10A 세포를 EGF의 부재 또는 존재하에 4일간 배양하였다. 팔로이딘(phalloidin) 및 DAPI를 이용하여 위상차(phase contrast) 이미지(상부, bar: 100 μm) 및 공초점(confocal) 이미지(하부, bar: 20 μm)를 얻었다. 도 2D-E - MCF10A 세포를 EGF의 부재 (NT의 부재) 또는 존재(10 ng/mL)하에 이동 또는 침습 챔버에서(5-6 × 104 세포/웰) 22시간 동안 배양하였다. 필터의 하부에 도달한 세포를 염색하고, 필터의 피복률(coverage)을 정량하였다(평균 ± S.D.).
도 3A-G는 유방 세포의 이동 및 침습을 수반하는 리딩 에지(leading edge)에 대한 SYNJ2의 유도성 전위(inducible translocation)를 나타낸다. 도 3A - 대조군 shRNA(shCtrl) 또는 SYNJ2에 대해 유도된 shRNA(shSYNJ2)와 마찬가지로, MDA-MB-231 세포를 LacZ(ctrl) 또는 V5로 태그된 SYNJ2(SYNJ2-V5)를 암호화하는 렌티바이러스 입자로 감염시켰다. V5-SYNJ2 및 내생적(endogenous) SYNJ2의 단백질 레벨을 면역학적 블로팅으로 검출하였다. AKT에 대한 면역학적 블로팅으로 동일한 단백질의 로딩(loading)을 확인하였다. 도 3B - SYNJ2 또는 대조군으로서 LacZ를 안정하게 과발현하는 MDA-MB-231 세포의 위상 이미지(왼쪽 패널) 및 침습 이미지(오른쪽 패널). 침습 검정법(invasion assay)을 사용하여, 세 번 반복하여 침습 능력(invasive capacity)을 측정하였고, 침습 세포를 정량하여 대조군(Ctrl)에 대해 정규화시켰다. 기준자(Scale bar), 50 μm. 도 3C - MDA-MB-231 세포를 SYNJ2로 유도된 siRNA 올리고뉴클레오티드(또는 siCtrl)로 형질감염시켰다. 36시간 후, SYNJ2의 단백질 레벨을 면역학적 블로팅으로 검출하였다. Ras-GAP에 대한 면역학적 블로팅에으로 동일한 단백질의 로딩을 확인하였다. 도 3D - C로부터의 세포를 이동 또는 침습 챔버에 치상하고, 18시간 동안 배양하였다. 이동 및 침습 시그널을 정량하고, EGF로 처리된 siCtrl 세포에 대해 정규화시켰다. 나타낸 데이터는 세 번 반복 실험의 평균 ± S.D.이다. 도 3E - GFP-SYNJ2를 일시적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 유리 커버슬립에 치상하고, TGFα(10 ng/mL)로 자극하였다. 타임-랩스 현미경(time-lapse microscopy) 사진을 얻었다(매 10초마다). 보여지는 이미지는 반전(inverted)된 것이며, 검은 점들(spots)은 층상 위족의 기저에서의 SYNJ2 및 그것의 집합체(assembly)를 나타낸다. 기준자, 10 μm. 도 3F - MDA-MB-231 세포를 TRITC-팔로이딘을 사용하여 내재적 SYNJ2 및 F-액틴(F-actin)에 대해 면역염색하였다. 네모친 부분을 확대하였다. 기준자, 10 μm. 도 3G - MCF10A 세포를 EGF로 18시간 동안 자극시킨 후, TRITC-팔로이딘을 사용하여 내재적 SYNJ2에 대해 면역염색하고, F-액틴에 대해서는 대비염색을 하였다. 기준자, 10μm.
도 4A-F는 SYNJ2의 촉매 활성이 침습적 성장에 필수적이라는 것을 보여준다. 도 4A-B - 대조군 세포뿐만 아니라, SYNJ2(SYNJ2-OX) 또는 SYNJ2에 대한 shRNA(shSYNJ2)를 발현하는 MDA-MB-231도 5% 매트리겔(Matrigel)에 시딩하였다. 6일 후 이미지를 캡처하고, 침습성 스페로이드(invasive spheroids)를 정량하였다(평균 ± S.D.). 기준자, 50 μm. 도 4C-D - shSYNJ2-발현 MDA-MB-231 세포를 WT SYNJ2(shSYNJ2+SYNJ2WT) 또는 촉매활성에 장애를 가진(catalytically disabled) 변이체(shSYNJ2+SYNJ2CD)로 감염시켰다. 세포를 지정된 바와 같이 추출하고 면역학적 블로팅을하거나, 침습 챔버에서 18시간 동안 침습하게 하였다. 침습된 세포의 이미지 및 그것들의 정규화된 정량을 나타내었다(평균 ± S.D.). 도 4E - 피브로넥틴(fibronectin) 상에 성장시킨 shCtrl 및 shSYNJ2 세포의 주사전자현미경 사진(scanning electron micrograph)을 나타낸다. 기준자 2 μm. 도 4F - 팔로이딘 및 DAPI로 염색된 표시된 MDA-MB-231 세포에서 F-액틴의 이미지. Z-축 섹션(줄)과 확대된 부위를 나타내었다. 화살표는 팽윤된 구조(swollen structures)를 표시한다. 기준자, 10 μm.
도 5A-H SYNJ2의 세포 내 위치를 나타낸다. 도 5A - GFP-SYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RFP-클라트린(Clathrin)으로 형질감염시키고, 피브로넥틴이 코팅된 플레이트에 치상하였다. 스피닝 디스크 현미경(spinning-disc microscopy)을 사용하여, 매 5초마다 세포의 이미지를 만들었다. 화살표는 새롭게 형성된 리딩 에지를 표시한다. 기준자 5 μm. 도 5B - 리딩 에지 및 세포체(cell body)의 기저에서의 SYNJ2의 조립(assembly) 및 분해(disassembly)(상부의 두 개의 화살표)를 묘사한 대표적 시간 프레임(time frame). 아래 줄을 위하여, 세포를 mCherry-lifeACT 플라스미드로 형질감염시키고, 콜라겐에 치상하였다. 그 후, 1분 간격으로 세포의 이미지를 만들었다. 참조를 위해 화살표를 삽입하였다. 시간의 척도(time scale)가 다르다는 것에 유의하라. 기준자, 1 μm. 도 5C - TIRF 및 동시형광 현미경(epifluorescence microscopy)으로 동시에 세포의 이미지를 만들고, 시그널을 카이모그래프(kymograph)로 전환하였다(X-축). 화살표는 시그널 개시(initiation)를 표시한다. 기준자, 5 μm. 도 5D - 세포를 Dyngo-4a(30 μm; Dynamin-2 억제인자)로 처리하기 5분 전 그리고 처리 5분 후를 스피닝 디스크 공초점 현미경을 사용하여 이미지로 만들었다. 기준자, 5 μm. 도 5E - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 Dyngo-4a(30 μm; 30분)와 함께 또는 용매(DMSO)와 함께 배양하였다. 세포 용해물(lysates)을 항-GFP 항체로 (또는 항체를 사용하지 않고; -Ab) 면역침강(immunoprecipitation)시킨 후, 표시된 항체를 사용하여 세포 용해물의 샘플(5%)과 함께 면역학적 블로팅을 하였다. 도 5F - 세포를 피브로넥틴에 치상하여 고정하고, 내재적 Rac1에 대해 면역염색하였다. 기준자, 10 μm. 도 5G - NSC-23766(5 μM)으로 30분간 처리하기 5분 전 그리고 처리 5분 후에 공초점 현미경을 사용하여 세포의 이미지를 만들었다. 기준자, 5 μm. 도 5H - MDA-MB-231 세포를 표시된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포 추출물을 SYNJ2 및 Ras-GAP에 대해 블로팅하였다. ELISA-기반 검정법(ELISA-based assay)(세포골격(Cytoskeleton))을 사용하여 GTP-Rac1 레벨을 검출하였다.
도 6A-D는 리딩 에지에 대한 SYNJ2의 국소화가 카베올린(caveolins)의 분포와는 완전히 다르며, F-액틴, 콜레스테롤 및 PI3K에 의존한다는 것을 보여준다. 도 6A - GFP-SYNJ2를 발현하고 RFP-Cav1을 동시발현(co-expressing)하는 MDA-MB-231 세포를 시간에 따라 동시에 이미지를 만들고, 시그널을 카이모그래프로 전환하였다(X 및 Y축). SYNJ2 조립체의 일시적 특성과 카베올린 1의 안정적인 출현(appearance)에 주목하라. 기준자, 5 μm. 도 6B - 왼쪽 패널은 150개의 랜덤하게 선택된 SYNJ2 집합체의 분포(벽공(pits) 대 수명(lifetime)의 %)를 묘사하고 있고, 도 5A에서와 같이 이미지를 만들었다(5초 간격, 단일 면(single plane), 스피닝 디스크 공초점). 오른쪽 패널은 55초의 수명을 보여주는 집합체의 평균(± SEM) 상대적 세기를 묘사하고 있다. 도 6C - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 MβCD(10 mM, 15분) 또는 보르트만닌(Wortmannin)(500 nM, 15분)으로 처리하였다. 처리하기 이전 또는 처리한 후에 동일하게 선택된 세포의 이미지를 매 6초마다 캡처하고, 시그널을 (왼쪽 패널에서 네모난 삽도(inset)를 나타내는) 카이모그래프로 전환하였다. 기준자, 20 μm. 도 6D - GFP-SYNJ2와 lifeACT-mCherry를 안정하게 동시 발현하는 MDA-MB-231 세포를 라트룬쿨린B(LatrunculinB)으로 처리하였다(1 μM, 15분). 처리 이전 또는 처리 후에 이미지를 얻었다. 기준자, 5 μm.
도 7A-E는 SYNJ2의 고갈(depletion)이 세포 내 소포에서 EGFR을 차단시킴을 보여준다. 도 7A - shRNA 대조군(shCtrl) 또는 SYNJ2에 특이적인 shRNA(shSYNJ2)를 안정하게 발현하는 MCF10A 세포를 EGF-함유 배지에 치상한지 3일 후에 추출하였다. SYNJ2, EGFR, EGFR의 인산화된 티로신 1068(pEGFR), 인산화된 ERK(phosphorylated ERK, pERK) 및 로딩 대조군으로서 Ras-GAP을 찾기 위해 면역학적 블로팅을 하였다. 도 7B - MCF10A 세포를 EGF의 존재하에 siRNA 대조군 또는 SYNJ2에 대해 유도된 siRNA로 형질감염시켰다. EGFR 및 SYNJ2 항체를 이용하여 공초점 면역형광 분석(confocal immunofluorescence analysis)을 수행하였다. 단지 SYNJ2-결핍 세포(별표)만이 EGFR 수송 결함(trafficking defects)을 나타냄에 주목하라. 기준자, 10 μm. 도 7C - MDA-MB-231 세포의 세 가지 파생세포를 EGFR에 대해 면역염색하고, DAPI 및 F-액틴에 대해 대비염색하였다: (i) SYNJ2의 발현이 억제된(knocked-down) 세포(shSYNJ2; 왼쪽 컬럼), (ii) 촉매활성이 없는(catalytically-dead) 형태에 해당하는 렌티바이러스 유전자 도입(transfer)에 의해 감염된 동일한 세포(shSYNJ2+SYNJ2CD; 중간 컬럼), 및 (iii) SYNJ2의 발현이 억제되고, 야행형의 형태가 감염에 의해 도입된 세포(shSYNJ2+SYNJ2WT; 오른쪽 컬럼). 기준자, 20 μm. 도 7D - 유비퀴틴화된(ubiquitinated) EGFR 레벨(밀도측정(densitometry)). 도 7E - MDA-MB-231 파생세포(derivatives)를 488-Tfn으로 자극시켰다(5분, 10 μg/mL). 세포를 얼음으로 고정시키고, 산으로 세척한 후, 시그널 세기를 분석하였다.
도 8A-I는 SYNJ2가 EGFR 수송(trafficking) 및 화학주성(chemotaxis)을 조절함을 보여준다. 도 8A - 표시된 siRNA로 형질감염된 MDA-MB-231 세포의 전추출물(whole extracts)을 지정된 바와 같이 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8B - 표시된 MDA-MB-231 서브클론(subclones)에서 표면 EGFR의 FACS(왼쪽) 및 125I-EGF 결합(오른쪽; 세 번의 반복 실험에서) 분석. 도 8C - shCtrl 및 shSYNJ2 세포를 피브로넥틴 상에 성장시키고, EGFR 및 F-액틴에 대해 면역염색하였다. 자, 20 μm. 도 8D - EGF 구배(gradient)에 노출된 화학주성 챔버에서 이동된 shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포 경로(track)의 로즈 플롯(rose plots). 적색 경로는 EGF를 향해 이동하는 세포를 나타낸다. 도 8E - 굶주린 MDA-MB-231 파생세포를 EGF(10 ng/mL)로 처리하고, 세포 용해물에 대해 나타낸 바와 같이 면역침강 및 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8F - 세포를 C에서와 같이 배양하고, 활성 EGFR(pY1045) 및 F-액틴에 대해 면역염색하였다. 자, 10 μm. 도 8G - 표시된 MDA-MB-231 파생세포를 5시간 동안 EGF(10 ng/mL)로 처리하고, 추출물을 나타낸 바와 같이 면역학적 블로팅을 하였다. 도 8H - 표시된 MDA-MB-231 파생세포를 알렉사 플루오르 488(Alexa Fluor 488)-Tfn(25 μg/ml; 5분)에 노출시키고, 표면에 결합된 리간드를 제거하기 위하여 산으로 세척하고, 표시된 간격으로 이미지를 얻었다. 정규화된 형광 시그널을 나타내었다. 자, 10 μm. 도 8I - siCtrl 또는 siSYNJ2로 전처리된(pre-treated) MDA-MB-231 세포를 알렉사 플루오르 488-EGF(20 μg/ml; 10분)로 자극하고, 산으로 세척하고, 표시된 간격 동안 37℃에서 배양하고, FACS로 분석하였다.
도 9A-D는 SYNJ2가 소포 수송 및 초점 부착부(focal adhesion)의 형성 양쪽 모두에 필요함을 보여준다. 도 9A- MDA-MB-231 파생세포(shCtrl 및 shSYNJ2)를 고정하고, EEA1, F-액틴 및 핵(nuclei)(DAPI)에 대해 염색하였다. 기준자, 10 μm. 도 9B - MDA-MB-231 파생세포, 즉 shCtrl 및 shSYNJ2 세포를 인테그린 베타-1(integrin beta-1), F-액틴 및 DAPI로 탐색하였다(기준자, 20 μm). 도 9C - MDA-MB-231 세포를 48시간 동안 siCtrl 및 siSYNJ2로 처리한 후, 엔테그린 베타-1 및 인산화된 EGFR에 대해 면역염색하였다. 도 9D - 팍실린(paxillin), 핵(DAPI) 및 F-액틴(TRITC-팔로이딘을 사용하여)에 대한 MDA-MB-231 파생세포의 면역형광 분석. 팍실린 시그널을 초점 부착부에 관하여 세포질 부분(cytoplasmic regions)에서 정량하고, 세포 당 초점 부착부의 수 또한 정량하였다. 또한, 초점 부착부의 형태는 완벽한 원(circle)으로부터의 편차(deviation)를 측정함으로써 정량하였다(편심률(eccentricity)). 기준자, 10 μm.
도 10A-F는 SYNJ2의 고갈이 포스포이노시티드 항상성(phosphoinositide homeostasis)을 교란시키고, 초기 엔도솜(early endosome)을 팽창시키고, 초점 부착부를 분해함을 보여준다. 도 10A - shCtrl 또는 shSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 GFP-Rab4 플라스미드로 형질감염시키고, 48시간 후에 세포를 고정시키고, TRITC-팔로이딘을 사용하여 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 도 10B - MDA-MB-231 파생세포를 Rab5, F-액틴 및 핵(DAPI)에 대해 면역염색하였다. 이미지를 평균 세포 면적(average cell area)뿐만 아니라, Rab5-양성 소포의 크기와 수에 대해서도 정량하였다. 기준자, 10 μm. 도 10C - 3H-포스포이노시톨로 표지된 MDA-MB-231 세포의 파생세포로부터 추출된 포스포이노시티드를 크로마토그래피로 분리하고, 그것들의 레벨을 세 가지 다른 실험으로 측정하였다(shCtrl 세포에 대해 정규화된 시그널). 도 10D - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 pY1068-EGFR, 팍실린 및 F-액틴으로 탐색하였다(동시 국소화(co-localization) 시그널은 흰색이다. 기준자, 10 μm). 도 10E - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 시딩하였다. 부착되지 않은 세포들을 20분 후에 제거하고, 부착된 세포들은 이미지를 만들고 표면적(surface area)에 대해 정량하였다. 도 10F - shCtrl 또는 shSYNJ2를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RTCA E-플레이트에 치상하고, 실시간 임피던스 측정값(real-time impedance measurements)을 80분 동안 5초 간격으로 기록한 후, 추가로 80분 동안 10분 간격으로 기록하였다. 2번 반복 실험한 평균(± S.D.)을 나타내었다.
도 11A-G는 SYNJ2가 프로테아제의 분비 및 침습 위족의 조립(assembly)을 조절함을 보여준다. 도 11A - shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 5일간 매트리겔에서 배양하여 고정하고, MMP-9에 대해 면역염색하였다. 시그널 세기를 히트-맵(heat-map)으로 전환하고, 콜로니 중심으로부터의 거리에 대해 곡선으로 나타내었다. 화살표는 스페로이드의 경계(boundaries)를 나타낸다. 자, 50 μm. 도 11B - 대조군 MDA-MB-231 세포 및 SYNJ2를 안정적으로 과발현하는 세포로부터 얻은 상층액을 젤라틴 자이모그래피(gelain zymography)를 사용하여 MMP-2 및 MMP-9 활성에 대해 세 번 반복실험하여 분석하였다. 도 11C - GFP-SYNJ2를 안정적으로 발현하는 MDA-MB-231 세포를 가교결합된 형광성 젤라틴(cross-linked fluorescent gelatin)으로 미리 코팅된 커버 슬립에 치상하였다. 3시간 후, 세포를 GFP 및 F-액틴으로 탐색하여 침습 위족성 구조(invadopodial structures)를 검출하였다(화살표 끝부분). 자, 10 μm. 도 11D - siCtrl 또는 siSYNJ2 올리고뉴클레오티드로 전처리된 세포뿐만 아니라, SYNJ2를 과발현하는 MDA-MB-231 세포(SYNJ2-OX) 또한 가교결합된 형광성 젤라틴으로 미리 코팅된 커버 슬립 상에 치상하고, 세 번의 독립적인 실험에서 침습 위족성 구조를 정량하였다. 도 11E - 표시된 siRNAs로 처리된 MDA-MB-231 세포의 칩습 위족성 구조를 F-액틴 또는 TKS5에 대한 염색뿐만 아니라 젤라틴 분해에 의해서도 검출하였다. 화살표 끝부분(Z-축 이미지)은 침습위족을 나타낸다. 자, 10 μm. 도 11F - siCtrl 또는 siSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 젤라틴이 코팅된 커버 슬립상에 치상하고, 팔로이딘 및 인산화된 형태의 EGFR에 대한 항체(티로신(tyrosine) 1068)를 사용하여 C에서와 같이 처리하였다. 기준자, 10 μm. 도 11G - 표시된 MDA-MB-231 파생세포에 의해 3일에 걸쳐 영향을 받은(conditioned) 배양액을 EGF-유사 리간드(EGF-like ligands)에 대한 ELISA-기반 검정법을 사용하여 검사하였다.
도 12A-G는 SYNJ2가 매트릭스 분해와 침습위족의 조립을 조절함을 보여준다. 도 12A - 표시된 siRNA-처리된 MDA-MB-231 세포를 세 번 반복 치상하고, 3일간 배양하여 그것의 영향을 받은 배양액을 젤라틴(0.1%)이 포매된(embedded) 겔을 사용하여 전기영동적으로 분리한 후, MMP-2 및 MMP-9 단백질 분해 활성(proteolytic activity)을 정량하기 위해 단백질을 염색하였다. 도 12B - GFP-접합 비드(GFP-conjugated beads) 및 GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포의 맑은(cleared) 추출물을 사용하는 동시 면역침강 분석(co-immunoprecipitation analysis). 도 12C - GFP-SYNJ2를 안정하게 발현하는 MDA-MB-231 세포를 RFP-코르탁틴(Cortactin) 플라스미드로 형질감염시키고, 콜라겐 플레이트 상에 치상하였다. 생세포(live cell) 이미지 분석을 48시간 후에 수행하고, 주변(peripheral) 및 중심(central) 세포 부위 모두의 대표적인 스냅샷 이미지를 캡처하였다. 기준자, 5 μm. 도 12D - 표시된 MDA-MB-231 세포의 파생세포를 Tapp1(PI(3,4)P2 바인더(binder))의 Myc-태그된 PH 도메인(Myc-tagged PH domain)을 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키고, 48시간 후에 그것들을 젤라틴이 코팅된 표면에 치상하였다. F-액틴, 응집된(aggregated) TKS5 및 PI(3,4)P2(Tapp1)의 동시 분포(co-distribution)를 시각화하고, 공초점 현미경을 사용하여 정량하였다. 기준자, 10 μm. 도 12E - siCtrl 또는 siSYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 FITC-젤라틴 코팅된 유리 커버 슬립 위에 치상하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 고정시키고, CD44에 대해 면역염색하고, TRITC-팔로이딘을 사용하여 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화하고, FITC-젤라틴 매트릭스에서 구멍(holes)을 관찰함으로써 침습위족을 검출하였다. 프레임 부분을 확대하였다. 기준자, 10 μm. 도 12F - shCtrl 및 shSYNJ2에 의한 표면 발현의 FACS 분석을 위해 CD44에 대한 항체를 사용하였다. 표시된 것들은 프레임 영역에 해당하는 세포의 단편들이다. 도 12G - siCtrl 또는 siSYNJ2로 전처리된 MDA-MB-231 세포를 FITC-젤라틴 코팅된 유리 커버 슬립 위에 치상하여 3시간 동안 배양하였다. 그 후 세포를 고정시키고, MT1-MMP에 대해 면역염색하고, TRITC-팔로이딘으로 F-액틴에 대해 대비염색하였다. 기준자, 10 μm.
도 13A-H는 SYNJ2의 효소 활성이 유방 종양 세포의 전이성 확산(metastatic spread)을 추진함을 보여준다. 도 13A - 표시된 RFP-발현 MDA-MB-231 세포의 파생세포(2×106/마우스)를 암컷 SCID 마우스(그룹당 10-11마리)의 지방 패드(fat pad)에 이식하였다. 종양의 크기(평균 ± S.D.)를 이식 후 2주 및 6주에 측정하였다. 도 13B-C - 액와(axillary) 및 원거리 림프절(distant lymph nodes)(도 13B), 또는 폐(도 13C)에서 이식 후 6주에 나타난 전이를 나타낸 것이다. 별표는 p 값을 표시한다: * < 0.05, ** < 0.01 및 *** < 0.001. 도 13D-F - 대조군(LacZ) 및 SYNJ2-과발현(SYNJ2-OX) RFP-표지된 MDA-MB-231 세포를 A에서와 같이 동물에 이식하고, 종양의 크기(도 13D)뿐만 아니라 림프절에의 전이(도 13E) 및 폐에의 전이(도 13F) 또한 이식 후 6주 및 8주에 정량하였다. 도 13G-H - 표시된 MDA-MB-231-RFP 파생세포를 5주령의 암컷 SCID 마우스의 정맥 안으로(마우스당 1.5×105; 꼬리 정맥) 또는 유방의 지방 패드(마우스당 2.5×106) 안으로 주입하였다. 4주 후, 꼬리 안으로 주입된 마우스로부터의 폐를 RFP 시그널에 대해 검사하였다(왼쪽 및 중간 패널). 피콜의 구배(gradient of ficoll)로 샘플을 정제하고, RFP-양성인 혈중 종양 세포(circulating tumor cells, CTC)의 수를 1×106 FACS 판독에 대해 점수를 매기고, 종양 무게에 대해 정규화하였다.
도 14는 국소 및 원거리 림프절 전이의 생체 내(in vivo) 영상이다. MDA-MB-231-RFP 세포가 접종되고 6주 후 분석된 마우스에서의 국소(동측(ipsilateral)) 및 원격(반대측(contralateral)) 림프절 전이의 대표적인 이미지(도 13b를 참조). 영상화 전에, 마우스를 마취시키고, 림프절에서의 전이의 시각화 및 정량화를 위해 마우스의 털을 제거하였다.
도 15는 세포 이동 및 침습에서의 SYNJ2의 통합된 작용(integrated action)을 나타내는 작동 모델(working model)이다. EGFR-로딩된 재활용 엔도솜(EGFR-loaded recycling endosomes)은 배측 막(ventral membrane)에서 활성 수용체에 배치되고, 그 후 PI3K의 국소 활성화가 뒤따른다. PI3K에 의한 막에 있는(membranal) PI(4,5)P2의 인산화는 PI(3,4,5)P3를 생성하고, 그것은 SYNJ2에 의해 PI(3,4)P2로 탈인산화된다. 후자는 코르탁틴을 고정시키고, 액틴 중합(actin polymerization)의 핵을 이루는 TKS5를 동원(recruit)한다. 동시에, SYNJ2는 세포 외 매트릭스(extracellular matrix, ECM)를 분해하고 새로운 침습성 구조, 침습위족을 만들기 위해, CD44와 같은 접착성 분자(adhesion molecules)의 운반(delivery) 및 MT1-MMP와 같은 프로테아제를 조절한다. 유사한 방식으로, 세포 주변(cell periphery)으로의 EGFR의 운반은 SYNJ2 (및 포스포리파아제 C(phospholipase C))에 의한 PI(4,5)P2의 파괴(breakdown)를 초래하고, 다이나민(Dynamin) 및 외피 액틴 섬유(cortical actin fibres)를 분해시키기 위한 코필린(Cofilin)과 같은 액틴 절단 효소(actin severing enzymes)를 국소적으로 활성화시키며, 층상위족이라 불리는 액틴으로 가득 차고(actin-filled), 인테그린이 풍부한(integrin-rich) 돌출부를 수립한다. 수평의 화살표는 세포 이동의 방향을 나타낸다. 원형질막(plasma membrane)의 색이 입혀진(color-coded) 부분은 특정 PI 포스포리피드(phospholipids)를 나타낸다.
도 16A-C는 SYNJ2가 공격적인(aggressive) 유방 종양에서 높게 발현됨을 보여준다. 도 16A - SYNJ2의 존재비(abundance)(높음, 중간 및 낮음)에 따른 331개의 침습적 유방 암종(invasive breast carcinomas)을 계층별로 분류하기 위하여, 면역조직화학법(immunohistochemistry) 및 조직 마이크로어레이(tissue microarray)를 사용하였다. 종양의 동류의 분획(relative fraction)은 임상학적 하위형태(subtypes)에 따라 나타내었다. 도 16B - (오른쪽 컬럼에 확대되어 있는) 동일성(identity) 및 패턴(pattern)을 보여주는 SYNJ2 염색의 대표적인 이미지는 내강형 사례(luminal case)(별표는 대조군으로서 내피세포(endothelial cells)에 의한 발현을 나타낸다)와 기저형(basal-like) 및 HER2-과발현성 유방 종양 모두에서 관찰되었다. 도 16C - 286명(왼쪽; GSE2034) 또는 99명(오른쪽; GSE19783)의 유방암 환자들의 집단에서 SYNJ2 mRNA 발현에 따라 계층별로 분류된 카플란-마이어 곡선(Kaplan-Meier curve).
도 17A-B는 SYNJ2의 5'-포스파타아제 활성을 측정하기 위해 사용된 형광 편광분석 검정법의 원리를 보여준다. 도 17A는 비결합된 PI(3,4)P2 형광 프로브는 편광 판독을 저하시키는 반면, 결합된 PI(3,4)P2 형광 프로브는 편광 판독을 증가시키는 일반적인 원리를 보여주는 도식이다. 도 17B는 편광값(polarization value, mP)에 의해 측정된 것과 같은 SYNJ2 5'-포스파타아제 활성의 검출을 보여주는 대표적인 막대 그래프이다.
도 18은 pET28 플라스미드 안으로 클로닝되고, 대장균(E. coli)에서 발현된 Flag-TAPP1 PH 도메인-His의 아미노산 및 핵산 서열(각각 SEQ ID NO:13 및 14)을 나타낸다. 상기 TAPP1-PH 도메인은 노란색으로 표시하였다.
본 발명의 몇몇의 구현에서, 본 발명은 종양 전이를 예방하고, 암을 치료하고 예후를 예측하며, 추정상의 전이 억제인자 물질을 확인하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 구현들을 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 반드시 다음의 설명에 기재되거나 실시예에 의해 예시된 세부 사항들에 대한 그것의 적용으로 한정되지 않는다는 것으로 이해되어야 할 것이다. 본 발명은 다른 구현들일 수 있거나 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다.
성장 인자는 세포 이동 및 전이를 추진하지만, 그 근본적인 메커니즘은 완벽하게 이해되지 않았다.
본 발명은 이제야 시험관 내(in vitro)에서 침습위족 및 층상위족을 조절하고, 생체 내(in vivo)에서 암 전이를 조절하는데 있어서 마스터 모듈(master module)로서 시냅토자닌-2(SYNJ2)를 확인하였다.
아래에 그리고 그 이후의 실시예 부분에서 설명된 바와 같이, 본 발명은 시험관 내, 동물들에서 그리고 환자의 시료들(specimen)에서의 그것들의 발견을 입증한다. 특히, EGF로 자극된 유방 세포를 사용하여, 본 발명자들은 침습성 표현형(invasive phenotype)에 대하여 리피드 포스파타아제 시냅토자닌 2(SYNJ2)를 관련짓고, 암환자의 짧은 생존률에 대하여 SYNJ2를 높게 관련지었다. SYNJ2의 발현억제는 동물 모델에서 유방 종양 세포의 전이를 강건하게 손상시켰다. 시험관 내에서, SYNJ2-결핍 세포는 EGFR과 인테그린의 경로를 벗어난 수송을 나타내어, 기형의 초점 부착부를 만들어내며, 층상위족의 발달을 정지시키고, 침습위족의 소실을 초래한다. 이론에 얽매이지 않고, 활성 EGFR의 재활용은 특정 포스포이노시톨 리피드의 SYNJ2-매개성 탈인산화를 국소적으로 촉진하고, 그것에 의해 침습위족 및 층상위족 모두의 형성이 유발되어, 종양 진행을 가능하게 한다(도 15를 참조).
따라서, 본 발명의 양상에 따라서, 본 발명은 종양이 신경교종이 아니라는 전제하에 종양 전이를 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 종양 전이를 예방하는 것을 포함한다.
본원에서 사용된 것과 같은 문구 "종양 전이(tumor metastasis)"는 그것의 원발성 위치(primary location)에서 신체의 다른 부분으로 퍼지는 악성 종양(malignant tumor), 예를 들어 폐로 전이하는 유방암을 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "암(cancer)" 및 "종양(tumor)"은 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 비정상적(abnormal)이고 억제되지 않는(uncontrolled) 세포 분열에 의해 야기된 악성 암종(malignant growth) 또는 종양을 말하다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "예방(preventing)"은 전이성 과정(process) 또는 진행(progression) 및 후속 전이(subsequent metastasis)를 정지시키고(arresting), 중단시키고(halting), 억제시키는 것(inhibiting)을 말한다.
또 다른 양상에 따르면, 본 발명은 암을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자를 그것을 필요로 하는 대상에게 투여하는 것, 그리고 그것에 의해 암을 치료하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "치료(treating)"는 질환의 진행을 차단(abrogating), 실질적으로 억제(inhibiting), 지연(slowing) 또는 역전(reversing)시키는 것, 질환의 임상학적(clinical) 또는 심미적(aesthetical) 증상을 실질적으로 개선하는 것, 또는 질환의 임상학적 또는 심미적 증상의 출현(appearance)을 예방하는 것을 포함한다.
본 발명의 몇몇 구현에 따라 치료(또는 예후 예측)될 수 있는 암의 비제한적인 예는 위장관(gastrointestinal tract)의 종양(결장 암종(colon carcinoma), 직장 암종(rectal carcinoma), 대장 암종(colorectal carcinoma), 대장암(colorectal cancer), 대장 선종(colorectal adenoma), 유전성 비용종증(hereditary nonpolyposis) 타입 1, 유전성 비용종증 타입 2, 유전성 비용종증 타입 3, 유전성 비용종증 타입 6; 대장암, 유전성 비용종증 타입 7, 작은창자 및/또는 큰창자 암종(small and/or large bowel carcinoma), 식도 암종(esophageal carcinoma), 식도암이 동반된 변지종(tylosis with esophageal cancer), 위 암종(stomach carcinoma), 췌장 암종(pancreatic carcinoma), 췌장 내분비 종양(pancreatic endocrine tumors)), 자궁내막 암종(endometrial carcinoma), 융기성 피부섬유 육종(dermatofibrosarcoma protuberans), 담낭 암종(gallbladder carcinoma), 담관 종양(biliary tract tumors), 전립선암(prostate cancer), 전립선 선암(prostate adenocarcinoma), 신장암(renal cancer)(예를 들어, 윌름스 종양(Wilms' tumor) 타입 2 또는 타입 1), 간암(liver cancer)(예를 들어, 간모세포종(hepatoblastoma), 간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 간세포암(hepatocellular cancer)). 방광암(bladder cancer), 배아형 횡문근육종(embryonal rhabdomyosarcoma), 생식 세포 종양(germ cell tumor), 융모상피성 종양(trophoblastic tumor), 고환 생식 세포 종양(testicular germ cell tumor), 난소(ovary), 자궁(uterine), 난소 상피(epithelial ovarian)의 미성숙 기형종(immature teratoma), 천미골 종양(sacrococcygeal tumor), 융모막 암종(choriocarcinoma), 태반부착 부위 융모상피성 종양(placental site trophoblastic tumor), 상피성 성인 종양(epithelial adult tumor), 난소 암종(ovarian carcinoma), 장액성 난소암(serous ovarian cancer), 난소 성기삭 종양(ovarian sex cord tumor), 자궁 암종(cervical carcinoma), 자궁경부 암종(uterine cervix carcinoma), 소세포 및 비소세포 폐 암종(small-cell and non-small cell lung carcinoma), 비인두 암종(nasopharyngeal carcinoma), 유방 암종(breast carcinoma)(예를 들어, 도관 유방암(ductal breast cancer), 침습성 도관내 유방암(invasive intraductal breast cancer), 산발적(sporadic); 유방암(breast cancer), 유방암에 대한 민감성(susceptibility), 타입 4 유방암(type 4 breast cancer), 유방암-1(breast cancer-1), 유방암-3(breast cancer-3; 유방-난소암(breast-ovarian cancer)), 편평 상피세포 암종(squamous cell carcinoma)(예를 들어, 두경부(head and neck)에서), 신경성 종양(neurogenic tumor), 성상세포종(astrocytoma), 신경절모세포종(ganglioblastoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 림프종(lymphoma)(예를 들어, 호지킨병(Hodgkin's disease), 비호지킨성 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), B세포 림프종(B cell lymphoma), 버킷 림프종(Burkitt lymphoma), 피부 T세포 림프종(cutaneous t cell lymphoma), 조직구 림프종(histiocytic lymphoma), 림프아구성 림프종(lymphoblastic lymphoma), T세포 림프종(T cell lymphoma), 흉선 림프종(thymic lymphoma)), 신경교종(glioma), 선암(adenocarcinoma), 부신 종양(adrenal tumor), 유전성 부신피질 암종(hereditary adrenocortical carcinoma), 뇌 악성 종양(brain malignancy (tumor)), 다양한 다른 암종들(carcinomas)(예를 들어, 기관지 대세포(bronchogenic large cell) 암종, 도관(ductal) 암종, 에를리히-레르트 복수(Ehrlich-Lettre ascites) 암종, 표피양(epidermoid) 암종, 대세포(large cell) 암종, 루이스 폐(Lewis lung) 암종, 수질(medullary) 암종, 점액표피양(mucoepidermoid) 암종, 연맥세포(oat cell) 암종, 소세포(small cell) 암종, 방추세포(spindle cell) 암종, 유극세포(spinocellular) 암종, 이행세포(transitional cell) 암종, 미분화(undifferentiated) 암종, 암육종(carcinosarcoma), 융모막 암종(choriocarcinoma), 낭선암종(cystadenocarcinoma)), 상의모세포종(ependymoblastoma), 상피종(epithelioma), 적백혈병(erythroleukemia)(예를 들어, 프렌드(Friend) 적백혈병, 림프구성(lymphoblast) 적백혈병), 섬유육종(fibrosarcoma), 거대세포 종양(giant cell tumor), 신경교 종양(glial tumor), 교모세포종(glioblastoma)(예를 들어, 다형성(multiforme) 교모세포종, 성상세포종(astrocytoma)), 신경교종(glioma), 간세포암(hepatoma), 이종융합세포(heterohybridoma), 이종골수종(heteromyeloma), 조직구종(histiocytoma), 융합세포(hybridoma)(예를 들어, B세포), 부신종(hypernephroma), 인슐린종(insulinoma), 섬 종양(islet tumor), 각화종(keratoma), 평활근모세포종(leiomyoblastoma), 평활근육종(leiomyosarcoma), 백혈병(leukemia)(예를 들어, 급성 림프성(acute lymphatic) 백혈병, 급성 림프구성(acute lymphoblastic) 백혈병, 급성 림프구성 전B세포(acute lymphoblastic pre-B cell) 백혈병, 급성 림프구성 T세포(acute lymphoblastic T cell) 백혈병, 급성 거핵모구성(acute megakaryoblastic) 백혈병, 단핵구성(monocytic) 백혈병, 단핵구성-대식세포(monocytic-macrophage) 백혈병, 골수아구성(myeloblastic) 백혈병, 골수성(myeloid) 백혈병, 골수단구성(myelomonocytic) 백혈병, 형질세포성(plasma cell) 백혈병, 전B세포성(pre-B cell) 백혈병, 전골수성(promyelocytic) 백혈병, 아급성(subacute) 백혈병, T세포성(T cell) 백혈병, 림프구성 신생물(lymphoid neoplasm) 백혈병, 골수성 악성종양(myeloid malignancy)에 대한 소인(predisposition), 급성 비림프구성(acute nonlymphocytic) 백혈병), 림프 육종(lymphosarcoma), 흑색종(melanoma), 유방 종양(mammary tumor), 비만세포종(mastocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 중피세포종(mesothelioma), 전이성 종양(metastatic tumor), 단핵구 종양(monocyte tumor), 다발성 골수종(multiple myeloma), 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 골수종(myeloma), 신아세포종(nephroblastoma), 신경조직 신경교 종양(nervous tissue glial tumor), 신경조직 신경세포 종양(nervous tissue neuronal tumor), 신경초종(neurinoma), 신경모세포종(neuroblastoma), 핍지교종(oligodendroglioma), 골연골종(osteochondroma), 골 골수종(osteomyeloma), 골육종(osteosarcoma), (예를 들어, 유잉(Ewing's) 육종), 유두종(papilloma), 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma), 갈색세포종(pheochromocytoma), 뇌하수체 종양(pituitary tumor)(침습성), 형질세포종(plasmacytoma), 망막모세포종(retinoblastoma), 횡문근육종(rhabdomyosarcoma), 육종(sarcoma)(예를 들어, 유잉 육종, 조직구 세포(histiocytic cell) 육종, 젠슨(Jensen) 육종, 골원성(osteogenic) 육종, 세망세포(reticulum cell) 육종), 신경초종(schwannoma), 피부 종양(subcutaneous tumor), 기형 암종(teratocarcinoma)(예를 들어, 다분화능 세포(pluripotent cell)), 기형종(teratoma), 고환 종양(testicular tumor), 흉선종(thymoma) 및 모낭 상피종(trichoepithelioma), 위암(gastric cancer), 섬유육종(fibrosarcoma), 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme); 다발성 사구 종양(multiple glomus tumor), 리-프라우메니 증후군(Li-Fraumeni syndrome), 지방육종(liposarcoma), 린치 암 가계 증후군 II(lynch cancer family syndrome II), 남성 생식 세포 종양(male germ cell tumor), 비만세포성 백혈병(mast cell leukemia), 갑상선 수질암(medullary thyroid cancer), 다발성 뇌수막종(multiple meningioma), 내분비 샘종증(endocrine neoplasia), 점액육종(myxosarcoma), 부신경절종(paraganglioma), 가족성 비크롬친화성 부신경절종(familial nonchromaffin paraganglioma), 모기질세포종(pilomatricoma), 유두 암종(papillary carcinoma), 가족성 및 산발성의 횡문근 소인 증후근(familial and sporadic, rhabdoid predisposition syndrome), 가족성 횡문근 종양(familial rhabdoid tumor), 연조직 육종(soft tissue sarcoma) 및 교모세포종을 동반한 타코트 증후군(turcot syndrome)을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 임의의 고형(solid) 또는 비고형(non-solid) 암 및/또는 암 전이를 포함한다.
특정 구현에 따르면, 암은 유방암이다.
특정 구현에 따르면, 암(또는 암 전이)은 EGF-조절형(EGF-regulated)이다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 암은 EGFR 또는 HER2와 같은 ErbB 수용체 분자의 과발현 또는 상향조절을 특징으로 한다.
(상향조절로 알려져 있는) EGFR 과발현을 야기하는 돌연변이 또는 과활성화(overactivity)는 폐암, 항문암 및 다형성 교모세포종(glioblastomamultiforme)을 포함하는 수많은 암과 관련되어 있다. 이 후자의 경우에는, EGFRvIII라 불리는 어느 정도 특이적인 EGFR의 변이가 종종 관찰된다. EGFR 또는 패밀리 구성원의 돌연변이, 증폭(amplification) 또는 오조절(misregulation)은 모든 상피성 암(epithelial cancer) 중 약 30%에 관련되어 있다.
EGFR와 관련된 돌연변이는 그것의 지속적인 활성화를 야기할 수 있으며, 억제되지 않는 세포 분열 - 암에 대한 소인(predispositon)을 초래할 수 있다. 그 결과, EGFR의 돌연변이는 여러 가지 형태의 암에서 확인되어 왔으며, 그것은 확대되는 항암 치료의 종류(class)의 표적이다(Zhang 2007 J. Clin . Invest. 117 (8):2051-8).
ERBB2 유전자의 증폭 또는 과발현은 유방암의 대략 30%에서 발생한다. 그것은 증가한 질병의 재발(recurrence)과 더욱 나쁜 예후 예측과 강하게 연관되어 있다. 과발현은 또한 난소, 위에서 발생하는 것으로 알려져 있으며, 장액성 자궁내막 암종(uterine serous endometrial carcinoma)과 같은 자궁암의 공격적인 형태(aggressive form)이다.
다음은 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)의 ErbB 패밀리의 구성원이 관련되어 있는 암의 리스트이다.
ErbB-1 - 부신피질암(adrenocortical cancer), 담관계암(biliary cancer), 자궁경부암, 대장암, 식도암(esophageal cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 위암, 교모세포종(glioblastoma), 두경부암(head and neck cancer), 폐암(비소세포(non-small cell) 폐암, 편평세포암종(squamous cell carcinoma), 선암(adenocarcinoma) 및 대세포(large cell) 폐암), 췌장암(pancreatic cancer), 침샘암(salivary gland cancer), 설사(diarrhea), 양성 신생물(benign neoplasm), 침습성 암종(invasive carcinoma), 피부병(skin disease), 유방 상피내암종(ductal carcinoma in situ), 손톱 주위염(paronychia).
ErbB-2 - 담관계암, 방광암, 유방암, 담관암종(cholangiocarcinoma), 식도암, 담낭암, 위암, 교모세포종, 난소암, 췌장암, 침샘암. 특정 구현에 따르면, 상기 암은 유방 또는 위암이다.
ErbB-3 - 유방암, 폐암 및 바이러스성 백혈병(viral leukemia).
ErbB-4 - 유방암, 바이러스성 백혈병, 수모세포종, 폐암 및 유방 종양.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "대상(subject)"은 암으로 진단받은 포유류(예를 들어, 인간)를 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 시냅토자닌-2 또는 SYNJ2는 시냅스성 이노시톨-1,4,5-트리포스페이트 5-포스파타아제 2(Synapatic inositol-1,4,5-triphosphate 5-phosphatase 2), EC 3.1.3.36을 말한다. 시냅토자닌-2는 보편적으로 발현되는 이노시톨 폴리포스페이트 5-포스파타아제(inositol polyphosphate 5-phosphatase)(SEQ ID NO:1 및 2, 각각 폴리뉴클레오티드와 관련이 있으며, 폴리뉴클레오티드를 암호화한다)이다.
본원에 사용된 것과 같은 문구 "시냅토자닌 2의 억제인자(inhiitor of synaptojanin 2, SYNJ2)"는 SYNJ2의 발현 또는 활성을 감소시키거나 하향조절하는 분자를 말한다.
하향조절은 10 %, 20 %, 30%, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 이상으로 할 수 있거나, 완전한 억제(아래에 기술된 것과 같이 주어진 검정법에 의해 측정된 것으로서 활성 또는 발현의 100% 소실)일 수 있다.
SYNJ2의 발현을 하향조절하는 것은 하기에 기술된 바와 같이 DNA, RNA 또는 단백질 레벨에 영향을 미칠 수 있다. SYNJ2 활성은 (PI(3,4,5)P3를 PI(3,4)P2로 전환하는 포스파타아제로서의) 촉매적 활성, (다이나민(dynamin), 코르탁틴(cortactin)과 상호작용하는) 그것의 신호전달(signaling) 활성(도 5E-H를 참조), 또는 세포내 국소화(cellular localization)를 말한다. 후자의 경우에 있어서, SYNJ2의 억제인자는 단백질의 세포내 국소화를 변경시킬 수 있다.
따라서, SYNJ2의 하향조절은 유전자를 삽입하거나(knock-in), 그것의 전사 및/또는 번역을 방해하는 다양한 분자들(예를 들어, 핵산 침묵화 물질, 예를 들어, 핵산(RNA) 침묵화 물질, 예를 들어 안티센스(antisense), siRNA, shRNA, 마이크로-RNA, 리보자임(Ribozyme) 및 DNA 효소(DNAzyme) 등)을 사용하여 게놈 및/또는 전사체의 레벨에 영향을 미치거나, 예를 들어, 길항제(antagonist), 폴리펩티드 등을 절단하는 효소를 사용하여 단백질 레벨에 영향을 미칠 수 있다.
다음은 SYNJ2의 발현 레벨 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는 물질(agents)의 리스트이다.
SYNJ2를 하향조절할 수 있는 물질의 한 예는 SYNJ2에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항체 단편이다. 바람직하게는, 상기 항체는 적어도 하나의 SYNJ2의 에피토프(epitope)에 특이적으로 결합한다. SYNJ2는 세포성 단백질이므로, 항체를 세포 내로 도입하기 위한 조치를 취한다. 본원에 사용된 것과 같은 용어 "에피토프(epitope)"는 항체의 파라토프(paratope)가 결합하는 항원에 있는 항원 결정부위(antigenic determinant)를 말한다.
항원 결정부위는 주로 아미노산 또는 탄수화물 측쇄와 같은 분자들의 화학적 활성 표면(chemically active surface) 그룹들로 이루어지며, 주로 특이적인 전하 특성뿐만 아니라 특이적인 3차원 구조 특성도 가진다.
본 발명에 사용된 것과 같은 용어 "항체(antibody)"는 순수한(intact) 분자뿐만 아니라, Fab, F(ab')2 및 대식세포에 결합할 수 있는 Fv와 같은 그것의 기능적 단편(functional fragment)도 포함한다. 이들 기능적 항체 단편들은 아래와 같이 정의된다: (1) Fab는 항체 분자의 1가의(monovalent) 항원 결합 단편을 포함하며, 순수한 경쇄(light chain) 및 하나의 중쇄(heavy chain)의 일부를 얻기 위해 파파인 효소를 사용하여 전 항체(whole antibody)의 분해에 의해 생성될 수 있는 단편이고; (2) Fab'는 펩신으로 전 항체를 처리한 후, 순수한 경쇄 및 중쇄의 일부를 얻기 위해 환원(reduction)에 의해 얻어질 수 있는 항체 분자의 단편이며; 항체 분자당 두 개의 Fab' 단편이 얻어질 수 있고; (3) (Fab')2는 차후의 환원 없이 펩신 효소를 사용하여 전 항체를 처리하여 얻어질 수 있는 항체의 단편이며; F(ab')2는 두 개의 이황화 결합(disulfide bonds)에 의해 결합된 두 개의 Fab' 단편의 2량체(dimer)이고; (4) Fv는 두 개의 사슬로 발현된 경쇄의 가변부위(variable retion) 및 중쇄의 가변부위를 포함하는 유전자 조작에 의해 생성된(genetically engineered) 단편으로 정의되고; (5) 단쇄 항체(Single chain antibody, "SCA")는 유전적으로 융합된(genetically fused) 단쇄 분자로서 적절한 폴리펩티드 링커(linker)에 의해 연결된, 경쇄의 가변부위 및 중쇄의 가변부위를 포함하는 유전자 조작에 의해 생성된 분자이다.
다클론(polyclonal) 및 단일클론(monoclonal) 항체뿐만 아니라 그것의 단편을 생산하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 본원에 참조로서 통합되어 있는 할로우 및 레인(Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988)을 참조).
본 발명의 몇몇 구현에 따른 항체 단편은 항체의 단백질 분해성 가수분해(proteolytic hydrolysis)에 의해, 또는 그 단편을 암호화하는 DNA의 대장균 또는 포유동물의 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터의 난소 세포 배양물 또는 다른 단백질 발현 시스템)에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 기존의 방법에 의한 전 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 F(ab')2를 나타내는 5S 단편을 제공하기 위해 펩신을 사용한 항체의 효소적 절단에 의해 생성될 수 있다. 이 단편은 티올 환원제(thiol reducing agent) 및 선택적으로 3.5S Fab' 1가의 단편을 생성하기 위하여 이황화 결합의 절단의 원인이 되는 설피드릴기에 대한 차단기(blocking group)를 사용하여 더 절단될 수 있다. 대안적으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 두 개의 1가의 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접적으로 생산한다. 이들 방법들은 예를 들어, 골덴버그(Goldengerg), U.S. Pat. Nos. 4,036,945와 4,331,647, 및 본원에 포함된 참조들에 의해 설명되며, 특허들은 그것들 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 또한, 포터 R.R.을 참조하라(Porter, R. R. Biochem. J. 73: 119-126 (1959)). 그 단편들이 순수한 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 1가의 경쇄-중쇄 단편을 만들기 위한 중쇄의 분리, 단편의 추가적 절단과 같은 항체를 절단하는 다른 방법 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기술들 또한 사용될 수 있다.
Fv 단편은 중쇄 가변부위(VH) 및 경쇄 가변부위(VL)의 조합을 포함한다. 이 조합은 인바 등에 기술된 바와 같이 비공유성(noncovalent)일 수 있다(Inbar et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 69:2659-62 (1972)). 대안적으로, 가변 사슬은 분자내 이황화 결합에 의해 결합될 수 있거나, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 화학물질에 의해 가교결합될 수 있다. 바람직하게는, Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄 가변부위를 포함한다. 이들 단쇄 항원 결합 단백질(single-chain antigen binding proteins, sFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 제작함으로써 제조된다. 상기 구조 유전자는 발현 벡터 내로 삽입된 후, 대장균과 같은 숙주 세포 내로 도입된다. 재조합 숙주 세포는 두 개의 가변 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 사용하여 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. sFv를 생산하기 위한 방법은 예를 들어, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되는, 문헌들(Whitlow and Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993)) 및 U.S. Pat. No. 4,946,778에 의해 설명된다.
항체 단편의 다른 형태는 단일 상보성 결정부위(complementarity determining region, CDR)를 암호화하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소 식별 단위(minimal recognition unit)")는 관심 항체의 CDR을 암호화하는 유전자를 제작함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는 예를 들어, 항체 생산 세포의 RNA로부터 가변부위를 합성하기 위해 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction)을 사용하여 제조된다. 예를 들어, 라릭 및 프라이를 참조하라(Larrick and Fry, Methods, 2: 106-10(1991)).
항 SYNJ2는 상업적으로 입수 가능하다. 항 인간 SYNJ2 단일클론 항체의 공급회사의 예는 암스바이오(Amsbio), 아틀라스 안티바디스(Atlas Antibodies), AbD 세로텍(AbD Serotec), 유나이티드 스테이츠 바이오로지컬(United States Biological), antibodies-conline.com, 젠웨이(Genway), 프로테인테크 그룹(Proteintech Group) 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체들은 치료학적 적용을 위해 비면역원성(non-immunogenic)이 된다.
비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 인간화(humanized) 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 면역글로불린(immunoglobulins), 면역글로불린 사슬 또는 (Fv, Fab, Fab', F(ab').sub.2 또는 항체의 다른 항원-결합 부분서열(subsequence)과 같은) 그것의 단편의 키메라 분자(chimeric molecule)이다. 인간화 항체는 수용자(recipient)의 상보성 결정부위(CDR)를 형성하는 잔기를 원하는 특이성(specificity), 친화도(affinity) 및 능력(capacity)을 갖는 마우스, 쥐 또는 토끼와 같은 비인간 종(공여자(donor) 항체)의 CDR 잔기로 치환시킨 인간 면역글로불린(수용자(recipient) 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 면역글로불린의 Fv 프레임워크(framework) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 치환된다. 인간화 항체는 또한 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 수 있고, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위는 비-인간 면역글로불린의 CDR 부위에 대응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 부위는 인간 면역글로불린 공통(consensus) 서열의 FR 부위에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 선택적으로 적어도 면역글로불린 불변부위(constant region)(Fc)의 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 불변부위의 일부를 포함할 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1988); and Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)).
비-인간 항체를 인간화하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원(source)으로부터 유래되어 도입된 아미노산 하나 또는 그 이상의 잔기를 가진다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 종종 외래 잔기(import residue)로 불리며, 전형적으로 외래의 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류의(rodent) CDR 또는 CDR 서열로 치환하는 것에 의하여, 기본적으로 윈터 및 그의 동료들(Winter and co-workers)의 방법에 따라 수행될 수 있다(Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)). 따라서, 인간화 항체는 키메라 항체이며(U.S. Pat. No. 4,816,567), 여기에서 실질적으로 순수한 인간 가변 도메인보다 적게 비-인간 종으로부터 유래된 상응하는 서열로 치환된다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로 몇몇의 CDR 잔기들 및 아마도 몇몇의 FR 잔기들이 설치류의 항체에 있는 유사한 부위들로부터 유래된 잔기들로 치환된 인간 항체이다.
인간 항체는 또한 파지 디스플레이(phage display) 라이브러리를 포함하는, 당업계에 공지된 다양한 기술들을 사용하여 생산될 수 있다(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). 콜 등 및 뵈르너 등의 기술 또한 인간 단일클론 항체의 제조를 위해 이용할 수 있다(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)). 유사하게는, 인간 항체는 형질전환(transgenic) 동물, 예를 들어 내재적 면역글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전하게 불활성화되어 있는 마우스 내로 인간 면역글로불린 유전자 좌(loci)의 도입에 의해 만들어질 수 있다. 유발(challenge)을 통해 인간 항체 생성이 관찰되며, 이는 유전자 재배열(gene rearrangement), 어셈블리(assembly) 및 항체 레퍼토리(antibody repertoire)를 포함하는 모든 사항들에서 보여지는 것과 거의 흡사하다. 이 접근법은 예를 들어, U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 및 아래의 과학 간행물들(Marks et al., Bio/Technology 10,: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); and Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995))에 설명되어 있다.
SYNJ2의 하향조절은 또한 RNA 침묵(silencing)에 의해 달성될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 문구 "RNA 침묵(RNA silencing)"은 대응하는 단백질-코딩 유전자의 발현을 억제하거나 "침묵시키는(silencing)" RNA 분자에 의해 매개된 조절 메커니즘(예를 들어, RNA 간섭(RNA interference, RNAi), 전사적 유전자 침묵(transcriptional gene silencing, TGS), 전사후 유전자 침묵(post-transcriptional gene silencing, PTGS), 진압(quelling), 동시억제(co-suppression) 및 번역 억제(translational repression))의 군을 말한다. RNA 침묵은 식물, 동물 및 진균을 포함하는 많은 형태의 생물체에서 관찰되어 왔다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "RNA 침묵화 물질(RNA silencing agent)"은 표적 유전자의 발현을 특별히 억제하거나 "침묵시킬" 수 있는 RNA를 말한다. 어떤 구현에서, RNA 침묵화 물질은 전사후 침묵 메커니즘을 통하여 mRNA 분자의 완전한 프로세싱(예를 들어, 완전한 번역 및/또는 발현)을 방지할 수 있다. RNA 침묵화 물질은 논코딩(noncoding) RNA 분자, 예를 들어 그러한 작은 논-코딩 RNA가 생성될 수 있는 전구체 RNA들뿐만 아니라 쌍을 이룬(paired) 가닥들을 포함하는 RNA 듀플렉스(duplexes)도 포함한다. 대표적인 RNA 침묵화 물질은 siRNAs, miRNAs 및 shRNAs와 같은 dsRNAs를 포함한다. 일 구현에서, RNA 침묵화 물질은 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 다른 구현에서, RNA 침묵화 물질은 번역 억제를 매개할 수 있다.
본 발명의 구현에 따르면, RNA 침묵화 물질은 표적 RNA(예를 들어, SYNJ2)에 특이적이며, 표적 유전자에 대해 99% 또는 그보다 적은 전역 상동성(global homology), 예를 들어, 표적 유전자에 대해 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%보다 적은 전역 상동성을 나타내는 유전자 또는 스플라이싱 변이체(splice variant)를 교차(cross) 억제하거나 침묵시키지 않는다.
RNA 간섭은 작은 간섭 RNAs(short interfering RNAs, siRNAs)에 의해 매개된 동물에서의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵의 프로세스를 말한다. 식물에서의 대응하는 프로세스는 흔히 전사후 유전자 침묵 또는 RNA 침묵으로 일컬어지며, 진균에서는 진압(quelling)으로도 일컬어진다. 전사후 유전자 침묵의 프로세스는 외래 유전자의 발현을 방지하기 위해 사용되는 진화적으로-보존된(evolutionarily-conserved) 세포 방어 메커니즘으로 여겨지며, 보통 다양한 식물상(flora) 및 생물족(phyla)에 의해 공유된다. 이러한 외래 유전자 발현으로 만들어진 방어는 바이러스 감염으로부터 또는 동족의 단일-가닥 RNA 또는 바이러스 게놈 RNA를 특이적으로 파괴하는 세포적 반응을 통해 숙주 게놈 내로의 트랜스포존 요소(transposon elements)의 랜덤 통합으로부터 유래된 이중-가닥 RNAs(double-stranded RNAs, dsRNAs)의 생성에 대한 반응으로 진화될 수 있다.
세포에서의 긴 dsRNA들의 존재는 다이서(dicer)로 불리는 리보뉴클레아제 III(ribonuclease III) 효소의 활성을 자극한다. 다이서는 작은 간섭 RNA(siRNAs)로 알려져 있는 dsRNA의 작은 조각들 내로의 dsRNA의 프로세싱에 관련되어 있다. 다이서 활성으로부터 유래된 작은 간섭 RNA들은 전형적으로 약 21 내지 약 23 뉴클레오티드 길이이고, 약 19 염기쌍의 듀플렉스를 포함한다. RNAi 반응은 또한 엔도뉴클레아제 복합체(endonucleae complex)를 특징으로 하고, 보통 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)로 칭하며, 그것은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 가지는 단일-가닥 RNA의 절단을 매개한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 듀플렉스의 안티센스 가닥에 상보적인 부위의 중간에서 일어난다.
따라서, 본 발명의 몇몇 구현은 mRNA로부터의 단백질 발현을 하향조절하기 위한 dsRNA의 사용을 고려한다.
일 구현에 따르면, dsRNA는 30 bp보다 크다. 긴 dsRNA(즉, 30 bp보다 큰 dsRNA)의 사용은 이들 이중 가닥 RNA의 긴 부위가 인터페론 및 PKR 반응을 유도하게 될 것이라고 믿어지기 때문에 매우 제한적이었다. 그러나, 긴 dsRNA의 사용은 수많은 siRNA들을 시험할 필요성을 덜어주는 최적의 침묵 서열을 선택할 수 있게 하는데 있어서 많은 이점을 제공할 수 있고; 긴 dsRNA들은 침묵 라이브러리가 siRNA에 필수적일 수 있는 복잡성을 덜 가질 수 있게 해주며, 그리고 아마도 가장 중요하게는, 긴 dsRNA는 치료제로서 사용될 때 바이러스 탈출성 변이(viral escape mutations)를 방지할 수 있다.
다양한 연구들이 긴 dsRNA들이 스트레스 반응을 유도하거나 현저한 약물부작용(off-target effect)을 야기하는 일 없이 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있다는 것을 입증하였다 - 예를 들어, 스트라트 등을 참조하라(Strat et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 13 3803-3810; Bhargava A et al. Brain Res. Protoc. 2004;13:115-125; Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003;13:381-392; Paddison P.J., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002;99:1443-1448; Tran N., et al., FEBS Lett. 2004;573:127-134).
특히, 그것의 몇몇 구현에 따른 본 발명은 인터페론 경로가 활성화되지 않은 세포(예를 들어, 배아세포(embryonic cell) 및 난모세포(oocytes))에서의 유전자 침묵을 위한 긴 dsRNA(30 bp 이상의 전사체)의 도입을 고려하며, 예를 들어, 빌리 등을 참고하라(Billy et al., PNAS 2001, Vol 98, pages 14428-14433 and Diallo et al, Oligonucleotides, October 1, 2003, 13(5): 381-392. doi:10.1089/154545703322617069).
그것들의 몇몇 구현에 따른 본 발명은 또한 유전자 발현을 하향조절하기 위해 인터페론 및 PKR 경로를 유도하지 않도록 특별히 설계된 긴 dsRNA의 도입을 고려한다. 예를 들면, 시나가와 및 이시이(Shinagwa and Ishii, Genes & Dev . 17 (11): 1340-1345, 2003)는 RNA 폴리머라아제 II(Pol II) 프로모터로부터 긴 이중-가닥 RNA를 발현하기 위해 pDECAP라 명명된 벡터를 개발하였다. pDECAP로부터의 전사체는 ds-RNA를 세포질로 내보낼 수 있게 하는 5'-캡(cap) 구조 및 3'-폴리(A) 꼬리(poly(A) tail)가 모두 결여되어 있기 때문에, pDECAP로부터의 긴 ds-RNA는 인터페론 반응을 유도하지 않는다.
포유동물계에서 인터페론 및 PKR 경로를 회피하는 다른 방법은 형질감염 또는 내재적 발현 중 하나를 통한 작은 간섭 RNA(siRNAs)의 도입에 의한 것이다.
용어 "siRNA"는 RNA 간섭(RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제성 RNA 듀플렉스(small inhibitory RNA duplexex)(일반적으로, 18-30 염기쌍 사이)를 말한다. 비록 25-30 염기 길이의 화학적으로 합성된 RNA 듀플렉스가 동일 위치에서 21mer와 비교하여 효능에 있어서 100배 정도를 증가시킬 수 있음이 최근 알려졌으나, 전형적으로 siRNA는 중앙의 19 bp의 듀플렉스 부위 및 말단(termini)에 있는 대칭적(symmetric) 2-염기 3'-돌출부(overhangs)와 함께 21mer로서 화학적으로 합성된다. RNAi를 유발하는데 더욱 긴 RNA들을 사용하여 얻어진 관찰된 증가된 효능은 생성물(21mer) 대신 기질(27mer)을 사용하여 다이서를 만들어내는 것에 대한 이론을 제시하며, 이것은 RISC 내로의 siRNA의 진입(entry)의 속도 또는 효율을 향상시킨다.
3'-돌출부의 위치는 siRNA의 효능에 영향을 주며, 안티센스 가닥에 3'-돌출부를 가지는 비대칭 듀플렉스는 일반적으로 센스 가닥에 3'-돌출부를 가지고 있는 것들보다 더 강력하다(Rose et al., 2005). 안티센스 전사체를 표적으로 할 때 정반대의 효능 패턴이 관찰되기 때문에, 이는 비대칭 가닥의 RISC로의 로딩(loading)에 기인한다고 여겨진다.
이중-가닥 간섭 RNA(예를 들어, siRNA)의 가닥들은 헤어핀 또는 스템 루프(stem loop)를 형성하도록 연결될 수 있다. 따라서, 언급한 바와 같은 본 발명의 몇몇 구현의 RNA 침묵화 물질은 또한 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)일 수 있다.
작은 간섭 RNA 분자들의 예는 SYNJ2의 암호화 부위(coding region) 1612-1633 또는 4925-4946에 대한 siRNA를 교시하고 있는 추앙 등(Chuang et al. (supra) SJ2-1 (coding region 1612-1633; 5´AACGTGAACGGAGGAAAGCAG, SEQ ID NO: 3), SJ2-2 (region 5419-5440 in the 3 untranslated region; 5′CTCTTGCTGATACGCGATATT, SEQ ID NO: 4)) 또는 러스크 등(Curr Biol. 2003 Apr 15;13(8):659-63. Erratum in: Curr Biol. 2003 Sep 30;13(19):1746)에서 발견할 수 있다.
SYNJ2 mRNA 레벨을 성공적으로 하향조절하는 siRNA 서열의 다른 예는 GAAGAAACAUCCCUUUGAU (SEQ ID NO: 5) 및 GGACAGCACUGCAGGUGUU (SEQ ID NO: 6)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "shRNA"는 상보적 서열의 제1부위 및 제2부위를 포함하는 스템-루프 구조를 가지는 RNA 물질을 말하며, 상기 부위들의 상보성의 정도 및 방향은 상기 부위들 사이에 염기쌍이 형성되기에 충분하고, 상기 제1 및 제2부위는 루프 부위에 연결되며, 상기 루프는 상기 루프 부위 내에 있는 뉴클레오티드들(또는 뉴클레오티드 유사체) 사이의 염기쌍의 결여에서 비롯된다. 루프 내의 뉴클레오티드의 수는 3 내지 23, 또는 5 내지 15, 또는 7 내지 13, 또는 4 내지 9, 또는 9 내지 11 사이 및 이를 포함하는 수이다. 루프 내의 몇몇의 뉴클레오티드들은 루프 내의 다른 뉴클레오티드들과의 염기쌍 상호작용에 관련될 수 있다. 루프를 형성하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, T. R. et al. (2002) Science 296: 550) 및 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454)을 포함한다. 그 결과 생성된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드는 RNAi 기구(machinery)와 상호작용할 수 있는 이중-가닥 부위를 포함하는 스템-루프 또는 헤어핀 구조를 형성한다는 것은 당업자들에게 인식될 수 있을 것이다.
SYNJ2 mRNA 레벨을 성공적으로 하향조절하는 shRNA 서열의 예는 CCGGCCTACGATACAAGCGACAAATCTCGAAGATTTGTCGCTTGTATCGTAGGTTTTTG (SEQ ID NO: 7); CCGGCGAGAGGAGATCATTCGGAAACTCGAGTTTCCGAATGATCTCCTCTCGTTTTTG (SEQ ID NO: 8); CCGGCCGGAAGAACAGTTTGAGCAACTCGAGTTGCTCAAACTGTTCTTCCGGTTTTTG (SEQ ID NO: 9)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 몇몇 구현과 함께 사용하기에 적합한 RNA 침묵화 물질의 합성은 아래와 같이 얻어질 수 있다. 첫째로, SYNJ2 mRNA 서열을 AA 디뉴클레오티드 서열에 대하여 AUG 시작 코돈의 하류쪽(downstream)으로 스캔한다. 각 AA 및 3'에 인접한 19개 뉴클레오티드의 발생을 잠재적인 siRNA 표적 부위로 기록한다. 바람직하게는, 비번역 부위(untranslated regions, UTRs)는 조절 단백질 결합 부위에 더 많이 존재하기 때문에, siRNA 표적 부위는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)으로부터 선택한다. UTR-결합 단백질 및/또는 번역 개시 복합체(translation initiation complexes)는 siRNA 엔도뉴클라아제 복합체의 결합을 방해할 수 있다(Tuschl ChemBiochem. 2:239-245). 그러나 GAPDH에 대해 입증된 바와 같이 비번역 부위를 대상으로 하는 siRNA들도 얻을 수 있음을 잘 알 수 있을 것이며, 여기에서 siRNA는 약 90%의 세포 GAPDH mRNA의 감소를 매개하고, 단백질의 레벨이 완전히 사라진 5' UTR을 대상으로 한다(wwwdotambiondotcom/techlib/tn/91/912dothtml).
둘째로, 잠재적 표적 부위들을 NCBI 서버(wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/)로부터 입수 가능한 BLAST 소프트웨어와 같은 임의의 서열 정렬 소프트웨어를 사용하여, 적합한 유전체 데이터베이스(예를 들어, 인간, 마우스, 쥐 등)와 비교한다. 다른 암호화 서열에 현저한 상동성을 나타내는 추정상의(putative) 표적 부위를 걸러낸다.
siRNA 합성을 위한 주형으로 자격을 충족하는(qualilfying) 표적 서열들을 선택한다. 바람직한 서열들은 55%보다 높은 G/C 함량을 가지는 것들과 비교하여 유전자 스플라이싱을 매개하는데 더욱 효과적인 것으로 증명된 것들만큼 낮은 G/C 함량을 포함하는 것들이다. 바람직하게는 평가를 위해 표적 유전자의 길이에 따라 여러 개의 표적 부위를 선택한다. 선택된 siRNA들의 더 나은 평가를 위해, 바람직하게는 음성 대조군을 결합에 사용한다. 음성 대조군 siRNA는 바람직하게는 siRNA로서 동일한 뉴클레오티드 구성(composition)을 포함하지만, 유전체에 대한 상동성은 상당히 부족하다. 따라서, 임의의 다른 유전자에 대해 어떠한 현저한 상동성도 보이지 않는다면, 바람직하게는 스크램블된 siRNA의 뉴클레오티드 서열을 사용한다.
본 발명의 몇몇 구현의 RNA 침묵화 물질은 RNA만을 포함하는 분자들만으로 한정될 필요는 없으나, 화학적으로-변경된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 더 포함한다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
몇몇 구현에서, 본원에서 제공되는 RNA 침묵화 물질은 "세포-투과 펩티드(cell-penetrating peptide)"와 기능적으로 관련될 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 "세포-투과 펩티드"는 짧은(약 12-30 잔기) 아미노산 서열, 또는 세포의 원형질막(plasma membrane) 및/또는 핵막(nuclear membrane)을 가로지르는 막-투과성 복합체(membrane-permeable complex)의 수송과 관련된 에너지-의존적(즉, 비-엔도시토시스성(non-endocytotic)) 전좌 특성을 부여하는 기능적 모티프(functional motif)를 포함하는 펩티드이다. 본 발명의 몇몇 구현의 막-투과성 복합체에 사용된 세포-투과 펩티드는 바람직하게는 적어도 하나의 비기능적 시스테인 잔기를 포함하며, 이황화 결합을 위해 변경된 이중-가닥 리보핵산(ribonucleic acid)과 이황화 결합을 자유롭게 형성하거나 형성하도록 유도된다. 이러한 특성을 부여하는 대표적인 아미노산 모티프는 그 내용이 참조로서 본원에 특별히 포함되는 U.S. Pat. No. 6,348,185에 열거되어 있다. 본 발명의 몇몇 구현의 세포-투과 펩티드는 바람직하게는 페네트라틴(penetratin), 트랜스포탄(transportan), pIsl, TAT(48-60), pVEC, MTS 및 MAP를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
RNA 침묵화 물질을 사용하여 표적화될 mRNA는 그것의 발현이 원하지 않는 형질(phenotypic trait)과 관련이 있는 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 표적이 될 수 있는 예시적 mRNA는 절단된(truncated) 단백질을 암호화하는(즉, 결실(deletion)을 포함하는) 것들이다. 따라서, 본 발명의 몇몇 구현들의 RNA 침묵화 물질은 결실의 양쪽에 있는 가교(bridging) 부위를 표적으로 할 수 있다. 이러한 RNA 침묵화 물질의 세포 내로의 도입은 변이된 단백질의 하향조절을 야기할 수 있는 반면, 남아 있는 변이되지 않은 단백질은 영향을 받지 않을 것이다.
다른 구현에 따르면, RNA 침묵화 물질은 miRNA일 수 있다.
용어 "마이크로RNA(microRNA)", "miRNA" 및 "miR"은 동의어이며, 약 19-28 뉴클레오티드 길이의 비암호화 단일-가닥 RNA 분자의 집합을 말하며, 유전자 발현을 조절한다. miRNA들은 광범위한 생물체들(바이러스, 인간)에서 발견되며, 발달, 항상성 및 질병의 발생원인(etiology)에서 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
아래는 miRNA 활성 메커니즘의 간단한 설명이다.
miRNA를 암호화하는 유전자는 번역되어 pri-miRNA로 알려진 miRNA 전구체를 생산한다. pri-miRNA는 전형적으로 다중의 pri-miRNA들을 포함하는 폴리시스트론성(polycistronic) RNA의 일부분이다. pri-miRNA는 스템 및 루프와 함께 헤어핀을 형성할 수 있다. 상기 스템은 미스매치(mismatched) 염기를 포함할 수 있다.
pri-miRNA의 헤어핀 구조는 RNase III 엔도유클라아제인 드로샤(Drosha)에 의해 인지된다. 드로샤는 전형적으로 pri-miRNA에 있는 말단 루프(terminal loop)를 인지하며, pre-miRNA로 알려진 60-70 뉴클레오티드의 전구체를 생성하기 위해 스템으로 바뀌는 대략 두 개의 나선(helical)을 절단한다. 드로샤는 5' 말단의 인산기(phosphate) 및 ~ 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부를 사용하여 pre-miRNA 스템 루프를 만들어내는 전형적인 RNase III 엔도유클라아제의 엇갈린 절단(staggered cut)으로 pri-miRNA를 절단한다. 드로샤 절단 부위 너머까지 미치는 스템의 대략 하나의 나선의 회전(helical turn)(~10 뉴클레오티드)은 효율적인 프로세싱에 필수적이다. 그 후, pre-miRNA는 Ran-GTP 및 운반(export) 수용체 엑스포틴-5(Ex-portin-5)에 의해 핵에서 세포질로 활발하게 수송된다.
그 후, pre-miRNA의 이중-가닥의 스템은 또한 RNase III 엔도뉴클레아제인 다이서에 의해 인지된다. 다이서도 스템 루프의 염기에서 5' 말단의 인산기 및 3' 돌출부를 인지한다. 그 후, 다이서는 추가의 5' 말단의 인산기 및 ~ 2개의 뉴클레오티드 3' 돌출부를 남기는 스템 루프의 염기를 떠나서 말단 루프의 2개의 나선의 회전을 절단한다. 그 결과 생성된 미스매치를 포함할 수 있는 siRNA-유사 듀플렉스는 성숙한 miRNA와 miRNA*로 알려진 유사한 크기의 단편을 포함한다. miRNA와 miRNA*은 pri-miRNA 및 pre-miRNA의 서로 다른쪽 암(arm)으로부터 유래될 수 있다. miRNA* 서열은 클로닝된 miRNA의 라이브러리에서 찾을 수 있으나, 전형적으로 miRNA들보다는 빈도가 낮다.
비록 처음에 miRNA*를 가진 이중-가닥 종으로서 존재한다 할지라도, miRNA는 최종적으로 RNA-유도성 침묵 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)로 알려진 리보뉴클레오단백질 복합체 내로 단일-가닥 RNA로서 통합되어진다. 다양한 단백질들이 RISC를 형성할 수 있으며, 이는 miRNA/miRNA* 듀플렉스, 표적 유전자의 결합 부위, miRNA의 활성(억제 또는 활성화)에 대한 특이성(specificity)에 가변성을 부여할 수 있고, miRNA/miRNA* 듀플렉스의 가닥은 RISC 안으로 로딩된다.
miRNA:miRNA* 듀플렉스의 miRNA 가닥이 RISC 안으로 로딩될 때, miRNA*는 제거되고 분해된다. RISC 안으로 로딩된 miRNA:miRNA* 듀플렉스의 가닥은 5' 말단이 덜 철저하게 쌍을 이룬(less tightly paired) 가닥이다. miRNA:miRNA*의 양쪽 말단 모두가 대략 동등하게 5' 페어링(pairing)을 가지는 경우에, miRNA 및 miRNA* 모두 유전자 침묵 활성을 가질 수 있다.
RISC는 miRNA와 mRNA 간의 높은 상보성 레벨에 기초하여, 특히 뉴클레오티드 2-7의 miRNA에 의해 표적 핵산을 확인한다.
수많은 연구들이 번역의 효과적인 억제를 달성하기 위한 miRNA와 그것의 mRNA 표적 간의 염기쌍 필요조건을 검토하여 왔다(reviewed by Bartel 2004, Cell 116-281). 포유동물의 세포에서, miRNA의 처음 8개의 뉴클레오티드는 중요할 수 있다(Doench & Sharp 2004 GenesDev 2004-504). 그러나, 마이크로RNA의 다른 부분 또한 mRNA 결합에 관여할 수 있다. 더욱이, 3' 말단에서의 충분한 염기 페어링은 5' 말단에서의 불충분한 페어링을 보충할 수 있다(Brennecke et al, 2005 PLoS 3-e85). 전체 유전체에 결합하는 miRNA를 분석하는 수치해석적 연구는 표적 결합에서 miRNA의 5' 말단에서의 염기 2-7에 대한 특이적 역할을 시사하였으나, 주로 "A"인 것으로 알려진 첫 번째 뉴클레오티드의 역할 또한 밝혀졌다(Lewis et at 2005 Cell 120-15)). 유사하게는, 뉴클레오티드 1-7 또는 2-8은 크렉 등에 의해 표적을 확인하고 입증하는데 사용되었다(Krek et al., 2005, Nat Genet 37-495).
mRNA에서의 표적 부위는 5' UTR, 3' UTR에 있거나, 암호화 부위에 있을 수 있다. 흥미롭게도, 다중 miRNA들은 동일하거나 다수의 부위들을 인지함으로써 동일한 mRNA 표적을 조절할 수 있다. 가장 많이 유전적으로 확인된 표적들에서의 다중 miRNA 결합 부위의 존재는 다중 RISC들의 협동 작업이 가장 효과적인 번역 억제를 제공한다는 것을 나타낼 수 있다.
miRNA는 두 개의 메커니즘: mRNA 절단 또는 번역 억제 중 하나에 의해 RISC가 유전자 발현을 하향조절하도록 유도할 수 있다. mRNA가 miRNA에 대해 어느 정도의 상보성을 가지고 있다면, miRNA는 mRNA를 특이적으로 절단할 수 있다. miRNA가 절단할 때, 자르는 부분(cut)은 전형적으로 뉴클레오티드 페어링에서 miRNA의 잔기 10 및 11 사이이다. 대안적으로, miRNA가 miRNA에 대해 필요한 정도의 상보성을 가지고 있지 않다면, miRNA는 번역을 억제할 수 있다. 동물들은 miRNA와 결합 부위 사이에 더욱 낮은 정도의 상보성을 가질 수 있으므로, 번역 억제는 동물들에서 더욱 일반적일 수 있다.
miRNA 및 miRNA*의 임의의 쌍의 5' 및 3' 말단에 가변성이 있을 수 있음에 유의하여야만 한다. 이 가변성은 절단 부위와 관련된 드로샤와 다이서의 효소 프로세싱에 있어서의 가변성 때문일 것이다. miRNA 및 miRNA*의 5' 및 3' 말단에서의 가변성은 또한 pri-miRNA 및 pre-miRNA의 스템 구조에서의 미스매치 때문일 수도 있다. 스템 가닥의 미스매치는 서로 다른 헤어핀 구조의 집단을 생성시킬 수 있다. 스템 구조에서의 가변성은 또한 드로샤와 다이서에 의한 절단 생성물에도 가변성을 줄 수 있다.
용어 "마이크로RNA 모방체(microRNA mimic)"는 RNAi 경로에 들어가 유전자 발현을 조절할 수 있는 합성 비암호화 RNA를 말한다. miRNA 모방체는 내재적 마이크로RNA들(miRNAs)의 기능을 모방하고, 성숙한 이중가닥 분자 또는 모방 전구체(예를 들어, 또는 pre-miRNAs)로서 설계될 수 있다. miRNA 모방체는 변경된 또는 변경되지 않은 RNA, DNA, RNA-DNA 하이브리드 또는 대안적인 핵산 화합물(nucleic acid chemistries)(예를 들어, LNAs 또는 2'-O,4'-C-에틸렌-가교 핵산(2'-O,4'-C-ethylene-bridged nucleic acid(ENA))로 이루어질 수 있다. 성숙한 이중가닥 miRNA 모방체에 대하여, 듀플렉스 부위의 길이는 13-33, 18-24 또는 21-23의 뉴클레오티드 사이로 다를 수 있다. miRNA는 또한 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 40개의 뉴클레오티드를 전부 포함할 수 있다. miRNA의 서열은 pre-miRNA의 처음 13-33의 뉴클레오티드일 수 있다. miRNA의 서열은 또한 pre-miRNA의 마지막 13-33의 뉴클레오티드일 수 있다.
miRNA와 암세포를 접촉시키는 것은 다수의 방식으로 이루어질 수 있음은 상기 본원에 제공된 설명으로부터 이해될 수 있을 것이다:
1. 성숙한 이중가닥 miRNA로 암세포를 일시적으로 형질감염시킨다.
2. 성숙한 miRNA를 암호화하는 발현 벡터로 암세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킨다.
3. pre-miRNA를 암호화하는 발현 벡터로 암세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킨다. 상기 pre-miRNA 서열은 45-90, 60-80 또는 60-70까지의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 pre-miRNA의 서열은 본원에 제시한 바와 같은 miRNA 및 miRNA*를 포함할 수 있다. 상기 pre-miRNA의 서열은 또한 pri-miRNA의 5' 및 3' 말단으로부터 0-160의 뉴클레오티드를 제외한 pri-miRNA의 것일 수 있다.
4. pri-miRNA를 암호화하는 발현 벡터로 암세포를 안정하게 또는 일시적으로 형질감염시킨다. 상기 pri-miRNA 서열은 45-30,000, 50-25,000, 100-20,000, 1,000-1,500 또는 80-100 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 pri-miRNA의 서열은 또한 본원에 제시한 것과 같은 pre-miRNA, miRNA와 miRNA* 및 그것들의 변이체를 포함할 수 있다.
SYNJ2를 하향조절할 수 있는 다른 약제는 SYNJ2의 mRNA 전사체 또는 DNA 서열을 특이적으로 절단할 수 있는 DNA 효소(DNAzyme) 분자이다. DNA 효소는 단일 및 이중가닥의 표적 서열 모두를 절단할 수 있는 단일-가닥 폴리뉴클레오티드이다(Breaker, R.R. and Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262). DNA 효소에 대한 일반적인 모델("10-23" 모델)이 제안되어 있다. "10-23" DNA 효소는 각각 7 내지 9의 데옥시리보뉴클레오티드의 두 개의 기질-인식(substrate-recognition) 도메인의 옆에 위치하는 15 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매 도메인(catalytic domain)을 가진다. 이런 형태의 DNA 효소는 퓨린:피리미딘 접합부(junctions)에서 그것의 기질 RNA를 효과적으로 절단할 수 있다(Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199; for rev of DNAzymes see Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)).
단일 및 이중-가닥의 표적 절단 부위를 인식하는 합성, 조작된 DNA 효소의 제작 및 증폭의 예는 조이스 등(Joyce et al.,)의 U.S. Pat. No. 6,326,174에 기술되어 있다. 인간 유로키나아제(Urokinase) 수용체를 향하도록 유도된 유사한 디자인의 DNA 효소는 최근 유로키나아제 수용체 발현을 억제하며, 생체 내에서 결장암 세포 전이를 성공적으로 억제하는 것으로 관찰되었다(Itoh et al, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgtdotorg). 다른 적용에서, bcr-ab1 발암유전자(oncogene)에 상보적인 DNA 효소는 백혈병 세포에서의 발암유전자의 발현을 억제하고, 만성 골수성 백혈병(CML) 및 급성 림프구성 백혈병(ALL) 발생시 자가 골수이식(autologous bone marrow transplant)에서의 재발률(relapse rate)을 줄이는데 성공하였다.
SYNJ2의 하향조절은 또한 SYNJ2를 암호화하는 mRNA 전사체와 특이적으로 혼성화될 수 있는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 사용하여 이루어질 수 있다.
SYNJ2를 효과적으로 하향조절하기 위해 사용될 수 있는 안티센스 분자의 디자인은 안티센스 접근법(approach)에 중요한 두 가지 양상을 고려하여 만들어져야만 한다. 첫 번째 양상은 적합한 세포의 세포질 내로의 올리고뉴클레오티드의 운반이며, 두 번째 양상은 그것의 번역을 억제하는 방식으로 세포 내에서 지정된(designated) mRNA에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드의 디자인이다.
선행 기술은 매우 다양한 세포 형태들 내로 올리고뉴클레오티드를 효과적으로 운반하는데 사용될 수 있는 다수의 운반 전략들을 교시하고 있다(예를 들어, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett et al. Blood 91: 852-62 (1998); Rajur et al. Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997); Lavigne et al. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) and Aoki et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)을 참조).
게다가, 표적 mRNA와 올리고뉴클레오티드 양쪽 모두에서의 구조적 변경(alteration)의 에너지론을 설명하는 열역학적 사이클에 기초하여 그것들의 표적 mRNA에 대해 가장 높게 예측된 결합 친화성(binding affinity)를 가지는 서열들을 확인하기 위한 알고리즘도 이용할 수 있다(예를 들어, Walton et al. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)를 참조).
이러한 알고리즘은 세포에서의 안티센스 접근법을 시행하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 예를 들면, 월튼 등에 의해 개발된 알고리즘 덕분에 과학자들은 토끼 베타-글로빈(rabbit beta-globin, RBG)에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 마우스 종양 괴사 인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF alpha) 전사체를 성공적으로 설계할 수 있었다. 같은 연구 그룹은 최근에 역학(kinetic) PCR 기술에 의해 평가된 것으로서 세포 배양액에서 3개의 모델 표적 mRNA들(인간 락테이트 디하이드로게나아제(lactate dehydrogenase) A 및 B 및 쥐의 gp130)에 대해 합리적으로 선택된 올리고뉴클레오티드의 안티센스 활성이 포스포디에스테르(phosphodiester) 및 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 올리고뉴클레오티드 화합물을 이용하는 두 개의 세포 형태에서의 세 개의 서로 다른 표적에 대한 테스트를 포함하는 거의 모든 경우에서 효과적인 것으로 드러났다고 보고하였다.
게다가, 시험관 내 시스템을 사용하는 특정 올리고뉴클레오티드의 효율성을 설계하고 예측하기 위한 몇몇의 접근법들 또한 공개되어 있다(Matveeva et al., Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)).
예를 들어, (SYNJ2 단백질을 암호화하는) SYNJ2 mRNA를 표적으로 하는 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기의 서열들 중 하나일 수 있다: CCCTTTGTCTGCCACCTCCT (SEQ ID NO: 10), ACCCATCTTGCTCTCTCCC (SEQ ID NO: 11) and TCTTCCTCCACCACAGCACC (SEQ ID NO: 12).
몇몇의 임상시험들은 안티센스 올리고뉴클레오티드의 안정성, 가능성 및 활성을 입증하였다. 예를 들면, c-myb 유전자, p53 및 Bcl-2를 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 통한 혈액 악성종양(hematological malignancies)의 치료가 임상시험에 들어가 환자들에 의해 받아들여지는 것으로 드러나는 동안(Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306 (1999)), 암을 치료하는데 적합한 안티센스 올리고뉴클레오티드가 성공적으로 사용되어 오고 있다(Holmund et al., Curr Opin Mol Ther 1:372-85 (1999)).
보다 최근에, 인간 헤파라나아제(heparanase) 유전자 발현의 안티센스-매개성 억제는 마우스 모델에서 인간 암 세포의 흉막 파종(pleural dissemination)을 억제하는 것으로 보고되었다(Uno et al., Cancer Res 61:7855-60 (2001)).
따라서, 현재의 여론은 상기 기술한 바와 같이 매우 정확한 안티센스 설계 알고리즘 및 매우 다양한 올리고뉴클레오티드 운반 시스템의 생성으로 이어지는 안티센스 기술 분야의 최근의 발전이 당업자들이 과도한 시행착오 실험에 의지할 필요없이 공지 서열의 발현을 하향조절하는데 적합한 안티센스 접근법을 설계하고 시행할 수 있게 한다는 것이다.
SYNJ2를 하향조절할 수 있는 다른 약제는 SYNJ2를 암호화하는 mRNA 전사체를 특이적으로 절단할 수 있는 리보자임(ribozyme) 분자이다. 리보자임은 점점 더 관심 단백질을 암호화하는 mRNA의 절단에 의한 유전자 발현의 서열-특이적(sequence-specific) 억제를 위해 사용되고 있다(Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)). 임의의 특정 표적 RNA를 절단하도록 리보자임을 설계할 수 있는 가능성은 그것들을 기초 연구 및 치료학적 적용 양쪽 모두에 있어서 유용한 도구가 되도록 만들었다. 치료 영역에서, 리보자임은 감염성 질병에서의 표적 바이러스 RNA들, 암에서의 우성 종양 유전자(dominant oncogenes) 및 유전성 질환에서의 특정 체세포 돌연변이(somatic mutations)에 이용되어 오고 있다(Welch et al., Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)). 무엇보다도 특히, HIV 환자들을 위한 몇몇의 리보자임 유전자 치료 프로토콜이 이미 제1상 임상시험(Phase 1 trials)에 들어갔다. 보다 최근에, 리보자임은 형질전환 동물, 유전자 표적 검증(validation) 및 경로의 해명(pathway elucidation)을 위해 사용되고 있다. 몇몇의 리보자임들이 다양한 임상시험 단계에 있다. ANGIOZYME은 인간 임상시험에서 연구된 첫 번째 화학적으로 합성된 리보자임이다. ANGIOZYME은 신생혈관형성(angiogenesis) 경로에서의 중요 성분인 혈관 내피 성장인자 수용체(vascular endothelial growth factor receptor, VEGR-r)의 형성을 특이적으로 억제한다. 다른 회사들뿐만 아니라 리보자임 제약회사(Ribozyme Pharmaceuticlas, Inc.,)도 동물 모델에서 항신생혈관형성 치료법의 중요성을 입증하였다. C형 간염 바이러스(Hepatitis C Virus, HCV)의 RNA를 선택적으로 파괴하도록 설계된 리보자임인 HEPTAZYME는 세포 배양 검정법에서 C형 간염 바이러스 RNA를 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다(Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB home page).
SYNJ2를 하향조절할 수 있는 다른 약제는 SYNJ2에 결합하고/하거나 SYNJ2를 절단하는 임의의 분자일 수 있다.
현재의 교시들은 세포 운동성(cellular motility)에서 SYNJ2의 역할의 기본이 되는 일반적인 메커니즘을 밝혔다.
그 원리를 도 15에 나타내었다. 따라서, 핵심적인 사건(key event)은 SYNJ2의 EGF-유도성 상향조절 및 그 결과에 따른 세 가지 포스포이노시티드의 감소를 수반한다: PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 and PI(3,5)P2. SYNJ2-매개성 PI(4,5)P2의 탈인산화는 포스포리파아제 C-감마에 의한 PI(4,5)P2의 분해 및 PI3K에 의한 인산화에 의해 평행이 되고, PI(3,4,5)P3를 생성한다. 총괄적으로, EGF에 의한 세 가지 효소의 자극은 원형질막으로부터 PI(4,5)P2 바인더 그룹을 분리시키며, 또한 PI(4,5)P2가 전혀 없는(PI(4,5)P2-devoid) 세포내 소포(endocytic vesicle)를 생성한다. 동시에, SYNJ2는 PI(3,4,5)P3를 PI(3,4)P2로 전환하며, 이것은 침습위족의 형성에 필수적이다. 일단 준비가 되면, PI(3,4)P2는 TKS5와 결합하고, 코필린이 침습위족 내에서 액틴의 반화살촉 말단(barbed end)을 생성할 수 있게 하는 다이나민(Dynamin) 및 코르탁틴-중심 복합체(Cortactin-centered complex)를 핵 주위에 모은다. 본 발명의 결과에 따르면, SYNJ2는 또한 다음의 침습위족 성숙 단계, 즉 MMP의 분비 및 MT1-MMP 및 CD44와 같은 다른 표면 분자들의 운반에도 관여한다. 유사한 방식으로, SYNJ2는 리딩 에지로의 EGFR과 인테그린의 운반을 조절하고 코필린을 활성화시키는 것으로 보이며, 층상위족 돌출부의 형성을 지시하는 중추적 사건을 조절한다.
이러한 발견들은 추정상의 종양 전이 억제물질인 SYNJ2 억제물질을 확인하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 양상에 따르면, 본 발명은 추정상의 종양 전이 억제물질을 확인하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 시료의 존재하에 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱을 분석하고, 여기에서 상기 시료의 부재하에서의 그것과 비교하여 상기 시료의 존재하에서 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 감소된 프로세싱은 추정상의 종양 전이의 억제물질을 나타낸다.
시료는 생체 분자(단백질, 예를 들어 펩티드 또는 항체, 핵산 분자, 예를 들어 침묵화 물질, 탄수화물, 지질 또는 그것들의 조합) 또는 소분자(예를 들어, 화학 물질)일 수 있다.
상기 방법은 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 이루어질 수 있다. 후자는 세포계(cellular system)에서 또는 무세포계(cell-free system)를 사용하여 시행될 수 있다.
예시적 검정법은 경쟁 검정법(competition assay)에 의한 PI(3,4,5)P3의 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱을 분석하는 것을 포함한다.
따라서, 상기 경쟁 검정법은 PI(3,4)P2에 결합된 PI(3,4)P2 결합 도메인을 포함하는 복합체로부터 PI(3,4)P2 결합 도메인의 변위(displacement)를 테스트한다.
예시적 구현에 따르면, 형광 편광(fluorescence polarization) 경쟁 검정법을 사용하였다. 상기 검정법은 일단 분자가 더 큰 봉쇄(sequestering) 요소(예를 들어, 단백질)와 결합하면 공간에서의 그것들의 움직임은 현저하게 감소된다는 이론에 의존한다. 이 현상은 형광 편광을 분석한 후 샘플의 병렬적이고 수직적인 평면으로부터의 측정을 가능하게 하는 형광 프로브를 사용하여 검출되고 측정될 수 있다. 따라서, 용액 내에서 결합하지 않은 형광 분자는 매우 낮은 편광 판독(readings)을 야기하지만, 이들 분자에 결합하는(봉쇄하는) 검출기(detector)(예를 들어, 결합 단백질)가 용액에 첨가되는 경우, 형광 분자는 용액에서 편광 판독을 증가시키는 한정된 조성물에서 안정화된다.
예를 들면, 상기 검정법은 재조합 SYNJ2 및 그것의 비형광성 기질인 PI(3,4,5)P3과 더불어, PI(3,4)P2 결합 도메인(예를 들어, PH-도메인; 예를 들어, Tapp1 PH 도메인, SEQ ID NOs:15-16) 및 형광성 PI(3,4)P2를 포함할 수 있다. SYNJ2들의 촉매 활성의 생성물은 형광성 PI(3,4)P2를 대체하므로 형광 편광은 감소된다.
특정 구현에 따르면, 상용의 5' PI(3,4,5)P3 포스파타아제 활성 형광 편광 검정법을 사용하였다(예를 들어, Echelon Bioscience, cat. no. K-1400).
특정 구현에 따르면, 시료가 제조되었는지에 상관없이, SYNJ2의 촉매 활성(탈인산화)을 가능하게 하는 조건하에서 SYNJ2 및 기질로서 PI(3,4,5)P3를 포함하는 반응 혼합물을 배양하였다. 상기 시료는 예를 들면, 소분자, 핵산 분자, 펩티드, 항체, 탄수화물 또는 그것들의 조합일 수 있다. 배양 후, PI(3,4)P2 생성물을 포함하는 용액을 PI(3,4)P2 결합 단백질(예를 들어, Tapp1의 PH-도메인, SEQ ID NO:15) 및 형광성 PI(3,4)P2의 혼합물과 혼합하고, 형광 편광을 측정하였다. 이 검정법에서 측정된 편광값은 결합된 형광성 PI(3,4)P2 분자가 SYNJ2의 효소 활성에 의해 생성된 비표지된 PI(3,4)P2로 대체되기 때문에 감소하며, 용액 내에서 비결합된 형광성 PI(3,4)P2 분자의 양은 증가한다. 시료의 존재하에서 형광 편광의 값이 시료의 부재하에서의 값과 비교하여 증가하는 경우에, 시료는 추정상의 SYNJ2 억제물질이다.
일단 확인되면, 항전이성 약물로서 시약의 기능성은 젤라틴-자이모그래피 검정법, 트랜스웰 검정법과 같은 적절한 검정법 및 및 아래에 더 예시될 실험 동물을 사용하여 더 입증된다.
이 방법론을 사용하여, 본 발명은 본 발명의 몇몇 구현에 따라 SYNJ2 억제물질로서 사용될 수 있는 다수의 소분자들을 확인하였다. 이 분자들을 아래 도 19에 묘사하였으며, 실시예 10의 표 2에 나타내었다.
언급한 바와 같이, SYNJ2의 억제물질은 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표며 수용체의 억제물질에 더하여 투여된다. 본 발명의 구현에 따르면, 상기 수용체는 발암 유전자이다.
본 발명의 교시에 따라 표적화될 수 있는 수용체의 예는 EGFR, PDGFR, VEGFR, FGFR 및 ErbB-2와 같은 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)이다.
표적화될 수 있는 다른 표면 분자는 인테그린 매트릭스 메탈로프로테이나아제(integrins matri metalloproteinase, MMPs), 다이나민(dynamin), TKS5 및 CD44를 포함한다.
세포 표면 분자의 억제물질은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 억제물질의 비제한적 리스트를 아래에 제공한다.
따라서, 예를 들어, 발암 유전자로서의 EGFR의 확인은 EGFR을 겨냥하는 항암 치료의 개발로 이어진다.
세툭시맙(cetuximab) 및 파니투무맙(panitumumab)은 단일클론 항체 억제물질의 예이다. 임상 개발에 있는 다른 단일클론은 잘루투무맙(zalutumumab), 니모투주맙(nimotuzumab) 및 마투주맙(matuzumab)이다. 단일클론 항체들은 세포외 리간드 결합 도메인을 차단한다. 결합 부위가 차단되면, 시그널 분자들은 더 이상 거기에 부착할 수 없고, 티로신 키나아제를 활성화시킨다.
다른 방법은 수용체의 세포질 쪽에 있는 EGFR 티로신 키나아제를 억제하기 위하여 소분자를 사용한다. 키나아제의 활성 없이 EGFR은 그 자체를 활성화시킬 수 없고, 그것은 하류쪽 어댑터 단백질(adaptor proteins)의 결합을 위한 전제 조건이다. 표면상으로, 성장을 위해 이 경로에 의존하는 세포에서의 신호전달 연쇄반응(signaling cascade)을 중단시킴으로써, 종양의 증식 및 이동이 줄어든다. 게피티닙(gefitinib), 엘로티닙(erlotinib) 및 라파티닙(lapatinib)(EGFR과 ERBB2가 혼합된 억제물질)은 소분자 키나아제 억제물질의 예이다. 다른 예는 EGFR을 직접적으로 겨냥하는 이레사(Iressa) 및 타쎄바(Tarceva)를 포함한다.
HER2는 단일클론 항체 트라스투주맙(trastuzumab)(허셉틴(Herceptin)으로 판매되고 있음)의 표적이다. 트라스투주맙은 HER2가 과발현된 암에만 효과가 있다. HER2 및 HER3 수용체의 이합체화(dimerization)를 억제하는 다른 단일클론 항체인 페르투주맙(Pertuzumab)은 2012년 6월에 트라스투주맙과 함께 사용하도록 FDA에 의해 승인되었다.
게다가, 뉴백스(NeuVax)(Galena Biopharma)는 HER2를 발현하는 암세포를 겨냥하고 파괴하기 위해 "킬러" T 세포를 겨냥하는 펩티드-기반 면역치료제이다.
HER2의 발현은 에스트로겐 수용체를 통한 신호전달에 의해 조절된다. 에스트로겐 수용체를 통해 작용하는 에스트라디올(estradiol) 및 타목시펜(tamoifen)은 HER2의 발현을 하향조절한다.
본 발명의 교시에 따라 사용될 수 있는 항체의 예들을 아래에 열거하였으며, 어떤 식으로든 한정하고자 하는 것은 아니다.
항체 | 상표명 | 승인 날짜 | 형태 | 표적 | 승인된 치료 |
알렘투주맙(Alemtuzumab) | 캠파스 (Campath) |
2001 | 인간화 | CD52 | 만성 림프성 백혈병 |
베바시주맙(Bevacizumab) | 아바스틴 (Avastin) |
2004 | 인간화 | 혈관 내피 성장인자 |
대장암 |
브렌툭시맙 베도틴 (Brentuximab vedotin) |
애드세트리스 (Adcetris) |
2011 | 키메라 | CD30 | 호지킨성 림프종, 미분화성 대세포 림프종 |
세툭시맙(Cetuximab) | 얼비툭스 (Erbitux) |
2004 | 키메라 | 상피세포 성장인자 수용체 |
대장암 |
젬투주맙 오조가마이신 (Gemtuzumab ozogamicin) |
마일로타그 (Mylotarg) |
2000 | 인간화 | CD33 | 급성 골수성 백혈병 (칼리키아마이신(calicheamicin)과 함께) |
이브리투모맙 튜세탄 (Ibritumomab tiuxetan) |
제발린 (Zevalin) |
2002 | 쥐 | CD20 | 비호지킨성 림프종 (이트륨-90 및 인듐-111과 함께) |
파니투무맙 (Panitumumab) |
벡티빅스 (Vectibix) |
2006 | 인간 | 상피세포 성장인자 수용체 |
대장암 |
리툭시맙(Rituximab) | 리툭산 (Rituxan), 맙테라 (Mabthera) |
1997 | 키메라 | CD20 | 비호지킨성 림프종 |
트라스투주맙 (Trastuzumab) |
허셉틴 (Herceptin) |
1998 | 인간화 | ErbB2 | 유방암 |
본원에 기술된 것과 같은 SYNJ2의 억제인자 및 선택적으로 세포 표면 수용체의 억제물질은 그 자체로(per se) 또는 적절한 담체 또는 첨가제와 함께 혼합된 약제학적 조성물로 대상에게 투여될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 "약제학적 조성물(pharmaceutical compostion)"은 생리학적으로 적합한 담체 및 첨가제와 같은 다른 화학적 성분들과 함께 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 활성 성분의 조제물(preparation)을 말한다. 약제학적 조성물의 목적은 생물체에 합성물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
본원에서 용어 "활성 성분(active ingredient)"은 생물학적 효과를 나타내는(accountable) SYNJ2의 억제인자 (및 선택적으로 세포 표면 수용체의 억제인자)를 말한다.
아래에서, 상호교환적으로 사용될 수 있는 문구 "생리학적으로 허용 가능한 담체(physiologically acceptable carrier)" 및 "약제학적으로 허용 가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 생물체에 현저한 자극을 야기하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 없애지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 보조약은 이러한 문구들 하에 포함된다.
본원에서 용어 "부형제(excipient)"는 활성 성분의 투여를 더 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 비활성 물질을 말한다. 제한 없이, 부형제의 예는 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 다양한 당 및 전분의 형태, 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycols)을 포함한다.
약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 참조로서 본원에 포함되는 "레밍턴의 약학"에서 찾을 수 있다("Remington's Pharmaceutical Sciences." Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition).
투여의 적절한 방법은 예를 들어, 경구(oral), 직장(rectal), 점막관통(transmucosal), 특히 척추강내(intrathecal), 직접적인 심실내(intraventricular), 심장내(intracardiac), 예를 들어 오른쪽 또는 왼쪽 심실강(ventricular cavity) 내로, 주간부 관상동맥(common coronary artery) 내로, 정맥내(intravenous), 복강내(intraperitoneal), 비강내(intranasal) 또는 안구내(intraocular) 주입뿐만 아니라, 근육내(intramuscular), 피하(subcutaneous) 및 골수내(intramedullary) 주입을 포함하는 경비(transnasal), 장내(intestinal) 또는 비경구적(parenteral) 운반도 포함할 수 있다.
중추 신경계(central nervous system, CNS)로의 약물 운반을 위한 기존의 접근법은: 신경외과 수술 전략(예를 들어, 뇌내 주입(intracerebral injection) 또는 뇌혈관내 주입(intracerebroventricular infusion); 혈액 뇌 장벽(blood brain barrier, BBB)의 내재적 수송 경로 중 하나를 이용하기 위한 시도로 약제의 분자적 조작(molecular manipulation)(예를 들어, 스스로 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 없는 약제와 함께 내피세포 표면 분자에 친화력을 가지는 수송 펩티드를 포함하는 키메라 융합 단백질의 생산); 약제의 지질 용해도(lipid solubility)를 증가시키도록 설계된 약학적 전략(예를 들어, 지질 또는 콜레스테롤 담체에의 수용성 약제의 포합(conjugation)); 및 (경동맥 내로의 만니톨 용액의 주입(infusion) 또는 안지오텐신(angiotensin) 펩티드와 같은 생물학적 활성제의 사용으로 인한) 고삼투압성 붕괴(hyperosmotic disruption)에 의한 혈액 뇌 장벽의 원형(integrity)의 일시적 붕괴를 포함한다. 그러나, 각각의 이들 전략은 침습적 수술 절차와 관련하여 내재하는 위험, 내재적 수송계에 내재하는 한계에 의해 정해진 크기의 한계, 중추 신경계의 바깥에서 활성화될 수 있는 담체 모티프로 구성된 키메라 분자의 전신적(systemic) 투여와 관련된 잠재적으로 바람직하지 않은 생물학적 부작용, 및 혈액 뇌 장벽이 붕괴되어 차선의 운반 방법이 되도록 한 뇌 부위 내에서 뇌 손상 발생 가능성의 위험과 같은 한계를 가진다.
대안적으로, 전신적 방식보다는 예를 들어, 환자의 조직 부위 내로의 직접적인 약제학적 조성물의 주입을 통하여 국소적으로 약제학적 조성물을 투여할 수 있다.
용어 "조직(tissue)"은 기능 또는 기능들을 수행하도록 만들어진 세포들로 구성된 생물체의 일부분을 말한다. 예로는 뇌 조직, 안구 조직, 피부 조직, 간 조직, 췌장 조직, 골 조직, 연골 조직, 결합(connective) 조직, 혈액 조직, 근육 조직, 심장 조직, 뇌 조직, 혈관 조직, 신장 조직, 폐 조직, 생식선(gonadal) 조직, 조혈(hematopoietic) 조직을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 몇몇 구현의 약제학적 조성물은 당업계에 잘 알려진 프로세스에 의해, 예를 들어 기존의 혼합, 용해, 과립화, 드라제화(dragee-making), 부양화(levigating), 에멀전화, 캡슐화, 트랩핑(entrapping) 또는 동결건조(lyophilizing) 프로세스를 사용하여 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 몇몇 구현에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분의 조제물로의 가공을 용이하게 하며, 약제학적으로 사용될 수 있는 부형제 및 보조제를 포함하는 하나 또는 그 이상의 생리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 기존의 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 선택된 투여의 방법에 의존한다.
주입을 위해서, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크 용액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution)과 같은 생리학적으로 서로 섞이는 완충액(physiologically compatible buffers) 또는 생리학적 염 완충액(physiological salt buffer)로 제형화될 수 있다. 점막관통 투여를 위해서, 투과되어야 할 장벽(barrier)에 적합한 투과제(penetrant)가 제형화에 사용된다. 이러한 투과제 당업계에 일반적으로 공지되어 있다.
경구 투여를 위해서, 약제학적 조성물은 당업계에 잘 알려져 있는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 활성 성분을 조합함으로써 쉽게 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 환자에 의한 경구 섭취(oral ingestion)를 위해, 약제학적 조성물이 정제(tablets), 알약(pills), 당의정(dragees), 캡슐(capsules), 액체(liquids), 젤(gels), 시럽(syrups), 슬러리(slurries), 현탁제(suspensions) 등으로 제형화될 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 약학적 조제물은 고체 부형체를 사용하고, 선택적으로 생성된 혼합물을 분쇄(grinding)하고, 원한다면 적합한 보조제를 첨가한 후 과립의 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 핵(core)으로 만들어질 수 있다. 적합한 부형제는 특히 락토오스, 수크로오스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당과 같은 필러(fillers); 예를 들어, 옥수수 전분(maize starch), 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트래거캔스(gum tragacanth), 메틸 셀룰로오스(methyl cellulose), 히드록시프로필메틸-셀룰로오스(hydroxypropylmethyl-cellulose), 소디움 카복시메틸셀룰로오스(sodium carboxymethylcellulose); 및/또는 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyroolidone, PVP)과 같은 생리학적으로 허용 가능한 폴리머이다. 원한다면, 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 한천(agar) 또는 알긴산, 또는 소디움 알기네이트(sodium alginate)와 같은 그것들의 염과 같은 붕해제가 첨가될 수 있다.
당의정 핵은 적당한 코팅물로 제공된다. 이러한 목적으로, 농축 당 용액이 사용될 수 있으며, 선택적으로 검 아라빅(gum arabic), 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔(carbopol gel), 폴리에틸렌 글리콜, 티타늄 디옥사이드, 래커액(lacquer solutions) 및 적당한 유기 용매 또는 용매 혼합액이 포함될 수 있다. 활성 성분 함유량(dose)의 상이한 조합을 확인하거나 특성화하기 위해, 정제 또는 당의정 코팅물에 염료(dyestuffs) 또는 안료(pigments)가 첨가될 수 있다.
경구용으로 사용될 수 있는 약제학적 조성물은 젤라틴과 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 가소제로 제조된 연질의 밀봉(soft, sealed) 캡슐뿐만 아니라 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캡슐도 포함한다. 푸쉬-핏 캡슐은 락토오스와 같은 필러, 전분과 같은 결합제, 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제 및 선택적으로 안정화제를 포함한 혼합물에 활성 성분을 포함할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 성분은 지방유(fatty oils), 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 액체에 용해되거나 현탁될 수 있다. 또한, 안정화제도 첨가될 수 있다. 모든 경구 투여용 제제는 선택된 투여 방법에 적합한 용량이어야 한다.
구강 투여를 위해서, 조성물은 기존의 방식으로 제형화된 정제 또는 마름모꼴 캔디(lozenges)의 형태를 취할 수 있다.
비강 흡입에 의한 투여를 위해서, 본 발명의 몇몇 구현에 따라 사용하기 위한 활성 성분은 적당한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소를 사용하여 가압 팩 또는 네브라이저(nebulizer)로부터 에어로졸 분무 프리젠테이션(aerosol spray presentation)의 형태로 편리하게 전달된다. 가압 에어로졸의 경우에 있어서, 투여 단위(dosage unit)는 계량된 양(metered amount)을 전달하기 위한 밸브(valve)를 제공함으로써 결정될 수 있다. 주입기(dispenser)에서의 사용을 위한, 예를 들어, 젤라틴 캡슐 및 카트리지(cartridges)는 화합물과 락토오스 또는 전분과 같은 적당한 분말 기제(powder base)의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 예를 들어, 급속주입(bolus injection) 또는 연속주입(continuous infusion)에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 주사를 위한 제형은 단위 투여 형태(unit dosage form)로, 예를 들어 앰풀(ampoules) 또는 선택적으로 방부제가 첨가된 다회용 저장용기(multi-dose containers)에 존재할 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클에 녹인 현탁액, 용액 또는 에멀전일 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제(formulatory agent)를 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 수용성 형태로 활성 조제물의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 성분의 현탁액은 적절한 유성 또는 수성 기반의 주사 현탁액으로 제조될 수 있다. 적합한 친지질 용매 또는 비히클은 참기름과 같은 지방유, 또는 에틸 올리에이트, 트리글리세리드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르를 포함한다. 수성 주사 현탁액은 소디움 카복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 또는 덱스트란과 같은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 포함할 수 있다. 선택적으로, 현탁액은 또한 고농도의 용액을 제조할 수 있게 활성 성분의 용해도를 증가시키는 적절한 안정화제 또는 약제를 포함할 수 있다.
대안적으로, 활성 성분은 사용하기 전 적절한 비히클, 예를 들어 멸균 주사용 증류수(sterile pyrogen-free water)에 기반한 용액과 함께 구성되기 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현의 약제학적 조성물은 또한 예를 들어, 코코아 버터 또는 다른 글리세리드와 같은 종래의 좌약 기제(suppository base)를 사용하여 좌약 또는 정체 관장제(retention enema)와 같은 직장 조성물로 제형화될 수도 있다.
본 발명의 몇몇 구현의 상황하에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 성취하고자 하는 목적을 달성하는데 효과적인 양으로 포함된 조성물을 포함한다. 더욱 상세하게는, 치료학적 유효량은 질환(예를 들어, 암 또는 전이성 암)의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나 치료될 대상의 생존을 연장시키는데 유효한 활성 성분(SYNJ2 억제인자)의 양을 의미한다.
치료학적 유효량의 결정은 특히 본원에 제공된 상세한 설명을 고려하여 당업자들의 능력 내에서 충분히 이루어질 수 있다.
본 발명의 방법에 사용된 임의의 제조물을 위해서, 치료학적 유효량 또는 투여량(dose)은 처음에 시험관 내 검정법 및 세포 배양 검정법으로부터 추정될 수 있다. 예를 들면, 투여량은 동물 모델에서 원하는 농도 또는 역가(titer)를 달성하도록 만들어질 수 있다. 이러한 정보는 인간에게 유용한 투여량을 더욱 정확하게 결정하기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료학적 효능은 시험관 내, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 측정될 수 있다. 이들 시험관 내 및 세포 배양 검정법 및 동물 실험으로부터 얻어진 데이터는 인간에게 사용하기 위한 투여의 범위를 정하는데 사용될 수 있다. 투여량은 사용될 투여 형태 및 사용될 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 조건을 고려하여 의사에 의해 선택될 수 있다(예를 들어, Fingl, et al., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1을 참조).
투여의 양 및 간격은 활성 성분이 생물학적 효과를 유도하거나 억제하기에 충분한(최소 유효 농도(minimal effective concentration, MEC)) SYNJ2 억제인자 레벨을 제공하도록 개별적으로 조정될 수 있다. 최소 유효 농도는 각 조제물에 따라 달라질 수 있으나, 시험관 내 데이터로부터 예측될 수 있다. 최소 유효 농도를 달성하는데 필요한 투여량은 개체의 특성 및 투여 경로에 의존할 것이다. 검출 검정법은 혈장 농도를 측정하는데 사용될 수 있다.
치료될 질환의 심각도 및 민감성에 따라, 약의 투여(dosing)는 며칠 내지는 몇 주로 이어지는 치료의 과정에 따라, 또는 치유가 되거나 질병 상태의 축소가 이루어질 때까지 단일 또는 복수의 투여가 될 수 있다.
투여되는 조성물의 양은 물론 치료될 대상, 고통의 심각도, 투여 방식, 처방한 의사의 판단에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 몇몇 구현의 조성물은 원한다면 활성 성분을 포함하는 하나 또는 그 이상의 단위 투여 형태를 포함할 수 있는, FDA 승인 키트와 같은 팩 또는 디스펜서 장치로 존재할 수 있다. 팩은 예를 들어, 발포제 팩(blister pack)과 같은 금속 또는 플라스틱 호일(foil)을 포함할 수 있다. 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 설명서를 수반할 수 있다. 팩 또는 디스펜서는 또한 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로 용기와 관련된 주의사항에 의해 수용될 수 있고, 이러한 주의사항은 인간 또는 가축의 투여에 대한 조성물 형태의 기관에 의한 승인을 반영한다. 이러한 주의사항은 예를 들어, 미국 식품의약품국(U.S. Food and Drug Administration)에 의해 승인된 라벨이거나 승인된 제품 첨가물(insert)일 수도 있다. 혼화성(compatible)의 약제학적 담체로 제형화된 본 발명의 제조물을 포함하는 조성물 또한 제조되어 적절한 용기에 보관될 수 있고, 상기에 더 상세히 설명한 바와 같이 지시된 질환의 치료를 위한 표지가 붙을 수 있다.
세포 이동에 대한 SYNJ2의 기여와 같은 방식으로, 본 발명의 발명자들은 암의 공격적 하위형태에서 SYNJ2가 예후예측 마커(prognostic marker)로서 사용될 수 있음을 암시하는 SYNJ2 mRNA 및 단백질 레벨의 현저한 상향조절을 관찰하였다.
따라서, 본 발명의 양상에 따르면, 본 발명은 암의 예후 예측이 필요한 대상에서 암을 예후 예측하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 대상의 암세포에서의 SYNJ2의 레벨 또는 활성을 측정하는 것을 포함하고, 여기에서 영향을 받지 않은 대조군 샘플의 세포에서의 SYNJ2의 활성 레벨과 비교하여 대상의 상기 암세포에서의 상기 SYNJ2의 상기 활성 레벨에서의 상향조절은 나쁜 예후(poor prognosis)의 지표이다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "예후 예측(prognosing)"은 질병(암)의 결과를 알아내는 것을 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 "나쁜 예후(poor prognosis)"는 질병의 재발 위험성의 증가 및/또는 질병으로 인한 사망 위험성의 증가를 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "레벨(level)"은 DNA(유전자 증폭), RNA 또는 단백질에서의 발현 레벨을 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 "SYNJ2 활성(SYNJ2 activity)"은 주로 그것의 포스파타아제 활성, 즉 PI(3,4,5)P3를 PI(3,4)P2로 전환하는 활성을 말한다.
특정 구현에 따르면, 상기 활성은 시험관 내 활성 검정법을 사용하여 분석된다.
시험관 내 활성 검정법(In vitro activity assays): 이들 방법에서, 특정 효소(이 경우에는 포스파타아제)의 활성은 세포로부터 추출된 단백질 혼합물에서 측정된다. 상기 활성은 비색법(colorimetric method)을 잘 이용하여 분광 광도계(spectrophotometer)에서 측정될 수 있거나, 비변성(non-denaturing) 아크릴아마이드 겔(즉, 활성 겔)에서 측정될 수 있다. 그 다음의 전기영동에서, 겔을 기질과 비색 시약(colorimetric reagent)을 포함하는 용액에 침지시킨다. 그 결과 얻어진 염색된 밴드는 관심 단백질의 효소 활성과 일치한다. 만약 잘 조정되었고(well-calibrated) 반응의 선형 구간(linear range) 내라면, 샘플에 존재하는 효소의 양은 생성된 색(color)의 양에 비례한다. 효소의 기준(standard)은 일반적으로 양적 정확도를 향상시키기 위해 사용된다.
SYNJ2에 특이적인 검정법은 상기에 기술하였으며, PI(3,4,5)P3에서 PI(3,4)P2로의 전환 활성을 테스트한다.
단백질 발현 및/또는 활성을 검출하는 방법
SYNJ2의 단백질 발현은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다.
효소결합 면역 흡착법(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA): 이 방법은 미세역가 플레이트(microtiter plate)의 웰과 같은 표면에 단백질 기질을 포함하는 샘플(예를 들어, 고정세포(fixed cells) 또는 단백질성 용액(proteinaceous solution))의 고정을 포함한다. 효소에 결합된 기질 특이적 항체를 사용하여 기질에 결합할 수 있게 하였다. 그 후, 항체의 존재를 검출하고, 항체에 결합된 효소를 이용하는 비색반응에 의해 정량하였다. 이 방법에 흔히 사용되는 효소는 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase) 및 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)를 포함한다. 만약 잘 조정되었고 반응의 선형구간 내라면, 샘플에 존재하는 기질의 양은 생성된 색의 양에 비례한다. 기질의 기준은 일반적으로 양적 정확도를 향상시키기 위해 사용된다.
웨스턴 블롯 (Western blot): 이 방법은 아크릴아마이드 겔을 사용하여 다른 단백질로부터 기질을 분리한 후, 그 기질을 막(예를 들어, 나일론 또는 PVDF)으로 옮기는 것을 포함한다. 그 후, 기질의 존재를 기질에 특이적인 항체에 의해 검출하며, 이는 항체 결합 시약으로 차례차례 검출한다. 항체 결합 시약은 예를 들어, 단백질 A 또는 다른 항체일 수 있다. 항체 결합 시약은 방사성 표지될 수 있거나, 상기 기술된 것과 같이 효소에 결합될 수 있다. 검출은 오토래디오그래피(autoradiography), 비색반응 또는 화학발광(chemiluminescence)에 의해 이루어질 수 있다. 이 방법은 전기영동하는 동안 아크릴아마이드 겔에서의 이동 거리를 나타내는 막 상에서의 상대적 위치에 의해 기질의 양의 정량 및 그것의 존재의 확인 모두를 가능하게 한다.
방사성 면역검정법(radio-immunoassay, RIA ): 하나의 버전에서, 이 방법은 특정 항체 및 아가로스 비드와 같은 침전 가능한(precipitable) 담체 상에 고정된 방사성 표지된 항체 결합 단백질(예를 들어, I125로 표지된 단백질 A)을 이용한 원하는 단백질(즉, 기질)의 침전(precipitation)을 포함한다. 침전된 펠릿에서의 카운트(count) 수는 기질의 양에 비례한다.
RIA의 대안적인 버전에서, 표지된 기질 및 비표지된 항체 결합 단백질이 사용된다. 알려지지 않은 양의 기질을 함유하는 샘플이 다양한 양으로 첨가된다. 표지된 기질에서 침전된 카운트의 감소는 첨가된 샘플에서의 기질의 양에 비례한다.
형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS ): 이 방법은 기질 특이적 항체에 의한 세포 내에서(in situ)의 기질의 검출을 포함한다. 상기 기질 특이적 항체는 형광단(fluorophore)에 결합된다. 검출은 세포가 광선(light beam)을 통과해서 지나갈 때 각 세포로부터 방사된 빛의 파장을 판독하는 세포 분류 장치(cell sorting machine)로 이루어진다. 이 방법은 두 개 또는 그 이상의 항체를 동시에 사용할 수 있다.
면역조직화학적 분석( immunohistochemical analysis): 이 방법은 기질 특이적 항체에 의해 고정된 세포 내에서(in situ)의 기질의 검출을 포함한다. 상기 기질 특이적 항체는 형광단에 결합된 효소일 수 있거나, 형광단에 결합될 수 있다. 검출은 현미경 및 주관적(subjective) 또는 자동(automatic) 평가에 의해 이루어진다. 효소 결합 항체가 사용된다면, 비색 반응이 필요할 수 있다. 면역조직화학 후 종종 예를 들어 헤마톡실린(hematoxylin) 또는 김사(Giemsa) 염색을 사용하는 세포 핵의 대비염색이 이루어진다.
현장 활성(in situ activity) 검정법: 이 방법에 따르면, 활성 효소를 포함하는 세포 상에 발색 기질(chromogenic substrate)이 사용되며, 상기 효소는 기질이 빛 또는 형광 현미경으로 볼 수 있는 발색 생성물을 생성하도록 분해되는 반응을 촉매한다.
대안적으로 또는 추가적으로, SYNJ2의 레벨은 당업계에 잘 알려져 있고 몇몇은 아래에 기술된 방법을 사용하여 RNA 레벨에서 검출된다.
RNA 발현 레벨을 검출하는 방법
본 발명의 몇몇 구현의 세포에서의 RNA의 발현 레벨은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
노던 블롯 분석법(Northern Blot analysis): 이 방법은 RNA들의 혼합물에 있는 특정 RNA의 검출을 포함한다. RNA 샘플은 염기쌍 사이의 수소결합을 보호하는 약제(예를 들어, 포름알데히드)로 처리함으로써 변성되어, 모든 RNA 분자들이 접히지 않은, 선형의 구조를 가지도록 한다. 각각의 RNA 분자들은 그 후 겔 전기영동에 의해 크기에 따라 분리되고, 변성된 RNA들의 부착을 위한 니트로셀룰로오스 또는 나일론-기반의 막으로 옮겨진다. 그 후, 상기 막을 표지된 DNA 프로브에 노출시킨다. 프로브는 방사성 동위원소(radio-isotopes) 또는 효소 결합 뉴클레오티드를 사용하여 표지될 수 있다. 검출은 오토래디오그래피, 비색 반응 또는 화학발광을 사용하여 이루어질 수 있다. 이 방법은 특정 RNA 분자의 양의 정량 및 전기영동하는 동안 겔에서의 이동 거리를 나타내는 막에서의 상대적 위치에 의한 그것의 정체의 검출 모두를 가능하게 한다.
RT- PCR 분석: 이 방법은 상대적으로 적은 RNA 분자들의 PCR 증폭을 사용한다. 먼저, RNA 분자들을 세포로부터 정제하고, (MMLV-RT와 같은) 역전사 효소(reverse transcriptase enzyme) 및 올리고(oligo) dT, 랜덤 헥사머(random heamer)와 같은 프라이머 또는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)로 전환시킨다. 그 후, 유전자 특이적 프라이머 및 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하여, PCR 기계에서 PCR 증폭 반응을 수행한다. 당업자들은 유전자 특이적 프라이머의 길이와 서열 및 특정 RNA 분자를 검출하는데 적합한 PCR 조건(즉, 어닐링 온도, 사이클의 수 등)을 선택할 수 있다. 반정량적 RT-PCR(semi-quantitative RT-PCR) 반응은 PCR 사이클의 횟수를 조정하고, 공지의 대조물질과 증폭 산물을 비교함으로써 사용될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
RNA 인시츄 혼성화 염색(RNA in situ hybridizatoin stain): 이 방법에서 DNA 또는 RNA 프로브는 세포에 존재하는 RNA 분자에 부착된다. 일반적으로, 세포는 먼저 세포 구조를 보존하고 RNA 분자가 분해되는 것을 방지하기 위하여 현미경 슬라이드에 고정된 후, 표지된 프로브를 포함하는 혼성화 버퍼에 넣어진다. 상기 혼성화 버퍼는 프로브의 비특이적 결합을 회피함과 동시에 그 자리에서(in situ) 그것들의 표적 mRNA 분자들과 DNA 또는 RNA 프로브의 특이적 혼성화를 가능하게 하는, 포름아미드 및 염(예를 들어, 소디움 클로라이드 및 소디움 시트레이트)와 같은 시약을 포함한다. 당업자들은 특정 프로브와 세포의 형태에 대해 혼성화 조건(즉, 온도, 염 및 포름아미드의 농도 등)을 조정할 수 있다. 혼성화 후, 임의의 비결합 프로브를 세척하고, 결합 프로브는 공지의 방법을 사용하여 검출한다. 예를 들어, 방사성 표지된 프로브가 사용된다면, 슬라이드는 그 후 방사성 표지된 프로브를 사용하여 생성된 시그널을 나타나게 하는 사진 유제(photographic emulsion)로 처리되고; 프로브가 효소로 표지된다면, 그 후 비색 반응의 형성을 위해 효소-특이적 기질이 첨가되고; 프로브가 형광성 표지를 사용하여 표지된다면, 그 후 결합된 프로브는 형광 현미경을 사용하여 보여지고; 프로브가 태그(예를 들어, 디곡시게닌(digoxigenin), 비오틴 등)를 사용하여 표지된다면, 그 후 결합된 프로브는 공지의 방법을 사용하여 검출될 수 있는 태그-특이적 항체와의 상호작용 후에 검출될 수 있다.
인시츄 RT- PCR 염색(in situ RT- PCR stain): 이 방법은 Nuovo GJ 등(Nuovo GJ, et al., Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90) 및 Komminoth P 등(Komminoth P, et al., Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract. 1994, 190: 1017-25)에 기술되어 있다. 간단하게는, RT-PCR 반응은 PCR 반응을 위해 표지된 뉴클레오티드를 혼입시키는 것에 의해 고정된 세포에서 수행된다. 상기 반응은 아르크투르스 엔지니어링(Arcturus Engineering; Mountainview, CA)로부터 입수 가능한 레이저-캡처 마이크로디섹션(laser-capture microdissection) PixCell I LCM 시스템과 같은 특정 인시츄 RT-PCR 기구를 사용하여 수행된다.
DNA
마이크로어레이
(
microarrays
)/DNA 칩(chips):
수천 개의 유전자의 발현이 DNA 마이크로어레이를 사용하여 동시에 분석될 수 있으며, 이는 특정 발달 과정 또는 생리학적 반응 동안 생물체의 완전한 전사 프로그램(complete transcriptional program)의 분석을 가능하게 한다. 수천 개의 각각의 유전자 서열들로 이루어진 DNA 마이크로어레이는 유리 현미경 슬라이드와 같은 지지체의 표면상의 꽉 찬 공간에 부착되어 있다. DNA 마이크로어레이를 제조하기 위한 다양한 방법들이 개발되어 있다. 한 방법에서는, 분석을 위해 각 유전자의 암호 부위의 대략 1 킬로베이스(kilobase)의 분절(segment)이 각각 PCR 증폭된다. 유리 현미경 슬라이드의 표면상의 밀접하게 배치된 지역(closely spaced zones)에 각각 증폭된 DNA 샘플을 적용하기 위해 로봇 장비들이 사용되며, 그 뒤 DNA 서열을 지지체의 표면에 결합시키기 위해 열처리 및 화학처리로 처리하여 그것들을 변성시킨다. 전형적으로, 이러한 어레이는 약 2 × 2 cm 이고, 각각 약 핵산 6000 스팟(spots)을 포함한다. 다른 기술에서, 주로 20 뉴클레오티드 길이의 다중 DNA 올리고뉴클레오티드는 지지체의 표면상의 작은 스퀘어 존에서 수만의 동일한 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 지지체의 표면에 공유적으로 결합된 첫 번째 뉴클레오티드로부터 합성된다. 단일 유전자로부터 얻은 다중 올리고뉴클레오티드 서열은 그 유전자 발현의 분석을 위한 슬라이드의 주변 부위(neighboring region)에 합성된다. 그러므로, 수천의 유전자들이 하나의 유리 슬라이드 상에 나타내어질 수 있다. 이러한 합성 올리고뉴클레오티드의 어레이는 상기 기술한 바와 같은 "DNA 마이크로어레이(DNA microarrays)"와는 대조적으로 당업계에서 "DNA 칩(DNA chips)"으로 칭해질 수 있다(Lodish et al. (eds.). Chapter 7.8: DNA Microarrays: Analyzing Genome-Wide Expression. In: Molecular Cell Biology, 4th ed., W. H. Freeman, New York. (2000)).
예후예측은 명확한 기준법(gold standard method), 예를 들어 영상 기법(imaging method), 생검(biopsy sampling), 마커 발현(marker expression), 면역조직화학 등을 사용하여 입증될 수 있다.
다음은 유방암에 대한 특정 예이지만, 이로 한정하고자 하는 것이 아니다. 유방암의 예후예측은 주로 종양의 크기(T), 림프절 주변부로의 전이 상태(N) 및 다른 기관으로의 원격 전이(distant metastasis)(M)를 평가하는 수술 후의 질병의 병기(stage)(TNM 병기)에 의해 결정된다. TNM 병기에 따라 분류된 환자의 예후예측은 동일한 병기에서도 서로 다르다. 즉, 동일한 병기의 유방암에서도 예후예측은 에스트로겐 또는 프로게스테론 수용체(ER 또는 PR)의 발현 및 HER2의 과발현 또는 유전자의 증폭에 의해 결정될 수 있다.
SYNJ2를 검출하기 위해 상기에 기술된 본 발명의 몇몇 구현의 약제들은 바람직하게는 적절한 사용 설명서 및 암의 병기 및/또는 예후를 진단 및/또는 평가하는데 사용하기 위한 FDA 승인을 나타내는 표지와 함께 진단키트/제조물(article of manufacture)에 포함될 수 있다.
이러한 키트는 예를 들어, 적어도 하나의 상기 기술된 진단제(예를 들어, 항 SYNJ2 항체, 예를 들어 항-HER2 및/또는 항 ER 또는 이들 표적에 대한 올리고뉴클레오티드 프로브/프라이머와 함께)를 포함하는 적어도 하나의 용기, 및 다른 용기에 포장된 영상화제(imaging reagent)(예를 들어, 효소, 2차 항체, 버퍼, 발색 기질, 형광성 물질)를 포함할 수 있다. 키트는 또한 적절한 버퍼와 키트의 유통기한을 개선하기 위한 방부제를 포함할 수 있다.
용어 "포함하다(comprises or includes)", "포함하는(comprising or including)", "가지는(having)" 및 그것들의 활용은 "포함하지만 이에 한정되지 않는(including but not limited to)"을 의미한다.
용어 "이루어지는(consisting of)"은 "포함하며 그것으로 한정되는(including and limited to)"을 의미한다.
용어 "필수적으로 이루어지는(consisting essentially of)"은 부가 구성요소, 단계 및/또는 부분들이 청구된 조성물, 방법 또는 구조의 기본적인 그리고 신규한 특성을 실질적으로(materially) 변경하지 않는 경우에만, 그 조성물, 방법 또는 구조가 부가 구성요소, 단계 및/또는 부분을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것과 같은 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 달리 전후 사정을 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 참조를 포함한다. 예를 들면, 용어 "화합물(a compound)" 또는 "적어도 하나의 화합물(at least one compound)"은 그것들의 혼합물을 포함하는, 다수의 화합물을 포함할 수 있다. 본 명세서 전체에 걸쳐, 본 발명의 다양한 구현들은 범위 형식(range format)으로 개시될 수 있다. 범위 형식을 이용한 설명은 단순히 편의성과 간결함을 위함이며, 본 발명의 권리 범위를 완고하게 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 상기 범위 내의 개별적인 절대값들(numerical value)뿐만 아니라 구체적으로 개시된 모든 가능한 하위 범위(subranges)를 포함하는 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 및 6과 같은 상기 범위 내의 개별적인 값들뿐만 아니라 구체적으로 개시된 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위 범위들을 포함하는 것으로 고려되어야 한다. 이것은 상기 범위의 폭과는 관계없이 적용된다.
수치 범위가 본원에 개시된다면, 그것은 개시된 범위 내의 임의의 인용된 숫자(분수(fractional) 또는 적분(integral))를 포함한다. 문구 제1의 지시 숫자와 제2의 지시 숫자 "범위(ranging)/사이의 범위(ranges between)", 및 제1의 지시 숫자 "내지" 제2의 지시 숫자 "범위(ranging)/까지의 범위(ranges from)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 제1 및 제2의 지시 숫자 및 그 사이에 있는 모든 분수 및 적분 수치를 포함한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "방법(method)"은 화학, 약학, 생물학, 생화학 및 의약 분야의 실무자들에게 알려졌거나 그들에 의해 공지의 방식들, 수단들, 기술들 및 공정들로부터 쉽게 개발된 방식들, 수단들, 기술들 및 공정들을 포함하나 이제 한정되지 않는, 주어진 임무를 수행하기 위한 방식들, 수단들, 기술들 및 공정들을 말한다.
본원에 사용된 것과 같은 용어 "치료(treating)"는 질환의 진행을 끝내고(abrogating), 실질적으로 억제하고(inhibiting), 지연(slowing) 또는 역전(reversing)시키고, 질환의 임상학적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선하거나, 질환의 임상학적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하는 것을 포함한다.
명확성을 위해 독립된 구현의 맥락에서 기술된 본 발명의 어떤 특징들은 또한 단일의 구현으로 조합하여 제공될 수도 있다. 역으로, 간결성을 위해 단일의 구현의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징들 또한 별도로 또는 본 발명의 임의의 적절한 하위조합(subcombination)으로 또는 본 발명의 임의의 다른 기술된 구현에 적합하게 제공될 수 있다. 다양한 구현들의 맥락에서 기술된 어떤 특징은 그 구현이 그러한 특징들 없이 작동하지 않는 한, 그 구현들의 필수적인 특징으로 고려되지 않는다.
상기에 기술되고 아래의 청구항에 청구된 것과 같은 본 발명의 다양한 구현들 및 양상들은 하기의 실시예들에서 실험적 근거를 찾는다.
실시예
이제 하기의 실시예들을 참고하여, 상기 명세서와 함께 비 제한적인 방식으로 본 발명의 몇몇 구현들을 설명한다.
일반적으로, 본원에 사용된 명명법 및 본 발명에 사용된 실험실 절차들은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술들은 문헌들에 자세하게 설명되어 있다(예를 들면, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)를 참조; 본원에 모두 개진된 것처럼 참조로서 본원에 포함된다). 다른 일반적인 참조들도 이 문서 전체에 걸쳐 제공된다. 그 안에 들어있는 절차들은 당업계에 잘 알려져 있는 것으로 생각되며, 독자의 편의를 위해 제공된다. 그 안에 포함된 모든 정보들은 참조로서 본원에 포함된다.
실시예
1
물질 및 방법
세포 이동, 침습 및
화학주성
검정법
트렌스웰 트레이(BD bioscience)의 상부 구획의 3개의 웰에 세포를 치상하고, 18시간 동안 막을 통과하여 이동하도록 하였다. 그 후에, 세포를 파라포름알데히드(3%)로 고정하고, 트리톤 X-100(0.05%)을 침투시키고, 메틸 바이올렛(0.02%)으로 염색하였다. 필터의 상측에서 자라는 비-이동 세포들을 제거하고, 이동된 세포들의 사진을 찍었다. 바이오코트 매트리겔 챔버(BioCoat Matrigel Chambers)를 사용하여 침습 검정법을 수행하였다. 화학주성을 위하여, 이비디(ibidi, Munchen, Germany)로부터 구입한 챔버와 타임 랩스 이미징(time lapse imaging)을 사용하였다. ImageJ를 이용하여 세포핵의 위치를 추적하였다.
포스포이노시티드
분석
이노시톨을 포함하지 않은 배지에서 30분간 세포를 배양하고, [3H]-이노시톨 및 투석된 혈청(dialyzed serum)(10%) 모두가 첨가된 배지로 바꾸었다. 3일 동안 세포를 배양하고, 세척하고 1M HCl로 추출한 다음에 1M 메탄올로 추출하였다. 그 후, 세포를 긁어 모으고 클로로포름으로 추출한 후, 메탄올:0.1M EDTA(pH 8.0)로 추출하고, 유기상(organic phase)을 증발시켰다. 그 후에, 추출물을 탈아세틸화시키고, 직렬로 두 개의 partisphere SAX 컬럼(Whatman) 및 암모늄 포스페이트(pH 6.0)의 4단계 기울기를 사용하여 음이온-교환 HPLC(Agilent 1200)으로 분리하였다. 방사성 표지된 용출액(elute)을 온라인 플로우 신틸레이션 분석기(online flow scintillation analyzer)로 검출하고, ProFSA 소프트웨어(Perkin-Elmer)를 사용하여 정량하였다.
젤라틴
자이모그래피
MMP-2의 활성을 검출하기 위하여, 생물학적 샘플을 10% 폴리아크릴아미드/0.1% 젤라틴-포매(gelatin-embedded) 겔 상에서 전기영동적으로 분리하였다. 그 후, 겔을 2.5% 트리톤 X-100으로 세척하고, 0.2 M NaCl, 5 mM CaCl2, 1 μM ZnCl2, 0.02% Brij 35 및 1 mM p-아미노페닐머큐릭 아세테이트(p-aminophenylmercuric acetate)를 포함하는 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5)에서 37℃에서 36시간 동안 배양하였다.
동물에서의 전이(metastasis) 테스트
암컷 CB-17 SCID 마우스(Harlan Laboratories, Haslett, MI; 그룹당 15마리)의 지방 패드(fat pad)에 MDA-MB-231 세포(1.4×106 세포/마우스)를 이식하였다. 이식 2주 및 6주 후 마우스를 마취시키고, 종양의 크기를 측정하고 림프절에의 전이를 형광 쌍안(fluorescent binocular) 현미경을 사용하여 시각화하였다. 폐 전이에 대해서는, 마우스를 희생시킨 뒤 폐를 제거하여 세척하고, 형광 쌍안 현미경을 사용하여 이미지를 얻었다. 림프절 전이의 분석을 위해 양측(two-sided) 피셔의 정확 검정법(Fischer's exact test)을 사용하였다. 종양 성장의 측정에는 유의확률(Exact-sig)(2×1-tailed) 만-위트니 테스트(Mann-Whitney test)를 사용하였다.
시약
달리 지시하지 않는 한, 인간 재조합 성장 인자 및 다른 물질들은 시그마사(Sigma, St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 면역학적 블로팅을 위한 방사성 물질 및 화학발광 키트는 아머샴사(Amersham, Buckinghamshire, UK)로부터 입수하였다. EGFR-키나아제 억제물질 AG1478, MEK 억제물질 U0126 및 PI3K 억제물질 보르트만닌은 칼바이오켐사(Calbiochem, San Diego, CA)로부터 입수하였다. 상처-치유 검정법(wound-healing assay)을 위한 플레이트는 이비디사(ibidi, Munich, Germany)로부터 입수하였다. 타임-랩스 이미징을 위한 35-mm 유리바닥 디쉬는 마텍사(MaTek, Ashland, MA)로부터 구입하였다. EGF-수용체에 대한 쥐 단일클론 항체(mAb) 111.6은 우리 실험실에서 만들었다. 웨스턴 블롯 분석을 위한 항-EGFR은 알렉시스사(Alexis, Lausen, Switzerland)로부터 입수하였다. 항 Ras-GAP 및 항-AKT 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로부터 입수하였다. 항-EEA1, 항-Rab5, 항-Rab4 및 항 Rac1은 BD 트랜스덕션 연구소(BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ)로부터 입수하였다. 항-SYNJ2 mAb는 압노바사(Abnova, Taipei, Taiwan)로부터 입수하였다. 다음의 2차 항체들을 사용하였다: 서양고추냉이 퍼록시다아제(Horseradish peroxidase, HRP)에 접합된 염소 항-마우스 IgG 및 염소 항-토끼 IgG 항체는 잭슨 이뮤노리서치 연구소(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Bar Harbor, Maine)로부터 구입하였다. 텍사스-레드 트랜스페린(texas-red transferrin), 염소 항 마우스 Alexa-488, Alexa-555 및 Alexa-647 2차 항체들은 인비트로젠사(Invitrogen, Carlsbad, CA)로부터 구입하였다.
siRNA 대조군은 "써모 사이언티픽 다마콘사(Thermo scientific Dharmacon)" cat. D-001810-10-05로 구입하였고; SYNJ2에 대한 siRNA 서열은 SEQ ID NO:6 - GGACAGCACUGCAGGUGUU에 제시한 바와 같고; 모든 shRNA는 시그마 이스라엘사(SIGMA Israel)로부터 구입하였고; shRNA 대조군 - cat. SHC002; 사용된 SYNJ2에 대한 shRNA 서열은 CCGGCCGGAAGAACAGTTTGAGCAACTCGAGTTGCTCAAACTGTTCTTCCGGTTTTTG (SEQ ID NO: 9)이다.
세포주(cell lines) 및 형질감염
MCF10A 세포를 항생제, 인슐린(10 μg/mL), 콜레라 독소(0.1 μg/mL), 하이드로코르티손(hydrocortisone)(0.5 μg/mL), 가열-불활화 말 혈청(heat-inactivated horse serum)(5% vol/vol) 및 EGF(10 ng/mL)이 첨가된 DMEM:F12(1:1) 배지에서 배양하였다. 인간 유방 MDA-MB-231 세포를 10% 가열 불활화 우태아 혈청(fetal calf serum)(Gibco), 1 mM 소디움 피루베이트 및 페니실린-스트렙토마이신 혼합물(100 unit/mol; 0.1 mg/ml; Beit Haemek, Israel)이 첨가된 RPMI-1640(Gibco BRL; Grand Island, NY)에서 배양하였다. MDA-MB-231-RFP의 안정한 세포주를 하다사 데가니 교수(Prof. Hadasa Degani, The Weizmann Institute of Science, Israel)로부터 얻었다. 제조사(Roche, Mannheim, Germany)의 가이드라인에 따라 Fugen-HD를 이용하여 플라스미드 형질감염을 수행하였다. 대안적으로, siRNA 올리고뉴클레오티드를 이용하는 일시적 mRNA 발현억제(transient mRNA knockdown) 실험을 위하여, 세포를 올리고펙타민(Oligofectamine)(Invitrogen)으로 형질감염시켰다.
렌티바이러스성
벡터(
lentiviral
vector) 및 바이러스 생산
제조사(Sigma)의 가이드라인에 따라 비표적 shRNA 헤어핀(대조군) 및 인간 SYNJ2를 겨냥한 헤어핀을 HEK-293T 세포에서 생산하였다. 표적 세포를 폴리브렌(polybrene)(8 μg/mL)이 첨가된 shRNA를 암호화하는 렌티바이러스로 감염시키고, 퓨로마이신(puromycin)(2 μg/mL)의 존재하에서 4일간 배양하였다. 제조사의 가이드라인에 따라, ViraPower 렌티바이러스 발현 시스템(Invitrogen)을 사용하여 인간 SYNJ2의 안정한 유전자-특이적 운반을 수행하였다.
면역형광법
및 이미지 처리
세포를 피브로넥틴 코팅된 커버 슬립 상에서 48시간 동안 배양하였다. 처치 후, 세포를 세척하고, 0.02% 트리톤 X-100 및 3% 파라포름알데히드를 사용하여 투과성을 높이고, 20분간 고정하였다. SlidebookTM의 지시하에 Zeiss LSM-710 현미경 또는 스피닝 디스크 현미경(Zeiss 100×, NA 1.45; Yokogawa CSU-22; Zeiss fully automated, inverted 200 M; Photometrics HQ-CCD camera) 중 하나 그리고 고체 레이저(solid state laser)(473, 561 및 660 nm, 노출 시간: 0.25-1초)를 사용하여 공초점 현미경을 사용하였다. 압전 제어식(piezo electrically controlled) 스테이지의 위치를 바꾸면서 Z-축을 따라서 매 70-300 ms마다 3D 이미지 스택(stacks)을 얻었다(step size: 0.1-0.4 μm). 대안적으로, 델타비전 시스템(DeltaVision system, Applied Precision, Issaqua, WA)을 이용하여 생세포 형광 현미경을 사용하였으며, 프리즘 소프트웨어(priism software)를 사용하여 이미지를 처리하였다.
EGF의
방사성표지
인간 재조합 EGF를 하기와 같이 IODOGEN으로 표지하였다: Iodogen으로 코팅된 튜브(1 mg의 시약)에서 EGF(5 μg)와 Na125I(1mCi)를 혼합하였다. 23℃에서 15분 배양한 후, 알부민을 첨가하여 최종 농도를 0.1 mg/ml로 만들고, 상기 혼합물을 Excellulose GF-5 컬럼으로 분리하였다.
수용체 하향조절 검정법
대조군을 치상한 추가적인 웰과 함께, MDA-MB-231 세포를 24-웰 플레이트에 각 시점에 대해 3회씩 시딩하였다. 48시간 후, 세포를 4시간 동안 기아상태(starved)에 놓아두고, 지시된 시간 간격 동안 37℃에서 EGF(2 ng/ml)로 자극하였다. 그 뒤에, 그것들을 얼음 위에 놓고 결합 버퍼(binding buffer)(DME 배지, 알부민 1%, Hepes 20 mM, pH 7.5)로 한번 세척하고, 표면 결합 EGF를 제거하기 위해 약산(mild acid)/중염(mild salt)(0.2 M Na Acetate buffer pH 4.5, 0.5 M NaCl)으로 세척하였다. 그 후, 4℃에서 1.5시간 동안 방사성 표지된 EGF와 함께 세포를 배양하고, 결합 버퍼로 세척하였다. 대조군 웰을 방사성 표지된 EGF 및 초과량의 비표지된 EGF와 함께 배양하였다. 마지막으로, 세포를 1M NaOH로 용해하고, 감마 카운터(γ-counter)를 이용하여 방사능(radioactivity)을 측정하였다. 데이터는 시간 0에 상대적인 세포 표면상의 수용체의 백분율을 나타낸다.
표면
EGF
-수용체의 확인
대조군을 치상한 추가적인 웰과 함께, 세포(2×104/웰)를 24-웰 플레이트에 3회씩 시딩하였다. 그 후, 4℃에서 1.5시간 동안 방사성 표지된 EGF와 함께 세포를 배양하고, 결합 버퍼로 세척하였다. 대조군 웰을 방사성 표지된 EGF 및 초과량의 비표지된 EGF와 함께 배양하였다. 마지막으로, 세포를 1M NaOH 용액으로 용해하고, 방사능(radioactivity)을 측정하였다. 데이터는 대조군 세포에 상대적인 세포 표면상의 수용체의 백분율을 나타낸다.
면역블로팅
분석
세포를 얼음처럼 차가운 식염수로 잠시 세척하고, 완충 세제 용액(25 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 0.5% Na-데옥시콜레이트(Na-deoxycholate), 1% NP-40, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 0.2 mM Na3VO4 및 1:1000으로 희석된 프로테아제 억제인자 칵테일(a protease inhibitor cocktail))로 긁어내었다. 동일한 겔 로딩을 위하여, BCA 시약(Pierce)을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 겔 전기영동 후, 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼다. 막을 10% 저지방 우유를 포함하는 TBST 버퍼(0.02 M Tris-Hcl (pH 7.5), 0.15 M NaCl 및 0.05% Tween 20)로 차단시키고, 1시간 동안 1차 항체로 블로팅하고, TBST로 세척하고, HRP가 접합된 2차 항체와 함께 30분간 배양하였다.
상처 치유(
스크래치
) 검정법
제조사(iBidi, Germany)의 프로토콜에 따라 상처 치유 검정법을 수행하였다. 간단하게는, MCF10A 세포를 단백질분해처리(trypsinized)하고, EGF-결핍(deprived) 배지에 재현탁시켜(7.0×105 cells/mL) 각 웰 안에 70 μl를 넣으면 24시간 내에 전면배양층(confluent layer)이 형성된다. 그 후, 멸균 핀섹을 사용하여 배양-인서트를 제거하고, 2시간 동안 세포를 이동시켰다.
전자주사현미경
(scanning electron microscopy) 및 투과전자현미경(transmission electron microscopy)
세포를 4% 파라포름알데히드 및 2% 수크로오스가 첨가된 식염수로 고정하였다. 샘플을 세척하고, 2차 고정액(fixative)으로 고정하였다(1% 수크로오스 및 5 mM CaCl2가 첨가된, 0.1 M 카코딜레이트 버퍼(cacodylate buffer)에 녹인 3% 파라포름알데히드 및 2.5% 글루타르알데히드, pH 7.4). 세포를 0.1 M 카코딜레이트 버퍼로 세척하고, 1시간 동안 카코딜레이트 버퍼에 녹인 1% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)로 후고정(post-fixed)시켰다. 전자주사현미경(SEM)을 위하여, 후고정된 샘플을 두 번 세척하고, 5분간 1% 타닌산(tannic acid)으로 처리한 후, 다시 세척하고 30분간 1% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 처리하였다. 등급별 에탄올(graded ethanol)로 샘플을 탈수시키고, 금-팔라듐 필름과 함께 스퍼터링(sputtering)함으로써 전도성을 갖게 하였다. 전자주사현미경을 사용하여 샘플의 사진을 찍었다(Leo Supra 55/Vp Zeiss, Thornwood, NY).
수용체 재활용 검정법(Receptor recycling assay)
MDA-MB-231 세포를 알렉사 플루오르 488-트랜스페린(Alexa Fluor 488-transferrin)(혈청을 포함하지 않는 배지에 25㎍/mL)과 함께 37℃에서 30분간 또는 알렉사 플루오르 488-EGF(40 ng/mL)과 함께 10분간 전배양하였다.
내재화된(internalized) 리간드의 재활용을 감안하여, 지정된 시간 간격 동안 37℃에서 이동하기 전에, 산성 버퍼(150mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.125mM CaCl2, 0.1M 글리신)에서 4℃에서 30분간 배양하여 표면 결합 리간드를 분리하였다. 영상화(imaging) 또는 FACS 중 어느 하나로 세포를 분석하였다.
실시간 세포 임피던스 검정법(Real-time cell impedance analysis,
RTCA
)
RTCA-Xcelligence 시스템(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)을 이용하여 세포의 퍼짐(spreading) 및 부착(adhesion)의 측정값을 기록하였다. 금 마이크로전극(gold microelectrode) E-플레이트-16을 식염수로 한 번 세척하였다. 먼저 세포(웰 당 2,500)를 시딩한 후, 지정된 간격으로 임피던스 데이터(세포 인덱스; 측정된 전기적 임피던스에서의 상대적인 변화로서 얻어짐)를 기록하였다. 제조사로부터 제공되는 소프트웨어 패키지 1.2를 사용하여 데이터를 분석하였다.
TAPP1
-
PH
도메인 발현 및 정제
TAPP1-PH 도메인 및 N-말단 플래그 태그(Flag tag) 및 C-말단 6xHis 태그(SEQ ID NO:13, 도 18)을 암호화하는 구조물을 pET28 플라스미드 안으로 클로닝하고, 200 μM IPTG로 유도한 후 대장균(E. coli) BL21(DE3)에서 발현시켰다. 세균을 15℃에서 배양한 후, 세포 파쇄기(cell disrupter)로 파쇄하였다. 원심분리에 의해 세포 찌꺼기를 제거하고, 50 mM 트리스(pH 8), 0.5 M NaCl, 및 20 mM 이미다졸로 평형화된 Ni 컬럼(HisPrep FF 16/10, GE Healthcare)상에 단백질을 포획하였다. 상기 단백질을 0.5 M 이미다졸을 포함하는 동일한 버퍼로 용출하였다. TAPP1-PH 도메인을 포함하는 분획을 50 mM 트리스(pH 8) 및 100 mM NaCl을 포함하는 버퍼로 평형화된 크기 배재 컬럼(size exclusion column)(Hiload_26/60_Superdex 75, GE Healthcare) 안으로 주입하였다. TAPP1-PH 도메인을 포함하는 혼합 피크(pooled peak)를 20 mM 소디움 포스페이트 버퍼(pH 7.2)를 이용하여 3배 희석하고, 동일한 포스페이트 버퍼로 평형화된 양이온 교환 컬럼(cation exchange column)(HiTrap_SP_FF_5ml, GE Healthcare)에 로딩하였다. 1 M NaCl을 포함하는 포스페이트 버퍼의 선형 구배(linear gradient)를 이용하여 컬럼으로부터 순수한 단백질을 용출하였다(TAPP1-PH 도메인은 200 mM NaCl에서 용출한다). SDS-PAGE에 의해 평가된 것으로서 순수한 TAPP1-PH 도메인을 포함하는 분획을 함께 모으고, 브래드퍼드 시약(Bradford reagent) 및 OD280(20,520의 흡광계수(extinction coefficient)) 양자화(auqntization)로 단백질 농도를 측정하였다.
SYNJ2의
5' 포스파타아제 활성
판독 출력(read out)으로서 형광 편광에 근거하여, PI(3,4)P2를 생성하기 위해 PI(3,4,5)P3로부터 5-포스페이트를 가수분해하는 SYNJ2의 능력의 측정값을 경쟁 검정법(competitive assay)에 의해 기록하였다. 유리 튜브에 100 μl의 SOPS(Avanti Inc., 50 mg / ml in chloroform) 및 50 μl의 콜레스테롤(Sigma Aldrich, 10 mg / ml in chloroform)을 첨가하여 안정화 SOP 지질 믹스(stabilizing SOP lipid mix)(x50)를 제조하였다. 상기 믹스를 알맞은 질소 스팀을 사용하여 공기-건조 시켜 클로로포름을 증발시켰다. 그 후, 증발된 지질 믹스를 상온에서 1분 볼텍싱하여 10 ml의 0.25 mg/ml C12E8 (Avanti Inc.)에 재현탁시켰다. 반응 믹스는 테스트된 화합물과 함께 또는 그것 없이, PBS, DTT, MgCl2(모두 시그마 알드리치사(Sigma Aldrich)로부터 입수), SOP 지질 믹스(x50), 전장의 정제된 SYNJ2(OriGene, cat no. TP315160) 및 PI(3,4,5)P3(Echelon Bioscience, cat no. P-3908)를 포함한다. 일단 PI(3,4,5)P3가 첨가되면, SYNJ2의 5'-포스파타아제 활성에 의해 PI(3,4)P2를 생성하도록 33℃에서 8분간 반응 믹스를 배양하였다. 그 후 PBS, DTT, 검출 단백질(TAPP1의 PH 도메인), SOP 지질 믹스(x50), 형광-표지된 PI(3,4)P2(Echelon Bioscience, cat no. C34M6) 및 EDTA(Sigma Aldrich)를 포함하는 검출 믹스를 첨가하여 반응물의 배양을 중단시켰다. BODIPY® TMR 염료(550 nm 여기(excitation)/580 nm 편광 방출 필터(polarizing emission filters))와 호환되는 적절한 플레이트 판독기 및 필터 세트를 사용하여 형광 편광을 측정하였다. 비표지 PI(3,4)P2 대조군은 에셜론 바이오사이언스사(Echelon Bioscience)로부터 구입하였다(Cat no. P-3408).
실시예
2
SYNJ2의
EGF
-유도성 발현 증가는 유방 세포 침습을
촉진한다
인간 유방 상피세포(MCF10A)는 EGF 패밀리 리간드와 함께 배양하였을 때는 강력한 이동성(migratory) 및 침습성 표현형을 나타내지만(도 1A 및 도 1B), 혈청을 이용한 처리는 세포의 운동성을 추진하기에 불충분하다. EGFR(AG1478), MEK(U0126) 또는 PI3K(Wortmannin)의 억제인자와 함께 EGF의 공배양은 운동성을 감소시키고(도 1C), 이는 MEK/ERK 및 PI3K의 활성 모두가 EGF-유도성 이동에 있어서 필수적이라는 것을 암시한다. 중요하게는, EGFR-유도성 운동성 표현형(motile phenotype)은 425개의 유전자의 전사적 상향조절과 연관이 있다(Amit et al., 2007). 전이를 추진하는 유전자를 확인하기 위하여, 이 유전자-세트를 유방암 세포의 전이성 서브-클론을 생체 내에서 선별하는 동안 상향조절하에 있는 더 큰 유전자 세트와 교차시켰다(Minn et al., 2005). 23개의 중복되는 유전자의 군(도 1D)은 시냅토자닌-2(SYNJ2)를 암호화하는 유전자에 포함되고, 리피드 포스파타아제는 신경교종 세포 침습에 관련된다(Chuang et al., 2004). SYNJ2의 EGF-유도성 상향조절을 PCR 및 면역학적 블로팅으로 입증하였다(도 2A 및 2B).
다음으로, MCF10A 세포를 형질전환시키고, SYNJ2를 안정하게 발현하도록 서브클로닝하였다(GFP 융합으로; SYNJ2-OX, 도 1E). EGF-결핍 배지에 치상하였을 때, SYNJ2-OX 세포는 강화된 기저막(basal) 및 EGF-유도성 이동 및 침습 능력과 함께, 세포막 주름짓기(membrane ruffling)를 특징으로 하는 전-이동(pro-migratory) 표현형을 나타내었다(도 2D 및 2C). 반대로, 작은 간섭 RNA(siRNAs; 도 1G)는 개별적 이동 및 집단 이동뿐만 아니라 세포의 침습도 현저하게 감소시켰다(도 2E, 1H 및 1J). 결론적으로, SYNJ2의 EGF-유도성 상향조절은 유방 세포가 강한(robust) 침습성 표현형을 나타내게 한다.
실시예
3
SYNJ2의
포스파타아제 활성은 유방 세포의
침습성에
있어서
필수적이다
생체 내 실험을 가능하게 하기 위하여, sh대조군(shControl) 또는 SYNJ2-특이적 헤어핀(shSYNJ2; 도 3A)을 발현하는 서브클론뿐만 아니라, SYNJ2 또는 LacZ(대조군) 중 어느 하나를 과발현하는 서브클론도 만들기 위해, 고전이성 MDA-MB-231 유방암 레드 형광 단백질(Red fluorescent protein, RFP)을 발현하는 세포를 사용하였다. 세포를 3D 배양으로 성장시켰을 때(도 4A), SYNJ2의 강화된 발현은 2D 배양(도 3B) 및 광범위한 침습성 암(arm)에 연장된 형태(elongated morphology)를 제공하였다. 반대로, SYNJ2 발현억제는 침습성 패턴을 제거하였다(도 4B). 유사하게는, 과발현은 3.2 배까지로 침습 능력을 강화시켰고(도 3B), 발현억제(도 3C)는 이동 및 침습(도 3D)을 억제하였다. 촉매적 포스파타아제 활성의 역할을 시험하기 위하여, WT SYNJ2 또는 촉매활성이 없는(catalytically-dead) 형태(D388A 및 D726A; 도 4C) 중 어느 하나를 암호화하는 렌티바이러스성 입자를 가진 shSYNJ2의 포스파타아제/뉴클레아제 도메인(Pfam: PF03372) 내의 각각의 보존된 WXGDXN(F/Y)R 모티프(Jefferson and Majerus, 1996)에 점 돌연변이(point mutation)를 도입하였다. WT SYNJ2와는 달리, 돌연변이의 재발현은 침습 능력을 회복시키는데 실패하였으며(도 4D), 이는 SYNJ2의 포스파타아제 활성이 침습성 표현형에 필수적이라는 것을 암시한다.
shSYNJ2 세포를 이동시키는 것에 대한 실패는 주사전자현미경(도 4E) 및 F-액틴 염색 양쪽 모두에 의해 더 뒷받침되며, 그것은 심각한 액틴 조직화 결함(actin organization defects) 및 세포의 길이의 증가(도 4F)를 보였다. 중요하게는, 원형 부분(circular moieties) 주변에 군집화된(clustered) 액틴 패치(actin patches)에도 주목하였다(도 4F; 화살표). 따라서, shSYNJ2 세포의 타임-랩스 현미경 분석은 비정상적인 세포 내 이입성 소포의 존재를 확인시켜 주었으며, 이는 SYNJ2 발현억제가 소포 이동의 경로를 벗어나게 한다는 것을 암시한다. 다음으로, SYNJ2의 세포내 국소화(subcellular localization)를 조사하였다. GFP-SYNJ2를 발현하는 MDA-MB-231 세포의 타임-랩스 이미지(도 3E)뿐만 아니라 항-SYNJ2 항체를 이용한 면역형광(도 3F)도 SYNJ2 분포의 두 가지 주요 패턴을 나타내었다: 리딩 에지에 위치한 작은 주변 조립체(peripheral assemblies)(도 3E에서의 검은색 화살표), 및 세포 중심에 더 근접하게 위치한 큰 조립체의 두 번째 집단(파란색 화살표). 특히, EGFR 리간드(TGF-알파)를 이용한 MDA-MB-231 세포의 짧은 자극 후, SYNJ2는 형성되는 리딩 에지의 아래에서 최근에 만들어진 층상위족의 기저부분에서 빠르게 조립된다(도 3E, 3F). 흥미롭게도, MCF10A 세포를 이용하여 수행된 유사한 분석도 SYNJ2가 처음에는 세포-세포간 간극(junctions)에서 F-액틴과 함께 동시-국소화되지만, EGF를 이용한 자극하에서는 리딩 에지, 전형적으로는 층상위족의 기저부분으로 이동한다(도 3G). 결론적으로, 이들 관찰은 성장인자가 SYNJ2의 발현 레벨뿐만 아니라, 리딩 에지로의 그것의 역동적인 동원(dynamic recruitment) 또한 조절한다는 것을 나타낸다.
실시예
4
배측
막으로의
SYNJ2의
동원은
다이나민
및
Rac1에
의존한다
SYNJ2의 국소화 부위의 역동성을 조사하기 위하여, GFP-SYNJ2 MDA-MB-231을 안정하게 발현하는 서브클론(GFP-SYNJ2 세포)을 만들고, GFP-SYNJ2 반점(puncta)의 형성 및 소모(consumption)를 분석하였다. 이것들을 속도론적으로 구별되는 하위-집단(kinetically distinct sub-populations)으로 분류하였다: 주름막(ruffling membrane)에 국소화된 역동적 반점 및 세포 중심부 쪽의 별개의 부위에 국소화된 반점(도 5A). 특히, GFP-SYNJ2 반점은 RFP-클라트린 경쇄 A(RFP-Clathrin light chain A)(도 5A) 또는 RFP-카베올린 1(RFP-Caveolin 1)(도 6A)을 특징으로 하는 조립체들과 최소한의 겹침(overlap)을 나타내었으며, 이는 클라트린-코팅된 구멍(pits)에 또는 카베올라(caveolae)에의 소수의 국소화를 암시한다. 중요하게는, 새롭게 형성된 주변의(peripheral) 반점은 그것들의 출현이 층상위족의 국소적 형성보다 앞서기 때문에 발생기(nascent) 층상위족으로 알려지고 있다. 반대로, 액틴과 동시 국소화되어 있는 더 중심부에 있고 안정한 반점의 클러스터는 30분까지 지속되었다(도 5B). 따라서, 개별적인 조립체의 추적(tracking)(도 6B, 왼쪽)은 몹시 넓은 분포의 수명(lifetime)을 나타내었다: 짧은-수명(~20-40초, 조립체의 60%), 중간-수명 및 긴-수명(조립체의 ~10%)의 조립체. 중간 그룹의 개시 후에 형광 세기는 지속적으로 증가한 반면, 조립체는 움직임의 관점에서 정지 상태를 유지하였다(도 6B; 오른쪽). 이 역동적 패턴은 클라트린-코팅된 구멍의 그것과 닮았으며(Ehrlich et al., 2004), 수송 중간물질의 형성 및 소모를 시사한다.
배측 막에서의 주로 GFP-SYNJ2의 바이모달성 구획화(compartmentalization)는 동시형광(epifluorescence)(적색; Z 차원에서 변화를 위한 상대적 세기) 및 내부 전반사(total internal reflection) 현미경(TIRF, 녹색; ~ 200 nm 깊이로 제한됨) 모두를 사용하는 실험에서 동시발생적 출현(synchronous appearance) 및 형광 시그널의 소실에 의해 보강된다. 반점이 그것들의 수명 내내 노란색을 나타내기 때문에, 본 발명자들은 SYNJ2가 배측 원형질막의 평평한 면(plane) 안에 모인다고 결론지었다. 억제인자의 패널을 사용함으로써, 조립체는 콜레스테롤 결핍에 의해 극적으로 억제되며(도 6C; 왼쪽), 이는 콜레스테롤이 풍부한 막의 마이크로도메인이 배측 막으로 SYNJ2를 동원하는데 필요하다는 것을 암시한다. 유사한 억제 효과가 보르트만닌에 의해 유도되었으며(도 6C; 오른쪽), 이는 PI3K의 역할을 암시한다. 또 다른 동원은 클라트린-의존성 및 클라트린-독립성 담체의 절단(scission) 단계를 매개하는 커다란 GTPase인 다이나민의 억제인자인 Dyngo-4a를 사용하여 밝혀졌고, 이 억제는 U-형태의 함입(invagination) 중간물질의 축적을 야기한다(Macia et al., 2006). Dyngo-4a가 원형질막에서 SYNJ2의 역동적 조립체를 강력하게 저지하였기 때문에(도 5D), 본 발명자들은 SYNJ2가 다이나민에 의해 조절된 발생기의 수송 중간물질로 동원되었다고 결론지었다. 다이나민은 세포 이동과 침습의 조력자(facilitator)로서 관련되어왔기 때문에(Kruchten and McNiven, 2006), SYNJ2와 그것의 물리적 상호작용을 테스트하였다. 이 실험은 세포 내 이입 및 액틴-기반 이동 양쪽 모두에서의 다이나민의 확장된 역할과 함께, 활성 다이나민 및 SYNJ2 사이의 복합체 형성(도 5E)을 확인시켜 주었다.
SYNJ2는 GTP-로딩된 Rac1과 물리적으로 상호작용할 수 있고(Malecz et al., 2000), Rac1의 유도성 활성화는 내재화(internalization) 및 그 다음의 재활용(recycling)을 필요로 한다(Palamidessi et al., 2008). 이런 이유로, Rac1과 동시에 일어나는 SYNJ2의 주변 반점의 동시발생을 테스트하였다. 사실, 내재적 Rac1의 면역염색은 GFP-SYNJ2의 주변 반점과의 동시-국소화를 밝혀내었다(도 5F). 더욱이, (NSC-23766을 이용한) Rac1으로의 GTP 로딩의 억제는 GFP-SYNJ2 반점의 수를 극적으로 감소시켰다(도 5G). 상호보완적으로, SYNJ2 발현억제는 MDA-MB-231 세포에서 GTP-로딩된 Rac1의 레벨을 감소시켰다(도 5H). SYNJ2의 막으로의 동원에서 Rac1과 액틴 세포골격(cytoskeleton)의 조절 역할에 따라, 라트룬쿨린(Latrunculin)을 이용한 액틴 역동성의 억제는 GFP-SYNJ2 역동성을 없앴다(도 6D). 종합하면, 이들 결과는 콜레스테롤, 3'-포스포이노시티드, 액틴 및 활성 Rac1에 의존하는 다이나민-매개성 세포 내 이입 경로(dynamin-mediated endocytic pathway)와 함께 주변 SYNJ2 조립체와 결부되어 있다. 특히, 이 경로는 이동하는 섬유아세포의 리딩 에지에서 빠른 막과 부착의 교체(turnover)를 가능하게 하는 클라트린-독립성 담체와 몇몇의 속성을 공유한다(Howes et al., 2010).
실시예
5
SYNJ2는
세포 표면 수용체의 소포 수송을
조절한다
비록 EGF-처리된 shSYNJ2-MCF10A 세포가 대조군 세포와 관련하여 높은 레벨의 전체 그리고 인산화된 EGFR을 나타내었다 할지라도, 이것은 ERK의 높은 활성화보다는 낮은 것으로 이해된다(도 7A). 이 점에 대하여, SYNJ2 발현억제는 커진 세포내 소포에 EGFR을 포집(trapped)한다는 점에 주의하여야 한다(도 7B). 포집(trapping)과 일치하게, MDA-MB-231 세포의 면역학적 블로팅은 EGFR 레벨이 siSYNJ2 세포에서는 안정화되었음을 유사하게 보여주었지만(도 8A), 두 가지 방법의 사용에 의한 표면 EGFR의 정량은 현저하게 낮은 표면 레벨을 나타내었다(도 8B). EGFR의 세포내 포집은 그것들의 잘-특성화된 화학주성 기능(Mouneimne et al., 2006; van Rheenen et al., 2007), EGFR은 유방세포의 리딩 에지에 국소화되지만 shSYNJ2 세포의 EGFR은 그것들의 극성 분포(polarized distribution)를 잃고 커다란 액틴으로 도배된(actin-decorated) 소포에 축적된다는 것과 일맥상통하는 기능적인 결과를 가진다(도 8C). 특히, shSYNJ2 세포에서 관찰된 EGFR 수송 결함은 WT SYNJ2에 구제될 수 있으나, 촉매적 활성이 없는 형태에 의해서는 구제될 수 없고(도 7C), 이는 SYNJ2의 포스파타아제 활성이 EGF의 구배(gradients)에 반응하는 화학주성을 매개하는, 리딩 에지와 EGFR의 왕복 소포 수송에 필수적이라는 것을 나타낸다. 이 모델과 일치하게, shSYNJ2 세포는 EGF의 구배에 따라 이동하는 능력을 심각하게 잃어버린다(도 8D).
SYNJ2-결핍 세포에서의 EGFR의 비정상적인 축적은 EGFR 운반에서의 결함, 억제된 재활용, 또는 손상된 분해를 위한 분류(sorting), 유비퀴틴화에 의해 조절되는 프로세스를 반영할 수 있다(Goh et al., 2010). 손상된 분류와 일치하게, SYNJ2-결핍 세포는 현저하게 높은 기저 EGFR의 유비퀴틴화를 나타내었고, 그것은 EGF에 반응하여 단지 약하게 변경되었을 뿐이다(도 8E 및 7D). 게다가, 티로신 1045의 인산화에 의한 분해를 위해 태그되었음에도 불구하고(유비퀴틴 리가아제 c-Cbl을 위한 도킹 부위(docking site); 도 8F), EGF 자극 실험은 정상적인 활성화(티로신 1068 인산화)를 확인시켜 주었으나, shSYNJ2 세포에서는 결함성 분해를 확인시켜주었다(도 8G). 재활용 결함을 해결하기 위하여, EGFR의 약한 재활용뿐만 아니라 트랜스페린 수용체(transferrin receptor, TfR)의 광범위한 재활용에도 형광성 리간드를 사용하였다. 비록 TfR 내재화에는 영향을 주지 않았으나, 재활용은 shSYNJ2 세포에서 현저하게 감소하였고, 반대로 SYNJ2-OX 세포에서는 현저하게 증가되었다(도 8H 및 7E). 비슷하게, 유세포분석기(flow cytometry) 분석은 형광성-EGF의 결함성 재활용을 나타내었고(도 8I), 생세포 이미지는 SYNJ2-결핍 세포의 커다란 소포 내로의 리간드 축적을 확인시켜 주었다. 결론적으로, 이들 결과는 SYNJ2가 EGFR 및 TfR 양쪽 모두의 재활용을 추진하는데 필수적이라는 것을 나타낸다.
실시예
6
SYNJ2
발현억제는
포스포이노시톨
리피드의
항상성을 교란시키고, 세포 내 이입 및 부착 모두를
변경한다
세포 내 이입성 시스템(endocytic system)은 특정 포스포이노시티드(PI)로 정의되는 몇몇의 구별되는 구획을 유지하며(Gruenberg and Stenmark, 2004), 본 발명의 분석은 SYNJ2에의 강력한 의존성을 밝혀내었다. 예를 들어, EEA1, PI(3)P-바인더에 대한 초기 엔도솜의 조사에 의해, SYNJ2-결핍 세포에서 그것의 공간 조직(spatial organization)이 현저하게 변경되어 있음을 발견하였다(도 9A). 유사하게는, GFP-태그된 Rab4를 이용한 재활용 구역의 조사는 shSYNJ2 세포의 원형 액틴 패치(patches)와의 강력한 관련성을 밝혀내었다(도 10A). 초기 엔도솜의 다른 마커인 Rab5의 분포 또한 SYNJ2에의 의존을 반영한다(도 10B). 반면, Rab5-양성 소포의 수는 shSYNJ2-결핍 세포에서 현저히 낮아졌고, 그것들의 평균 크기는 증가하였으며, 그것들은 원형 액틴 패치에 부분적으로 국소화되었다(도 9A). 포스포이노시티드에서의 근본적인 변경을 밝혀내기 위하여, 생합성적으로 표지된 shCtrl 및 shSYNJ2 MDA-MB-231 세포를 비교한 후, 그것들의 포스포리피드를 추출하였다(도 10C). 그 결과들은 주로 PI(3)P, 그러나 PI(4,5)P2 및 PI(3,5)P2도 shSYNJ2 세포에서 높은 레벨로 존재하는 반면 PI(4)P의 레벨은 바뀌지 않고 유지되었고, PI(3,4)P2 및 PI(3,4,5)P3의 레벨은 모두 이 방법에 의해 거의 검출할 수 없음을 보여주었다. 이들 결과들은 SYNJ2가 주로 PI들의 D5 위치를 표적으로 한다는 생각을 확인시켜줌에도 불구하고, 본 발명자들은 오히려 관찰된 한정적 전역 효과(global effect)가 더욱 큰 국소적 차이를 나타낸다고 가정하였다. 결론적으로, 이들 관찰은 SYNJ2가 초기 엔도솜에서의 전달물질 분류(cargo sorting)뿐만 아니라 차후의 재활용 단계까지도 조절한다는 것을 재차 확인하였다.
EGFR과 비슷한 RTK의 재활용과 마찬가지로, 인테그린의 소포 수송 및 팍실린(Paxillin)과 같은 하류쪽 파트너와의 그것들의 상호작용은 세포 이동 및 초점 부착부(focal adhesion, FA)의 성숙에 중요한 역할을 한다(Guo and Giancotti, 2004). 따라서, 베타-1 인테그린 및 인산화된-EGFR(pEGFR)은 MDA-MB-231 세포의 FA에 국소화된다. 그와 대조적으로, 커다란 소포에서의 비정상적인 축적으로 인하여, 두 가지 단백질 모두 SYNJ2-결핍 세포의 주변부에의 국소화에 실패하였다(도 10D, S5B 및 S5C). 더욱이, 성숙한 FA의 마커로서 팍실린을 사용하여, FA는 shSYNJ2 세포에서 둥글고 상대적으로 짧은 외관인 것으로 추정된다는 것을 발견하였다(도 9D). 종합하면, 이들 관찰은 SYNJ2가 두 가지 방법을 사용하여 세포 확산(cell spreading)을 측정함으로써 조사된 시나리오인 기질 부착(substrate adhesion)에 필요하다는 것을 의미한다(도 10E 및 10F). 그 결과는 인테그린 및 RTK 양쪽 모두의 FA로의 결함성 운반에 기인한 shSYNJ2 세포의 감쇠된(attenuated) 부착을 입증하였다.
실시예
7
SYNJ2는
침습위족의
조립을
조절한다
MDA-MB-231 세포의 매트릭스-기반 3D 배양은 보통 V자 모양(wedge-shaped)의 돌출부를 나타내지만, shSYNJ2 세포는 둥그스름한 신장(roundish extensions)을 나타내며(도 11A), 이는 불완전한 매트릭스 분해를 암시한다. 이를 테스트하기 위하여, MMP-9의 공초점 면역형광 이미지를 얻었고, shSYNJ2 스페로이드는 그것들의 경계에서 MMP-9의 존재비(abundance)의 상대적 격감(sharp decrease)을 나타내었으며(도 11A), 이는 손상된 분비에 기인한 것일 가능성이 있다. 사실, 조정 배지(conditioned media)에서 수행된 자이모그래피 검정법은 siSYNJ2 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에 의한 결함성 MMP-9 분비를 확인시켜주었으나, MMP-2 분비는 변경되지 않고 유지되었다(도 12A). 반대로, SYNJ2를 과발현하는 세포에 의해 조정된 배지는 MMP 분비에서의 SYNJ2의 선상 개입(in line involvement)으로, MMP-9의 활성에 상당한 증가를 나타내었다(도 11B).
국소 단백질 분해(focal proteolysis)를 가시화하기 위하여, 세포를 가교-결합 형광성 젤라틴상에 치상하고, 침습위족으로 불리는 액틴-중심성(actin-centered)의 매트릭스 분해 세포 소기관(matrix-degrading organelles)에 대해 조사하였다(Murphy and Courtneidge, 2011). 이전의 보고에 따라, 활성 매트릭스 단백질 분해는 세포체(cell body)의 아래쪽에 국소화된 액틴 점(actin dots)과 일치한다. 중요하게는, SYNJ2-GFP 반점은 이들 구조들과 동시-국소화되며(도 11C, 화살표), 이는 도 5B에 나타낸 액틴-관련 긴 수명의 반점과 닮았다. SYNJ2의 발현 레벨은 침습위족의 발생과 명확하게 관련이 있고; SYNJ2 과발현은 침습위족-포함 세포의 단편을 거의 두 배로 늘리지만, siSYNJ2는 침습위족의 발생 정도를 현저하게 감소시키며(도 11D), 이는 인과관계(causal relationship)를 나타낸다. 다음으로, SYNJ2와 잘 특성화된 침습위족의 마커인 코르탁틴 사이의 잠재적인 물리적 연관성을 조사하였고, SYNJ2와 코르탁틴은 침습위족 및 리딩 에지 양쪽 모두에 동시 국소화될뿐만 아니라(도 12C), 동시 면역침강(co-immunoprecipitate)도 된다는 것을 발견하였다(도 12B). SYNJ2에 대한 촉발 역할(driving role)을 확고히 확립하기 위하여 TKS5를 관찰하였고, PI(3,4)P2 및 코르탁틴의 바인더는 침습위족의 이정표로서의 역할을 한다(Courtneidge et al., 2005). 예상한 바와 같이, 내재적 TKS5는 대조군 MDA-MB-231 세포에서의 매트릭스 분해의 다수의 배측 부위에 국소화되었지만, 어떠한 활성 부위도 siSYNJ2 세포에서 거의 발견되지 않았고, TKS5는 그것의 배측 위치를 잃어버렸다(도 6E; X-Y 및 Z 패널). 게다가, 침습위족성 TKS5는 PI(3,4)P2에 고정되므로(Oikawa et al., 2008), PI(3,4)P2-결합 도메인, 즉 Tapp1의 PH 도메인을 프로브로서 사용하였다. 이전의 보고들과 일치하게, pH 도메인의 이소성(ectopic) 발현은 침습위족의 수는 감소시켰으나, 그럼에도 불구하고 남아있는 시그널은 TKS5 및 액틴 중심과 함께 동시에 국소화된다(도 12D). 결론적으로, SYNJ2는 TKS5의 참여(engagement)에 선행하는 단계에 필요한 것으로 나타났고, 이는 PI3K(Yamaguchi et al., 2011)와 SYNJ2의 순차적인(sequential) 작용과 일치하였으며, 각각 PI3K의 EGFR-유도성 활성화 부위에 TKS5를 고정시키기 위해 PI(3,4,5)P3를 생성한 후 PI(3,4)P2를 생성한다.
EGFR-PI3K-SYNJ2 시나리오에 의거하면, 단백질 분해적 활성(proteolytically active)의 침습위족에서 EGFR의 활성형(pEGFR)을 검출하였으나, SYNJ2-결핍 세포의 EGFR은 팽창된 소포에 국소화되어 있었다(도 11F). 국소 수용체 활성화에 관련된 메커니즘은 여전히 알려져 있지 않다. 하나의 모델에 따라, MMP-7 및 CD44를 포함하는 복합체에 의한 헤파린-결합 EGF(heparin-binding EGF, HB-EGF)와 같은 프로-리간드(pro-ligand)의 절단은 EGFR을 국소적으로 자극할 수 있다(Yu et al., 2002). 이 모델에 의거하면, SYNJ2 존재비는 EGFR 리간드의 분비와 관련이 있으며(도 11G), 침습위족의 액틴 중심과 CD44의 동시 국소화를 검출하였다(도 12E). 비슷하게는, 유세포분석기를 사용하여 CD44의 표면 발현이 대조군 세포에 비례하여 shSYNJ2 세포에서 강력하게 억제되었음을 발견하였다(도 12F). 침습위족의 성숙에 있어서 또 다른 중요한 단계는 가용성 MMP를 활성화시키는 막 유형-1 매트릭스 메탈로프로테이나아제(membrane type-1 matrix metalloproteinase, MT1-MMP)의 동원이다(Wang and McNiven, 2012). 따라서, 대조군 세포에서 MT1-MMP는 침습위족 돌출부의 부위와 일치하지만, siSYNJ2 세포의 MT1-MMP 분자는 커다란 응집체를 형성하며, 이는 매트릭스 분해와는 관련이 없다는 것을 발견하였다(도 9E). 종합하면, 이들 관찰은 SYNJ2가 프로테아제 및 두 개의 이전에는 인정받지 못했던 상주하는(residents) CD44와 활성 EGFR 모두를 이 세포 소기관으로 표적화하기 위한것일뿐만 아니라, 침습위족의 프라이밍(priming)에 필수적이라는 것을 나타낸다.
실시예
8
SYNJ2는
유방 동물 모델에서 종양의 성장 및 전이 확산을
촉진한다
생체 내 전이성 파종(dissemination)에 대한 SYNJ2의 효과를 평가하기 위하여, MDA-MB-231-RFP 세포(및 파생세포)를 암컷 마우스의 유방 지방 패드 안으로 이식하고, 2주 또는 6주 후에 종양의 크기(도 13A) 및 전이(도 13B)를 모두 측정하였다. 원발성 종양(primary tumor)의 성장은 shSYNJ2와 '비능동적 구제(inactive rescue)'(shSYNJ2+SYNJ2CD)군에 비해 shCtrl과 shSYNJ2+SYNJ2WT("능동적 구제(active rescue)") 군에서 더욱 현저하게 빨랐다. 전이성 거동(behavior)은 SYNJ2와 유사하게 관련이 있으며; shSYNJ2 및 '비능동적 구제' 군은 국소(local) 및 원격(distant) 림프절에 대한 전이성 확산에 현저한 감소를 보였다(도 13B 및 14). 원격 전이를 조사하기 위하여, 마우스를 희생시키고, 그것들의 폐를 평가하였다. shSYNJ2 세포 또는 '비능동적 구제' 세포가 이식된 동물의 폐는 shCtrl 또는 '능동적 구제' 세포가 접종된 동물과 비교하여 전이의 수와 크기에 극적인 감소를 나타내었다(도 13C). 종합하면, 이들 결과는 전이 촉진에 SYNJ2가 연루되어 있음을 보여준다.
유사하게는, SYNJ2를 과발현하는 이종이식편(xenografts)을 관찰하였다. 예상한 바와 같이, SYNJ2-OX 세포는 종양이 더 빠르게 성장하게 하였고(도 13D), 그것들은 또한 림프절 전이(nodal metastases)의 조기 발생을 나타내었다(도 13E). 강한(robust) 림프관 침습과 일치하게, SYNJ2-OX 세포가 이식된 동물의 폐는 전이의 수의 증가를 나타내었다(도 13F). 다음으로, 혈관내 침투(intravasation) 또는 혈관외 유출(extravasation)에 대한 SYNJ2의 효과를 테스트하였다. 이런 이유로, MDA-MB-231-RFP 세포의 서브클론을 암컷 마우스의 혈액의 흐름(circulation)(꼬리 정맥) 내로 직접 주사하고, 폐의 군체 형성(lung colonization)(혈관외 유출)의 수를 측정하고, 또는 그것들을 지방 패드 내로 이식하여 혈중 종양 세포(circularing tumor cells, CTCs; 혈관내 침투)로서 혈액에서의 수를 측정하였다. 이들 실험은 각각의 원발성 종양 사이에서의 크기 차이를 고려한 것임에 주의한다. 정규화된 결과는 SYNJ2가 혈관내 침투(p = 0.0031) 및 혈관외 유출(p = 0.0082, 도 13G) 양쪽 모두에 필요하다는 것을 나타낸다. 이 결론을 GFP-SYNJ2 과발현 세포를 사용하여 추가로 테스트하였다(도 13H). 특히, 이 실험에서 얻어진 세포내 침투 결과는 통계학적 유의성을 나타내었으나, 원격의 기관을 일혈시키고 군집화시키는데 더 나은 SYNJ2-OX 세포의 능력은 유의함에 도달하지 못하였고, 이는 국소 및 원격 전이에서 관찰된 SYNJ2의 강력한 효과가 주로 림프 및 혈관 내로의 강화된 혈관내 침투때문임을 암시한다.
실시예
9
SYNJ2는
공격적 인간 유방 종양과 연관이
있다
인간의 암에 대한 SYNJ2의 관련성을 해결하기 위하여, NCI-60 패널의 60개의 인간 암 세포주에서 SYNJ2의 전사체 레벨을 분석하였다. 운동성 표현형에 대한 기여도에 의거하여, SYNJ2의 높은 전사체 레벨은 간엽성(mesenchymal) 표현형과 연관이 있음을 발견하였다. 다음으로, 유방암종 NJ2의 일련의 331개의 파라핀-포매 샘플을 면역염색하였다(도 16A). 중요하게는, SYNJ2의 발현 세기는 HER2 과발현(p < 0.001) 및/또는 에스트로겐 수용체의 결여(p < 0.001)로 정의되는 예후적으로 불리한 하위유형과 분명히 연관되어 있다. 그러나, SYNJ2의 존재비 및 수명, 조직학적 하위유형, 액와 림프절(axillary lymph node) 상태 및 분화 등급(differentiation grade) 사이에 어떠한 현저한 연관성도 발견되지 않았다. 흥미롭게도, SYNJ2의 염색 패턴 또한 다양하였으며; HER2+ 종양은 주로 세포막질성(membranal) 염색을 나타내었지만, 루미날(luminal) 및 삼중음성(triple negative) 종양은 세포질성(cytoplasmic) 염색을 나타내었다(도 16B). 이 결과를 뒷받침하기 위하여, 두 집단의 유방암 샘플에서 SYNJ2 mRNA 레벨을 분석하였고, 짧은 환자의 생존율과 관련성이 있음을 발견하였다(도 16C). 대체적으로, 이들 관찰은 유방암의 진행에서의 SYNJ2의 관여를 뒷받침하지만, 전사체 상향조절의 배후에 있는 메커니즘은 미해결 상태이다.
요약하면, 상기 관찰들은 임상학적 데이터 및 시험관 내 실험과 함께 동물에서 이루어졌으며, 이는 침습위족 및 리딩 에지로의 세포 표면 분자의 왕복 수송에서 있어서의 포스포이노시티드의 주요한 역할 때문에 SYNJ2에 의한 이노시톨 리피드의 탈인산화가 전이성 프로세스에 매우 중요하다는 것을 명확히 보여준다. 아래에 작동 모델(working model)을 나타내었으며(도 15), 종양 진행의 넓은 맥락에서의 SYNJ2의 다수의 기능을 논의한다.
실시예
10
SYNJ2의
5' 포스파타아제 활성의 선택적 억제인자
SYNJ2 포스파타아제 활성의 선택적 억제인자를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 분자들은 공간 내에서 끊임없이 회전하고 움직이고 있으나, 일단 다른 커다란 성분(예를 들어, 단백질)에 결합되면 그것들의 움직임이 극적으로 제한된다는 원리에 의존하는 형광 편광 경쟁 검정법을 사용하였다. 움직임에서의 이러한 변화는, 비결합된 상태에서 매우 낮은 편광 판독을 야기하는 형광성 분자들(즉, 프로브)을 사용하여 검출되고 측정될 수 있지만, 이들 분자들이 결합하는 검출자(예를 들어, 결합 단백질)가 용액에 첨가되는 경우 상기 형광성 분자들은 용액 내에서 편광 판독을 증가시키는 한정된(confined) 조성물에서 안정화된다(도 17A).
수행된 선별에서, 본 발명자들은 서로 다른 화합물의 존재하에서, PI(3,4)P2를 생산하기 위해 PI(3,4,5,)P3의 5' 위치를 탈인산화시키기 위한 SYNJ2의 효소 활성을 측정하였다. 일단 효소 반응이 완료/정지되면, PI(3,4)P2 생성물을 포함하는 용액을 PI(3,4)P2 결합 단백질(검출자)과 형광성 PI(3,4)P2(프로브)의 혼합물과 혼합하였다. 사용된 검출 단백질은 PI(3,4)P2와 선택적으로 결합하는 정제된 Tapp1의 PH-도메인이다(SEQ ID NO:15). 도 17B에 나타낸 바와 같이, 결합된 PI(3,4)P2 형광 프로브가 SYNJ2의 효소 활성에 의해 생성된 비표지된 PI(3,4)P2로 치환되었기 때문에, 이 검정법에서 측정된 편광값은 감소하였으며, 이 용액에서 비결합된 형광 프로브의 양은 증가하였다.
아래의 표 2는 SYNJ2에 의해 PI(3,4)P2의 생성을 억제할 수 있는, 이 방법에서 사용하여 확인된 다양한 화합물을 묘사한 것이다.
논의
세포 이동 및 암 전이의 통합적인 마스터 조절자로서의 SYNJ2의 기능이 입증되었으며, 이는 특정 막 서브-도메인의 동일성(identity)을 결정하는 2차 전달자(second messengers) 및 이정표(signposts) 양쪽 모두로서 작용하는 PI 포스포리피드의 레벨을 조절하는 그것의 능력에 기인한 것일 가능성이 있다. 다수의 SYNJ2의 작용의 또 다른 반영은 주로 침습위족 및 층상위족에 대한 바이모달성(bimodal) 배측 국소화(ventral localization)이다. 따라서, SYNJ2는 액틴 역동성(actin dynamics)의 중요한 조절자(예를 들어, 다이나민, 코르탁틴 및 Rac1)와 함께 물리적 복합체를 형성한다. SYNJ2의 작용을 이해하기 위한 하나의 핵심은 세포 내 이입성 수송(endocytic trafficking)을 조절하는 능력이다. 끊임없이 액틴-기반 돌출부(actin-based protrusion)를 공급하는 소포에서의 원형질막 일부의 빈번한 패키징은 세포의 이동을 추진한다(Ridley, 2011). 층상위족의 SYNJ2는 놀랄만한 역동성을 나타내며(도 3B), 생세포 이미지는 SYNJ2 동원(recruitment)이 새로운 층상위족 형성의 부위를 표시한다는 것을 나타낸다. 리딩 에지에 위치하는 SYNJ2 분자는 다이나민, Rac1, 액틴 중합 및 콜레스테롤에 의존하지만, 그것의 분포는 카베올린-1 및 클라트린의 그것과는 구별되기 때문에, 본 발명자들은 그것이 클라트린-독립성 담체(Clathrin-independent carriers, CLICs)의 다이나민-의존성 변이체를 대표하며, 이것이 리딩 에지에서의 막의 턴오버(turnover)를 지속시킨다고 추정하였다(Howes et al., 2010).
일련의 명쾌한 연구는 뉴런에서의 시냅스성 소포 재활용에 SYNJ1가 연루되어 있음을 보여주었다(Cremona et al., 1999). 마우스에서, SYNJ1의 결실은 정상-상태(steady-state) PI(4,5)P2의 상승, 클라트린-코팅된 소포의 축적 및 세포 내 이입 후(post-endocytic) 소포 재이용(reavailability)의 지연을 야기한다(Mani et al., 2007). 이들 관찰은 소포의 피복 배출(vesicle coat shedding)을 가능하게 할 수 있는 PI(4,5)P2의 탈인산화가 표현형의 기저를 이루고 있다는 것을 암시한다. 유추하자면, 본 발명의 SYNJ2-결핍 유방세포는 활성 EGFR의 세포내 축적을 나타낸다. 세포 내 이입 경로의 수용체 유비퀴틴화 상태 및 마커들은 수송이 분류(sorting) 엔도솜에서 정지되고, 거기에서 내재화된 수용체는 정상적으로 재활용 또는 분해 중 어느 하나로 이동된다는 것을 나타내었다. 상상컨대, 상기 결함은 소포의 피복 또는 그것의 액틴 코멧 꼬리(comet tail)와 연관된 PI(4,5)P2-결합 단백질을 분해하지 못하는 것에 기인한다(Kaksonen et al., 2003). 따라서, SYNJ1 제거(ablation)에 대해 관찰된 시냅스 전달(synaptic transmission)에서의 결함과 유사하게, SYNJ2의 손실은 운동성에 필수적인 표면 분자의 수송을 정지시키기 때문에 세포 이동 및 침습을 심각하게 손상시킨다.
SYNJ2-결핍 세포에서 관찰된 각각 초기(early) 및 말기(late) 엔도솜의 조절자인 PI(3)P 및 PI(3,5)P2의 증가(도 5C)는 추가적인 수송 메커니즘을 제시한다. PI(3,5)P2의 조절 역할은 인테그린 및 몇몇의 Rab 단백질과 같은 다중 바인더의 확인에 의해 보강되었다(Catimel et al., 2008). PI(3)P는 PIKfyve에 의해 인산화되며, 5-키나아제(5-kinase)는 MT1-MMP를 침습위족으로 운반하는 경로인 엔도솜과 트랜스-골지 네트워크(trans-Golgi network) 사이에서의 순환(cycling)에 연루되어 있다(Poincloux et al., 2009). 그러므로, PI(4,5)P2의 탈인산화에 더하여, SYNJ2는 초기 엔도솜의 PI(3)P 풀(pool)을 미세 조정(fine tune)하기 위해 PI(3,5)P2를 가공하고, EGFR뿐만 아니라 MT1-MMP의 세포 내 이입 및 인테그린의 재활용 모두를 조정하는 것으로 예상된다.
동물 안으로 도입하였을 때, shSYNJ2 MDA-MB-231 세포는 림프절 및 혈관에 도달하는 능력이 감소되었기 때문에, 전이 능력(potential)을 심하게 잃어버린다(도 13A-H). 이들 결과와 시험관 내 표현형을 통합시키기 위한 시도로, 도 15에 나타낸 것은 세포 운동성에서의 SYNJ2의 역할의 근본적인 메커니즘이다. 따라서, 핵심 사건은 SYNJ2의 EGF-유도성 상향조절과 그 결과에 따른 세 가지 포스포이노시티드: PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 및 PI(3,5)P2의 결핍(depletion)을 수반한다. SYNJ2-매개성 PI(4,5)P2 탈인산화는 포스포리파아제 C-감마(phospholipase C-gamma)에 의한 PI(4,5)P2의 분해 및 PI3K에 의한 인산화와 병행되어, PI(3,4,5)P3를 생성한다. 총괄적으로, EGF에 의한 세 가지 효소의 자극은 원형질막으로부터 PI(4,5)P2 바인더군을 분리하고, 또한 PI(4,5)P2가 없는 세포 내 이입성 소포를 생성한다. 동시에, SYNJ2는 PI(3,4,5)P3를 PI(3,4)P2로 전환하며, 이는 침습위족 형성에 필수적이다. 이 모델에 의거하여, PI3K가 침습위족의 형성에 필요하다는 것이 보고되어 있다. 일단 제 자리에서, PI(3,4)P2는 TKS5와 결합하고, 침습위족 내에서 코필린이 액틴의 반화살촉 말단(barbed end)을 생성할 수 있게 하는 다이나민(Dynamin) 및 코르탁틴-중심 복합체(Cortactin-centered complex)를 응집한다. 본 발명의 결과에 따르면, SYNJ2는 또한 다음의 침습위족 성숙 단계, 즉 MMP의 분비 및 MT1-MMP 및 CD44와 같은 다른 표면 분자들의 운반에도 관여한다. 유사한 방식으로, SYNJ2는 리딩 에지로의 EGFR과 인테그린의 운반을 조절하고, 코필린을 활성화시키는 것으로 보이며, 층상위족 돌출부의 형성을 지시하는 중추적 사건을 조절한다.
시험관 내에서의 세포 이동 및 동물에서의 전이에 대한 SYNJ2의 역할에 의거하여, 본 발명의 유방암 샘플의 조사는 질병의 공격적인 하위형태에서 SYNJ2 mRNA 및 단백질 레벨의 현저한 상향조절을 관찰하였다. 게다가, 두 집단으로부터의 데이터를 사용하여, 높은 SYNJ2 mRNA 발현과 짧은 생존률의 유방암 환자 사이에서의 관련성을 관찰하였다.
요약하면, 본 연구는 필수적인 전이-개시성 사건(metastasis-initiating events)을 침습위족의 이정표인 PI(3,4)P2를 생성할 뿐만 아니라, PI(4,5)P2에서의 순차적 작용이 리딩 에지에서 액틴 역동성을 조절하는, PI3K의 EGF-유도성 국소 활성화 및 SYNJ2의 전역 상향 조절에 따른 결과로 보았다. 게다가, 본 연구는 SYNJ2에 의한 PI(3,4)P2의 생성을 선택적으로 억제하는 다양한 화합물들을 확인하였다.
비록 본 발명은 그것들의 특정 구현들과 함께 기술하였지만, 많은 변형들, 변경들 및 변화들이 당업자들에게 이해될 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 이는 부가된 청구항의 정신 및 넓은 범위에 포함되는 모든 이러 한 변형들, 변경들 및 변화들까지도 포괄한다.
이 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원서는 각 개별적인 간행물, 특허 및 특허 출원서가 특별히 그리고 개별적으로 참조로서 본원에 포함되는 것으로 나타내지는 바와 같은 정도로, 명세서 내에 참조로서 그것의 전체 내용이 본원에 포함된다. 또한, 이 명세서에서 임의의 참조의 인용 또는 식별은 이러한 참조를 본 발명에 대한 선행기술로 이용할 수 있다고 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 섹션의 제목이 사용될 경우, 그것들은 반드시 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
참조
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atggccctga gcaaagggct gcggctgctg gggcgcctgg gggccgaggg ggactgtagc 60
gtgctgctgg aggcgcgcgg ccgcgacgac tgcctgctgt tcgaggccgg cacggtggcc 120
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aagccagagg cagccccact tcttggtgat tatcaggacc ccttctggaa ccttcttcac 4260
caccctaaac tgttgaataa cacttggctt tctaagagct cagacccttt ggactcagga 4320
accaggagcc ccaaaagaga tcccatagac ccagtgtcag ctggcgcttc agctgccaag 4380
gcagagctgc caccagatca tgaacacaaa accttaggtc actgggtgac aatcagtgac 4440
caagaaaaga ggacagcact gcaggtgttt gacccactgg caaaaacatg aatggccctg 4500
agcaaagggc tgcggctgct ggggcgcctg ggggccgagg gggactgtag cgtgctgctg 4560
gaggcgcgcg gccgcgacga ctgcctgctg ttcgaggccg gcacggtggc cacgctggct 4620
ccagaagaaa aggaagtcat taaaggacag tatggcaagc tcacggacgc gtacggctgc 4680
ctgggggagc tgaggctgaa atctggtggc acgtctctga gcttcctggt gttggtgaca 4740
ggctgcacat ctgtgggcag aattccagat gctgaaatct acaaaatcac tgccactgac 4800
ttttaccctc ttcaggaaga ggccaaggag gaggaacgcc tcatagcttt gaagaaaatc 4860
ctcagctcgg gggtgttcta tttctcatgg ccaaacgatg ggtctcgctt tgacctgact 4920
gtccgcacgc agaagcaggg ggatgacagc tctgaatggg ggaactcctt cttctggaac 4980
cagctgttgc acgtgccctt gaggcagcac caggtgagct gctgtgactg gctgctgaag 5040
atcatctgcg gggtggtcac catccgcacc gtgtatgcct cccacaagca ggccaaggcc 5100
tgcctcgtct ctcgcgttag ctgtgagcgc acaggcactc gcttccacac ccgtggcgtg 5160
aacgacgacg gccatgtgtc caacttcgtg gagacagagc agatgattta catggacgat 5220
ggagtgtcat cttttgtcca gatcagaggc tccgttccgc tgttctggga acagccaggg 5280
cttcaggttg gctcccatca tctgagactc cacagaggcc tggaagccaa tgcccctgct 5340
ttcgacaggc acatggtgct tctgaaggag cagtacgggc agcaggtggt cgtgaacctt 5400
ctgggaagca gaggcggaga ggaggtgctc aacagagcct tcaagaagct gctctgggct 5460
tcttgccacg cgggcgacac gcctatgatc aattttgact tccatcagtt tgccaaaggt 5520
gggaagctag agaaattgga gaccctcttg aggccacagt taaagctgca ctgggaagac 5580
ttcgatgtgt tcacaaaggg ggagaacgtc agtccacgtt ttcagaaagg cactttgcgg 5640
atgaactgtc ttgactgcct ggaccgaacc aacactgtgc agagcttcat cgcgctcgag 5700
gtcctgcatc tgcagctcaa gaccctgggg ctgagttcaa aacccatcgt tgaccgcttt 5760
gtggagtcct tcaaagccat gtggtctctg aatggccaca gcctgagcaa ggtgttcaca 5820
ggcagcagag ccctggaagg gaaggccaag gtggggaagc tgaaggatgg agcccggtcc 5880
atgtctcgaa ccatccagtc caacttcttc gacggggtga agcaggaggc catcaagctg 5940
ctgctggttg gggacgtcta cggcgaggag gtggcagaca aagggggcat gctgctggac 6000
agcacggcgc tcctggtgac tcccaggatc ctgaaagcta tgactgagcg tcagtccgaa 6060
ttcacaaatt tcaagcggat ccggattgct atggggacct ggaacgtgaa cggaggaaag 6120
cagttccgga gcaacgtgct caggacggcg gagctgacag actggctgct cgactcgccc 6180
cagctctcgg gagctaccga ctcccaggat gacagcagcc cagctgacat atttgctgtg 6240
gggtttgaag agatggtgga attgagcgca gggaatattg tcaatgccag tactaccaac 6300
aagaagatgt ggggtgaaca gcttcagaaa gccatctcac gctctcatag atacattctg 6360
ttgacttcgg cacagctggt gggcgtctgt ctttatatct ttgtacgtcc ataccatgtc 6420
ccgttcatca gggacgtagc catcgacaca gtgaagacgg gcatgggggg caaggcgggg 6480
aacaagggcg ccgtcggcat ccgcttccag ttccacagca ccagcttctg cttcatatgt 6540
agtcacctga cggccgggca gtcccaggtg aaggagcgga atgaagacta caaggagatc 6600
acccagaaac tctgcttccc aatggggaga aatgtttttt ctcatgatta tgtattttgg 6660
tgtggcgatt tcaactaccg cattgatctt acttatgaag aagtcttcta ttttgttaaa 6720
cgccaagact ggaagaaact tctggaattt gatcaactac agctacagaa atcaagtgga 6780
aaaattttta aggactttca cgaaggagcc attaactttg gacccaccta caagtatgac 6840
gttggctcag ccgcctacga tacaagcgac aaatgccgca cccccgcctg gacagacagg 6900
gtgctgtggt ggaggaagaa acatcccttt gataaaacag ctggagaact caaccttcta 6960
gacagtgatc tagatgttga caccaaagtc agacacacct ggtctcctgg tgccctgcag 7020
tattatggtc gtgcggagct acaagcgtct gatcacagac ctgtgctggc gatcgtggag 7080
gtggaagttc aggaagtcga tgtgggtgct cgggagaggg ttttccagga agtgtcctcc 7140
ttccagggcc ccctggatgc cactgttgta gtaaaccttc aatcaccgac cttagaagag 7200
aaaaacgagt ttccagagga cctgcgtact gagctcatgc agaccttggg gagttatggg 7260
acaattgttc ttgtcaggat caaccaaggg cagatgctgg taacttttgc agacagtcac 7320
tcggctctca gtgtcctgga cgtggacggt atgaaggtga aaggcagagc agtgaagatt 7380
agaccgaaga ccaaggactg gctgaaaggt ttgcgagagg agatcattcg gaaacgagac 7440
agcatggccc ccgtgtctcc cactgccaac tcctgtttgc tggaggaaaa ctttgacttc 7500
acaagtttgg actatgagtc agaaggggat attcttgaag acgatgaaga ctacttggtg 7560
gatgaattca atcagcctgg agtctcggac agtgaactcg ggggagacga cctctctgat 7620
gtccccggcc ccacagcact ggctcctccc agcaagtcac ctgctctcac caaaaagaag 7680
cagcatccaa cgtacaaaga tgacgcggac ctggtggagc tcaagcggga gctggaagcc 7740
gtcggggagt tccgccaccg ttctccgagc aggtctctgt cggtccccaa ccggcctcgg 7800
ccacctcaac ccccgcagag acccccccct ccaaccggtt taatggtgaa aaagtcggct 7860
tcagatgcgt ccatctcctc cggcacccat ggacagtatt caattttgca gacggcaaga 7920
cttctaccag gagcacctca gcaacctccc aaggctcgga ctggaataag taaaccttat 7980
aatgtcaagc agatcaaaac caccaatgcc caggaggcag aagcagcaat ccggtgtctc 8040
ctggaagcca gaggaggtgc ctccgaagaa gccctaagtg ccgtggcccc aagggacctt 8100
gaagcatcct ctgaaccaga gcccacaccg ggggcagcca aaccagagac cccacaggcg 8160
cccccactcc ttccccgtcg gcccccaccc agagttcctg ccatcaagaa gccaaccttg 8220
agaaggacag gaaagcccct gtcaccggaa gaacagtttg agcaacagac tgtccatttt 8280
acaatcgggc ccccggagac aagcgttgag gcccctcctg tcgtgacagc ccctcgagtc 8340
cctcctgttc ccaaaccaag aacatttcag cctgggaaag ctgcagagag gccaagccac 8400
aggaagccag catcagacga agcccctcct ggggcaggag cctctgtgcc accacctctg 8460
gaggcgccgc ctcttgtgcc caaggtaccc ccgaggagga agaagtcagc ccccgcagcc 8520
ttccacctgc aggtcctgca gagcaacagc cagcttctcc agggcctcac ttacaatagc 8580
agtgacagcc cctctgggca cccacctgcc gcgggcaccg tcttcccaca aggggacttt 8640
ctcagcactt catctgctac aagccccgac agcgatggca ccaaagcgat gaagccagag 8700
gcagccccac ttcttggtga ttatcaggac cccttctgga accttcttca ccaccctaaa 8760
ctgttgaata acacttggct ttctaagagc tcagaccctt tggactcagg aaccaggagc 8820
cccaaaagag atcccataga cccagtgtca gctggcgctt cagctgccaa ggcagagctg 8880
ccaccagatc atgaacacaa aaccttaggt cactgggtga caatcagtga ccaagaaaag 8940
aggacagcac tgcaggtgtt tgacccactg gcaaaaacat ga 8982
<210> 2
<211> 1496
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Ala Leu Ser Lys Gly Leu Arg Leu Leu Gly Arg Leu Gly Ala Glu
1 5 10 15
Gly Asp Cys Ser Val Leu Leu Glu Ala Arg Gly Arg Asp Asp Cys Leu
20 25 30
Leu Phe Glu Ala Gly Thr Val Ala Thr Leu Ala Pro Glu Glu Lys Glu
35 40 45
Val Ile Lys Gly Gln Tyr Gly Lys Leu Thr Asp Ala Tyr Gly Cys Leu
50 55 60
Gly Glu Leu Arg Leu Lys Ser Gly Gly Thr Ser Leu Ser Phe Leu Val
65 70 75 80
Leu Val Thr Gly Cys Thr Ser Val Gly Arg Ile Pro Asp Ala Glu Ile
85 90 95
Tyr Lys Ile Thr Ala Thr Asp Phe Tyr Pro Leu Gln Glu Glu Ala Lys
100 105 110
Glu Glu Glu Arg Leu Ile Ala Leu Lys Lys Ile Leu Ser Ser Gly Val
115 120 125
Phe Tyr Phe Ser Trp Pro Asn Asp Gly Ser Arg Phe Asp Leu Thr Val
130 135 140
Arg Thr Gln Lys Gln Gly Asp Asp Ser Ser Glu Trp Gly Asn Ser Phe
145 150 155 160
Phe Trp Asn Gln Leu Leu His Val Pro Leu Arg Gln His Gln Val Ser
165 170 175
Cys Cys Asp Trp Leu Leu Lys Ile Ile Cys Gly Val Val Thr Ile Arg
180 185 190
Thr Val Tyr Ala Ser His Lys Gln Ala Lys Ala Cys Leu Val Ser Arg
195 200 205
Val Ser Cys Glu Arg Thr Gly Thr Arg Phe His Thr Arg Gly Val Asn
210 215 220
Asp Asp Gly His Val Ser Asn Phe Val Glu Thr Glu Gln Met Ile Tyr
225 230 235 240
Met Asp Asp Gly Val Ser Ser Phe Val Gln Ile Arg Gly Ser Val Pro
245 250 255
Leu Phe Trp Glu Gln Pro Gly Leu Gln Val Gly Ser His His Leu Arg
260 265 270
Leu His Arg Gly Leu Glu Ala Asn Ala Pro Ala Phe Asp Arg His Met
275 280 285
Val Leu Leu Lys Glu Gln Tyr Gly Gln Gln Val Val Val Asn Leu Leu
290 295 300
Gly Ser Arg Gly Gly Glu Glu Val Leu Asn Arg Ala Phe Lys Lys Leu
305 310 315 320
Leu Trp Ala Ser Cys His Ala Gly Asp Thr Pro Met Ile Asn Phe Asp
325 330 335
Phe His Gln Phe Ala Lys Gly Gly Lys Leu Glu Lys Leu Glu Thr Leu
340 345 350
Leu Arg Pro Gln Leu Lys Leu His Trp Glu Asp Phe Asp Val Phe Thr
355 360 365
Lys Gly Glu Asn Val Ser Pro Arg Phe Gln Lys Gly Thr Leu Arg Met
370 375 380
Asn Cys Leu Asp Cys Leu Asp Arg Thr Asn Thr Val Gln Ser Phe Ile
385 390 395 400
Ala Leu Glu Val Leu His Leu Gln Leu Lys Thr Leu Gly Leu Ser Ser
405 410 415
Lys Pro Ile Val Asp Arg Phe Val Glu Ser Phe Lys Ala Met Trp Ser
420 425 430
Leu Asn Gly His Ser Leu Ser Lys Val Phe Thr Gly Ser Arg Ala Leu
435 440 445
Glu Gly Lys Ala Lys Val Gly Lys Leu Lys Asp Gly Ala Arg Ser Met
450 455 460
Ser Arg Thr Ile Gln Ser Asn Phe Phe Asp Gly Val Lys Gln Glu Ala
465 470 475 480
Ile Lys Leu Leu Leu Val Gly Asp Val Tyr Gly Glu Glu Val Ala Asp
485 490 495
Lys Gly Gly Met Leu Leu Asp Ser Thr Ala Leu Leu Val Thr Pro Arg
500 505 510
Ile Leu Lys Ala Met Thr Glu Arg Gln Ser Glu Phe Thr Asn Phe Lys
515 520 525
Arg Ile Arg Ile Ala Met Gly Thr Trp Asn Val Asn Gly Gly Lys Gln
530 535 540
Phe Arg Ser Asn Val Leu Arg Thr Ala Glu Leu Thr Asp Trp Leu Leu
545 550 555 560
Asp Ser Pro Gln Leu Ser Gly Ala Thr Asp Ser Gln Asp Asp Ser Ser
565 570 575
Pro Ala Asp Ile Phe Ala Val Gly Phe Glu Glu Met Val Glu Leu Ser
580 585 590
Ala Gly Asn Ile Val Asn Ala Ser Thr Thr Asn Lys Lys Met Trp Gly
595 600 605
Glu Gln Leu Gln Lys Ala Ile Ser Arg Ser His Arg Tyr Ile Leu Leu
610 615 620
Thr Ser Ala Gln Leu Val Gly Val Cys Leu Tyr Ile Phe Val Arg Pro
625 630 635 640
Tyr His Val Pro Phe Ile Arg Asp Val Ala Ile Asp Thr Val Lys Thr
645 650 655
Gly Met Gly Gly Lys Ala Gly Asn Lys Gly Ala Val Gly Ile Arg Phe
660 665 670
Gln Phe His Ser Thr Ser Phe Cys Phe Ile Cys Ser His Leu Thr Ala
675 680 685
Gly Gln Ser Gln Val Lys Glu Arg Asn Glu Asp Tyr Lys Glu Ile Thr
690 695 700
Gln Lys Leu Cys Phe Pro Met Gly Arg Asn Val Phe Ser His Asp Tyr
705 710 715 720
Val Phe Trp Cys Gly Asp Phe Asn Tyr Arg Ile Asp Leu Thr Tyr Glu
725 730 735
Glu Val Phe Tyr Phe Val Lys Arg Gln Asp Trp Lys Lys Leu Leu Glu
740 745 750
Phe Asp Gln Leu Gln Leu Gln Lys Ser Ser Gly Lys Ile Phe Lys Asp
755 760 765
Phe His Glu Gly Ala Ile Asn Phe Gly Pro Thr Tyr Lys Tyr Asp Val
770 775 780
Gly Ser Ala Ala Tyr Asp Thr Ser Asp Lys Cys Arg Thr Pro Ala Trp
785 790 795 800
Thr Asp Arg Val Leu Trp Trp Arg Lys Lys His Pro Phe Asp Lys Thr
805 810 815
Ala Gly Glu Leu Asn Leu Leu Asp Ser Asp Leu Asp Val Asp Thr Lys
820 825 830
Val Arg His Thr Trp Ser Pro Gly Ala Leu Gln Tyr Tyr Gly Arg Ala
835 840 845
Glu Leu Gln Ala Ser Asp His Arg Pro Val Leu Ala Ile Val Glu Val
850 855 860
Glu Val Gln Glu Val Asp Val Gly Ala Arg Glu Arg Val Phe Gln Glu
865 870 875 880
Val Ser Ser Phe Gln Gly Pro Leu Asp Ala Thr Val Val Val Asn Leu
885 890 895
Gln Ser Pro Thr Leu Glu Glu Lys Asn Glu Phe Pro Glu Asp Leu Arg
900 905 910
Thr Glu Leu Met Gln Thr Leu Gly Ser Tyr Gly Thr Ile Val Leu Val
915 920 925
Arg Ile Asn Gln Gly Gln Met Leu Val Thr Phe Ala Asp Ser His Ser
930 935 940
Ala Leu Ser Val Leu Asp Val Asp Gly Met Lys Val Lys Gly Arg Ala
945 950 955 960
Val Lys Ile Arg Pro Lys Thr Lys Asp Trp Leu Lys Gly Leu Arg Glu
965 970 975
Glu Ile Ile Arg Lys Arg Asp Ser Met Ala Pro Val Ser Pro Thr Ala
980 985 990
Asn Ser Cys Leu Leu Glu Glu Asn Phe Asp Phe Thr Ser Leu Asp Tyr
995 1000 1005
Glu Ser Glu Gly Asp Ile Leu Glu Asp Asp Glu Asp Tyr Leu Val
1010 1015 1020
Asp Glu Phe Asn Gln Pro Gly Val Ser Asp Ser Glu Leu Gly Gly
1025 1030 1035
Asp Asp Leu Ser Asp Val Pro Gly Pro Thr Ala Leu Ala Pro Pro
1040 1045 1050
Ser Lys Ser Pro Ala Leu Thr Lys Lys Lys Gln His Pro Thr Tyr
1055 1060 1065
Lys Asp Asp Ala Asp Leu Val Glu Leu Lys Arg Glu Leu Glu Ala
1070 1075 1080
Val Gly Glu Phe Arg His Arg Ser Pro Ser Arg Ser Leu Ser Val
1085 1090 1095
Pro Asn Arg Pro Arg Pro Pro Gln Pro Pro Gln Arg Pro Pro Pro
1100 1105 1110
Pro Thr Gly Leu Met Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Ala Ser Ile
1115 1120 1125
Ser Ser Gly Thr His Gly Gln Tyr Ser Ile Leu Gln Thr Ala Arg
1130 1135 1140
Leu Leu Pro Gly Ala Pro Gln Gln Pro Pro Lys Ala Arg Thr Gly
1145 1150 1155
Ile Ser Lys Pro Tyr Asn Val Lys Gln Ile Lys Thr Thr Asn Ala
1160 1165 1170
Gln Glu Ala Glu Ala Ala Ile Arg Cys Leu Leu Glu Ala Arg Gly
1175 1180 1185
Gly Ala Ser Glu Glu Ala Leu Ser Ala Val Ala Pro Arg Asp Leu
1190 1195 1200
Glu Ala Ser Ser Glu Pro Glu Pro Thr Pro Gly Ala Ala Lys Pro
1205 1210 1215
Glu Thr Pro Gln Ala Pro Pro Leu Leu Pro Arg Arg Pro Pro Pro
1220 1225 1230
Arg Val Pro Ala Ile Lys Lys Pro Thr Leu Arg Arg Thr Gly Lys
1235 1240 1245
Pro Leu Ser Pro Glu Glu Gln Phe Glu Gln Gln Thr Val His Phe
1250 1255 1260
Thr Ile Gly Pro Pro Glu Thr Ser Val Glu Ala Pro Pro Val Val
1265 1270 1275
Thr Ala Pro Arg Val Pro Pro Val Pro Lys Pro Arg Thr Phe Gln
1280 1285 1290
Pro Gly Lys Ala Ala Glu Arg Pro Ser His Arg Lys Pro Ala Ser
1295 1300 1305
Asp Glu Ala Pro Pro Gly Ala Gly Ala Ser Val Pro Pro Pro Leu
1310 1315 1320
Glu Ala Pro Pro Leu Val Pro Lys Val Pro Pro Arg Arg Lys Lys
1325 1330 1335
Ser Ala Pro Ala Ala Phe His Leu Gln Val Leu Gln Ser Asn Ser
1340 1345 1350
Gln Leu Leu Gln Gly Leu Thr Tyr Asn Ser Ser Asp Ser Pro Ser
1355 1360 1365
Gly His Pro Pro Ala Ala Gly Thr Val Phe Pro Gln Gly Asp Phe
1370 1375 1380
Leu Ser Thr Ser Ser Ala Thr Ser Pro Asp Ser Asp Gly Thr Lys
1385 1390 1395
Ala Met Lys Pro Glu Ala Ala Pro Leu Leu Gly Asp Tyr Gln Asp
1400 1405 1410
Pro Phe Trp Asn Leu Leu His His Pro Lys Leu Leu Asn Asn Thr
1415 1420 1425
Trp Leu Ser Lys Ser Ser Asp Pro Leu Asp Ser Gly Thr Arg Ser
1430 1435 1440
Pro Lys Arg Asp Pro Ile Asp Pro Val Ser Ala Gly Ala Ser Ala
1445 1450 1455
Ala Lys Ala Glu Leu Pro Pro Asp His Glu His Lys Thr Leu Gly
1460 1465 1470
His Trp Val Thr Ile Ser Asp Gln Glu Lys Arg Thr Ala Leu Gln
1475 1480 1485
Val Phe Asp Pro Leu Ala Lys Thr
1490 1495
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Examples of a small interfering RNA molecule sequence, targeting
coding region 1612-1633 (SJ2-1)
<400> 3
aacgtgaacg gaggaaagca g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Examples of a small interfering RNA molecule sequence, targeting
the 3? untranslated region (SJ2-2)
<400> 4
ctcttgctga tacgcgatat t 21
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an siRNA sequence that successfully downregulates
SYNJ2 mRNA levels
<400> 5
gaagaaacau cccuuugau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an siRNA sequence that successfully downregulates
SYNJ2 mRNA levels
<400> 6
ggacagcacu gcagguguu 19
<210> 7
<211> 59
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an shRNA sequence that successfully downregulates
SYNJ2 mRNA levels
<400> 7
ccggcctacg atacaagcga caaatctcga agatttgtcg cttgtatcgt aggtttttg 59
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an shRNA sequence that successfully downregulates
SYNJ2 mRNA levels
<400> 8
ccggcgagag gagatcattc ggaaactcga gtttccgaat gatctcctct cgtttttg 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an shRNA sequence that successfully downregulates
SYNJ2 mRNA levels
<400> 9
ccggccggaa gaacagtttg agcaactcga gttgctcaaa ctgttcttcc ggtttttg 58
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an antisense oligonucleotide targeting coding region
1494-1475
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate backbone
<400> 10
ccctttgtct gccacctcct 20
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an antisense oligonucleotide targeting the 3' UTR
sequence
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(19)
<223> phosphorothioate backbone
<400> 11
acccatcttg ctctctccc 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Example of an antisense oligonucleotide targeting coding region
2428-2409
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> phosphorothioate backbone
<400> 12
tcttcctcca ccacagcacc 20
<210> 13
<211> 738
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant TAPP1 PH domain derived from Homo sapiens
<400> 13
atggattaca aggacgacga cgataagggc ggatcccctt actttactcc taaaccacct 60
caagatagta cggttatcaa agctggatat tgtgtaaaac aaggagcagt gatgaaaaac 120
tggaagagaa gatattttca attggatgaa aacacaatag gctacttcaa atctgaactg 180
gaaaaggaac ctcttcgcgt aataccactt aaagaggttc ataaagtcca ggaatgtaag 240
caaagcgaca taatgatgag ggacaacctc tttgaaattg taacaacgtc tcgaactttc 300
tatgtgcagg ctgatagccc tgaagagatg cacagttgga ttaaagcagt ctctggcgcc 360
attgtagcac agcggggtcc cggcagatct gcgtcttctg agcatccccc cggtccttca 420
gaatccaaac acgctttccg tcctaccaac gcagccaccg ccacctcaca ttccacagcc 480
tctcgcagca actctttggt ctcaaccttt accatggaga agcgaggatt ttacgagtct 540
cttgccaagg tcaagccagg gaacttcaag gtccagactg tctctccaag agaaccagct 600
tccaaagtga ctgaacaagc tctgttaaga cctcaaagta aaaatggccc tcaggaaaaa 660
gattgtgacc tagtagactt ggacgatgcg agccttccgg tcagtgacgt gctcgagcac 720
caccaccacc accactga 738
<210> 14
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Recombinant TAPP1 PH domain derived from Homo sapiens
<400> 14
Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Ser Pro Tyr Phe Thr
1 5 10 15
Pro Lys Pro Pro Gln Asp Ser Thr Val Ile Lys Ala Gly Tyr Cys Val
20 25 30
Lys Gln Gly Ala Val Met Lys Asn Trp Lys Arg Arg Tyr Phe Gln Leu
35 40 45
Asp Glu Asn Thr Ile Gly Tyr Phe Lys Ser Glu Leu Glu Lys Glu Pro
50 55 60
Leu Arg Val Ile Pro Leu Lys Glu Val His Lys Val Gln Glu Cys Lys
65 70 75 80
Gln Ser Asp Ile Met Met Arg Asp Asn Leu Phe Glu Ile Val Thr Thr
85 90 95
Ser Arg Thr Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ser Pro Glu Glu Met His Ser
100 105 110
Trp Ile Lys Ala Val Ser Gly Ala Ile Val Ala Gln Arg Gly Pro Gly
115 120 125
Arg Ser Ala Ser Ser Glu His Pro Pro Gly Pro Ser Glu Ser Lys His
130 135 140
Ala Phe Arg Pro Thr Asn Ala Ala Thr Ala Thr Ser His Ser Thr Ala
145 150 155 160
Ser Arg Ser Asn Ser Leu Val Ser Thr Phe Thr Met Glu Lys Arg Gly
165 170 175
Phe Tyr Glu Ser Leu Ala Lys Val Lys Pro Gly Asn Phe Lys Val Gln
180 185 190
Thr Val Ser Pro Arg Glu Pro Ala Ser Lys Val Thr Glu Gln Ala Leu
195 200 205
Leu Arg Pro Gln Ser Lys Asn Gly Pro Gln Glu Lys Asp Cys Asp Leu
210 215 220
Val Asp Leu Asp Asp Ala Ser Leu Pro Val Ser Asp Val Leu Glu His
225 230 235 240
His His His His His
245
<210> 15
<211> 225
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Pro Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Pro Gln Asp Ser Thr Val Ile Lys Ala
1 5 10 15
Gly Tyr Cys Val Lys Gln Gly Ala Val Met Lys Asn Trp Lys Arg Arg
20 25 30
Tyr Phe Gln Leu Asp Glu Asn Thr Ile Gly Tyr Phe Lys Ser Glu Leu
35 40 45
Glu Lys Glu Pro Leu Arg Val Ile Pro Leu Lys Glu Val His Lys Val
50 55 60
Gln Glu Cys Lys Gln Ser Asp Ile Met Met Arg Asp Asn Leu Phe Glu
65 70 75 80
Ile Val Thr Thr Ser Arg Thr Phe Tyr Val Gln Ala Asp Ser Pro Glu
85 90 95
Glu Met His Ser Trp Ile Lys Ala Val Ser Gly Ala Ile Val Ala Gln
100 105 110
Arg Gly Pro Gly Arg Ser Ala Ser Ser Glu His Pro Pro Gly Pro Ser
115 120 125
Glu Ser Lys His Ala Phe Arg Pro Thr Asn Ala Ala Thr Ala Thr Ser
130 135 140
His Ser Thr Ala Ser Arg Ser Asn Ser Leu Val Ser Thr Phe Thr Met
145 150 155 160
Glu Lys Arg Gly Phe Tyr Glu Ser Leu Ala Lys Val Lys Pro Gly Asn
165 170 175
Phe Lys Val Gln Thr Val Ser Pro Arg Glu Pro Ala Ser Lys Val Thr
180 185 190
Glu Gln Ala Leu Leu Arg Pro Gln Ser Lys Asn Gly Pro Gln Glu Lys
195 200 205
Asp Cys Asp Leu Val Asp Leu Asp Asp Ala Ser Leu Pro Val Ser Asp
210 215 220
Val
225
<210> 16
<211> 675
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
ccttacttta ctcctaaacc acctcaagat agtacggtta tcaaagctgg atattgtgta 60
aaacaaggag cagtgatgaa aaactggaag agaagatatt ttcaattgga tgaaaacaca 120
ataggctact tcaaatctga actggaaaag gaacctcttc gcgtaatacc acttaaagag 180
gttcataaag tccaggaatg taagcaaagc gacataatga tgagggacaa cctctttgaa 240
attgtaacaa cgtctcgaac tttctatgtg caggctgata gccctgaaga gatgcacagt 300
tggattaaag cagtctctgg cgccattgta gcacagcggg gtcccggcag atctgcgtct 360
tctgagcatc cccccggtcc ttcagaatcc aaacacgctt tccgtcctac caacgcagcc 420
accgccacct cacattccac agcctctcgc agcaactctt tggtctcaac ctttaccatg 480
gagaagcgag gattttacga gtctcttgcc aaggtcaagc cagggaactt caaggtccag 540
actgtctctc caagagaacc agcttccaaa gtgactgaac aagctctgtt aagacctcaa 600
agtaaaaatg gccctcagga aaaagattgt gacctagtag acttggacga tgcgagcctt 660
ccggtcagtg acgtg 675
Claims (22)
- 종양이 신경교종(glioma)이 아니라는 전제하에, 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(synaptojanin 2, SYNJ2)의 억제인자를 대상에게 투여하고, 그것에 의해 종양 전이(metastasis)를 예방하는 것을 포함하는, 종양 전이를 예방하는 방법.
- 종양이 신경교종이 아니라는 전제하에, 종양 전이를 예방하기 위한 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자.
- 치료학적 유효량의 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체(cell surface receptor)의 억제인자를 대상에게 투여하고, 그것에 의해 암을 치료하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법.
- 암을 치료하기 위한, 시냅토자닌 2(SYNJ2)의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 관련된 세포 표면 수용체의 억제인자.
- 제3항에 있어서,
상기 암의 발병 또는 진행과 관련된 세포 표면 수용체는 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase)인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제5항에 있어서,
상기 수용체 티로신 키나아제는 ErbB 수용체인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제6항에 있어서,
상기 ErbB 수용체는 표피 성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)인 것을 특징으로 하는, 방법. - 시료 물질(test agent)의 존재하에서 PI(3,4,5)P3에서 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱을 분석하는 것을 포함하며, 여기에서 시료 물질의 부재하에서 동일하게 비교했을 때 시료 물질의 존재하에서 PI(3,4,5)P3에서 PI(3,4)P2로의 감소된 프로세싱은 종양 전이의 추정상의(putative) 억제인자를 가리키는 것을 특징으로 하는, 종양 전이의 추정상의 억제인자를 확인하는 방법.
- 제8항에 있어서,
상기 PI(3,4,5)P3에서 PI(3,4)P2로의 SYNJ2-매개성 프로세싱을 분석하는 것은 경쟁 검정법(competition assay)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제9항에 있어서,
상기 경쟁 검정법은 PI(3,4)P2에 결합된 PI(3,4)P2 결합 도메인을 포함하는 복합체로부터의 PI(3,4)P2 결합 도메인의 치환을 분석하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제9항 또는 제10항에서,
상기 경쟁 검정법은 형광 편광(fluorescence polarization) 경쟁 검정법인 것을 특징으로 하는, 방법. - 대상의 암세포에서 SYNJ2의 레벨 또는 활성을 측정하는 것을 포함하고, 여기에서 영향을 받지 않은 대조군 샘플의 세포에서 동일하게 측정한 것과 비교하여 대상의 상기 암세포에서의 상기 SYNJ2 활성 레벨에서의 상향조절(upregulation)은 나쁜 예후(prognosis)를 나타내는 것을 특징으로 하는, 필요로 하는 대상에게서 암의 예후를 예측을 하는 방법.
- 제12항에 있어서,
우수한 표준 기법(Gold standard method)을 사용하여 예후를 증강시키는 것(augmenting)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제13항에 있어서,
상기 우수한 표준 기법은 마커(marker)의 검출을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제14항에 있어서,
상기 마커는 HER-2 및 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항 또는 제12항에 있어서,
상기 전이는 EGF 의존적인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제3항 또는 제12항에 있어서,
상기 암은 유방암인 것을 특징으로 하는, 방법. - 제1항 또는 제3항에 있어서,
상기 SYNJ2의 억제인자는 소분자(small molecule), 항체(antibody), 펩티드(peptide) 및 핵산 침묵화 물질(nucleic acid silencing agent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법. - 제18항에 있어서,
상기 소분자는 표 2에 열거된 분자들로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법. - SYNJ2의 억제인자 및 암의 발병 또는 진행과 연관된 세포 표면 수용체의 억제인자를 패키징(packaging)하는 패키징 물질(packaging material)을 포함하는, 암의 치료 또는 암 전이의 예방을 위한 제조물(article of manufacture).
- 제3항의 방법 또는 제20항의 제조물에 있어서,
상기 암의 발병 또는 진행과 연관된 상기 세포 표면 수용체의 상기 억제인자는 항체인 것을 특징으로 하는, 방법 또는 제조물. - 제3항의 방법 또는 제20항의 제조물에 있어서,
상기 암의 발병 또는 진행과 연관된 상기 세포 표면 수용체의 상기 억제인자는 소분자 억제인자(small molecule inhibitor)인 것을 특징으로 하는, 방법 또는 제조물.
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