MX2015004626A - Metodos para prevenir metastasis de tumor, tratar y pronosticar cancer e identificar agentes que son inhibidores putativos de metastasis. - Google Patents

Metodos para prevenir metastasis de tumor, tratar y pronosticar cancer e identificar agentes que son inhibidores putativos de metastasis.

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Abstract

Se proporciona un método para prevenir metástasis de tumor con la condición de que el tumor no sea glioma. El método que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2), para de esta manera prevenir la metástasis de tumor. También se proporciona un método para tratar cáncer. El método que comprende, administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) y un inhibidor de un receptor de superficie celular asociado con un inicio o progresión de cáncer, para de esta manera tratar el cáncer.

Description

MÉTODOS PARA PREVENIR METÁSTASIS DE TUMOR, TRATAR Y PRONOSTICAR CÁNCER E IDENTIFICAR AGENTES QUE SON INHIBIDORES PUTATIVOS DE METÁSTASIS CAMPO Y ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a métodos para prevenir metástasis de tumor, tratar y pronosticar cáncer e identificar agentes que son inhibidores putativos de metástasis.
La motilidad celular sustenta una variedad de procesos fisiológicos y patológicos, incluyendo la metástasis de tumor (Ridlcy, 2011). El inicio de la migración es accionado por la polimerización de actina y GTPasas de la familia Rho, que instigan la formación de lamelipodios y filopodios. La evidencia creciente implica otro tipo de protuberancias accionadas por actina, llamadas invadopodios, en la degradación de matriz (Murphy y Courtneidge, 2011). Para sembrar metástasis, las células de cáncer de mama migratorias forman invadopodios y se infiltran en vasos cercanos. Los estudios que se dirigen a caracterizar los distintivos de expresión génica asociados con metástasis de células de cáncer de mama a los pulmones (Minn y colaboradores., 2005) y cerebro (Bos y colaboradores., 2009) identificaron conjuntos de genes que implican metástasis especifica del sitio. De manera interesante, ambos conjuntos incluyen miembros de la familia del factor de crecimiento epidérmico (EGF), sugiriendo que la señalización por el receptor compartido, EGFR, sustenta la diseminación metastásica.
El tráfico intracelular emerge como una característica clave de la migración celular y la progresión del tumor (Mosesson y colaboradores., 2008). Por ejemplo, se ha mostrado que el mutante p53 promueve la metástasis a través de la integrina mejorada y el tráfico de EGFR, que depende de la proteína de acoplamiento de Rab (RCP) (Muller y colaboradores., 2010). Junto con las proteínas Rab, las fosfoinositidas desempeñan funciones de pivote en la compartimentalización celular al determinar la identidad de las vesículas (Yuan y Cantlcy, 2008). Por ejemplo, la fosforilación en la posición D3 de PI (4,5)P2 (fosfatidil-inositol 4,5-bifosfato) por fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) genera PI(3,4,5)P3, que es necesario para la formación de invadopodios (Yamaguchi y colaboradores., 2011). De manera similar, PI(4,5)P2 regula múltiples proteínas que controlan la endocitosis y dinámica de la actina, (Saarikangas y colaboradores., 2010), pero sus niveles son severamente controlados por dos tipos adicionales de enzimas: fosfolipasa C (PLCy) promueve la hidrólisis de PI(4,5)P2, que activa Cofilina (una proteína cortadora de actina) e induce la migración celular mamaria (van Rheenen y colaboradores., 2007). Del mismo modo, inositol polifosfato 5-fosfatasas, tal como Sinaptojanina 2 (SYNJ2), desfosforilan la posición D5 del anillo de inositol y controlan la migración de célula de glioma (Chuang y colaboradores., 2004; Malecz y colaboradores, 2000). Además se identificaron mutaciones homocigóticas en ciertas muestras de cáncer de próstata Rossi y colaboradores. Cáncer Genet Cytogenet. 2005 Septiembre; 161(2):97-103.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un método para prevenir metástasis de tumor con la condición de que el tumor no sea glioma, el método que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2), para de esta manera prevenir la metástasis de tumor.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para tratar cáncer, el método que comprende, administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) y un inhibidor de receptor de superficie celular asociado con un inicio o progresión de cáncer, para de esta manera tratar cáncer.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) para prevenir la metástasis de tumor con la condición de que el tumor no sea glioma.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención, se proporciona un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) y un inhibidor de un receptor de superficie celular asociado con un inicio o progresión de cáncer para tratar cáncer.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el receptor de superficie celular asociado con el inicio o progresión de cáncer es una tirosina quinasa receptora.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la tirosina quinasa receptora es un receptor de ErbB.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el receptor de ErbB es el Receptor de Factor Crecimiento Epidérmico (EGFR).
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para identificar un inhibidor putativo de metástasis de tumor, el método que comprende analizar el procesamiento mediado por SYNJ2 de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia de un agente de prueba, en donde un procesamiento disminuido de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia del agente de prueba como se compara con el mismo en su ausencia es indicativo de un inhibidor putativo de metástasis de tumor.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el análisis del procesamiento mediado por SYNJ2 de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 se realiza mediante un ensayo de competición.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el ensayo de competición analiza el desplazamiento de un dominio de enlace de PI(3,4)P2 de un complejo que comprende el dominio de enlace de PI(3,4)P2 enlazado a PI(3,4)P2.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el ensayo de competición es un ensayo competitivo de polarización de fluorescencia.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un método para pronosticar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende determinar un nivel o actividad de SYNJ2 en una célula de cáncer del sujeto, en donde una regulación hacia arriba en el nivel de actividad del SYNJ2 en la célula de cáncer del sujeto comparado con el mismo en una célula de una muestra de control no afectada, es indicativo de una pobre prognosis.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método además comprende aumentar la prognosis utilizando un método estándar Gold.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el método estándar Gold comprende la detección de un marcador.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el marcador se selecciona del grupo que consiste de HER-2 y receptor de estrógeno (ER).
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la metástasis es dependiente de EGF.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el cáncer es cáncer de mama.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el inhibidor de SYNJ2 se selecciona del grupo que consiste de una molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido y un agente de silenciamiento de ácido nucleico.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, la molécula pequeña se selecciona de las moléculas listadas en la Tabla 2.
De acuerdo con un aspecto de algunas modalidades de la presente invención se proporciona un articulo de manufactura para tratamiento de cáncer o prevención de metástasis de cáncer, que comprende un material de empaquetamiento que empaqueta un inhibidor de SYNJ2 y un inhibidor de un receptor de superficie celular asociado con un inicio o progresión del cáncer.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el inhibidor del receptor de superficie celular asociado con el inicio o progresión de cáncer es un anticuerpo.
De acuerdo con algunas modalidades de la invención, el inhibidor del receptor de superficie celular asociado con el inicio o progresión de cáncer es un inhibidor de molécula pequeña.
A menos que se defina de otra manera, todos los términos téenicos y/o científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es comúnmente entendido por uno de habilidad ordinaria en la téenica a la cual la invención pertenece. Aunque métodos y materiales similares o equivalentes aquellos descritos en la presente se pueden utilizar en la práctica o la prueba de las modalidades de la invención, métodos y/o materiales ejemplares se describen enseguida. En caso de conflicto, la especificación de patente, incluyendo las definiciones, lo controlará. Además, los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos únicamente y no se proponen para ser necesariamente limitantes.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Algunas modalidades de la invención se describen en la presente, a manera de ejemplo únicamente, con referencia a los dibujos acompañantes. Con referencia especifica ahora a los dibujos en detalle, se acentúa que los detalles particulares mostrados son a manera de ejemplo y para propósitos de discusión ilustrativa de modalidades de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente a aquellos expertos en la técnica de cómo se pueden llevar a la práctica las modalidades de la invención.
En los dibujos: Las Figuras 1A-I muestran que EGF promueve el crecimiento invasivo de células mamarias e induce un conjunto especifico de genes. Figura 1A - células MCF10A se colocaron en placa en la ausencia de factores de crecimiento, y se dejaron formar agrupaciones. Setenta y dos horas después, las células se trataron con los factores de crecimiento indicados (cada uno en 10 ng/mL) y las imágenes de contraste de fase se tomaron 24 horas después (barra de escala, 50pm). Figura IB - células MCF10A se colocaron en placa en cámaras de migración o invasión, como es indicado, en la presencia de los ligandos indicados (10 ng/mL), y 18 horas después las células que migraron al compartimiento inferior se mancharon con violeta cristal (panel izquierdo). Se muestran cuantificaciones de las señales de migración e invasión, normalizadas al efecto del tratamiento con EGF. Los datos representan la media ± S.D. de triplicados biológicos de un experimento representativo que se repitió dos veces (panel derecho). Figura 1C - células MCF10A se colocaron en placa en insertos transwell en el medio que contiene EGF, sin o con los inhibidores AG-1478 (1 mM), U0126 (5 mM), o Wortmanina (200 nM) y se dejaron migrar durante 18 horas. Los datos representan la media ± S.D. de triplicados. El experimento se repitió dos veces. Figura ID - Una lista de 425 genes específicamente inducidos en células MCF10A mamarias humanas por EGF (y no por suero (Amit y colaboradores, 2007)), se interceptó con genes que se regularon hacia arriba en el contexto de metástasis de células MDA-MB-231 (1597 genes) (Minn y colaboradores., 2005). Uno de los 23 genes sobrepuestos codifica la 5'-fosfatidilinositol lípido fosfatasa, sinaptojanina-2 (SYNJ2). Figura 1E células MCF10A se infectaron con partículas lentivirales que codifican LacZ (Ctrl) o SYNJ2-GFP (SYNJ2-OX). Los niveles de expresión del SYNJ2 endógeno y la proteina de fusión SYNJ2-GFP se determinaron mediante in unomanchado, y la carga de proteina igual se cargó al sondear para tubulina. Figura 1F - Los clones Ctrl y SYNJ2-OX de células MCF10A se colocaron en placa en cámaras de migración (5 x 104 células/cavidad) en la ausencia (NT) o presencia de EGF (10 ng/mL) y se dejaron migrar durante 22 horas. Las células migrantes que alcanzaron el otro lado del filtro se mancharon con violeta cristal y se tomaron imágenes. Figura 1G - células MCF10A se transíectaron con el control de siRNA (siCtrl) o siRNA dirigido a SYNJ2 (siSYNJ2) y los niveles de proteina de SYNJ2 se determinaron 36 horas después mediante el inmunomanchado. La carga de proteina igual se confirmó mediante el inmunomanchado para Ras-GAP. Figura 1H - Las células presentadas en G se colocaron en placa en cámaras de migración (5 x 104 células/cavidad) en la ausencia (NT) o presencia de EGF (10 ng/mL) y se dejaron migrar durante 22 horas. Las células migrantes que alcanzaron la cara inferior del filtro se mancharon con violeta cristal y se capturaron las imágenes. Figura II - Cultivos confluentes de células MCF10A se trataron con los siRNAs indicados. Una vez que se formaron mono capas, ellas se sometieron a un sistema de rayado automatizado que monitorea la tasa de cierre de rayado.
Las Figuras 2A-E muestran que la inducción transcrípcional de SYNJ2 por EGF promueve el crecimiento invasivo. Figura 2A - Células MCF10A con deficiencia de suero se estimularon con EGF (20 ng/mL) o suero (5%) y la expresión de mRNA de SYNJ2 se analizó al utilizar microarreglos o RT-qPCR. Figura 2B - células MCF10A se estimularon con EGF, se extrajeron y se inmunomancharon como es indicado. Figura 2C -células MCF10A, infectadas con virus que codifican GFP-SYNJ2 (SYNJ2-OX) o LacZ como control (CTRL), se cultivaron durante 4 dias en la ausencia o presencia de EGF. El contraste de fase (parte superior, barra: 100 mm) y las imágenes confocales (fondo, barra: 20 gm) utilizando faloidina y DAPI se obtuvieron. Figuras 2D-E - células MCF10A se cultivaron durante 22 horas en cámaras de migración o invasión (5-6 x 104 células/cavidad) en la ausencia (NT) o presencia de EGF (10 ng/mL). Las células que alcanzaron el fondo del filtro se mancharon y se cuantificó la cobertura del filtro (media ± S.D.).
Las Figuras 3A-G muestran la translocación inducible de SYNJ2 al borde de guia que acompaña la migración e invasión de célula mamaria. Figura 3A - células MDA-MB-231 se infectaron con partículas lentivirales que codifican LacZ (Ctrl) o un SYNJ2 etiquetado con V5 (SYNJ2-V5), junto con shRNA de control (shCtrl) o un shRNA dirigido· contra SYNJ2 (shSYNJ2). Los niveles de proteína de V5-SYNJ2 y SYNJ2 endógeno se determinaron mediante inmunomanchado. La carga de proteína igual se confirmó mediante el inmunomanchado para AKT. Figura 3B - imágenes de fase (paneles izquierdos) e imágenes de invasión (paneles derechos) de células MDA-MB-231 que sobreexpresan establemente SYNJ2, o LacZ como control. Las capacidades invasivas se determinaron por triplicado utilizando un ensayo de invasión, y las células invasoras se cuantificaron y se normalizaron al control (Ctrl). Barra de escala, 50pm. Figura 3C - células MDA-MB-231 se transíectaron con oligonucleótidos de siRNA dirigidos a SYNJ2 (o siCtrl). Después de 36 horas, los niveles de proteína de SYNJ2 se determinaron mediante inmunomanchado. La carga de proteína igual se confirmó mediante el inmunomanchado para Ras-GAP. Figura 3D - Las células de C se colocaron en placa en cámaras de migración o invasión y se incubaron durante 18 horas. Las señales de migración e invasión se cuantificaron y se normalizaron a las células siCtrl tratadas con EGF. Los datos mostrados son medias ± S.D. de triplicados. Figura 3E - células MDA-MB-231 que expresan transientemente GFP-SYNJ2 se colocaron en cubiertas de vidrio y se estimularon con TGFa (10 ng/mL). Fotos de microscopía de lapso de tiempo se tomaron (cada 10 segundos). Las imágenes mostradas se invirtien, con puntos negros que representan SYNJ2 y su ensamble en la base de lamelipodio. Barra de escala, 10pm. Figura 3F - células MDA-MB-231 se inmunomancharon para SYNJ2 endógeno y F-actina utilizando TRITC-faloidina. El área cuadrada se aumentó. Barra de escala, IOmm. Figura 3G - células MCF10A se estimularon con EGF durante 18 horas, y luego se inmunomancharon para SYNJ2 endógeno y se contramancharon para F-actina utilizando TRITC-faloidina. Barra de escala, 10 pm.
Las Figuras 4A-F muestran que la actividad catalítica de SYNJ2 es esencial para el crecimiento invasivo. Figuras 4A-B - células MDA-MB-231 que expresan SYNJ2 (SYNJ2-OX) o shRNA a SYNJ2 (shSYNJ2), así como células de control, se sembraron en Matrigel al 5%. Las imágenes se capturaron después de seis días, y los esferoides invasivos se cuantificaron (media ± S.D.). Barras de escala, 50 pm. Figuras 4C-D - células MDA-MB-231 que expresan shSYNJ2 se infectaron con WT SYNJ2 (shSYNJ2 + SYNJ2WT) o con un mutante catalíticamente deshabilitado (ShSYNJ2 + SYNJ2CD). Las células ya sea que se extrajeron y se inmunomancharon como es indicado, o se dejaron invadir durante 18 horas en cámaras de invasión. Las imágenes de las células invadidas y su cuantificación normalizada se muestran (media ± S.D.). Figura 4E - muestra micrografías electrónicas de exploración de células shCtrl y shSYNJ2 cultivadas en fibronectina. Barra de escala, 2 pm. Figura 4F - Imágenes de F-actina en las células MDA-MB-231 indicadas, manchadas con faloidina y DAPI. Las secciones del eje Z (líneas) y áreas aumentadas son mostradas. Las cabezas de flecha marcan las estructuras hinchadas. Barra de escala, 10 pm.
Las Figuras 5A-H muestran la localización subcelular de SYNJ2. Figura 5A - células MDA-MB-231 que expresan GFP-SYNJ2 se transíectaron con un RFP-Clatrina y se colocaron en placas recubiertas de fibronectina. Utilizando la microscopía de disco de giro, las células se formaron en imagen cada cinco segundos. Las cabezas de flecha marcan un borde de guía recientemente formado. Barra de escala, 5 pm. Figura 5B - estructuras de tiempo representativas que representan el ensamblaje y desensamblaje de SYNJ2 en el borde de guía (dos hileras superiores) y por abajo del cuerpo celular. Para las hileras inferiores, las células se transfectaron con el plásmido mCherry-lifeACT y se colocaron sobre colágeno. Después, las células se formaron en imagen en intervalos de 1 minuto. Las cabezas de flecha se insertaron para referencia. Observar la diferencia en las escalas de tiempo. Barra de escala, 1 pm. Figura 5C - células se formaron en imágenes simultáneamente mediante TIRF y microscopía de epifluorescencia y las señales se convirtieron en cimografías (eje X). Las cabezas de flecha marcan la iniciación de señal. Barra de escala, 5 pm. Figura 5D - Las células se formaron en imágenes utilizando la microscopía confocal de disco de giro 5 minutos antes y 5 minutos después del tratamiento con Dyngo-4a (30 pM; un inhibidor de Dinamina-2) . Barra de escala, 5 pm. Figura 5E - células MDA-MB-231 que expresan establemente GFP-SYNJ2 se preincubaron con Dyngo-4a (30 pM; 30 min) o con solvente (DMSO). Los U sados de células se sometieron a inmunoprecipitación con anticuerpos anti-GFP (o sin anticuerpo; -Ab) , y luego se inmunomancharon, junto con una muestra (5%) del U sado de células, con los anticuerpos indicados. Figura 5F - Células se colocaron en placas sobre fibronectina, se fijaron y se inmunomancharon para Racl endógeno. Barra de escala, 10 pm. Figura 5G - Células se formaron en imagen utilizando la microscopia confocal 5 minutos antes de y 5 minutos después de un tratamiento largo de 30 minutos con NSC-23766 (5mM). Barra de escala, 5 pm. Figura 5H -Célula MDA-MB-231 se trató con los oligonucleótidos de siRNA indicados. Los extractos de células se mancharon para SYNJ2 y Ras-GAP. Los niveles de GTP-Racl se determinaron utilizando un ensayo basado en ELISA (Citoesqueleto).
Las Figuras 6A-D muestran la localización de SYNJ2 al borde de guia que es distinto de la distribución de caveolinas y depende de F-actina, colesterol y PI3K. Figura 6A - Células MDA-MB-231 que expresan GFP-SYNJ2 y que coexpresan RFP-Cavl se formaron en imágenes simultáneamente a través del tiempo, y las señales se convirtieron en cimografias (ejes X y Y). Observar la naturaleza transiente de los ensamblajes de SYNJ2 y la apariencia estable de caveolina 1. Barra de escala, 5pm. Figura 6B - El panel izquierdo representa la distribución (% de puntos contra el tiempo de vida) de 150 ensamblajes SYNJ2 aleatoriamente seleccionados, formados en imagen como en la Figura 5A (intervalos de 5 segundos, un solo plano, confocal de disco de giro). El panel derecho representa la intensidad relativa promedio (± SEM) de ensamblajes que mostraron un tiempo de vida de 55 segundos. Figura 6C - Células MDA-MB-231 que expresan establemente GFP-SYNJ2 se trataron con Mbq? (10 mM, 15 minutos) o con wortmanina (500 nM, 15 minutos). Las imágenes de las mismas células seleccionadas se capturaron cada 6 segundos, ya sea antes de o después del tratamiento, y las señales se convirtieron en quimografías (que representa los insertos cuadrados en los paneles izquierdos). Barra de escala, 20pm. Figura 6D - células MDA-MB-231 que coexpresan establemente GFP-SYNJ2 y lifeACT-mCherry se trataron con LatrunculinaB (1 mM, 15 minutos). Las imágenes se adquirieron ya sea antes o después del tratamiento. Barra de escala, 5 pm.
Las Figuras 7A-E muestran que el agotamiento de SYNJ2 detiene EGFR en las vesículas intracelulares. Figura 7A células MCF10A que expresan establemente el control de shRNA (shCtri) o shRNA específico a SYNJ2 (shSYNJ2) se extrajeron tres días después de la colocación de placa en el medio que contiene EGF. Los inmunomanchados se sondearon para SYNJ2, EGFR, tirosina 1068 fosforilada de EGFR (pEGFR), ERK fosforilada (pERK) y Ras-GAP como un control de carga. Figura 7B - células MCF10A se transfectaron con el control de siRNA, o siRNA dirigido contra SYNJ2, en la presencia de EGF. El análisis de inmunofluorescencia confocal se realizó utilizando anticuerpos EGFR y SYNJ2. Observar que únicamente la célula agotada de SYNJ2 (asterisco) exhibe los defectos de tráfico de EGFR. Barra de escala, 10 mm. Figura 7C - Tres derivados de células MDA-MB-231 se immunomancharon para EGFR y se contramancharon para DAPI y F-actina: (i) células en las cuales SYNJ2 se inactivó (shSYNJ2; columna izquierda), (ii) las mismas células infectadas por la transferencia de gen lentiviral correspondiente a la forma catalíticamente muerta (shSYNJ2+SYNJ2CD; columna del medio), y (iii) células en las cuales SYNJ2 se inactivó y la forma de tipo silvestre se introdujo mediante infección (shSYNJ2 +SYNJ2WT; columna derecha). Barra de escala, 20 pm. Figura 7D - niveles de EGFR ubiquitinado (densitometría). Figura 7E - derivados de MDA-MB-231 se estimularon con 488-Tfn (5 minutos, 10 g/mL). Las células se fijaron en hielo, se lavaron con ácido y se analizaron para la intensidad de señal.
Las Figuras 8A-I muestran que SYNJ2 regula el tráfico de EGFR y la quimiotaxis. Figura 8A - extractos completos de células MDA-MB-231 transíectadas con los siRNAs indicados se inmunomancharon como es indicado. Figura 8B - FACS (izquierdo) y enlace de 125I-EGF (derecho; en triplicado) los análisis de EGFR de superficie en los subclones de MDA-MB-231. Figura 8C -las células shCtrl y shSYNJ2 se cultivaron en fibronectina y se inmunomancharon para EGFR y F-actina. Barra, 20 pm. Figura 8D -gráficas rosas de rastreos de células shCtrl y shSYNJ2 MDA-MB-231, que emigraron en las cámaras de quimiotaxis en la exposición a un gradiente de EGF. Los rastreos rojos indican las células que migran hacia EGF. Figura 8E - derivados de MDA-MB-231 deficientes se trataron con EGF (10 ng/mL) y U sados de células se sometieron a la inmunoprecipitación e inmunomanchado como es indicado. Figura 8F - células se cultivaron como en C y se inmunomancharon para EGFR activo (pY1045) y F-actina. Barra, 10 pm. Figura 8G - Los derivados de MDA-MB-231 indicados se trataron con EGF (10 ng/ml) durante 5 horas y los extractos inmunomanchados como es indicado. Figura 8H - Los derivados de MDA-MB-231 indicados se expusieron a Alexa Fluor 488-Tfn (25 mg/ml; 5 min) se lavaron con ácido para remover los ligandos enlazados en la superficie y las imágenes se tomaron en los intervalos indicados. Se muestran las señales de fluorescencia normalizada. Barra, 10 pm. Figura 81 - células MDA-MB-231, pretratadas con siCtrl o SÍSYNJ2, se estimularon con Alexa Fluor 488-EGF (20 mg/ml; 10 min) se lavaron con ácido, se incubaron a 37°C para los intervalos indicados y se analizaron mediante FACS.
Las Figuras 9A-D muestran que SYNJ2 es necesario para tanto el tráfico vesicular como la formación de adhesión focal. Figura 9A - derivados de MDA-MB-231 (shCtrl y shSYNJ2) se fijaron y mancharon para EEAl, F-actina y núcleos (DAPI). Barra de escala, 10 pm. Figura 9B - derivados de MDA-MB-231, específicamente células shCtrl y shSYNJ2, se sondearon para integrina beta-1, F-actina y DAPI (barra de escala, 20 pm). Figura 9C - células MDA-MB-231 se trataron con siCtrl y siSYNJ2 durante 48 horas y luego se inmunomancharon para integrina beta-1 y EGFR fosforilado. Figura 9D - Análisis de inmunofluorescencia de derivados de MDA-MB-231 para paxilina, núcleos (DAPI) y F-actina (utilizando TRITC-faloidina). La señal de paxilina se cuantificó en regiones citoplasmáticas con relación a adhesiones focales, y los números de adhesiones focales por célula también se cuantificaron. Además, las formas de adhesiones focales se cuantificaron al deteriorar las desviaciones de un circulo perfecto (excentricidad). Barra de escala, 10 mm.
Las Figuras 10A-F muestran que el agotamiento de SYNJ2 perturba la homeostasis de fosfoinositida, infla las endosomas tempranos y desensambla las adhesiones focales. Figura 10A - células MDA-MB-231, que expresan shCtrl o shSYNJ2, se transfectaron con un plásmido GFP-Rab4 y 48 horas después las células se fijaron y se contramancharon para F-actina utilizando TRITC-faloidina. Figura 10B - derivados de MDA-MB-231 se inmunomancharon para Rab5, F-actina y núcleos (DAPI). Las imágenes se cuantificaron para el tamaño y el número de vesículas positiva de Rab5, así como para el área de celda promedio. Las barras de escala, 10 pm. Figura 10C Fosfoinositidas extraídas de derivados marcados con 3H-fosfoinositol de células MDA-MB-231, se separaron mediante cromatografía y sus niveles determinados en tres experimentos diferentes (señales normalizadas a células shCtrl). Figura 10D - células shCtrl y shSYNJ2 MDA-MB-231 se sondearon para pY1068-EGFR, Paxilina y F-actina (la señal de co-localización es blanca). Barra de escala, 10 mm). Figura 10E - se sembraron células shCtrl y shSYNJ2 MDA-MB-231. Las células desunidas se removieron 20 minutos después y las células unidas se formaron en imágenes y cuantificaron para el área superficial. Figura 10F - células MDA-MB-231, que expresan establemente shCtrl o shSYNJ2, se colocaron en placas de RTCA E y se registraron las mediciones de impedancia en tiempo real en intervalos de 5 segundos durante 80 min, y luego en intervalos de 10 min durante 80 min adicionales. Se muestran las Medias de 2 replicados (± S.D.).
Las Figuras 11A-G muestran que SYNJ2 regula la secreción de proteasa y el ensamblaje de invadopodio. Figura 11A - células shCtrl y shSYNJ2 MDA-MB-231 se cultivaron en Matrigel durante 5 dias, se fijaron y se inmunomancharon para MMP-9. Las intensidades de señal se convirtieron en mapas de calor y se graficaron contra la distancia de los núcleos de colonias. Las cabezas de flecha marcan los limites esferoides. Barra, 50 pm. Figura 11B - Sobrenadantes de células MDA-MB-231 de control y células que sobreexpresan establemente SYNJ2 se analizaron por triplicado para la actividad MMP-2 y MMP-9 utilizando la cimografia de gelatina. Figura 11C - células MDA-MB-231 que expresan establemente GFP-SYNJ2 se colocaron en cubiertas pre-recubiertas con gelatina fluorescente reticulada.
Tres horas después, las células se sondearon para GFP y F-actina, y se detectaron las estructuras invadopodiales (cabezas de flecha). Barra, 10 pm. Figura 11D - células MDA-MB-231 que sobreexpresan SYNJ2 (SYNJ2-OX), asi como células pre-tratadas con siCtrl u oligonucleótidos de siSYNJ2, se colocaron en platinas pre-recubiertas con gelatina fluorescente reticulada y las estructuras invadopodiales se cuantificaron en tres experimentos independientes. Figura 11E - estructuras invadopodiales de células MDA-MB-231 tratadas con los siRNAs indicados se detectaron mediante la degradación de gelatina, asi como mediante el manchado para F-actina o TKS5. Las cabezas de flecha (imágenes en el eje Z) marcan los invadopodios. Barra, 10 pm. Figura 11F - células MDA-MB-231 que expresan siCtrl o siSYNJ2 se colocaron en platinas recubiertas de gelatina y se procesaron como en C utilizando faloidina y anticuerpos a la forma fosforilada de EGFR (tirosina 1068). Barra de escala, 10 pm. Figura 11G - medio acondicionado durante 3 dias por los derivados de MDA-MB-231 indicados se examinaron utilizando un ensayo basado en ELISA para ligandos similares a EGF.
Las Figuras 12A-G muestran que SYJN2 regula la degradación de matriz y el ensamblaje de invadopodios. Figura 12A - Las células MDA-MB-231 tratadas con siRNA indicadas se colocaron en placa por triplicado, se cultivaron durante 3 dias y sus medios acondicionados se separaron electroforéticamente utilizando un gel incrustado en gelatina (0.1%), seguido por el manchado de proteínas para cuantificar la actividad proteolítica de MMP-2 y MMP-9. Figura 12B - análisis de Co-inmunoprecipitación utilizando cuentas conjugadas con GFP y extractos clarificados de células MDA-MB-231 que expresan establemente GFP-SYNJ2. Figura 12C - células MDA-MB-231 que expresan establemente GFP-SYNJ2 se transíectaron con un plásmido-RFP Cortactina y se colocaron en placas de colágeno. Análisis de imágenes de célula viva se realizó cuarenta y ocho horas después, e imágenes de disparo representativas de áreas de células tanto periféricas como centrales se capturaron. Barra de escala 5 pm. Figura 12D - Los derivados indicados de células MDA-MB-231 se transíectaron con un plásmido que codifica un dominio PH etiquetado con Myc de Tappl (un enlazador de PI (3,4)P2) y 48 horas después se colocaron en superficies recubiertas de gelatina. La co-distribución de F-actina, TKS5 agregada y PI(3,4)P2 (Tappl) se visualizó y se cuantificó utilizando la microscopía confocal. Barra de escala, 10 pm. Figura 12E - células MDA-MB-231 que expresan siCtrl o SÍSYNJ2 se colocaron en platinas de vidrio recubiertas con FITC gelatina y se incubaron durante 3 horas. Las células luego se fijaron y se inmunomancharon para CD44 y contramancharon para F-actina con TRITC-faloidina . Las células se visualizaron utilizando la microscopía de fluorescencia, y los invadopodios se detectaron mediante agujeros de observación en la matriz de FITC-gelatina. Las áreas estructuradas son agrandadas. Barra de escala, 10 mm. Figura 12F - un anticuerpo a CD44 se utilizó para el análisis de FACS de expresión de superficie mediante las células shCtrl y shSYNJ2. Se indican las fracciones de células correspondientes a las regiones enmarcadas. Figura 12G - células MDA-MB-231 pre-tratadas con siCtrl o siSYNJ2 se colocaron sobre cubiertas de vidrio recubiertas con FITC-gelatina y se incubaron durante 3 horas. Las células luego se fijaron y se inmunomancharon para MTL-MMP, y se contramancharon para F-actina con TRITC-faloidina. Barra de escala, 10 pm.
Las Figuras 13A-H muestran que la actividad enzimática de SYNJ2 propulsa la diseminación metastática de células de tumor mamario. Figura 13A - Los derivados indicados de células MDA-MB-231 que expresan RFP (2X106/ratón) se implantaron en la almohadilla de grasa de ratones SCID hembra (10-11 por grupo). El tamaño de tumor (media ± S.D.) se midió 2 y 6 semanas de post implantación. Figuras 13B-C - Las metástasis que aparecieron seis semanas de post implantación en los ganglios linfáticos axilares y distantes (Figura 13B) o pulmones (Figura 13C) son mostrados. Los asteriscos marcan los valores p: * <0.05, ** <0.01 y *** <0.001. Figuras 13D-F -Células MDA-MB-231 de control (LacZ) y marcadas con RFP que sobre expresan SYNJ2 (SYNJ2-OX) se implantaron en animales como en A y el tamaño de tumor (Figura 13D) asi como la metástasis a los ganglios linfáticos (Figura 13E) y pulmones (Figura 13F) se cuantificaron 6 y 8 semanas de post implantación. Figuras 13G-H - Los derivados de MDA-MB-231-RFP indicados se inyectaron ya sea intravenosamente (1.5X105 por ratón; vena de la cola) o en la almohadilla de grasa mamaria (2.5xl06 por ratón) de ratones SCID hembra de 5 semanas de edad. Cuatro semanas después, los pulmones de los ratones se inyectaron en la vena se examinaron para señales de RFP (paneles izquierdo y parte media). La sangre periférica se recolectó de grupo tratado en la almohadilla de grasa cuatro semanas después. Las muestras se purificaron en un gradiente de ficol y los números de células de tumor circulantes positivas de RFP (CTC) se registraron por lxlO6 FACS lecturas y se normalizaron al peso de tumor.
La Figura 14 es una formación de imagen in-vivo de metástasis de ganglios linfáticos local y distante. Las imágenes representativas de metástasis de ganglio linfático local (ipsilateral) y distante (contralateral) en ratones que se inocularon con células MDA-MB-231-RFP y se analizaron 6 semanas después (ver la Figura 13B). Antes de la formación de imagen, los ratones se anestesiaron y su pelaje se removió para la visualización y cuantificación de metástasis en ganglios linfáticos.
La Figura 15 es un modelo de trabajo que representa la acción integrada de SYNJ2 en la migración e invasión de célula. Los receptores activos de la posición de endosomas de recielado cargadas de EGFR en la membrana ventral, y este seguido por la activación local de PI3K. La fosforilación de PI (4,5)P2 de membrana mediante PI3K genera PI(3,4,5)P3, que es desfosforilado mediante SYNJ2 a PI(3,4)P2. Este último recluta TKS5, que fija Cortactina y nuclea la polimerización de actina. En paralelo, SYNJ2 controla el suministro de moléculas de adhesión similares a CD44, y proteasas similares mtl-MMP, para degradar la matriz extracelular (ECM) y establece nuevas estructuras invasivas, los invadopodios. De una manera similar, el suministro de EGFR a la periferia celular conduce a la descomposición de PI(4,5)P2 mediante SYNJ2 (y fosfolipasa C), que activa localmente Dinamina y las enzimas de acortamiento de actina similar a Cofilina para disolver las fibras de actina cortical e iniciar las protuberancias ricas en integrina, llenas de actina llamadas lamelipodios. La flecha horizontal marca la dirección de la migración de célula. Los segmentos codificados de color de la membrana de plasma denotan los fosfolipidos PI específicos.
Las Figuras 16A-C muestran que SYNJ2 es altamente expresado en tumores de mama agresivos. Figura 16A Inmunohistoquimica y microarreglo de tejido se utilizaron para estratificar 331 carcinomas de mama invasivos de acuerdo con la abundancia de SYNJ2 (alto, medio y bajo). La fracción relativa de tumores se presenta de acuerdo a los subtipos clínicos. Figura 16B - Imágenes representativas del manchado de SYNJ2 que demuestran intensidades y patrones (aumentados en la columna derecha) observados en un caso luminal (un asterisco marca la expresión por células endoteliales como control) y tanto tumores de mama similares a básales y que sobreexpresan HER2. Figura 16C - curvas de Kaplan-Meier estratificadas de acuerdo con la expresión de mRNA en clases de 286 (izquierdo; GSE2034) o 99 (derecho; GSE19783) de pacientes con cáncer de mama.
Las Figuras 17A-B muestran los principios del ensayo de polarización de fluorescencia utilizado para medir la actividad de 5'-fosfatasa de SYNJ2. La Figura 17A es un esquema que demuestra el principio general que una sonda fluorescente de PI(3,4)P2 no enlazada da origen a bajas lecturas de polarización, mientras que la sonda fluorescente de PI(3,4)P2 enlazada incrementa las lecturas de polarización. La Figura 17B es un gráfica de barras representativa que muestra la detección de actividad de SYNJ2 5'-fosfatasa como es medido por los valores de polarización (MP).
La FIG.18 representa la secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico (SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente) del dominio-His de PH Flag-TAPPI que se clonó en el plásmido pET28 y se expresó en E.coli. El dominio TAPPI-PH se marca en amarillo.
DESCRIPCIÓN DE MODALIDADES ESPECÍFICAS DE LA INVENCIÓN La presente invención, en algunas modalidades de la misma, se relaciona a métodos para prevenir metástasis de tumor, tratar y pronosticar cáncer e identificar agentes que son inhibidores putativos de metástasis.
Antes de explicar por lo menos una modalidad de la invención en detalle, se va a entender que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificada por los Ejemplos. La invención es capaz de otras modalidades o de ser practicada o llevada a cabo de varias maneras.
Los factores de crecimiento propulsan la migración de células y metástasis, pero implican mecanismos que son incompletamente entendidos.
Los presentes inventores ahora han identificado sinaptojanina-2 (SYNJ2) como un módulo maestro en regular invadopodios y lamelipodios in vitro y metástasis del cáncer in vivo.
Como se ilustra enseguida en la presente y en la sección de ejemplos que sigue, los presentes inventores comprobaron su descubrimiento in vitro, en animales y en especímenes de pacientes. Específicamente, empleando células mamarias estimuladas con EGF los presentes inventores ligan la fosfatasa de lípido sinaptojanina 2 (SYNJ2) a un fenotipo invasivo, y relacionan la alta SYNJ2, para acortar las tasas de supervivencia de pacientes de cáncer. La inactivación de SYNJ2 robustamente deterioró la metástasis de células de tumor mamario en un modelo animal. In vitro, las células agotadas de SYNJ2 exhibieron tráfico deteriorado de EGFR e integrinas, que da por resultado las adhesiones focales deformadas, lamelipodios detenidos y desaparición de invadopodios. Sin que sea limitado la teoría se sugiere que el recielado de EGFR activo focalmente promueve la desfosforilación mediada por SYNJ2 de lípidos de fosfoinositol específicos, para de esta manera instigar la formación de tanto invadopodios como lamelipodios y facilita la progresión de tumor (ver la Figura 15).
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método para prevenir metástasis de tumor con la condición de que el tumor no sea glioma, el método que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2(SYNJ2), para de esta manera prevenir la metástasis de tumor.
Como se utiliza en la presente la frase "metástasis de tumor" se refiere a un tumor maligno que se dispersa de su ubicación primaria a otras partes del cuerpo, por ejemplo, cáncer de mama que se etastastiza a los pulmones.
Como se utiliza en la presente los términos "cáncer" y "tumor" se utilizan intercambiablemente. El término se refiere a un crecimiento maligno o tumor causado por la división celular anormal y descontrolada.
Como se utiliza en la presente el término "prevención" se refiere a la detención, interrupción, inhibición del proceso metastásico o progresión y la metástasis subsecuente.
De acuerdo con todavía otro aspecto, se proporciona un método para tratar cáncer, el método que comprende, administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) y un inhibidor de un receptor de superficie celular asociada con un inicio o progresión de cáncer, para de esta manera tratar cáncer.
Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" incluye la anulación, sustancialmente inhibición, retardo o inversión de la progresión de una condición, sustancialmente mejorando los sintomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente previniendo la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.
Ejemplos no limitantes de cánceres que pueden ser tratados (o pronosticados) de acuerdo con algunas modalidades de la invención incluyen cualquier cáncer sólido o no sólido y/o metástasis de cáncer, que incluye pero no está limitado a, tumores del tracto gastrointestinal (carcinoma de colon, carcinoma rectal, carcinoma colorrectal, cáncer colorrectal, adenoma colorrectal, no poliposis hereditaria tipo 1, no poliposis hereditaria tipo 2, no poliposis hereditaria tipo 3, no poliposis hereditaria tipo 6; cáncer colorrectal, no poliposis hereditaria tipo 7, carcinoma de intestino delgado y/o grueso, carcinoma esofágico, tilosis con cáncer esofágico, carcinoma de estómago, carcinoma pancreático, tumores endocrinos pancreáticos), carcinoma endometrial, protuberancias de dermatofibrosarcoma, carcinoma de vesícula biliar, tumores de tracto biliar, cáncer de próstata, adenocarcinoma de próstata, cáncer renal (por ejemplo, tumor de il s tupo 2 o tipo 1), cáncer de hígado (por ejemplo, hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular, cáncer hepatocelular), cáncer de vejiga, rabdomiosarcoma embrional, tumor de células germinales, tumor trofoblástico, tumor de células germinales testiculares, teratoma inmaduro de ovario, uterino, ovárico epitelial, tumor sacrococcígeal, coriocarcinoma, tumor trofoblástico de sitio placenta, tumor de adulto epitelial, carcinoma ovárico, cáncer de ovario seroso, tumores del cordón sexual ovárico, carcinoma cervical, carcinoma de cerviz uterino, carcinoma de pulmón de célula pequeña y célula no pequeña, nasofaríngeo, carcinoma de mama (por ejemplo, cáncer de mama ductal, cáncer de mama intraductal invasivo, esporádico; cáncer de mama, susceptibilidad a cáncer de mama, cáncer de mama tipo 4, cáncer de mama-1, cáncer de mama-3; cáncer de mama-ovárico), carcinoma de células escamosas (por ejemplo, en cabeza y cuello), tumor neurogénico, astrocitoma, ganglioblastoma, neuroblastoma, linfomas (por ejemplo, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, célula B, Burkitt, célula T cutánea, histiocítico, linfoblástica, célula T, tímico), gliomas, adenocarcinoma, tumor atírenal, carcinoma adrenocortical hereditario, malignidad de mama, (tumor), varios de otros carcinomas (por ejemplo, célula grande broncogénica, ductal, ascitis de Ehrlich-Lettre, epidermoide, células grandes, pulmón de Lewis, medular, mucoepidermoide, células de avena, células pequeñas, células de husillo, espinocelular, célula transicional, no diferenciada, carcinoma, coriocarcinoma, cistadenocarcinoma) , ependimoblastoma, epitelioma, eritroleucemia (por ejemplo, Friend, linfoblastos), fibrosarcoma, tumor de célula gigante, tumor glial, glioblastoma (por ejemplo, multiforme, astrocito a), hepatoma de glioma, heterohibridoma , heteromieloma, histiocitoma, hibridoma (por ejemplo, células B), hipernefroma, insulinoma, tumor de isleta, queratoma, leiomioblastoma, leiomiosarcoma, leucemia (por ejemplo, linfática aguda, linfoblástica aguda, célula pre-B linfoblástica aguda, leucemia de célula T linfoblástica aguda, aguda - megacarioblástica, monocitica, mielógena aguda, mieloide aguda, mieloide aguda con eosinofilia, células B, basofilica, mieloide crónica, crónica, célula B, eosinofilica, Friend, granulocitica o mielocitica, célula pilosa, linfocitica, megacarioblástica, monocitica, monocítica-macrófago, mieloblástica, mieloide, mielomonocitica, células de plasma, células pre-B, promielocítica, subaguda, células T, neoplasia linfoide, predisposición a malignidad mieloide, leucemia no linfocitica aguda), linfosarcoma, melanoma, tumor mamario, mastocitoma, meduloblastoma, mesotelioma, tumor metastásico, tumor de monocitos, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, mieloma, nefroblastoma, tumor de glial de tejido nervioso, tumor neuronal de tejido nervioso, neurinoma, neuroblastoma, oligodendroglioma, osteocondroma, osteomieloma, osteosarcoma (por ejemplo, de Ewing), papiloma, células transicional, feocromocitoma, tumor de pituitaria (invasivo), plasmocitoma, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma (por ejemplo, de Ewing, célula histiocítica, Jensen, osteogénica, célula de retículo), schwannoma, tumor subcutáneo, teratocarcinoma (por ejemplo, pluripotentes), teratoma, tumor testicular, timoma y tricoepitelioma, cáncer gástrico, fibrosarcoma, glioblastoma multiforme; tumores de glomus múltiple, síndrome de Li-Fraumeni, liposarcoma, síndrome II de familia de cáncer de linch, tumor de célula germinal masculina, leucemia de mastocitos, tiroide medular, meningio a múltiple, mixosarcoma de neoplasía endocrina, paraganglioma, noncromafina familiar, pilomatricoma, papilar, familiar y esporádica, síndrome de predisposición rabdoide, familiar, tumores rabdoides, sarcoma de tejidos blandos y síndrome de Turcot con glioblastoma .
De acuerdo a una modalidad específica, el cáncer es cáncer de mama.
De acuerdo con una modalidad específica, el cáncer (o la metástasis de cáncer) es regulada con EGF.
De acuerdo con otra modalidad preferida, el cáncer se caracteriza por sobreexpresión o regulación hacia arriba de una molécula de receptor de ErbB tal como EGFR o HER2.
Las mutaciones que conducen a la sobreexpresión de EGFR (conocida como regulación hacia arriba) o sobre actividad se ha asociado con un número de cánceres, que incluyen cáncer de pulmón, cánceres anales y glioblastoma multiforme. En este último caso una mutación más o menos especifica de EGFR, llamada EGFRvIII frecuentemente se observa. Las mutaciones, amplificaciones o mas regulaciones de EGFR o miembros de familia se implican en aproximadamente 30% de todos los cánceres epiteliales.
Las mutaciones que involucran EGFR podrían conducir a su activación constante, que podría dar por resultado a división celular no controlada - una predisposición para cáncer. Consecuentemente, las mutaciones de EGFR se han identificado en varios tipos de cáncer, y es el objetivo de una clase de expansión de terapias anti cáncer [Zhang 2007 J. Clin . Invest . 117 (8): 2051-8].
La amplificación o sobreexpresión del gen ERBB2 ocurre en aproximadamente 30% de cánceres de mama. Está fuertemente asociado con la recurrencia de enfermedad incrementada y una pobre prognosis. La sobre-expresión también se conoce que ocurre en el ovario, estómago y formas agresivas de cáncer uterino, tal como carcinoma endometrial seroso uterino.
Lo siguiente es una lista de cánceres en los cuales se implican los miembros de la familia ErbB de tirosina quinasas de receptor.
ErbB-1 - cáncer adrenocortical, cáncer biliar, cáncer cervical, cáncer colorrectal, cáncer esofágico, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón (célula no pegueña, carcinoma de célula escamosa, adenocarcinoma y cáncer de pulmón de célula grande), cáncer pancreático, cáncer de glándula salival, neoplasma benigno de diarrea, carcinoma invasivo, enfermedad de la piel, carcinoma ductal in situ, paroniquia.
ErbB-2 - cáncer biliar, cáncer de vejiga, cáncer de mama, colangiocarcinoma, cáncer de esófago, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, glioblastoma, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de glándula salival. De acuerdo con una modalidad específica el cáncer es cáncer de mama o gástrico.
ErbB-3 - cáncer de mama, cáncer de pulmón y leucemia viral .
ErbB-4 - cáncer de mama, leucemia viral, meduloblastoma, cáncer de pulmón y tumor mamario.
Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" se refiere a un mamífero (por ejemplo, humano) quien se ha diagnosticado con cáncer.
Como se utiliza en la presente sinaptojanina-2 o SYNJ2 se refiere a inositol-1,4,5-trifosfato 5-fosfatasa 2 Sináptica, EC 3.1.3.36. Sinaptojanina-2 es una polifosfato 5-fosfatasa de inositol ubicuitamente expresada (SEQ ID NO: 1 y 2, se refiere a polinucleótido y polipéptido codificado, respectivamente).
Como se utiliza en la presente la frase "inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2)" se refiere a una molécula que disminuye o regula hacia abajo la expresión o actividad de SYNJ2.
La regulación hacia abajo puede ser por más de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o una inhibición completa (100% de pérdida de actividad o expresión como se determina por un ensayo dado tal como es descrito enseguida en la presente).
La regulación hacia abajo de la expresión de SYNJ2 se puede efectuar en el DNA, RNA o nivel de proteínas como es descrito enseguida en la presente. Una actividad de SYNJ2 se refiere a su actividad catalítica [como una fosfatasa, que convierte PI(3,4,5)P3 en PI(3,4)P2]. Su actividad de señalización (interactúa con dinamina, cotractina, ver las Figuras 5E-H) o localización celular. En este último caso, el inhibidor de SYNJ2 alterará la localización celular de la proteina.
De esta manera, la regulación hacia abajo de SYNJ2 se puede efectuar en el nivel genómico y/o de transcripto utilizando una variedad de moléculas que inactivan el gen o interfieren con su transcripción y/o traducción [por ejemplo, agentes de silenciamiento de ácido nucleico, por ejemplo, agentes de silenciamiento de ácido nucleico (RNA), antisentido, siRNA, shRNA, micro-RNA, ribozimas y ADNzima] o en el nivel de proteina utilizando, por ejemplo, antagonistas, enzimas que segmentan el polipéptido y los similares.
Lo siguiente es una lista de agentes capaces de regular hacia abajo el nivel de expresión y/o actividad de SYNJ2.
Un ejemplo, de un agente capaz de regular hacia abajo SYNJ2 es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo capaz de enlazar específicamente SYNJ2. De preferencia, el anticuerpo específicamente enlaza por lo menos un epítopo de SYNJ2. Como SYNJ2 es una proteína celular, se toman medidas para introducir el anticuerpo en las células. Como se utiliza en la presente, el término "epítopo" se refiere a cualquier determinante antigénico en un antígeno al cual se enlaza el parátopo de un anticuerpo.
Los determinantes epitópicos usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidrato y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga especifica .
El término "anticuerpo" como se utiliza en esta invención incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2, y Fv que son capaces de enlazar a macrófagos. Estos fragmentos de anticuerpos funcionales se definen como sigue: (1) Fab, el fragmento que contiene un fragmento de enlace de antígeno monovalente de una molécula de anticuerpo, se puede producir mediante la digestión del anticuerpo completo con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab', el fragmento de una molécula de anticuerpo que se puede obtener al tratar el anticuerpo completo con pepsina, seguido por reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; dos fragmentos Fab' se obtienen por molécula de anticuerpo; (3) (Fab') 2, el fragmento del anticuerpo se puede obtener al tratar el anticuerpo completo con la enzima pepsina sin reducción subsecuente; F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' mantenidos conjuntamente mediante dos enlaces de disulfuro; (4) Fv, definido como un fragmento genéticamente diseñado que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (5) anticuerpo de una sola cadena ("SCA"), una molécula genéticamente diseñada que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, enlazada por un enlazador de polipéptido adecuado como una molécula de una solo cadena genéticamente fusionada.
Métodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales asi como fragmentos de los mismos son bien conocidos en la téenica (ver, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988, incorporada en la presente por referencia).
Los fragmentos de anticuerpo de acuerdo con algunas modalidades de la invención se pueden preparar mediante hidrólisis proteolitica del anticuerpo o mediante la expresión en E. coli o células de mamífero (por ejemplo, cultivo de células de ovario de hámster chino u otros sistemas de expresión de proteínas) de DNA que codifica el fragmento. Los fragmentos de anticuerpos se pueden obtener mediante la digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos por métodos convencionales. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos se pueden producir mediante segmentación enzimática de anticuerpos con pepsina para proporcionar un fragmento 5S denotado F(ab')2. Este fragmento además se puede segmentar utilizando un agente de reducción de tiol, y opcionalmente un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo que resultan de la segmentación de los enlaces de disulfuro, para producir fragmentos monovalentes 3,5S Fab'. Alternativamente, una segmentación enzimática utilizando pepsina produce dos fragmentos Fab' monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, por Goldenberg, Patentes de Estados los Unidos. Nos. 4,036,945 y 4,331,647, y referencias contenidas en las mismas, las Patentes que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Ver también Porter, R.R. [Biochem. J.73: 119-126 (1959)]. Otros métodos de segmentación de anticuerpos, tal como la separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada monovalentes, además segmentan fragmentos, u otras téenicas enzimáticas, químicas o genéticas también se pueden utilizar, mientras que los fragmentos enlazan al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.
Los fragmentos Fv comprenden una asociación de cadenas VH y VL. Esta asociación puede ser no covalente, como es descrito en Inbar y colaboradores. [Proc. Nat'1 Acad. Sci. USA 69:2659-62 (19720]. Alternativamente, las cadenas variables pueden ser enlazadas por un enlace de disulfuro intermolecular o reticuladas por químicos tal como glutaraldehído. De preferencia, los fragmentos Fv comprenden cadenas VH y VL conectadas por un enlazador de péptido. Estas proteínas de enlace de antígeno de una sola cadena (sFv) se preparan al construir un gen estructural que comprende secuencias de DNA que codifican los dominios VH y VL conectados por un oligonucleótido. El gen estructural se inserta en un vector de expresión, que se introduce subsecuentemente en una célula hospedera tal como E. coli. Las células hospederas recombinantes sintetizan una sola cadena de polipéptido con un péptido enlazador que puentea los dos dominios V. Métodos para producir sFvs se describen, por ejemplo, por [Whitlow y Filpula, Métodos 2: 97-105 (1991); Bird y colaboradores, Science 242:423-426 (1988); Pack y colaboradores, Bio/Technology 11:1271-1277 (1993); y la Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad..
Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un péptido que codifica para una sola región de determinación de complementariedad (CDR). Péptidos CDR ("unidades de reconocimiento mínimo") se pueden obtener al construir genes que codifican la CDR de un anticuerpo de interés. Tales genes se preparan, por ejemplo, al utilizar la reacción en cadena de polimerasa para sintetizar la región variable del RNA de las células que producen anticuerpos. Ver, por ejemplo, Larrick y Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].
Anti SYNJ2 son comercialmente disponibles. Ejemplos de proveedores de anticuerpos monoclonales anti SYNJ2 humano incluyen, pero no están limitados a, Amsbio, Atlas Antibodies, AbD Serotec, United Stated Biological, antibodies-online.com, Genway, Proteintech Group y más. Los anticuerpos de la invención se vuelven no inmunogénicos para aplicaciones terapéuticas .
Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murino) son moléculas quiméricas de inmunoglobulinas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab').sub.2 u otras secuencias de enlace de antígeno de los anticuerpos) que contienen secuencia mínima derivada de in unoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recibidor) en los cuales los residuos forman una región de determinación complementaria (CDR) del recipiente que son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo de donador) tal como ratón, rata o conejo que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la estructura Fv de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del recibidor ni en las CDR importadas o las secuencias de estructura. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia consensual de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado óptimamente también comprenderá por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente aquella de una inmunoglobulina humana [Jones y colaboradores , Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores., Nature, 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)].
Métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la téenica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en este desde una fuente que no es humana. Los residuos de aminoácidos no humanos frecuentemente son referidos como residuos de importación, que son típicamente tomados de un dominio variable de importación. La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores [Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature 332:323-327 (1988); Verhocyen y colaboradores., Science, 239:1534-1536 (1988)], al sustituir CDRs de roedor o secuencias de CDR por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos humanizados son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos. No. 4,816,567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedor.
Los anticuerpos humanos también se pueden producir utilizando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo librerías de exhibición de fagos [Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y colaboradores., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. Las téenicas de Colé y colaboradores. y Boerner y colaboradores., también son disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé y colaboradores, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77(1985) y Boerner y colaboradores, J. Immunol, 147(1):86-95 (1991)]. De manera similar, los anticuerpos humanos se pueden hacer mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado parcial o completamente. En la estimulación, se observa la producción de anticuerpos humanos, que estrechamente se asemeja a aquel observado en humanos en todos los aspectos, incluyendo el rearreglo de genes, ensamblaje y repertorio de anticuerpos. Este procedimiento es descrito, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos No.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y colaboradores, Bio/Technology 10,: 779-783 (1992); Lonberg y colaboradores, Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368812-13 (1994); Fishwild y colaboradores., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol.13, 65-93 (1995).
La regulación hacia abajo de SYNJ2 también se puede lograr mediante el silenciamiento de RNA. Como se utiliza en la presente, la frase "silenciamiento de RNA" se refiere a un grupo de mecanismos reguladores [por ejemplo, interferencia de RNA (RNAi), silenciamiento de gen transcripcional (TGS), silenciamiento de gen post-transcripcional (PTGS), obstrucción, co-supresión y represión traduccional] mediada por moléculas de RNA que dan por resultado la inhibición o "silenciamiento" de la expresión de un gen de codificación de proteina correspondiente. El silenciamiento de RNA se ha observado en muchos tipos de organismos, incluyendo plantas, animales y hongos.
Tal como se utiliza en la presente, el término "agente de silenciamiento de RNA" se refiere a un RNA que es capaz de inhibir específicamente o "silenciar" la expresión de un gen objetivo. En ciertas modalidades, el agente de silenciamiento de RNA es capaz de prevenir el procesamiento completo (por ejemplo, la traducción completa y/o expresión) de una molécula de mRNA a través de un mecanismo de silenciamiento post-transcripcional. Los agentes de silenciamiento de RNA incluyen moléculas de RNA de no codificación, por ejemplo, dúplexes de RNA que comprende hebras emparejadas, así como RNAs precursores de los cuales se puede generar RNA de no codificación pequeños. Los agentes de silenciamiento de RNA ejemplares incluyen dsRNAs tales como siRNAs, iRNAs y shRNAs. En una modalidad, el agente de silenciamiento de RNA es capaz de inducir la interferencia de RNA. En otra modalidad, el agente de silenciamiento de RNA es capaz de mediar la represión traduccional.
De acuerdo con una modalidad de la invención, el agente de silenciamiento de RNA es especifico del RNA objetivo (por ejemplo, SYNJ2) y no inhibe cruzadamente o silencia un gen o una variante de empalme que exhibe 99% o menos de homología global al gen objetivo, por ejemplo, menor que 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% de homología global al gen objetivo.
La interferencia de RNA se refiere al proceso de silenciamiento de gen post-transcripcional específico de secuencia en animales mediados por RNA de interferencia corta (siRNAs). El proceso correspondiente en plantas es comúnmente referido como silenciamiento de gen post-transcripcional o silenciamiento de RNA y también es referido como obstrucción en hongos. El proceso de silenciamiento de gen post-transcripcional se cree que es un mecanismo de defensa celular evolucionariamente conservado utilizado para prevenir la expresión de genes extraños y es comúnmente compartido por diversas floras y fila. Tal protección de la expresión de gen extraño puede haber evolucionado en respuesta a la producción de RNA de doble hebra (dsRNAs) derivada de la infección viral o de la integración aleatoria de elementos de transposón en un genoma hospedero por la vía de una respuesta celular que específicamente destruye el RNA de una sola hebra homólogo o RNA genómico viral.
La presencia de dsRNAs largos en células estimula la actividad de una enzima ribonucleasa III referida como cortador o dicer. El cortador está involucrado en el procesamiento del dsRNA en piezas cortas de dsRNA conocidas como RNAs de interferencia corta (siRNAs). Los RNA de interferencia cortos derivados de la actividad cortadora son de manera típica de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos en longitud y comprenden aproximadamente dúplexes de 19 pares de bases. La respuesta de iRNA también caracteriza un complejo de endonucleasa, comúnmente referido como un complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), que media la segmentación del RNA de una solo hebra que tiene secuencia complementaria a la hebra de antisentido del dúplex siRNA. La segmentación del RNA objetivo toma lugar en la parte media de la región complementaria a la hebra de antisentido del dúplex de siRNA.
Por consiguiente, algunas modalidades de la invención contemplan el uso de dsRNA para regular hacia abajo la expresión de proteina del mRNA.
De acuerdo con una modalidad, el dsRNA es mayor que 30 pb. El uso de dsRNAs largos (es decir dsRNA mayor que 30 pb) ha sido muy limitado debido a la creencia de que estas regiones más largas de RNA de doble hebra darán por resultado la inducción de la interferona y la respuesta de PKR. Sin embargo, el uso de dsRNAs largos puede proporcionar numerosas ventajas en que la célula puede seleccionar la secuencia de silenciamiento óptima que alivia la necesidad de probar numerosos siRNAs; los dsRNAs largos permitirán a las librerías de silenciamiento tener menor complejidad que sería necesario para siRNAs; y, quizás más importante, el dsRNA largo podría prevenir las mutaciones de escape viral cuando se utilizan como terapéuticos.
Varios estudios demuestran que los dsRNAs largos se pueden utilizar para silenciar la expresión de gen sin inducir la respuesta de estrés o causar efectos fuera de objetivos significativos - ver por ejemplo [Strat y colaboradores., Nucleic Acids Research, 2006, vol. 34, No. 13 3803-3810; Bhargava A y colaboradores. Brain Res. Protoc.2004;13:115-125; Diallo M., y colaboradores., Oligonucleotides.2003;13:381-392; Paddison PJ, y colaboradores., Proc. Nati Acad. USA. 2002;99:1443-1448; Tran N., y colaboradores., FEBS Lett. 2004;573:127-134].
En particular, la invención de acuerdo con algunas modalidades de la misma contempla la introducción de dsRNA largo (transcriptos de arriba de 30 bases) para el silenciamiento del gen en células donde la ruta de interferona no es activada (por ejemplo, células embriónicas y oocitos) ver, por ejemplo Billy y colaboradores., PNAS 2001, Vol 98, páginas 14428-14433 y Diallo y colaboradores, oligonucleotides, 1 de Octubre del 2003, 13(5): 381-392. doi:10.1089/154545703322617069.
La invención de acuerdo con algunas modalidades de la misma también contempla la introducción de dsRNA largo específicamente diseñado no para inducir la interferona y rutas de PKR para la expresión de gen de regulación hacia abajo. Por ejemplo, Shinagwa y Ishii [ Genes & Dev. 17(11): 1340-1345, 2003] han desarrollado un vector, llamado pDECAP, para expresar RNA de doble hebra largo a partir de un promotor de RNA polimerasa II (Pol II). Debido a que los transcriptos de pDECAP carecen tanto de la estructura 5'-terminación y el extremo 3'-poli (A) que facilitan la exportación de ds-RNA al citoplasma, el ds-RNA largo del pDECAP no induce la respuesta de interferona.
Otro método para evadir la interferona y rutas de PKR en sistemas mamíferos es mediante la introducción de RNAs inhibidores pequeños (siRNAs) ya sea por la vía de la transfección o la expresión endógena.
El término "siRNA" se refiere a dúplexes de RNA inhibidores pequeños (generalmente entre 18-30 pares de bases) que inducen la ruta de interferencia de RNA (RNAi). Típicamente, los siRNAs se sintetizan químicamente como 21 ers con una región de dúplex de 19 pb central y 3'-colgamientos de 2-bases simétricas en las terminales, aunque se ha descrito recientemente que los dúplexes de RNA químicamente sintetizados de 25-30 bases de longitud pueden tener tanto como 100 veces en incremento en potencia comparados con 21mers en la misma ubicación. La potencia incrementada observada, obtenida utilizando RNAs más largos en la activación de RNAi se plantea como teoría que resulta de proporcionar el Cortador con un sustrato (27mer) en lugar de un producto (21mer) y que esto mejora la velocidad o eficiencia de entrada del dúplex de siRNA en RISC.
Se ha encontrado que la posición del 3'-colgamiento influye en la potencia de un siRNA y los dúplexes asimétricos que tienen un 3'-colgamiento en la hebra de antisentido son generalmente más potentes que aquellos con el 3'-colgamiento en la hebra de sentido (Rose y colaboradores., 2005). Esto se puede atribuir a la carga de hebra asimétrica en el RISC, ya que los patrones de eficacia opuestos se observan cuando se dirige el transcripto de antisentido.
Las hebras de un RNA de interferencia de doble hebra (por ejemplo, un siRNA) se pueden conectar para formar una estructura de horquilla o de tallo-bucle (por ejemplo, un shRNA). De esta manera como se mencionó el agente de silenciamiento de RNA de algunas modalidades de la invención también puede ser un RNA de horquilla corta (shRNA).
Ejemplos de moléculas de RNA de interferencia pequeña se pueden encontrar en Chuang y colaboradores. (supra) SJ2-1 (región de codificación 1612-1633; 5'AACGTGAACGGAGGAAAGCAG, SEQ ID NO: 3), SJ2-2 (región 5419-5440 en la región no traducida 3'; 5'CTCTTGCTGATACGCGATATT, SEQ ID NO: 4); o Rusk y colaboradores. [Curr Biol.2003 Abr; 15-13(8):659-63. Erratum in: Curr Biol.2003 Sep; 30;13(19):1746], que enseña el siRNA a las regiones de codificación 1612-1633 o 4925-4946 de SYNJ2.
Otros ejemplos de secuencias de siRNA que regulan hacia abajo exitosamente los niveles de mRNA de SYNJ2 incluyen, pero no están limitados a GAAGAAACAUCCCUUUGAU (SEQ ID NO: 5) y GGACAGCACUGCAGGUGUU (SEQ ID NO: 6).
El término "shRNA", como se utiliza en la presente, se refiere a un agente de RNA que tiene una estructura de tallo-bucle, que comprende una primera y segunda región de secuencia complementaria, el grado de complementariedad y orientación de las regiones que es suficiente tal que el emparejamiento de base ocurre entre las regiones, la primera y segunda regiones que son unidas por una región de bucle, el bucle que resulta de una carencia de emparejamiento de bases entre los nucleótidos (o análogos de nucleótido) dentro de la región de bucle. El número de nucleótidos en el bucle es un número entre y que incluye 3 a 23, o 5 a 15, o 7 a 13, o 4 a 9, o 9 a 11. Algunos de los nucleótidos en el bucle pueden ser involucrados en interacciones de par de base con otros nucleótidos en el bucle. Ejemplos de secuencias de oligonucleótidos que se pueden utilizar para formar el bucle incluyen 5'UUCAAGAGA-3' (Brummelkamp, TR y colaboradores (2002), Science 296: 550) y 5'-UUUGUGUAG-3' (Castanotto, D. y colaboradores. (2002) RNA 8:1454). Será reconocido por uno de habilidad con la téenica que el oligonucleótido de una sola cadena resultante forma una estructura de tallo-bucle o horquilla que comprende una región de doble hebra capaz de interactuar con la maquinaria de RNAi.
Ejemplos de secuencias de shRNA que regulan hacia abajo exitosamente los niveles de mRNA de SYNJ2 incluyen, pero no están limitadas a, CCGGCCTACGATACAAGCGACAAATCTCGAAGATTTGTCGCTTGTATCGTAGGTTTTTG (SEQ ID NO: 7); CCGGCGAGAGGAGATCATTCGGAAACTCGAGTTTCCGAATGATCTCCTCTCGTTTTTG (SEQ ID NO: 8); CCGGCCGGAAGAACAGTTTGAGCAACTCGAGTTGCTCAAACTGTTCTTCCGGTTTTTG (SEQ ID NO: 9).
La sintesis de agentes de silenciamiento de RNA adecuados para el uso con algunas modalidades de la invención se puede efectuar como sigue. Primero, la secuencia de mRNA de SYNJ2 se explora corriente abajo del codón de inicio AUG para las secuencias de dinucleótido AA. La ocurrencia de cada AA y los 19 nucleótidos adyacentes 3' se registra como sitios objetivos de siRNA potenciales. De preferencia, los sitios objetivos de siRNA se seleccionan de la estructura de lectura abierta, ya que las regiones no traducidas (UTRs) son más ricas en sitios de enlace de proteina reguladores. Las proteínas que enlazan UTR y/o complejos de iniciación de traducción pueden interferir con el enlace de del complejo de endonucleasa de siRNA [Tuschl Chembiochem. 2:239-245]. Será apreciado que, los siRNAs dirigidos en las regiones no traducidas también pueden ser efectivos, como es demostrado por GAPDH en donde siRNA dirigido en el 5' UTR medió aproximadamente 90% de disminución en el mRNA de GAPDH celular y completamente anuló el nivel de proteína (wwwdotambiondotcom/Techlib/tn/91/912dothtml).
Segundo, los sitios objetivo potenciales se comparan a una base de datos genómica apropiada (por ejemplo, humano, ratón, rata, etc.) utilizando cualquier software de alineación de secuencias, tal como el software BLAST disponible del servidor NCBI (wwwdotncbidotnlmdotnihdotgov/BLAST/). Los sitios objetivos putativos que exhiben homología significativa a otras secuencias de codificación son filtrados.
Las secuencias objetivo calificantes se seleccionan como una plantilla para síntesis de siRNA. Las secuencias preferidas son aquellas que incluyen bajo contenido de G/C ya que estas se han probado que son más efectivas en mediar el silenciamiento del gen como es comparado con aquellas con el contenido de G/C más alto que 55%. Varios sitios objetivos se seleccionan de preferencia a lo largo de la longitud del gen objetivo para evaluación. Para mejor evaluación de los siRNAs seleccionados, un control negativo se utiliza de preferencia en conjunción. El siRNA de control negativo de preferencia incluye la misma composición de nucleótidos como el siRNAs pero carecen de homología significativa al genoma. De esta manera, una secuencia de nucleótido entremezclada del siRNA de preferencia se utiliza, con la condición de que no exhiba cualquier homología significativa a cualquier otro gen.
Será apreciado que el agente de silencia iento de RNA de algunas modalidades de la invención no necesita ser limitado a esas moléculas que contienen únicamente RNA, sino además abarca nucleótidos y no nucleótidos químicamente modificados.
En algunas modalidades, el agente de silenciamiento de RNA proporcionado en la presente se puede asociar funcionalmente con un péptido de penetración de célula. Como se utiliza en la presente un "péptido de penetración de célula" es un péptido que comprende una secuencia de aminoácido corta (aproximadamente 12-30 residuos) o motivo funcional que confiere las propiedades de translocación independiente de energía (es decir, no endocitótica) asociadas con el transporte del complejo de permeable de membrana a través del plasma y/o membranas nucleares de una célula. El péptido de penetración de célula utilizado en el complejo de permeable de membrana de algunas modalidades de la invención de preferencia comprende por lo menos un residuo de cisteína no funcional, que es ya sea libre o derivado para formar un enlace de disulfuro con un ácido ribonucleico de doble hebra que se ha modificado para tal enlace. Los motivos de aminoácidos representativos que confieren tales propiedades se listan en la Patente de los Estados Unidos No. 6,348,185, los contenidos de la cual se incorporan expresamente en la presente por referencia. Los péptidos de penetración de célula de algunas modalidades de la invención de preferencia incluyen, pero no están limitados a, penetratina, transportan, plsl, TAT(48-60), pVEC, MTS y MAP.
Los mRNAs que sin dirigidos utilizando los agentes de silenciamiento de RNA incluyen, pero no están limitados a, aquellos cuya expresión está correlacionada con el atributo fenotipico indeseado. Los RNAm ejemplares que pueden ser dirigidos son aquellos que codifican proteínas truncadas es decir comprenden supresiones. Por consiguiente el agentes de silenciamiento de RNA de algunas modalidades de la invención puede ser dirigido a una región de puenteo en cualquier lado de la supresión. La introducción de tales agentes de silenciamiento de RNA en una célula causaría una regulación hacia abajo de la proteína mutada mientras que deja la proteína no mutada sin afectar.
De acuerdo con otra modalidad, el agente de silenciamiento de RNA puede ser un miRNA.
El término "microRNA", "miRNA", y "miR" son sinónimos y se refieren a una colección de moléculas de RNA de una sola hebra de no codificación de aproximadamente 19-28 nucleótidos de longitud, que regulan la expresión del gen. Los miRNAs se encuentran en una amplia gama de organismos (virusesdotfwdarwdothumans) y se ha mostrado que desempeñan una función en el desarrollo, homeostasis y etiología de enfermedad.
Enseguida está una breve descripción del mecanismo de la actividad de miRNA.
Los genes que codifican para miRNAs se transcriben conduciendo a la producción de un precursor de miRNA conocido como el pri-miRNA. El pri-miRNA es típicamente parte de un RNA policistrónico que comprende múltiples pri-miRNAs. El pri-miRNA puede formar una horquilla con un tallo y bucle. El tallo puede comprender bases desigualadas.
La estructura de horquilla del pri-miRNA se reconoce por Drosha, que es una RNasa III endonucleasa. Drosha típicamente reconoce los bucles terminales en el pri-miRNA y segmenta aproximadamente dos vueltas helicoidales en el tallo para producir un precursor de 60-70 nucleótidos conocido como pre-miRNA. Drosha segmenta el pri-miRNA con un corte escalonado típico de RNasa III endonucleasas que producen un tallo bucle de pre-miRNA con un 5'fosfato y 3' colgante de ~2 nucleótido. Se estima que aproximadamente una vuelta helicoidal del tallo (~10 nucleótidos) que se extiende más allá del sitio de segmentación Drosha es esencial para el procesamiento eficiente. El pre-miRNA luego se transporta activamente del núcleo al citoplasma mediante Ran-GTP y el receptor de exportación Ex-Portin-5.
El tallo de doble hebra del pre-miRNA luego se reconoce mediante el Cortador, que también es una RNasa III endonucleasa. El Cortador también puede reconocer el 5'fosfato y 3' colgamiento en la base del bucle de tallo. El cortador luego segmenta el bucle terminal dos vueltas helicoidales alejado de la base del bucle de tallo que deja un 5' fosfato adicional y el 3' colgamiento de ~2 nucleótido. El dúplex similar a siRNA resultante, que puede comprender desigualaciones, comprende el miRNA maduro y un fragmento de tamaño similar conocido como el miRNA*. El miRNA y miRNA* se pueden derivar de brazos opuestos del pri-miRNA y pre-miRNA. Las secuencias de MiRNA* se pueden encontrar en librerías de miRNAs clonados pero típicamente de frecuencia menor que los miRNAs.
Aunque inicialmente presente como una especie de doble hebra con miRNA*, el miRNA eventualmente llega a ser incorporado como un RNA de una sola hebra en un complejo de ribonucleoproteína conocido como el complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC). Varias proteínas pueden formar el RISC, que puede conducir a la variabilidad en la especificidad para dúplexes de miRNA/miRNA*, el sitio de enlace del gen objetivo, la actividad de miRNA (represión o activación) o de hebra del dúplex de miRNA/miRNA* se carga en el RISC.
Cuando la hebra de miRNA del dúplex del miRNA: miRNA* se carga en el RISC, el miRNA* se remueve y se degrada. La hebra del dúplex de miRNA: miRNA* que se carga en el RISC es la hebra cuyo extremo 5' es menos herméticamente emparejado. En casos en donde ambos extremos del miRNA: miRNA* tienen aproximadamente emparejamiento 5' equivalente, tanto miRNA como miRNA* puede tener actividad de silenciamiento de gen.
El RISC identifica ácidos nucleicos objetivo en base a los altos niveles de complementariedad entre el miRNA y el mRNA, especialmente por los nucleótidos 2-7 del miRNA.
Un número de estudios se han enfocado en el requerimiento de emparejamiento de base entre miRNA y su objetivo de mRNA para lograr la inhibición eficiente de la traducción (revisado por Bartel 2004, Cell 116-281). En células de mamífero, los primeros 8 nucleótidos del miRNA pueden ser importantes (Doench y Sharp 2004 GenesDev 2004-504). Sin embargo, otras partes del microRNA también pueden participar en el enlace de mRNA. Por otra parte, el emparejamiento de base suficiente en el 3' puede compensar el emparejamiento suficiente en el 5' (Brennecke y colaboradores, 2005 PLoS 3-e85) . Los estudios de computación, que analizan el enlace de miRNA de genomas completos han sugerido una función especifica para las bases 2-7 en el 5' del miRNA en el enlace objetivo pero la función del primer nucleótido, encontrado usualmente que es "A" también se reconoció (Lewis y colaboradores., 2005 Cell 120-15). De manera similar, los nucleótidos 1-7 o 2-8 se utilizaron para identificar y validar objetivos mediante Krek y colaboradores (2005, Nat Genet 37-495).
Los sitios objetivo en el mRNA pueden ser en el 5' UTR, el 3' UTR o en la región de codificación. De manera interesante, múltiples miRNAs pueden regular el mismo objetivo de mRNA al reconocer los mismos o múltiples sitios. La presencia de múltiples sitios de enlace de miRNA en la mayoría de los objetivos genéticamente identificados puede indicar que la acción cooperativa de múltiples RISCs proporciona la inhibición traduccional más eficiente.
Los miRNAs pueden dirigir la RISC para regular a hacia abajo la expresión del gen por cualquiera de dos mecanismos: segmentación de mRNA o represión traduccional. El miRNA puede especificar la segmentación del mRNA si el mRNA tiene un cierto grado de complementariedad con el miRNA. Cuando un miRNA guía la segmentación, el corte es típicamente entre los nucleótidos que emparejan a los residuos 10 y 11 de la miRNA. Alternativamente, el miRNA puede reprimir la traducción si el miRNA no tiene el grado necesario de complementariedad al miRNA. La represión traduccional puede ser más prevalente en animales puesto que los animales pueden tener un menor grado de complementariedad entre el miRNA y el sitio de enlace.
Se debe observar que puede haber variabilidad en los extremos 5' y 3' de cualquier par de miRNA y miRNA*. Esta variabilidad puede ser debido a la variabilidad en el procesamiento enzimático de Drosha y el Cortador con respecto al sitio de segmentación. La variabilidad de los extremos 5' y 3' de miRNA y miRNA* también puede ser debido a desigualaciones en las estructuras de tallo del pri-miRNA y pre-miRNA. Las desigualaciones de las hebras de tallo pueden conducir a una población de diferentes estructuras de horquilla. La variabilidad de las estructuras del tallo también puede conducir a la variabilidad en los productos de segmentación por Drosha y el Cortador.
El término ''imitación de microRNA" se refiere a RNAs de no codificación sintéticos que son capaces de entrar a la ruta de RNAi y regular la expresión del gen. Las imitaciones de miRNA imitan la función de los microRNAs endógenos (miRNAs) y se pueden diseñar como moléculas de doble hebra, maduras o precursores de imitación (por ejemplo, o pre-miRNAs). Las imitaciones de miRNA pueden estar comprendidas de RNA modificado o no modificado, DNA, híbridos de RNA-DNA, o químicos de ácidos nucleicos alternativos (por ejemplo, LNAs o ácidos nucleicos con puente de 2 ' -O,4'-C-etileno (ENA)). Para imitaciones de miRNA de doble hebra, maduros, la longitud de la región dúplex puede variar entre 13-33, 18-24 o 21-23 nucleótidos. El miRNA también puede comprender un total de por lo menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 nucleótidos. La secuencia del miRNA puede ser los primeros 13-33 nucleótidos del pre-miRNA. La secuencia del miRNA también puede ser los últimos 13-33 nucleótidos del pre-miRNA.
Será apreciado a partir de la descripción proporcionada en lo anterior en la presente, que el contacto de la célula de cáncer con un miRNA se puede afectar en un número de maneras: 1. Transfectar transientemente las células de cáncer con el miRNA de doble hebra maduro. 2. Transfectar establemente o transientemente las células de cáncer con un vector de expresión que codifica el miRNA maduro. 3. Transfectar establemente o transientemente las células de cáncer con un vector de expresión que codifica el pre-miRNA. La secuencia de pre-miRNA puede comprender de 45-90, 60-80 o 60-70 nucleótidos. La secuencia del pre-miRNA puede comprender un miRNA y miRNA* como se expone en la presente. La secuencia de pre-miRNA también puede ser aquella de un pri-miRNA que excluye de 0-160 nucleótidos desde los extremos 5' y 3' del pri-miRNA. 4. Transfectar establemente o transientemente las células de cáncer con un vector de expresión que codifica el pri-miRNA. La secuencia de pri-miRNA puede comprender de 45-30,000, 50-25,000, 100-20,000, 1,000-1,500 o 80-100 nucleótidos. La secuencia del pri-miRNA puede comprender un pre-miRNA, miRNA y miRNA*, como se expone en la presente, y variantes de los mismos .
Otro agente capaz de regular hacia abajo un SYNJ2 es una molécula de DNAzima capaz de segmentar específicamente un transcripto de mRNA o secuencia de DNA del SYNJ2. Las DNAzimas son polinucleótidos de una sola hebra que son capaces de segmentar ambas de las secuencias objetivo de una sola y doble hebra ((Breaker, R.R. y Joyce, G. Chemistry y Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Nati, Acad. Sci. USA 1997;943:4262). Un modelo general (el modelo "10-23") para la DNAzima se ha propuesto. Las DNAzimas "10-23" tienen un dominio catalítico de 15 desoxirribonucleótidos, flanqueados por dos dominios de reconocimiento de sustrato de siete a nueve desoxirribonucleótidos cada uno. Este tipo de DNAzima puede segmentar efectivamente su RNA de sustrato en uniones de pirimidina (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Nati, Acad. Sci. USA 199; para revisión de DNAzimas ver Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)].
Ejemplos de construcción y amplificación de DNAzimas diseñadas, sintéticas que reconocen sitios de segmentación objetivo de una sola y doble hebra se han descrito en la Patente de los Estados Unidos No. 6,326,174 de Joyce y colaboradores. Las DNAzimas de diseño similar dirigidas contra el receptor de uroquinasa humana se observaron recientemente que inhiben la expresión del receptor de uroquinasa, y exitosamente inhibe la metástasis de célula de cáncer de colon in vivo (Itoh y colaboradores, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther wwwdotasgtdotorg). En otra aplicación, las DNAzimas complementarias a oncogenes bcr-abl fueron exitosas en inhibir la expresión de oncogenes en células de leucemia, y disminuyeron las velocidades de recaída en el trasplante de médula ósea o autólogo en casos de LMC y ALL.
La regulación hacia abajo de un SYNJ2 también se puede efectuar al utilizar un polinucleótido de antisentido capaz de hibridar específicamente con un transcrito de mRNA que codifica el SYNJ2.
El diseño de moléculas de antisentido que se pueden utilizar para regular hacia abajo eficientemente un SYNJ2 se debe efectuar mientras que se consideran dos aspectos importantes al procedimiento de antisentido. El primer aspecto es el suministro del oligonucleótido en el citoplasma de las células apropiadas, mientras que el segundo aspecto es el diseño de un oligonucleótido que específicamente enlaza el mRNA designado dentro de las células de una manera que inhibe la traducción del mismo.
La téenica previa enseña un número de estrategias de suministro que se pueden utilizar para suministrar eficientemente oligonucleótidos en una amplia variedad de tipos de células [ver, por ejemplo, Luft J Mol Med 76: 75-6 (1998); Kronenwett y colaboradores. Blood 91: 852-62 (1998); Rajur y colaboradores. Bioconjug Chem 8: 935-40 (1997); Lavigne y colaboradores. Biochem Biophys Res Commun 237: 566-71 (1997) y Aoki y colaboradores. (1997) Biochem Biophys Res Commun 231: 540-5 (1997)].
Además, los algoritmos para identificar aquellas secuencias con la afinidad de enlace predicha más alta por su mRNA objetivo en base a un ciclo termodinámico que tiene en cuenta la energética de las alteraciones estructurales en tanto el mRNA objetivo como el oligonucleótido también están disponibles [ver, por ejemplo, Walton y colaboradores. Biotechnol Bioeng 65: 1-9 (1999)].
Tales algoritmos se han utilizado exitosamente para implementar un procedimiento de antisentido en células. Por ejemplo, el algoritmo desarrollado por Walton y colaboradores, permitió a los científicos diseñar exitosamente oligonucleótidos de antisentido para beta-globina de conejo (RBG) y transcriptos de factor-alfa de necrosis de tumor de ratón (TNF alfa). El mismo grupo de investigación ha reportado más recientemente que la actividad de antisentido de los oligonucleótidos racionalmente seleccionados contra tres mRNAs objetivo de modelo (lactato deshidrogenasa A y B de humano y gpl30 de rata) en el cultivo celular como se evaluó por una téenica de PCR cinética se probó efectiva en casi todos los casos, incluyendo las pruebas contra tres objetivos diferentes en dos tipos de células con químicas de fosfodiéster y oligonucleótidos fosforotioato.
Además, varios procedimientos para diseñar y predecir la eficiencia de oligonucleótidos específicos utilizando un sistema in vitro también se publicaron (Matveeva y colaboradores, Nature Biotechnology 16: 1374 - 1375 (1998)].
Por ejemplo, un oligonucleótido de antisentido adecuado dirigido contra el mRNA de SYNJ2 (que está codificando para la proteína SYNJ2) serían de las siguientes secuencias: CCCTTTGTCTGCCACCTCCT (SEQ ID NO: 10), ACCCATCTTGCTCTCTCCC (SEQ ID NO: 11) y TCTTCCTCCACCACAGCACC (SEQ ID NO: 12).
Varios experimentos clínicos han demostrado seguridad, factibilidad y habilidad de los oligonucleótidos de antisentido. Por ejemplo, los oligonucleótidos de antisentido adecuados para el tratamiento de cáncer se han utilizado exitosamente [Holmund y colaboradores, Curr Opin Mol Ther 1:372-85 (1999)], mientras que el tratamiento de malignidad hematológicas por la vía de oligonucleótidos de antisentido que se dirigen al gen c-myb, p53 y Bcl-2 han introducido en experimentos clínicos y se ha mostrado que son tolerados por los pacientes [Gerwitz Curr Opin Mol Ther 1:297-306 (1999)].
Más recientemente, la supresión mediada por antisentido de la expresión del gen de heparanasa humana se ha reportado que inhibe la desimanación pleural de células de cáncer humano en un modelo de ratón [Uno y colaboradores, Cáncer Res.61:7855-60 (2001)].
De esta manera, el consenso actual es que desarrollos recientes en el campo de teenología de antisentido que, como es descrito en lo anterior, han conducido a la generación de algoritmos de diseño de antisentido altamente precisos y una amplia variedad de sistemas de suministro de oligonucleótido, permitieron a un persona ordinariamente experta diseñar e implementar procedimientos de antisentido adecuados para regular hacia abajo la expresión de secuencias conocidas sin tener que recurrir al experimento indebido y la experimentación de error.
Otro agente capaz de regular hacia abajo SYNJ2 es una molécula de ribozima capaz de segmentar específicamente un transcrito de mRNA que codifica una SYNJ2. Las ribozimas son cada vez más utilizadas para la inhibición específica de secuencia de la expresión de gen mediante la segmentación de proteínas que codifican mRNA de interés [Welch y colaboradores., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]. La posibilidad de diseñar ribozimas para segmentar cualquier RNA objetivo específico les ha vuelto herramientas valiosas en tanto la investigación básica como en aplicaciones terapéuticas. En el área terapéutica, las ribozimas se han explotado para los RNAs virales objetivos en enfermedades infecciosas, oncogenes dominantes en cánceres y mutaciones somáticas específicas en trastornos genéticos [Welch y colaboradores., Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]. Más notablemente, varios protocolos de terapia de gen de ribozima para pacientes de HIV ya están en experimentos de fase 1. Más recientemente, llaass rriibboozziimmaass se han utilizado para la investigación de animal transgénico, validación objetivo de gen y elucidación de la ruta. Varias ribozimas están en varias etapas de experimentos clínicos. ANGIOZYME fue la primera ribozima químicamente sintetizada que es estudiada en experimentos clínicos humanos. ANGIOZYME específicamente inhibe la formación de VEGF-R (Receptor de Factor de Crecimiento Endotelial Vascular), un componente clave en la ruta de angiogénesis. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., así como otras firmas han demostrado la importancia de la terapéutica de anti-angiogénesis en modelos de animales. HEPTAZYME, una ribozima diseñada para destruir selectivamente el RMA de virus de hepatitis C (VHC), se encontró efectivo en disminuir el RNA viral de hepatitis C en ensayos de cultivo de células (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB home page).
Otro agente capaz de regular hacia abajo SYNJ2 seria cualquier molécula que enlaza a y/o segmenta SYNJ2.
Las presentes enseñanzas validaron un mecanismo general que implica las funciones de SYNJ2 en la motilidad celular.
Los principios se resumen en la Figura 15. Por consiguiente, un evento clave comprende la regulación hacia arriba inducida por EGF de SYNJ2, un agotamiento subsecuente de tres fosfoinosítidas: PI(4,5)P2, PI(3,4,5)P3 y PI(3,5)P2, desfosforilación de PI(4,5)P2 mediada por SYNJ2 es paralela por la degradación de PI(4,5)P2 mediante fosfolipasa C-gamma, y la fosforilación por PI3K, que genera PI(3,4,5)P3. Colectivamente, la estimulación de las tres enzimas por EGF disocia un grupo de enlazadores de PI(4,5)P2 de la membrana de plasma, y también genera vesículas endocíticas libres de PI(4,5)P2. Concurrentemente, SYNJ2 convierte PI(3,4,5)P3 en PI(3,4)P2, que es esencial para la formación de invadopodios. Una vez en el lugar, PI(3,4)P2 enlaza TKS5 y nuclea una Dinamina y el complejo centrado de Cortactina que permite la Cofilina generar extremos barbados de actina dentro de los invadopodios. De acuerdo con los presentes resultados, SYNJ2 está involucrado también en las siguientes etapas de maduración de invadopodios, específicamente la secreción de MMPs y el suministro de MT1-MMP y otras moléculas de superficie, tal como CD44. De una manera similar, SYNJ2 controla el suministro de EGFRs e integrina al borde de guía, y probablemente activa cofilina, un evento de pivote que dicta la formación de protuberancias lamelipodiales.
Estos descubrimientos pueden ser acentuados hacia la identificación de inhibidores de SYNJ2, que son inhibidores putativos de metástasis de tumoral.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la invención se proporciona un método para identificar un inhibidor putativo de metástasis de tumor, el método que comprende análisis el procesamiento mediado por SYNJ2 de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia de un agente de prueba, en donde un procesamiento disminuido de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia del agente de prueba como se compara con el mismo en una ausencia de este es indicativo de un inhibidor putativo de metástasis de tumor.
El agente de prueba puede ser una bio olécula (por ejemplo, proteina, un péptido o un anticuerpo, molécula de ácido nucleico, por ejemplo agente de silenciamiento, un carbohidrato, un lipido o una combinación de los mismos) o una molécula pequeña (por ejemplo, químico).
El método se puede efectuar in vivo o in vitro. Este último se puede implementar en un sistema celular o utilizando un sistema libre de células.
Un ensayo ejemplar, involucra analizar el procesamiento mediado por SYNJ2 de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 mediante un ensayo de competición.
Por consiguiente, el ensayo de competición prueba el desplazamiento de un dominio de enlace PI(3,4)P2 de un complejo que comprende el dominio de enlace PI(3,4)P2 enlazada a PI(3,4)P2.
De acuerdo con una modalidad ejemplar, se emplea un ensayo competitivo de polarización de fluorescencia. El ensayo depende del principio de que una vez que las moléculas se enlazan a un elemento más grande de secuestración (por ejemplo, una proteína) su movimiento en el espacio es significativamente disminuido. Este fenómeno se puede detectar y medir utilizando una sonda fluorescente, que permite ensayar la polarización fluorescente después de las mediciones de los planos paralelos y perpendiculares de la muestra. Por consiguiente, las moléculas fluorescentes no enlazadas en solución dan origen a lecturas de polarización muy bajas, pero cuando un detector (por ejemplo, una proteina de enlace) que enlaza (secuestra) estas moléculas se adicionan a la solución, las moléculas fluorescentes se estabilizan en una composición confinada que incrementa las lecturas de polarización en la solución.
Por ejemplo, el ensayo puede comprender un dominio de enlace de PI(3,4)P2 (por ejemplo; dominio PH, por ejemplo; dominio Tappl PH, SEQ ID NOs: 15-16) y un PI(3,4)P2 fluorescente, junto con un SYNJ2 recombinante y su sustrato no fluorescente, PI(3,4,5)P3. El producto de la actividad catalítica DE SYNJ2 desplaza el PI(3,4)P2 fluorescente, para de esta manera disminuir la polarización de fluorescencia.
De acuerdo con modalidades específicas se utiliza un Ensayo de Polarización de Fluorescencia de Actividad de Fosfatasa 5' PI(3,4,5)P3 comercial (por ejemplo, Echelon Bioscience, cat. no. K-1400).
De acuerdo con modalidades específicas, una mezcla de reacción que comprende SYNJ2 y PI(3,4,5)P3, como sustrato, se incuba bajo condiciones que permiten la actividad catalítica (defosforilación) de SYNJ2 con o sin un agente de prueba que es preparado. El agente de prueba puede ser, por ejemplo, una molécula pequeña, una molécula de ácido nucleico, un péptido, un anticuerpo, un carbohidrato o una combinación de los mismos. Después de la incubación, la solución que contiene los productos PI(3,4)P2 se mezcla con una mezcla de proteina de enlace de PI(3,4)P2 (por ejemplo; PH-dominio de Tappl, SEQ ID NO: 15) y un PI(3,4)P2 fluorescente y se mide la polarización de fluorescencia. Los valores de polarización medidos en este ensayo disminuye conforme las moléculas PI{3,4)P2 fluorescentes enlazadas están siendo desplazadas por PI(3,4)P2 no etiquetado producido por la actividad enzimática de SYNJ2 y la cantidad de moléculas PI(3,4)P2 fluorescentes no enlazadas en la solución se incrementa. En el caso donde el valor de polarización de fluorescencia en la presencia del agente de prueba se incrementa en comparación al valor en la ausencia del agente de prueba, el agente de prueba es un inhibidor SYNJ2 putativo.
Una vez identificada, la funcionalidad del agente de prueba como un fármaco anti metastásico además se apoya utilizando ensayos relevantes, tal como el ensayo de gelatina-zimografía, ensayo de transwell y animales de prueba como es ejemplificado enseguida adicionalmente.
Utilizando esta metodología los presentes inventores han identificado un número de moléculas pequeñas que se pueden utilizar como inhibidores de SYNJ2 de acuerdo con algunas modalidades de la presente invención. Estas moléculas se representan en la Tabla 2 del Ejemplo 10, enseguida en la presente.
Como se mencionó, el inhibidor de SYNJ2 se administra además de un inhibidor de un receptor de superficie de célula asociado con un inicio o progresión de cáncer. De acuerdo con una modalidad de la invención, el receptor es un oncogén.
Ejemplos de receptores que pueden ser dirigidos de acuerdo con las presentes enseñanzas son tirosina quinasas de receptor tales como aquellas EGFR, PDGFR, VEGFR, FGFR y ErbB-2.
Otras moléculas de superficie que pueden ser dirigidas incluyen integrinas matriz metalo proteinasas (MMP) de dinamina, TKS5 y CD44.
Los inhibidores de moléculas de superficie de células son bien conocidos en la téenica. Una lista no limitante de tales inhibidores se proporciona enseguida.
De esta manera por ejemplo, la identificación de EGFR como un oncogén ha conducido al desarrollo de terapéuticos anti cáncer dirigidos contra EGFR.
Cetuximab y panitumumab son ejemplos de inhibidores de anticuerpo monoclonal. Otros monoclonales en desarrollo clínico son zalutumumab, nimotuzumab y matuzumab. Los anticuerpos monoclonales bloquean el dominio de enlace de ligando extracelular. Con el sitio de enlace bloqueado, las moléculas de señal no pueden unirse por más tiempo ahí y activar la tirosina quinasa.
Otro método es utilizar moléculas pequeñas para inhibir la tirosina quinasa de EGFR, que está en el lado citoplásmico del receptor. Sin actividad de quinasa, EGFR es incapaz de activarse por si mismo, que es un prerequisito para el enlace de las proteínas adaptadoras corriente abajo. Ostensiblemente al detener la cascada de señalización en células que dependen de esta ruta para el crecimiento, se disminuye la proliferación y migración de tumor. Gefitinib, erlotinib y lapatinib (inhibidor de EGFR y erbB2 mezclado) son ejemplos de inhibidores de quinasa de molécula pequeña. Otros ejemplos incluyen, Iressa y Tarceva directamente el objetivo del EGFR.
HER2 es el objetivo del anticuerpo monoclonal trastuzumab (comercializado como Herceptin). Trastuzumab es únicamente efectivo en cánceres donde HER2 es sobreexpresado. Otro anticuerpo monoclonal, pertuzumab, que inhibe la dimerización de receptores de HER2 y HER3, se aprobó por la FDA para el uso en combinación con trastuzumab en Junio del 2012.
Adicionalmente, Neu Vax (Galena Biopharma) es una inmunoterapia a base de péptido que dirige las células T "exterminadoras" para dirigir y destruir las células de cáncer que expresan HER2.
La expresión de HER2 se regula al señalizar a través de receptores de estrógeno. Estradiol y tamoxifen que actúan a través del receptor de estrógenos regulan hacia abajo la expresión de HER2.
Ejemplos de anticuerpos que se pueden utilizar de acuerdo con las presentes enseñanzas se listan enseguida y no se proponen como una manera para ser limitantes.
Tabla 1 Los inhibidores del SYNJ2 y opcionalmente el inhibidor del receptor de superficie de célula como es descrito en la presente se pueden administrar al sujeto per se o en una composición farmacéutica donde se mezcla con portadores o excipientes adecuados.
Como se utiliza en la presente una "composición farmacéutica" se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en la presente con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En la presente al término "ingrediente activo" se refiere al inhibidor del SYNJ2 (y opcionalmente el inhibidor del receptor de superficie de célula) que se tiene en cuenta para el efecto biológico.
Después en la presente, las frases "portador fisiológicamente aceptable" y "portador farmacéuticamente aceptable" que se pueden utilizar intercambiables se refieren a un portador o un diluyente que no causa irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye bajo estas frases.
En la presente el término "excipiente" se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar además la administración de un ingrediente activo. Ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceiteS vegetales y polietilenglicoles.
Téenicas para formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania, más última edición, que se incorpora en la presente por referencia.
Las rutas adecuadas de administración, por ejemplo, pueden incluir el suministro oral, rectal, transmucosal, especialmente transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intra edulares asi como intratecales, intraventriculares directas, intracardiacas, por ejemplo, en la cavidad ventricular derecha o izquierda, en la arteria coronaria común, inyecciones intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
Los procedimientos convencionales para suministro de fármaco al sistema nervioso central (CNS) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (por ejemplo, inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (por ejemplo, producción de una proteina de fusión quimérica que comprende un péptido de transporte que tiene una afinidad para una molécula de superficie de célula endotelial en combinación con un agente que es por si mismo incapaz de cruzar la BBB) en un intento para explotar una de las rutas de transporte endógenas de la BBB; estrategias farmacológicas diseñadas para incrementar la solubilidad de lípido de un agente (por ejemplo, conjugación de agentes solubles en agua a portadores de lipidos o de colesterol); y la interrupción transitoria de la integridad de la BBB mediante interrupción hiperosmótica (que resulta de la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos inherentes asociados con un procedimiento quirúrgico invasivo, una limitación de tamaño impuesta por una limitación inherente en los sistemas de transporte endógenos, los efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables asociados con la administración sistémica de una molécula quimérica comprendida de un motivo portador que podría ser activo afuera del SNC, y el riesgo posible de daño cerebral dentro de regiones del cerebro donde se interrumpe la BBB, que lo vuelve un método de suministro subóptimo.
Alternativamente, se puede administrar la composición farmacéutica en una manera local antes que sistémica, por ejemplo, por la vía de la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región de tejido de un paciente.
El término "tejido" se refiere a parte de un organismo que consiste de células diseñadas para realizar una función o funciones. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, tejido cerebro, retina, tejido de piel, tejido hepático, tejido pancreático, hueso, cartílago, tejido conectivo, tejido de sangre, tejido de músculo, tejido cardiaco, tejido de cerebro, tejido vascular, tejido renal, tejido pulmonar, tejido gonadal, tejido hematopoyético.
Las composiciones farmacéuticas de algunas modalidades de la invención se pueden fabricar por procesos bien conocidos en la téenica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, elaboración de grageas, levigación, emulsificación, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con algunas modalidades de la invención de esa manera se pueden formular en un modo convencional o utilizando uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones, que se pueden utilizar farmacéuticamente. La formulación apropiada es dependiente de la ruta de administración elegida.
Para inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, de preferencia en soluciones amortiguadores fisiológicamente compatibles tal como la solución de Hank, solución de Ringer o solución amortiguadora de sal fisiológica. Para administración transmucosal, los penetrantes apropiados a la barrera que es permeada se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la téenica.
Para administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente al combinar los compuestos activos con portadores farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que la composición farmacéutica sea formulada como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones espesas, suspensiones y los similares, para ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacológicas para uso oral se pueden hacer utilizando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y mezclando la mezcla de gránulos, después de adicionar auxiliares adecuados si es deseado, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, rellenadores tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tal como polivinilpirrolidona (PVP). Si es deseado, se pueden adicionar agentes desintegrante, tal como polivinil pirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, soluciones de azúcar concentrada se pueden utilizar que opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Los materiales colorantes o pigmentos se pueden adicionar o recubrimientos de tabletas o de gragea para identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar oralmente, incluyen cápsulas de empuje por ajuste hechas de gelatina asi como cápsulas selladas, blandas hechas de gelatina y plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste por empuje pueden contener los ingredientes activos en mezcla con rellenador tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden adicionar estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral deben estar en dosificaciones adecuadas para la ruta de administración elegida.
Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o pastillas formuladas en manera convencional.
Para administración mediante inhalación nasal, los ingredientes activos para el uso de acuerdo con algunas modalidades de la invención se suministran convenientemente en la forma de una presentación de rocío en aerosol a partir de un envase presurizado o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorof luor orne taño, diclorotetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar proporcionar una válvula para suministrar una cantidad dosificada. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo, gelatina para el uso en un dispensador se pueden formular para contener una mezcla en polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.
La composición farmacéutica descrita en la presente se puede formular para administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección de bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampolletas o en recipientes de multidosis con opcionalmente, un conservador adicionado. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección de base aceitosa o en agua apropiadas. Los solventes o lipofílicos adecuados o vehículos incluyen aceites grasos tal como aceite de ajonjolí, o ásteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias, incrementan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizadores o agentes adecuados que incrementan la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
Alternativamente, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base agua libre de pirógenos estéril, antes del uso.
La composición farmacéutica de algunas modalidades de la invención también se puede formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, por ejemplo, bases de supositorio convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de algunas modalidades de la invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad efectiva para lograr el propósito propuesto. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente efectiva significa una cantidad de ingredientes activos (inhibidor SYNJ2) efectiva para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (por ejemplo, cáncer o cáncer metastásico) o prolongar la supervivencia del sujeto que está es tratado.
La determinación de una cantidad terapéuticamente efectiva está dentro de la capacidad de aquellos expertos en la téenica, especialmente en vista de la descripción detallada proporcionada en la presente.
Para cualquier preparación utilizada en los métodos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente de ensayos de cultivo in vitro y de célula. Por ejemplo, una dosis se puede formular en modelos animales para lograr una concentración o titulo deseado. Tal información se puede utilizar para determinar más precisamente dosis útiles en humanos.
La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos de células o animales experimentales. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo de células y estudios en animales se pueden utilizar la formulación de un intervalo de dosificación para el uso en humano. La dosificación puede variar dependiendo de la forma de dosificación empleada y la ruta de administración utilizada. La formulación exacta, ruta de administración y dosificación se puede elegir por el médico individual en vista de la condición del paciente. (Ver, por ejemplo, Fingí, y colaboradores., 1975, in "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch.1 p.l).
La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajustar individualmente para proporcionar niveles de inhibidor de SYNJ2 del ingrediente activo que son suficientes para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración efectiva mínima, MEC). La MEC variará para cada preparación, pero se puede estimar de datos in vitro. Las dosificaciones necesarias para lograr la MEC dependerán de las características individuales y la ruta de administración. Ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones en el plasma.
Dependiendo de la severidad y responsividad de la condición que es tratada, la dosificación puede ser de una sola o una pluralidad de administraciones, con el curso de tratamiento que dura de varios días a varias semanas o hasta que se efectúa la curación o se logra la disminución del estado de enfermedad.
La cantidad de una composición que es administrada, por supuesto, será dependiente del sujeto que es tratado, la severidad de la aflicción, la manera de administración, el buen juicio del médico que prescribe, etc.
Las composiciones de algunas modalidades de la invención, si se desea, se presentar en un paquete o dispositivo dispensador, tal como un kit aprobado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. El paquete puede comprender, por ejemplo, lámina delgada de metal o de plástico, tal como un paquete de ampollas. El paquete o dispositivo dispensador puede ser acompañado por instrucciones para la administración. El paquete dispensador también se puede ajustar por una notificación asociada con el recipiente en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de farmacéuticos, la notificación que es reflectiva de la aprobación de la agencia de la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal notificación, por ejemplo, puede ser de etiquetación aprobada por la U.S. Food and Drug Administration para fármacos de prescripción p de un inserto de producto aprobado. Las composiciones que comprenden una preparación de la invención formulada en un portador farmacéutico compatible también se pueden preparar, colocar en un recipiente apropiado y etiquetar para el tratamiento de una condición indicada, como es detallada adicionalmente en lo anterior.
En línea con la contribución de SYNJ2 a la migración de célula, los presentes inventores observaron una regulación hacia arriba significativa de mRNA de SYNJ2 y niveles de proteína en subtipos agresivos de cáncer, sugiriendo que SYNJ2 se puede utilizar como un marcador de pronóstico.
De esta manera, de acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para pronosticar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, el método que comprende determinar un nivel o actividad de SYNJ2 en una célula de cáncer del sujeto, en donde una regulación hacia arriba en el nivel de actividad de SYNJ2 en la célula de cáncer del sujeto comparado con el mismo en una célula de una muestra de control no afectada, es indicativa de una pobre pronóstico.
Como se utiliza en la presente el término "pronóstico" se refiere a determinar el efecto de la enfermedad (cáncer).
Como se utiliza en la presente "pobre prognosis" se refiere al riesgo incrementado de recurrencia de la enfermedad y/o riesgo incrementado de muerte debido a la enfermedad.
Como se utiliza en la presente el término "nivel" se refiere al nivel de expresión del DNA (amplificación del gen), RNA o proteina.
Como se utiliza en la presente "actividad de SYNJ2" se refiere a principalmente a su actividad de fosfatasa es decir conversión de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2.
De acuerdo con una modalidad especifica, la actividad se ensaya utilizando un ensayo de actividad in vitro.
Ensayos de actividad in vitro: En estos métodos la actividad de una enzima particular (en este caso fosfatasa) se mide en una mezcla de proteina extraída de las células. La actividad se puede medir en una cavidad de espectrofotómetro utilizando métodos colorimétricos o se puede medir en un gel de acrilamida no desnaturalizante (es decir, gel de actividad). Después de la electroforesis el gel se empapa en una solución que contiene un sustrato y los reactivos colorimétricos. La banda manchada resultante corresponde a la actividad enzimática de la proteina de interés. Si se calibra bien y dentro del intervalo lineal de respuesta, la cantidad de enzima presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Un estándar de enzima finalmente se emplea para mejorar la precisión cuantitativa.
Un ensayo especifico para SYNJ2 descrito en lo anterior, donde se prueba la actividad de conversión de PI (3,4,5)P3 a PI(3,4)P2.
Métodos para detectar la expresión y/o actividad de proteínas La expresión de proteínas de SYNJ2 se puede determinar utilizando métodos conocidos en las téenicas.
Ensayo inmonoabsorbente enlazado en enzima (ELISA) : Este método involucra la fijación de una muestra (por ejemplo, células fijadas o una solución proteinasa) que contiene un sustrato de proteína a una superficie tal como una cavidad de una placa de microtítulo. Un anticuerpo específico de sustrato acoplado a una enzima se aplica y se deja enlazar al sustrato. La presencia del anticuerpo luego se detecta y se cuantifica mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si se calibra bien y dentro del intervalo lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Un estándar de sustrato se emplea generalmente para mejorar la precisión cuantitativa.
Manchado de Western: Este método involucra la separación de un sustrato de otra proteina por medio de un gel de acrilamida seguido por la transferencia del sustrato a una membrana (por ejemplo, nylon o PVDF). La presencia del sustrato luego se detecta por anticuerpos específicos al sustrato, que son a su vez detectados por reactivos de enlace de anticuerpo. Los reactivos de enlace de anticuerpos pueden ser, por ejemplo, proteína A, u otros anticuerpos. Los reactivos de enlace de anticuerpo puede ser radio marcados en enlazados a enzima como es descrito anteriormente en la presente. La detección puede ser mediante autorradiografía, reacción colorimétrica y quimioluminiscencia. Este método permite tanto la cuantificación de una cantidad de sustrato y la determinación de su identidad mediante una posición relativa en la membrana que es indicativa de una distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis.
Radio- in onoensayo (RIA) : En una versión, este método involucra la precipitación de la proteína deseada (es decir, el sustrato) con un anticuerpo específico y la proteína de enlace de anticuerpo radiomarcada (por ejemplo, proteína A marcada con I125) inmovilizada en un portador precipitable tales como cuentas de agarosa. El número de conteo en la pelotilla precipitada es proporcional a la cantidad de sustrato.
En una versión alterna del RIA, un sustrato marcado y una proteina de enlace de anticuerpo no marcada son empleados. Una muestra que contiene una cantidad desconocida de sustrato se adiciona en cantidades variantes. La disminución en los conteos precipitados del sustrato marcado es proporcional a la cantidad de sustrato en la muestra adicionada.
Clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) : Este método involucra la detección de un sustrato in situ en células mediante anticuerpos específicos de sustrato. Los anticuerpos específicos de sustrato se enlazan a fluoróforos. La detección es por medio de una máquina de clasificación de célula que lee la longitud de onda de luz emitida de cada célula conforme pasa a través de un haz de luz. Este método puede emplear dos o más anticuerpos simultáneamente.
Análisis inmunohi toquimico: Este método involucra la detección de un sustrato ín situ en células fijadas por anticuerpos específicos de sustrato. Los anticuerpos específicos de sustrato pueden ser enlazados a enzima o enlazados a fluoróforos. La detección es mediante microscopía y la evaluación subjetiva o automática. Si se emplean anticuerpos enlazados a enzimas, se puede requerir una reacción colorimétrica. Será apreciado que la inmunohistoquimica es frecuentemente seguida por contramanchado de los núcleos de célula utilizando, por ejemplo, la tinción de hematoxilina y Giemsa.
Ensayo de actividad in situ: De acuerdo con este método, un sustrato cromogénico se aplica en las células que contienen una enzima activa y la enzima cataliza una reacción en la cual el sustrato se descompone para producir un producto cromogénico visible por una luz o un microscopio fluorescente.
Alternativamente o adicionalmente, el nivel de SYNJ2 se detecta en el nivel de RNA utilizando métodos que son bien conocidos en las téenicas y algunos son descritos infra.
Métodos para detectar el nivel de expresión de RNA El nivel de expresión del RNA en las células de algunas modalidades de la invención se puede determinar utilizando métodos conocidos en las técnicas.
Análisis de Manchado de Norther : Este método involucra la detección de un RNA particular en una mezcla de RNAs. Una muestra de RNA se desnaturaliza mediante el tratamiento con un agente (por ejemplo, formaldehido) que previene el enlace de hidrógeno entre pares de bases, asegurando que todas las moléculas de RNA tienen una conformación lineal, desplegada. Las moléculas de RNA individuales luego se separan de acuerdo con el tamaño mediante electroforesis de gel y se transfieren a una nitrocelulosa o una membrana a base de nylon al cual se adhieren los RNAs desnaturalizados. La membrana luego se expone a sondas de DNA marcadas. Las sondas se pueden marcar utilizando radioisótopos o nucleótidos enlazados a enzimas. La detección se puede hacer utilizando autorradiografia, reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este método permite tanto la cuantificación de una cantidad de moléculas de RNA particular como la determinación de su identidad mediante una posición relativa en la membrana que es indicativa de una distancia de migración en el gel durante la electroforesis.
Análisis de RT-PCR: Este método utiliza la amplificación de PCR de moléculas de RNAs relativamente raras. Primero, las moléculas de RNA se purifican de las células y se convierten en ADN complementario (cDNA) utilizando una enzima de transcriptasa inversa (tal como un MMLV-RT) y cebadores tales como, oligo dT, hexámeros aleatorios o cebadores específicos de gen. Luego al aplicar los cebadores específicos de gen y la Taq DNA polimerasa, una reacción de amplificación de PCR se lleva a cabo en una máquina de PCR. Aquellos de habilidades en la téenica son capaces de seleccionar la longitud y secuencia de los cebadores específicos de gen y las condiciones de PCR (es decir, temperaturas de recocido, el número de ciclos y los similares) que son adecuados para detectar moléculas de RNA específicas. Será apreciado que una reacción de RT-PCR semi-cuantitativa se puede emplear al ajustar el número de ciclos de PCR y al comparar el producto de amplificación a controles conocidos.
Mancha de hibridación in situ da RNA: En este método sondas de ADN o RNA se unen a las moléculas de RNA presentes en las células. Generalmente, las células se fijan primero a platinas microscópicas para preservar la estructura celular y para prevenir que las moléculas de RNA sean degradadas y luego sometidas a la solución amortiguadora de hibridación que contiene la sonda marcada. La solución amortiguadora de hibridación incluye reactivos tal como formamida y sales (por ejemplo, cloruro de sodio y citrato de sodio) que permiten la hibridación especifica de las sondas de ADN o RNA con sus moléculas de mRNA objetivo in si tu mientras que evita el enlace no especifico de la sonda. Aquellos de habilidades en la téenica son capaces de ajustar las condiciones de hibridación (es decir, temperatura, concentración de sales y formamida y los similares) a sondas especificas y tipos de células. Después de la hibridación, cualquier sonda no enlazada se deslava y la sonda enlazada se detecta utilizando métodos conocidos. Por ejemplo, si se utiliza una sonda radio-marcada, entonces la platina se somete a una emulsión fotográfica que revela señales generadas utilizando sondas radio-marcadas; si la sonda se marcó con una enzima entonces el sustrato especifico de enzima se adiciona para la formación de una reacción colorimétrica; si la sonda se marca utilizando una marca fluorescente, entonces la sonda enlazada se revela utilizando un microscopio fluorescente; Si la sonda se marca utilizando una etiqueta (por ejemplo, digoxigenina, biotina, y los similares), entonces la sonda enlazada puede ser detectada después de la interacción con un anticuerpo especifico de etiqueta que puede ser detectada usando métodos conocidos.
Mancha de RT-PCR in situ: Este método es descrito en Nuovo GJ, y colaboradores. [Intracellular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 1993, 17: 683-90] and Komminoth P, y colaboradores. [Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR. Pathol Res Pract.1994, 190: 1017-25]. Brevemente, la reacción de RT-PCR se realiza en células fijadas al incorporar nucleótidos marcados a la reacción de PCR. La reacción se lleva a cabo utilizando un aparato de RT-PCR de in situ especifico tal como el sistema PixCell I LCM de microdisección de captura de láser disponible de Arcturus Engineering (Mountainview, CA).
Mi croar regios de ADN/chips de AON: La expresión de miles de genes se puede analizar simultáneamente utilizando microarreglos de DNA, que permite el análisis del programa transcripcional completo de un organismo durante procesos de desarrollo específicos o respuestas fisiológicas. Los microarreglos de ADN consisten de miles de secuencias de gen individuales unidas a áreas estrechamente empacadas sobre la superficie de un soporte tal como una platina de microscopio de vidrio. Varios métodos han desarrollado para preparar microarreglos de ADN. En un método, un segmento de aproximadamente 1 kilobase de la región de codificación de cada gen para análisis se amplifica por PCR individualmente. Un aparato robótico se emplea para aplicar cada muestra de DNA amplificada a zonas estrechamente espaciadas sobre la superficie de una platina de microscopio de vidrio, que subsecuentemente se procesa mediante el tratamiento térmico y químico para enlazar las secuencias de ADN a la superficie del soporte y desnaturalizarlas. Típicamente, tales arreglos son de aproximadamente 2 x 2 cm y contienen aproximadamente 6000 puntos de ácidos nucleicos individuales. En una variante de la téenica, múltiples oligonucleótidos de DNA, usualmente 20 nucleótidos de longitud, se sintetizan de un nucleótido inicial que se enlaza covalentemente a la superficie de un soporte, tal que decenas de miles de oligonucleótidos idénticos se sintetizan en una zona cuadrado pequeña sobre la superficie de soporte. Múltiples secuencias de oligonucleótidos de un solo gen se sintetizan en regiones vecinas de la platina para análisis de la expresión de ese gen. Por consiguiente, miles de genes se pueden representar en una platina de vidrio. Tales arreglos de oligonucleótidos sintéticos pueden ser referidos en la técnica como "chips de DNA" como es opuesto a "microarreglos de DNA" como es descrito en lo anterior [Lodish y colaboradores. (eds.). Chapter 7.8: DNA Microarrays: Analyzing Genome-Wide Expression. In: Molecular Cell Biology, 4th ed., W. H. Freeman, New York. (2000)].
La prognosis se puede comprobar al utilizar métodos estándar Gold, por ejemplo, métodos de formación de imagen, muestreo de biopsia, expresión de marcador, ínmunohistoquímica y los similares.
Lo siguiente es un ejemplo especifico para el cáncer de mama pero no se propone de ninguna manera para ser limitante. La prognosis de cáncer de mama usualmente se determina por la etapa de enfermedad (etapa de TNM) después de la cirugía que estima el tamaño de tumor (T) el estado de metástasis a los ganglios linfáticos adyacentes (N) y la presencia o ausencia de metástasis distantes a otro órganos (M). La prognosis de pacientes clasificados de acuerdo con la etapa de TNM es diferente aún en la misma etapa. En otras palabras, en la misma etapa de cáncer de mama, la prognosis se puede determinar mediante la expresión de receptor de estrógeno o de progesterona (ER o PR) y la sobreexpresión de proteína HER2 o la amplificación del gen.
Los agentes de algunas modalidades de la invención que se describen en lo anterior en la presente para detectar el SYNJ2 se pueden incluir en un kit/artículo de diagnóstico de fabricación de preferencia junto con instrucciones apropiadas para el uso y etiquetas que indican la aprobación del FDA para el uso en la diagnosis y/o estimación de la etapa de cáncer y/o prognosis.
Tal equipo puede incluir, por ejemplo, por lo menos un recipiente que incluye por lo menos uno de los agentes de diagnóstico descritos en lo anterior (por ejemplo, anticuerpo anti SYNJ2 por ejemplo, junto con anti-HER2 y/o anti ER o sondas/cebadores de oligonucleótidos para estos objetivos) y un reactivo de formación de imagen empacado en otro recipiente (por ejemplo, enzimas, anticuerpos secundarios, soluciones amortiguadoras, sustratos cromogénicos, material fluorogénico). El kit también incluir soluciones amortiguadoras apropiadas y conservadores para mejorar la vida en anaquel del kit.
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tienen" y sus conjugados significan "que incluye pero no limitado a" .
El término "que consiste de" significa "que incluye a limitado a".
El término "que consiste esencialmente de" significa que la composición, método o estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero únicamente si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reclamada.
Como se utiliza en la presente, la forma singular "un" "uno" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra manera. Por ejemplo, el término "un compuesto" o "por lo menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos. Por toda esta solicitud, varias modalidades de esta invención se pueden presentar en un formato de intervalo. Se debe entender que la descripción en formato de intervalo es meramente para conveniencia y brevedad y no se debe considerar como una limitación inflexible en el alcance de la invención. Por consiquiente, la descripción de un intervalo debe ser considera que tiene específicamente todos los subintervalos posibles descritos así como los valores numéricos individuales dentro de este intervalo. Por ejemplo, la descripción de un intervalo tal como de 1 a 6 debe ser considerado que tiene los subintervalos específicamente descritos, tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto aplica sin considerar el ancho del intervalo .
Cada vez que un intervalo numérico se indica en el presente, este se propone para incluir cualquier número citado (fraccionario o entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varia/varia entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varia/varia desde" un primer número indicado "un" segundo número indicado se utilizan en la presente intercambiablemente y se proponen para incluir el primero y segundo números indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre los mismos.
Como se utiliza en la presente el término "método" se refiere a maneras medios, téenicas y procedimientos para realizar una tarea dada que impide, pero no limitado a, aquellas maneras, medios, técnicas y procedimientos ya sea conocidos, o fácilmente desarrollados de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por profesionales de las técnicas química, farmacológica, biológicas, bioquímicas y médicas.
Como se utiliza en la presente, el término "tratamiento" incluye la anulación, sustancialmente la inhibición, retardo o reversión de la progresión de una condición, sustancialmente mejorando los síntomas clínicos o estéticos de una condición o sustancialmente previniendo la aparición de síntomas clínicos o estéticos de una condición.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que son, por claridad, descritas en el contexto de modalidades separadas, también se pueden proporcionar en combinación en una sola modalidad. D la inversa, varias características de la invención, que son, por brevedad, descritas en el contexto de una sola modalidad, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como sea adecuado en cualquier otra modalidad descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de varias modalidades no se van a considerar características esenciales de estas modalidades, a menos que la modalidad sea inoperativas sin esos elementos.
Varias modalidades y aspectos de la presente invención como son delineados anteriormente como en la presente como es reclamado en la sección de reivindicaciones enseguida encuentran soporte experimental en los siguientes ejemplos.
EJEMPLOS La referencia ahora se hace a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas modalidades de la invención en un aspecto no limitante.
Generalmente, la nomenclatura utilizada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen téenicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y DNA recombinante. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook y colaboradores, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R.M., ed. (1994); Ausubel y colaboradores, "Current Protocols in Molecular Biology", John Wilcy and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y colaboradores, "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York; Birren y colaboradores. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols.1-4, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J.E., ed. (1994); "Current Protocols in Im unology" Volumes I-III Coligan J.E., ed. (1994); Stites y colaboradores. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), "Selected Methods in CelularUmmunology", W.H. Freeman and Co., New York (1980); inmunoensayos disponibles se describen extensivamente en la literatura de Patentes y Científica, ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Ha es, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshncy, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol.1- 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y colaborades ., "Strategies for Protein Purification and Characterization - ? Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todas las cuales se incorporan por referencia como si se expusieran completamente en la presente. Otras referencias generales se proporcionan por todo este documento. Los procedimientos en la misma se cree que son bien conocidos en la téenica y se proporcionan para la conveniencia del lector. Toda la información contenida en la misma se incorpora a la presente por referencia.
EJEMPLO 1 MATERIALES Y MÉTODOS Ensayos de migración, invasión y quimiotaxis de célula Las células se colocaron por triplicado en el compartimiento superior de una bandeja Transwell (BD Bioscience) y se dejaron migrar a través de la membrana de intervención durante 18 horas. Después, las células se fijaron en paraformaldehido (3%), se permeabilizaron en Tritón X-100 (0.05%) y se mancharon con violeta de metilo (0.02%). Las células no migrantes, que crecen en el lado superior del filtro, se removieron y las células migradas se fotografiaron. Los ensayos de invasión se realizaron utilizando Cámaras BioCoat Matrigel. Para cámaras de quimiotaxis de ibidi (München, Alemania) y la formación de imagen de lapso de tiempo fueron utilizados. Las posiciones de los núcleos de células se rastrearon utilizando ImagenJ.
Análisis de fosfoinositida Las células se incubaron durante 30 minutos en el medio libre de inositol, que se cambió al medio suplementado con tanto [3H]-inositol y suero dializado (10%). Las células se cultivaron durante tres dias, se enjuagaron y se extrajeron en HCl 1M seguido por metanol 1M. Las células luego se rasparon y se extrajeron en cloroformo, y luego en metanol:EDTA 0.1M pH8.0 y la fase orgánica se evaporó. Después, los extractos se de-acetilaron, se separaron mediante HPLC de intercambio aniónico (Agilent 1200) utilizando dos columnas Partisphere SAX (Whatman) en tándem, y un gradiente de cuatro etapas de fosfato de amonio pH 6.0. El material eluido radiomarcado se detectó mediante un analizador de centelleo de flujo en linea y se cuantificó utilizando el software ProFSA (Perkin-Elmer).
Zimografia en gelatina Para detectar la actividad de MMP-2, muestras biológicas se separaron electroforáticamente en geles incrustados con poliacrilamida de 10%/gelatina 0.1%. Los geles luego se lavaron en Tritón X-100 al 2.5% y se incubaron a 37°C durante 36 horas en Tris-HCl 50 mM (pH 7.5) que contiene NaCl 0.2 M, CaCl 5 mM, ZnCl21 mM, Brij 35 al 0.02% y acetato p-aminofenilmercúrico 1 mM.
Prueba de metástasis en animales Ratones SCID CB-17 hembras (Harían Laboratories, Haslett, MI; 15 por grupo) se implantaron en la almohadilla de grasa con células MDA-MB-231 (1.4 X106 células/ratón). Dos y seis semanas de post implantación, los ratones se anestesiaron, los tamaños de tumor se midieron y la metástasis en los ganglios linfáticos se visualizó utilizando un binocular fluorescente. Para la metástasis de pulmón, los ratones se sacrificaron, los pulmones se removieron, se lavaron y las imágenes se adguirieron utilizando un binocular fluorescente. La prueba exacta de Fisher de dos lados se utilizó para el análisis de metástasis de ganglio linfático. Las mediciones de crecimiento del tumor utilizaron la prueba Exact-sig [2x1-extremo]) Mann-Whitncy.
Reactivos A menos que sea indicado, los factores de crecimiento recombinantes humanos y otros materiales se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, USA). Los materiales radiactivos y un kit de quimioluminiscencia para el inmunomanchado se obtuvieron de Amersham (Buckinghamshire, UK). El inhibidor de EGFR-quinasa AG1478, inhibidor de MEK U0126 y el inhibidor de PI3K Wortmannin fueron de Calbiochem (San Diego, CA). Las placas para ensayos de sanación de heridas fueron de ibidi (Munich, Alemania). Placas de fondo de vidrio de 35 mm para la formación de imagen de lapso de tiempo se adquirieron de Matek (Ashland, MA). El anticuerpo monoclonal de murino (mAb) 111.6 al receptor de EGF se generó en el laboratorio de los inventores. Anti-EGFR para el análisis manchado de Western fue de Alexis (Lausen, Suiza). Los anticuerpos anti-Ras-GAP y anti-AKT fueron de Santa Cruz Bioteenology (Santa Cruz, CA). Anti-EEAl, anti-Rab5, anti-Rab4 y anti Racl fueron de BD Transducción Laboratories (Franklin Lakes, NJ). mAB Anti-SYNJ2 fue de Abnova (Taipei, Taiwán). Los siguientes anticuerpos secundarios de utilizaron: IgG anti-ratón de cabra y anticuerpos IgG anti-conejo de cabra conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) se adquirieron de Jackson ImmunoResearch Laboratories (Bar Harbor, Maine). Transferrina Texas-red, Alexa-488 anti-ratón de cabra, Alexa-555 y Alexa-647 anticuerpos secundarios fueron de Invitrogen (Carlsbad, CA).
• El control de siRNA fue de "Thermo scientific Dharmacon" cat. D-001810-10-05; la secuencia de siRNA contra SYNJ2 es como se expone en SEQ ID NO: 6 - GGACAGCACUGCAGGUGUU; todo shRNA fueron de Sigma Israel: shRNA control-cat. SHC002; secuencias shRNA contra SYNJ2 utilizada es CCGGCCGGAAGAACAGTTTGAGCAACTCGAGTTGCTCAAACTGTTCTTCCGGTTTTTG (SEQ ID NO: 9).
Lineas de células y transfecciones Las células MCF10A se cultivaron en el medio de DMEM: F12 (1:1) suplementado con antibióticos, insulina (10 mg/mL), toxina de cólera (0.1 pg/mL), hidrocortisona (0.5 pg/mL), suero de caballo inactivado con calor (5% vol/vol) y EGF (10 ng/mL). Las células MDA-MB-231 mamarias humanas se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco BRL; Grand Island, NY) suplementado con suero de ternero fetal inactivado con calor al 10% (Gibco), piruvato de sodio lmM y una mezcla de penicilina-estreptomicina (100 unidades/ml; 0.1 mg/ml; Beit Haemek, Israel). La línea de células estable MDA-MB-231-RFP fue una clase obsequiada del Prof. Hadasa Degani (The Weizmann Institute of Science, Israel). Las transfecciones de plásmido se realizaron utilizando Fugen-HD de acuerdo con las guías del fabricante (Roche, Mannheim, Alemania). Alternativamente, para experimentos de inactivación de mRNA transientes utilizando oligonucleótidos de siRNA, las células se transíectaron con Oligofectamina (Invitrogen).
Vectores lentivirales y producción de virus Horquillas de shRNA no dirigidas (control) y horquillas dirigidas contra SYNJ2 humano se produjeron en células HEK-293T siguiendo las guías del fabricante (Sigma). Las células objetivo se infectaron con lentivirus que codifican shRNA suplementado con polibreno (8 mg/mL), y cultivadas en presencia de puromicina (2 pg/mL) durante 4 días. El suministro específicos de gen estable de SYNJ2 humano se ha realizó utilizando el sistema de expresión lentiviral ViraPower (Invitrogen) siguiendo las guias del fabricante.
Inmunofluorescencia y procesamiento de imágenes Las células se cultivaron en platinas de cubierta recubiertas de fibronectina durante 48 horas. Después de los tratamientos, las células se lavaron, se permeabilizaron utilizando Tritón X- 100 al 0.02% y paraformaldehido al 3%, y se fijaron durante 20 minutos. La microscopía confocal se realizó utilizando ya sea un microscopio Zeiss LSM-710, o un microscopio de disco de giro (Zeiss lOOx, NA 1.45; Yokogawa CSU-22; Zeiss completamente automatizado, invertido 200 M; cámara fotométrica HQ-CCD) y láseres de estado sólido (473, 561 y 660 nm, tiempos de exposición: 0.25-1 seg), bajo el comando de Slidebook™. Apilamiento de imágenes 3D se adquirieron cada 70-300 ms a lo largo del eje Z al variar la posición de la etapa piezo eléctricamente controlada (tamaño de etapa: 0.1-0.4 pm). Alternativamente, la microscopía de fluorescencia de célula viva se llevó a cabo utilizando el sistema DeltaVision (Applied Precisión, Issaqua, WA) y las imágenes se procesaron utilizando el software priism.
Radiomarcación de EGF EGF recombinante humano se marcó con Iodogen como sigue: EGF (5 yg) se mezcló en un tubo recubierto de Iodogen (1 mg de reactivo) con Na125I (lmCi). Después de 15 minutos de incubación a 23°C, se adicionó albúmina a una concentración final de 0.1 mg/ml, y la mezcla se separó en una columna Excellulose GF-5.
Ensayo de regulación hacia abajo de receptor Las células MDA-MB-231 se sembraron por triplicado para cada punto de tiempo en placas de 24 cavidades, con una cavidad adicional de la placa para control.48 horas después, las células fueron deficientes por 4 horas y se estimularon con EGF (2 ng/ml) a 37°C para los intervalos de tiempo indicados. Subsecuentemente, se colocaron en hielo, se enjuagaron una vez con la solución amortiguadora de enlace (medio de DME, albúmina al 1%, Hepes 20 mM, pH 7.5) y se sometieron al lavado de ácido/sal leve (solución amortiguadora de acetato de Na 0.2 M pH 4.5, NaCl 0.5 M) para remover el EGF enlazado a la superficie. Después, las células se incubaron con un EGF radiomarcado durante 1.5 horas a 4°C y se enjuagaron con solución amortiguadora de enlace. La cavidad de control se incubó con un EGF radiomarcado y un exceso de EGF no marcado. Finalmente, las células se lisaron con NaOH 1M, y la radiactividad se determinó utilizando un g-contador. Los datos representan el porcentaje de receptores en la superficie de la célula con relación al tiempo 0.
Determinación del receptor de E6F de superficie Las células (2 x 104/cavidad) se sembraron por triplicado en placas de 24 cavidades, con un cavidad adicional para control. Después, las células se incubaron con una EGF radiomarcado durante 1.5 horas a 4°C y se enjuagaron con solución amortiguadora de enlace. La cavidad de control se incubó con una EGF radiomarcado y un exceso de EGF no marcado. Finalmente, las células se lisaron en solución de NaOH 1M y se determinó la radiactividad. Los datos representan el porcentaje de receptores en la superficie de la célula con relación a las células control.
Análisis de inmunomanchado Las células se lavaron brevemente con solución salina enfriada con hielo, y se rasparon en una solución de detergente amortiguada (HEPES 25 mM (pH 7.5), NaCl 150 M, Na-desoxicolato al 0.5%, NP-40, al 1% SDS al 0.1%, EDTA 1 M, EGTA 1 mM, Na3V04 0.2 mM y un cóctel inhibidor de proteasa diluida en 1:1000). Para la carga de gel igual, las concentraciones de proteina se determinaron al utilizar el reactivo BCA (Pierce). Después de la electroforesis en gel, las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Las membranas se bloquearon en solución amortiguadora TBST (Tris-HCl 0.02 M (pH 7.5), NaCl 0.15 M y Tween 20 al 0.05%) que contiene leche baja en grasa 10%, se mancharon con un anticuerpo primario durante 1 hora, se lavaron con TBST y se incubaron durante 30 minutos con un anticuerpo secundario conjugado a HRP.
Ensayos de sanación de heridas (rasguño) Los ensayos de sanación de herida se realizaron de acuerdo con el protocolo del fabricante (iBidi, Alemania). Brevemente, las células MCF10A se tripsinizaron, se resuspendieron en medio privado de EGF (7.0 x 105 células/mL) y 70 ml colocado en cada cavidad, que da por resultado una capa confluente dentro de 24 horas. Después, los insertos de cultivos se removieron al utilizar pinzas estériles y las células se dejaron migrar durante 2 horas.
Exploración y microscopía electrónica de transmisión Las células se fijaron en solución salina suplementada con paraformaldehído al 4% y sacarosa al 2%. Las muestras se lavaron y se sometieron a un segundo fijador (paraformaldehído al 3% y glutaraldehido al 2.5% en solución amortiguadora de cacodilato 0.1 M suplementada con sacarosa al 1% CaCl 2 5 mM, pH 7.4). Las células se lavaron en solución amortiguadora de cacodilato 0.1 M y se post-fijaron con tetróxido al 1% en solución amortiguadora de cacodilato durante 1 hora. Para la microscopía electrónica de exploración (SEM), las muestras post-fijadas se lavaron dos veces y se trataron con ácido tánico al 1% durante 5 minutos seguido por otro lavado y el tratamiento con acetato de uranilo al 1% durante 30 minutos. Las muestras se deshidrataron en etanol graduado, y se hicieron conductivas al dispersar con una película de oro-paladio. Las muestras se fotografiaron utilizando un microscopio electrónico de exploración (Leo Supra 55/Vp Zeiss, Thornwood, NY).
Ensayo de recielado de receptor Las células MDA-MB-231 se pre-incubaron durante 30 minutos a 37°C con Alexa Fluor 488-transferrina (25 mg/ml en medio libre de suero) o durante 10 minutos con Alexa Fluor 488-EGF (40 ng/mL). Los ligandos enlazados a la superficie se desunieron mediante incubación durante 30 minutos a 4°C en una solución amortiguadora acídica (NaCl 150 mM, MgCl2 mM, CaCl2 0.125 mM, glicina 0.1 M), antes de la transferencia a 37°C para los intervalos de tiempo indicados, para permitir el recielado de los ligandos internalizados. Las células se analizaron, ya sea por formación de imágenes o por FACS.
Análisis de impedancia celular en tiempo real Las mediciones de dispersión de células y adhesión se registraron al utilizar el Sistema RTCA-Xcelligence (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania). E-placas-16 de microelectrodos de Oro se lavaron una vez en solución salina. Las células (2,500 por cavidad) primeros se sembraron y luego los datos de impedancia (índice de célula; derivados como un cambio relativo en la impedancia eléctrica medida) se registró en los intervalos indicados. Los datos se analizaron utilizando el paquete de software 1.2 proporcionado por el fabricante.
Expresión del dominio TAPP1-PH y purificación Un constructo que codifica el dominio TAPPl-PH y una etiqueta Flag N-terminal y la etiqueta 6xHis C-terminal (SEQ ID NO.: 13, Figura 18) se clonó en el plásmido pET28 y se expresó en E. coli BL21(DE3) después de la inducción con IPTG 200 mM. Las bacterias se cultivaron a 15°C y luego se U saron con un interruptor de células. Los restos celulares se removieron por centrifugación y la proteina se capturó en una columna de Ni (HisPrep FF 16/10, GE Healthcare) equilibrada con Tris 50 mM pH 8, NaCl 0.5 M e imidazol 20 mM. La proteína se eluyó en la misma solución amortiguadora que contiene imidazol 0.5 M.
Fracciones que contienen el dominio TAPP1-PH se inyectaron en una columna de exclusión de tamaño (Hiload_26/60_Superdex 75, GE Healthcare) equilibrada con solución amortiguadora que contiene Tris 50 mM pH 8 y NaCl 100 mM. El pico acumulado que contiene el dominio TAPP1-PH se diluyó tres veces con solución amortiguadora de fosfato de sodio a 20 mM pH 7.2 y se cargó en una columna de intercambio catiónico (HiTrap_SP_FF_5ml, GE Healthcare) equilibrada con la misma solución amortiguadora de fosfato. La proteina pura se eluyó de la columna con un gradiente lineal de la solución amortiguadora de fosfato que contiene NaCl 1 M (el dominio TAPP1-PH se eluye en NaCl 200 mM). Las fracciones que contienen el dominio TAPP1-PH puro como es evaluado mediante SDS-PAGE se acumularon conjuntamente y la concentración de proteina se determinó mediante el reactivo Bradford y la cuantificación de OD28o (coeficiente de extinción de 20,520). La proteina se dividió en alícuotas, se congeló instantáneamente con nitrógeno líquido y se almacenó a -80°C.
Actividad de 5' fosfatasa del SYNJ2 Las mediciones de la habilidad de SYNJ2 para hidrolizar el 5-fosfato de PI(3,4,5)P3 para generar PI(3,4)P2 se registraron mediante un ensayo competitivo, basado en la polarización de fluorescencia como una lectura. La mezcla de lípido SOP estabilizante (x50) se preparó en un tubo de vidrio al adicionar 100 ml de SOPS (Avanti Inc., 50 mg / mi en cloroformo) y 50 ml de Colesterol (Sigma Aldrich, 10 mg / i en cloroformo). La mezcla se secó con aire utilizando una corriente de nitrógeno suave para evaporar el cloroformo. La mezcla de lípido evaporada luego se resuspendió en 10 mi de 0.25 mg / mi de CI2ES (Avanti Inc.) mediante el vórtice de 1 minuto a temperatura ambiente. Una mezcla de reacción que comprende PBS, TDT, MgC12 (todos de Sigma Aldrich), mezcla de lipidos SOP (x50) SYNJ2 purificado de longitud completa (OriGene, cat no. TP315160) y PI(3,4,5)P3 (Echelon Bioscience, cat no. P-3908), con o sin un compuesto probado. Una vez que se adicionó PI(3,4,5)P3, la mezcla de reacción se incubó en 33°C durante 8 minutos para permitir la producción de PI(3,4)P2 por la actividad de SYNJ25 ' -fosfatasa. Después de la incubación la reacción se detuvo al adicionar una mezcla de detección que comprende PBS, DTT, proteínas detectoras (dominio PH de TAPP1), mezcla de lipidos SOP (x50) PI(3,4)P2 fluorescentemente marcados (Echelon Bioscience, cat no. C34M6) y EDTA (Sigma Aldrich) . La polarización de fluorescencia se midió utilizando un lector de placa apropiado y el ajuste de filtros compatible con el tinte BODIPY® TMR (excitación de 550 nm7filtros de emisión polarizante de 580 nm). El control PI(3,4)P2 no marcado se adquirió de Echelon Bioscience (Cat no. P-3408).
EJEMPLO 2 LA EXPRESIÓN ELEVADA INDUCIDA POR EGP DEL SYNJ2 PROMUEVE LA INVASIÓN DE CÉLULA MAMARIA Las células epiteliales mamarias humanas (MCF10A) exhiben fuertes fenotipos migratorios e invasivos cuando se cultivan con ligandos de la familia EGF (Figuras 1A y IB), pero el tratamiento con suero es insuficiente para propulsar la movilidad celular. La co-incubación de EGF junto con los inhibidores de EGFR (AG1478), MEK (U0126) o PI3K (Wortmanína) redujeron la motilidad (Figura 1C), sugiriendo que ambas actividades de MEK/ERK y PI3K son esenciales para la migración inducida por EGF. De manera importante, el fenotipo motil inducida por EGFR se asocia con la regulación hacia arriba transcripcionales de 425 genes (A it y colaboradores., 2007). Para identificar genes que propulsan la metástasis, este conjunto de genes se interceptó con un conjunto más grande de genes que se someten a la regulación hacia arriba durante la selección in vivo de sub-clones metastásicos de células de cáncer de mama (Minn y colaboradores., 2005). El grupo de 23 genes sobrepuestos (Figura ID) incluyó el gen que codifica sinaptojanina-2 (SYNJ2), una fosfatasa de lipidos implicada en la invasión de célula de glioma (Chuang y colaboradores., 2004). La regulación hacia arriba inducida por EGF de SYNJ2 se validó PCR y el inmunomanchado (Figuras 2A y 2B).
Enseguida, las células MCF10A se transformaron y se subclonaron para sobreexpresar establemente SYNJ2 (como una fusión de GFP; SYNJ2-OX, Figura 1E). Cuando se colocaron en placa en el medio privado de EGF, las células SYNJ2-OX exhibieron un fenotipo pro-migratorio caracterizado por la desviación la membrana (Figura 2C) junto con las capacidades migratorias e invasivas a básales aumentadas inducida por EGF (Figuras 2D y 2C). A la inversa, la inactivación de SYNJ2 utilizando RNAs de interferencia pequeña (siRNAs; Figura 1G) significativamente redujo la invasión celular, asi como la migración individual y colectiva (Figuras 2E, 1H y II). En conclusión, la regulación hacia arriba inducida por EGF de la SYNJ2 acciona un fenotipo invasivo robusto de las células mamarias.
EJEMPLO 3 LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA DEL SYNJ2 ES ESENCIAL PARA LA INVASIVIDAD DE CÉLULAS MAMARIAS Para permitir experimentos in vivo, las células que expresan proteina fluorescente Roja (RFP) de cáncer de mama MDA-MB-231 altamente metastático se utilizaron para generar subclones que sobreexpresan ya sea SYNJ2 o LacZ (control) asi como sub-clones que expresan shControl u horquillas o específica de SYNJ2 (shSYNJ2; Figura 3A). La expresión aumentada de SYNJ2 confirió una morfología alargada en cultivos 2D (Figura 3B) y brazos invasivos extensivos, cuando las células se cultivaron en cultivos 3D (Figura 4A). A la inversa, la inactivación de SYNJ2 anuló los patrones invasivos (Figura 4B) . De manera similar, la sobre-expresión de capacidades invasivas aumentadas por ~3.2 veces (Figura 3B) y la inactivación (Figura 3C) inhibieron la migración e invasión (Figura 3D). Para examinar las funciones para la actividad de fosfatasa catalítica, las células shSYNJ2 con partículas lentivirales que codifican ya sea un SYNJ2 WT o una forma catalíticamente muerta (D388A y D726A; Figura 4C) de las mutaciones de punto de alberge en cada uno de los motivos WXGDXN(F/Y)R conservados (Jefferson y Majerus, 1996) dentro del dominio de fosfatasa/nucleasa (Pfam: PF03372). Distinto a SYNJ2 WT, la re-expresión del mutante no logró restaurar la capacidad invasiva (Figura 4D) indicando que la actividad de fosfatasa de SYNJ2 es esencial para el fenotipo invasivo.
La falla de las células shSYNJ2 para migrar además se sustentó por tanto la microscopía electrónica de exploración (Figura 4E) y el manchado con F-actina, que reveló severos defectos de organización de actina y un aumento en la altura de las células (Figura 4F). De manera importante, también se observaron parches de actina agrupados alrededor de porciones circulares (Figura 4F, cabeza de flecha). Por consiguiente, el análisis de microscopía de lapso de tiempo de las células shSYNJ2 confirmó la existencia de vesículas intracelulares anormales, sugiriendo que la inactivación de SYNJ2 deterioró el tráfico vesicular. Enseguida, se examinó la localización subcelular de SYNJ2. Las imágenes de lapso de tiempo de las células MDA-MB-231 que expresan GFP-SYNJ2 (Figura 3E) así como de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos anti-SYNJ2 (Figura 3F) reflejaron dos patrones mayores de distribución de SYNJ2: ensamblajes periféricos pequeños, que se localizaron al borde de guia (cabeza de flecha negra en la Figura 3E) y una segunda población de ensamblajes más grandes, que se localizaros más cercanos al centro de la células (cabezas de flecha azules). Notablemente, poco tiempo después de la estimulación de las células MDA-MB-231 con un ligando de EGFR (TGF-alfa), SYNJ2 rápidamente se ensambló en la base de lamelipodia emergente, debajo del borde de guia de formación (Figuras 3E, 3F). De manera interesante, análisis similares se realizaron con células MCF10A que indicaron que SYNJ2 inicialmente se co-localiza con F-actina en uniones de célula a célula, pero se translocaliza al borde de guia, típicamente a la base de lamelipodia, a la estimulación con EGF (Figura 3G). En conclusión, estas observaciones indican que los factores de crecimiento regulan no únicamente los niveles de expresión de SYNJ2, sino también su reclutamiento dinámico al borde de guía.
EJEMPLO 4 El RECLUTAMIENTO DE SYNJ2 A LA MEMBRANA VENTRAL DEPENDE DE DINAMINA Y RAC1 Para investigar la dinámica de los sitios de localización de SYNJ2, un subclón GFP-SYNJ2 MDA-MB-231 que se expresa establemente (células GFP-SYNJ2) se generó y se analizó para la formación y el consumo de puntos de GFP-SYNJ2. Estos se clasificaron en subpoblaciones cinéticamente distintas: puntos dinámicos que localizaron a las membranas dispuestas y puntos localizados a las regiones discretas próximas al centro de las células (Figura 5A). Notablemente, los puntos GFP-SYNJ2 mostraron sobre posición mínima con los ensamblajes marcados por cadena ligera A de RFP-Clatrina A (Figura 5A) o RFP-Caveolina 1 (Figura 6A) sugiriendo localización menor a los fosos recubiertos de Clatrina o a las caveolas. De manera importante, los puntos periféricos recientemente formados anunciaron el lamelipodio naciente, ya que su aparición precedió la formación local de lamelipodio. En contraste, las agrupaciones más centrales y estables de puntos, que se co localizaron con actina, persistieron durante ~30 minutos (Figura 5B). Por consiguiente, el rastreo de ensamblajes individuales (Figura 6B; izquierda) reveló distribución notablemente amplia de tiempos de vida: vida corta (~20-40s, 60% de ensamblaje) tiempos de vida intermedios y ensamblajes de vida larga (-10% de ensamblajes). La iniciación del grupo intermedio fue seguido por un incremento continuo en la intensidad de fluorescencia, mientras que el ensamblaje permaneció estático en términos de movimiento (Figura 6B; derecha) . Este patrón dinámico se asemeja a aquel de los fosos recubiertos de Clatrina (Ehrlich y colaboradores., 2004) y sugiere la formación y consumo de intermediarios de tráfico.
La compartimentalización principalmente bimodal de GFP-SYNJ2 en la membrana ventral se reforzó por la aparición sincrónica y desaparición de señales de fluorescencia en experimentos que emplean tanto epifluorescencia (rojo; relativamente insensible a cambios en la dimensión Z) como la microscopía de reflexión interna total (TIRF, verde; limitado a ~ 200 nm de profundidad). Debido a que los puntos aparecieron amarillos por todo su tiempo de vida (Figura 5C), los presentes inventores concluyeron que SYNJ2 se ensamblan dentro del plano de la membrana de plasma ventral. Al emplear un panel de inhibidores se encontró que el ensamblaje se inhibió notablemente mediante el agotamiento de colesterol (Figura 6C; izquierda), sugiriendo que los microdominios de membrana ricos en colesterol son necesarios para el reclutamiento de SYNJ2 a la membrana ventral. Un efecto inhibitorio similar se indujo por Wortmanina (Figura 6C; derecha) sugiriendo una función para PI3K. Otro requerimiento se reveló al emplear DynG0-4a, un inhibidor de Dinamina, la GTPasa grande media la etapa de escisión de portadores dependiente de clatrina e independiente de clatrina, y cuya inhibición conduce a la acumulación de intermediarios de invaginación en forma de U (Macia y colaboradores., 2006). Debido a que DynGO-4a fuertemente detuvo los ensamblaje dinámicos de SYNJ2 en la membrana de plasma (Figura 5D), los presentes inventores concluyeron que SYNJ2 es reclutado a los intermedios de tráfico nacientes regulados por Dinamina. Debido que Dinamina se ha implicado como un facilitador de migración e invasión de célula (Kruchten y McNiven, 2006), se probó sus interacciones físicas con SYNJ2.
Este experimento confirmó la formación de complejo entre Dinamina activa y SYNJ2 (Figura 5E), en linea con una función extendida para Dinamina en tanto endocitosis como la migración a base de actina.
SYNJ2 puede interactuar físicamente con Racl cargado con GTP (Malecz y colaboradores., 2000) y la activación inducible de Racl requiere la internalización y recielado subsecuente (Palamidessi y colaboradores., 2008). Por consiguiente, la coincidencia de los puntos periféricos de SYNJ2 coincide con Racl que fue probado. En realidad, el inmunomanchado Racl endógeno reveló la co-localización con puntos periféricos de GFP-SYNJ2 (Figura 5F). Por otra parte, la inhibición de carga de GTP sobre Racl (utilizando NSC-23766) notablemente redujo el número de puntos de GFP-SYNJ2 (Figura 5G). Complementariamente, la inactivación de SYNJ2 redujo los niveles de Racl cargado con GTP en células MDA-MB-231 (Figura 5H). De acuerdo con una función reguladora para Racl y el citoesqueleto de actina en el reclutamiento de SYNJ2 a la membrana, la inhibición de la dinámica de actina con latrunculina anuló la dinámica de GFP-SYNJ2 (Figura 6D). Tomados conjuntamente, estos resultados asocian los ensamblajes de SYNJ2 periféricos, con una ruta endocítica mediada por dinamina que depende de colesterol, 3'-fosfoinosítidas, actina y Racl activa. Notablemente, esta ruta comparte varios atributos comportadores independientes de clatrina que permiten el giro de membrana rápido y de adhesión en el borde de guia de fibroblastos de migración (Howes y colaboradores., 2010).
EJEMPLO 5 SYNJ2 CONTROLA EL TRÁFICO VESICULAR DE RECEPTORES DE SUPERFICIE DE CÉLULA Aunque las células shSYNJ2-MCF10A tratadas con EGF exhibieron niveles más altos de EGFR totales y fosforilado con relación a las células de control, este se tradujo a menor, antes que mayor activación de ERK (Figura 7A). A lo largo de esta linea, se observó que la inactivación de SYNJ2 atrapó EGFR en vesículas intracelulares agrandadas (Figura 7B). Consistente con el atrapamiento, el inmunomanchado de células MDA- B-231 de manera similar reveló que los niveles de EGFR se estabilizaron en las células SÍSYNJ2 (Figura 8A) pero la cuantificación de EGFR de superficie al utilizar dos métodos indicó niveles de superficie significativamente menores (Figura 8B) . El atrapamiento intracelular de EGFR lleva consecuencias funcionales: en linea con su función quimiotáctica bien caracterizada;, (Mouneimne y colaboradores, 2006 van Rheenen y colaboradores., 2007). Los EGFRs localizados al borde de guia de las células mamarias, pero EGFRs de células shSYNJ2 pierden su distribución polarizada y se acumulan en vesículas decoradas de actina grandes (Figura 8C). Notablemente, los defectos de tráfico de EGFR observados en células shSYNJ2 podrían ser rescatados por WT y SYNJ2, pero no por una forma catalíticamente muerta (Figura 7C), indicando que la actividad de fosfatasa de SYNJ2 es esencial para el tráfico vesicular de EGFR hacia y desde el borde de guía, donde se media la respuesta quimiotáctica a los gradientes de EGF. Consistente con este modelo, las células shSYNJ2 severamente pierden la habilidad para migrar a lo largo de un gradiente de EGF (Figura 8D).
La acumulación anormal de EGFR en células agotadas de SYNJ2 podría reflejar los defectos en el suministro de EGFR, el recielado detenido o la clasificación deteriorada para la degradación, un proceso regulado por la ubicuitinación (Goh y colaboradores., 2010). Consistente con la clasificación deteriorada, las células agotadas de SYNJ2 exhibieron ubicuitinación de EGFR basal significativamente más alta, que fue sólo débilmente alterada en respuesta a EGF (Figuras 8E y 7D). Además, a pesar de ser etiquetada para la degradación por fosforilación de tirosina 1045 (un sitio de acoplamiento para la ligasa de ubiquitina c-Cbl; Figura 8F), un experimento de estimulación de EGF confirmó la activación normal (fosforilación de tirosina 1068), pero la degradación defectuosa en células shSYNJ2 (Figura 8G). Para dirigirse a un defecto de reciclado, se emplearon ligandos fluorescentes para seguir el reciclado extensivo del receptor de transferrina (TfR), así como el reciclado más débil de EGFR. Aunque no se afectó la internalización de TfR, el reciclado se disminuyó notablemente en células shSYNJ2 y, a la inversa, se aceleró notablemente en células SYNJ2-0X (Figuras 8H y 7E). Del mismo modo, los análisis de citometria de flujo indicaron el recielado defectuoso de EGF fluorescente (Figura 81) y la formación de imágenes de célula viva confirmó la acumulación de ligando dentro de las vesículas grandes de células agotadas de SYNJ2. En conclusión, estos resultados indican que SYNJ2 es esencial para el reciclado apropiado de tanto EGFR como de TfR.
EJEMPLO 6 LA INACTIVACIÓN DE SYNJ2 PERTURBA LA HOMEOSTASIS DE LÍPIDOS DE FOSFOINOSITOL Y ALTERA TANTO LA ENDOCITOSIS COMO LA ADHESIÓN El sistema endocítico mantiene varios compartimentos distintos, que son definidos por fosfoinosítidas (PI) específicas (Gruenberg y Stenmark, 2004), y los presentes análisis descubrieron fuerte dependencia en SYNJ2. Por ejemplo, al sondear endosomas tempranos para EEA1, un PI(3)P-enlazador, se encontró que su organización parcial se alteró notablemente en células agotadas de SYNJ2 (Figura 9A). De manera similar, el sondeo del compartimiento de reciclado utilizando Rab4 etiquetado con GFP, descubrió fuertes asociaciones con los parches de actina circulares de células de shSYNJ2 (Figura 10a) . La distribución de otro marcador de endosoma temprano, Rab5, también reflejó la dependencia en SYNJ2 (Figura 10B). Mientras que el número de vesículas positivas de Rab5 fue significativamente menor en células agotadas de shSYNJ2, su tamaño promedio se incrementó y parcialmente se localizaron a los parches de actina circulares (Figura 9A). Para descubrir alteraciones implícitas en fosfoinosítidas, células MDA-MB-231 shCtrl y shSYNJ2 que se marcaron biosínteticamente se compararon, y después se extrajeron sus fosfolípidos (Figura COI). Los resultados mostraron que principalmente PI(3)P, pero también PI(4,5)P2 y PI(3,5)P2 estuvieron presentes en niveles más altos en las células shSYNJ2, mientras que los niveles de PI (4)P permanecieron no alterados y los niveles de tanto PI(3,4)P2 como PI(3,4,5)P3 fueron difícilmente detectables por este método. Mientras que estos resultados confirman la noción de que SYNJ2 se dirige principalmente a la posición D5 de PIs, los presentes inventores asumen que los efectos globales más bien limitados observados representan diferencias locales más grandes. En conclusión, estas observaciones reafirman que SYNJ2 controla la carga que clasifica en el endosoma temprano, así como en la etapa de recielado subsecuente.
Junto con el reciclado de RTK similar a EGFR, el tráfico vesicular de integrinas y sus interacciones con asociados corriente abajo, tal como Paxilina, desempeña funciones mayores en la migración de célula y la maduración de adhesión focal (FA) (Guo y Giancotti, 2004). Por consiguiente, la beta-1 integrina y EGFR fosforilado (pEGFR) localizado a FAS de células MDA-MB-231. En contraste, debido a la acumulación anormal en vesículas grandes, ambas proteínas no lograron localizarse a la periferia de las células agotadas de SYNJ2 (Figuras 10D, S5B y S5C). Por otra parte, utilizando Paxilina como un marcador de Fas maduros, se encontró que AF asumieron una apariencia redonda y relativamente corta en células shSYNJ2 (Figura 9D). Tomadas conjuntamente, estas observaciones implican que SYNJ2 es requerido para la adhesión sustrato, un escenario examinado al medir la dispersión de célula utilizando dos métodos (Figuras 10E y 10F). Los resultados demostraron la adhesión atenuada de células shSYNJ2, que se atribuye al suministro defectuoso de ambas integrinas y RTK a FAS.
EJEMPLO 7 SYNJ2 REGULA EL ASAMBLAJE DE INVADOPODIOS Los cultivos 3D a base de matriz de células MDA-MB-231 normalmente exhiben protuberancias en forma de cuña, pero las células shSYNJ2 exhibieron extensiones redondeadas (Figura 11A), sugiriendo la degradación de matriz defectuosa. Para probar esto, las imágenes de inmunofluorescencia confocales MMP-9 se obtuvieron, y se observó que los esferoides shSYNJ2 exhibieron una disminución relativamente aguda de abundancia de MMP-9 en sus bordes (Figura 11A) probablemente debido a la secreción deteriorada. En realidad, los ensayos de zimografia realizados en medios acondicionados confirmaron la secreción de MMP-9 defectuosa por las células que se trataron con oligonucleótidos de siSYNJ2, pero la secreción de MMP-2 permaneció no alterada (Figura 12A). A la inversa, los medios condicionados por células que sobreexpresan SYNJ2 exhibieron un incremento sustancial en la actividad de MMP-9 (Figura 11B), en involucramiento en linea de SYNJ2 en la secreción de MMP.
Para visualizar la proteolisis focal, las células se colocaron en placa en gelatina fluorescente reticulada y se sondearon para las organelas de degradación de matriz, centrada de actina llamadas invadopodios (Murphy y Courtneidge, 2011). En linea con reportes previos, la proteolisis de matriz activa correspondió a puntos de actina localizados abajo del cuerpo de célula. De manera importante, los puntos de SYNJ2-GFP co localizados con estas estructuras (Figura 11C, cabezas de flechas), que se asemejaron a los puntos de vida largas asociados con actina presentado en la Figura 5B. Los niveles de expresión de SYNJ2 se correlacionan claramente con la ocurrencia de invadopodios; mientras que la sobreexpresión de SYNJ2 casi duplicó la fracción de células que contiene invadopodios, siSYNJ2 redujo significativamente la incidencia de invadopodios (Figura 11D) implicando relaciones causales, enseguida, las asociaciones físicas potenciales en SYNJ2 y Cortactina, un marcador bien caracterizado de invadopodios, se examinó y se encontró que SYNJ2 y Cortactina co-inmunoprecipitan (Figura 12B), así como co-localizan a tanto los invadopodios como los bordes de guías (Figura 12C). Para establecer firmemente una función de accionamiento para SYNJ2, se observó TKS5, un PI(3,4)P2 y un enlazador de Cortactina que sirve como una señal de invadopodios (Courtneidge y colaboradores., 2005). Como es esperado, TKS5 endógeno localizó a múltiples sitios ventrales de degradación de matriz en las células MDA-MB-231 de control, pero casi ninguno de los sitios activos se encontraron en las células siSYNJ2, y que TKS5 pierde su ubicación ventral (Figura 4F; paneles X-Y y Z). Además, debido a que TKS5 invadopodial se fija en PI(3,4)P2 (Oikawa y colaboradores., 2008), un dominio de enlace de PI(3,4)P2, específicamente el dominio PH de Tappl se utilizó como una sonda. Consistente con los reportes previos, la expresión ectópica del dominio PH redujo el número de invadopodios, pero no obstante la señal restante co-localizada con TKS5 y núcleo de actina (Figura 12D). En conclusión, SYNJ2 aparece en necesario en una etapa anterior que precede el acoplamiento de TKS5, consistente con la acción secuencial de PI3K (Yamaguchi y colaboradores., 2011) y SYNJ2, que respectivamente generan PI(3,4,5)P3 y luego PI(3,4)P2, para fijar TKS5 en sitios de activación inducido por EGFR de PI3K.
En línea con un escenario EGFR-PI3K-SYNJ2, la forma activa de EGFR (pEGFR) se detectó en invadopodios proteolíticamente activos, pero EGFR de células agotadas de SYNJ2 se localizaron a vesículas hinchadas (Figura 11F). El mecanismo responsable para la activación del receptor local permanece desconocido. De acuerdo con un modelo, la segmentación de pro-ligandos, tal como la EGF de enlace de heparina (HB-EGF), mediante un complejo que comprende MMP-7 y CD44, podría estimular localmente EGFR (Yu y colaboradores., 2002). En linea con este modelo, la abundancia de SYNJ2 se correlacionó con la secreción de ligandos EGFR (Figura 11G) y se detectó la co-localización de CD44 con los núcleos de actina de invadopodios (Figura 12E). Del mismo modo, utilizando la citometría de flujo, se encontró que la expresión en superficie de CD44 se suprimió fuertemente en células shSYNJ2 con relación a las células de control (Figura 12F). Todavía otra etapa crítica en la maduración de invadopodios es el reclutamiento de la metaloproteinasa de matriz de tipo 1 de membrana (MMP-MTL), que activa MMPs solubles (Wang y McNiven, 2012). Por consiguiente, se encontró que en las células de control MT1-MMP correspondió a sitios de protuberancias invadopodiales, pero las moléculas MT1-MMP de células SÍSYNJ2 formaron agregados grandes, que no estuvieron asociados con la degradación de matriz (Figura 9E). Tomadas conjuntamente, estas observaciones implican que SYNJ2 es esencial para el cebado de invadopodios, así como para dirigir a esta organela ambas proteasas y dos residentes previamente no reconocidos, CD44 y un EGFR activo.
EJEMPLO 8 SYNJ2 PROMUEVE EL CRECIMIENTO DE TUMOR Y LA DISPERSIÓN METASTÁTICA EN UN MODELO ANIMAL MAMARIO Para estimar el efecto de SYNJ2 en la diseminación metastática in vivo, células MDA-MB-231-RFP (y derivados) se implantaron en la almohadilla de grasa mamaria de ratones hembra, y dos a seis semanas después se midió tanto el tamaño de tumor (Figura 13A) como la metástasis (Figura 13B). El crecimiento de tumor primario fue significativamente más rápido en los grupos shCtrl y shSYNJ2+SYNJ2WT ('rescate activo'), con relación a los grupo shSYNJ2 y de 'rescate activo' (shSYNJ2+SYNJ2CD). El comportamiento metastático de manera similar se correlacionó con SYNJ2: el shSYNJ2 y el grupo de 'rescate inactivo' exhibieron reducción significativa en la diseminación metastática a los ganglios linfáticos locales y distantes (Figuras 13B y 14). Con el fin de examinar la metástasis distante, los ratones se sacrificaron y sus pulmones se evaluaron. Los pulmones de los animales implantados con células shSYNJ2, o las células de 'rescate inactivo' mostraron una reducción notable en el número y tamaño de metástasis, comparado con los animales inoculados con el shCtrl o las células 'rescate activo' (Figura 13C). Tomados conjuntamente, estos resultados implican SYNJ2 en la promoción de metástasis.
De manera similar, se monitorearon los xenoinjertos que sobreexpresan SYNJ2. Como es esperado, las células SYNJ2-OX dieron origen a tumores de crecimiento más rápido (Figura 13D) y también exhibieron inicio más temprano de metástasis nodales (Figura 13E). Consistente con la invasión linfática robusta, los pulmones de animales implantados con células SYNJ2-OX mostraron un incremento en el número de metástasis (Figura 13F). Enseguida, el efecto de SYNJ2 en la intravasación o extravasación se probó. Por consiguiente, los sub-clones de células MDA-MB-231-RFP se inyectaron ya sea directamente en la circulación (vena de la cola) de los ratones hembra y se registraron para la colonización de pulmón (extravasación) o se implantaron en la almohadilla de grasa y se registraron en la sangre como células de tumor circulantes (CTC; intravasación). Observar que estos experimentos tomaron en cuenta las diferencias de tamaño entre los tumores primarios respectivos. Los resultados normalizados indicaron que SYNJ2 es necesario para tanto la intravasación (p=0.0031) y extravasación (p=0.0082; Figura 13G). Esta conclusión además se probó al utilizar células que sobreexpresan GFP-SYNJ2 (Figura 13H). Notablemente, los resultados de intravasación obtenidos en este experimento exhibieron significado estadístico, pero la habilidad de las células SYNJ2-OX para mejor extravasar y colonizar un órgano distante no alcanzó significado, sugiriendo que los fuertes efectos observados de SYNJ2 y la metástasis local y distante son principalmente debido a la intravasación aumentada en vasos linfáticos y sanguíneos.
EJEMPLO 9 SYNJ2 SE ASOCIA CON TUMORES DE MAMA HUMANOS AGRESIVOS Para dirigir la relevancia de SYNJ2 al cáncer humano, se analizaron los niveles de transcripto de SYNJ2 en el panel NCI-60 de 60 lineas de cáncer humano. En línea con la contribución a los fenotipos motiles, se encontró que los altos niveles de transcripción de SYNJ2 se asocian con fenotipos mesenquimales. Enseguida, se inmunomancharon un conjunto de 331 muestras incrustadas en parafina de carcinomas de mama NJ2 (Figura 16A). De manera importante la intensidad de expresión de SYNJ2 se asoció positivamente con subtipos pronósticamente desfavorables definidos por la sobreexpresión de HER2 (p<0.001) y/o la carencia de receptor de estrógeno (p<0.001). Sin embargo, no se encontró asociación significativa entre la abundancia de SYNJ2 y la edad, subtipo histológico, estado de ganglios linfáticos axilar y grado de diferenciación. De manera interesante, los patrones de manchado para SYNJ2 también variaron; mientras que los tumores HER2+ exhibieron principalmente manchado membranal, los tumores negativos luminales y triples exhibieron manchado citoplasmático (Figura 16B) . Para sustentar los descubrimientos, los niveles de RNA de SYNJ2 se analizaron en dos grupos de especímenes de cáncer de mama y se encontró una asociación con las tasas de supervivencia de pacientes más cortas (Figura 16C) . Conjuntamente, estas observaciones sustentan el involucramiento de SYNJ2 en la progresión del cáncer de mama, pero dejan abierto el mecanismo detrás de la regulación hacia arriba del transcripto .
En resumen, las observaciones hechas en animales, junto con los datos clínicos y los experimentos in vitro, claramente indican que la desfosforilación de lipidos de inositol por SYNJ2 es critica para el proceso metastático, principalmente debido a las funciones cardinales desempeñadas por fosfoinositidas en el tráfico de moléculas de superficie de célula hacia y desde invadopodios y el borde de guia. Enseguida se presenta un modelo de trabajo (Figura 15) y discute las múltiples funciones de SYNJ2 en el contexto amplio de la progresión de tumor.
EJEMPLO 10 INHIBIDORES SELECTIVOS DE LA ACTIVIDAD DE 5' FOSFATASA DE SYNJ2 Con el fin de identificar inhibidores selectivos de la actividad de fosfatasa de SYNJ2, los presentes inventores utilizaron un ensayo competitivo de polarización de fluorescencia que depende del principio de que las moléculas están constantemente rotando y moviéndose en el espacio pero una vez enlazadas a otro elemento más grande (por ejemplo, una proteina) su movimiento es notablemente limitado. Estos cambios en el movimiento se pueden detectar y medir utilizando moléculas fluorescentes (es decir, sondas) que en el estado no enlazado dan origen a lecturas de polarización muy bajas, pero cuando un detector (por ejemplo, una proteina de enlace) que enlaza estas moléculas se adiciona a la solución, las moléculas fluorescentes se estabilizan en una composición confinada que incrementa las lecturas de polarización en la solución (ver Figura 17A).
En la clasificación preformada, los presentes inventores midieron la actividad enzimática de SYNJ2 para de-fosforilar la posición 5' de PI(3,4,5,)P3 para producir PI(3,4)P2, en la presencia de diferentes compuestos. Una vez que se completó/detuvo la reacción enzimática, la solución que contiene los productos PI(3,4)P2 se mezcló con una mezcla de proteina de enlace de PI(3,4)P2 (detector) y un PI(3,4)P2 fluorescente (sonda). La proteina detectora utilizada fue el dominio PH-purificada de Tappl que selectivamente enlaza PI(3,4)P2 (SEQ ID NO.: 15). Como es demostrado en la Figura 17B, los valores de polarización medidos en este ensayo disminuyeron a medida que las sondas fluorescentes PI(3,4)P2 enlazadas estuvieron siendo desplazadas por un IP(3,4)P2 no marcado, producido por la actividad enzimática de SYNJ2 y la cantidad de sonda fluorescente no enlazada en la solución incrementada.
La Tabla 2 enseguida representa los diversos compuestos identificados utilizando este método que fueron capaces de inhibir la producción de PI(3,4)P2 por SYNJ2.
Tabla 2: Inhibidores selectivos identificados de SY J2 DISCUSIÓN Las funciones de SYNJ2 como un regulador maestro integrativo de la migración de célula y metástasis de tumor se demuestran, probablemente debido a su habilidad para controlar los niveles de fosfolipidos PI que actúan tanto como segundos mensajeros y señales que determinan la identidad de subdominios de membrana específicos. Otra reflexión de la multiplicidad de la acción de SYNJ2 es la localización ventral principalmente bimodal a los invadopodios y lamelipodios. Por consiguiente, SYNJ2 forma complejos físicos con reguladores prominentes de la dinámica de actina (por ejemplo, Dinamina, Cortactina y Racl). Una clave para el entendimiento de la acción de SYNJ2 es la habilidad para controlar el tráfico endocitico. El empacado frecuente de porciones de la membrana de plasma en vesículas, que constantemente alimentan protuberancias a base de actina propulsa la migración de la célula (Ridlcy, 2011). SYNJ2 de lamelipodios exhibe dinamismo notable (Figura 3B) y la formación de imagen de células implica que el reclutamiento de SYNJ2 marca sitios de nueva formación de lamelipodios. Debido a que las moléculas SYNJ2 localizadas en el borde de guía dependen de Dinamina, Racl, polimerización de actina y colesterol, pero su distribución es distinta de aquella de Caveolina-1 y Clatrina, los presentes inventores suponen que estos representan una variante dependiente de Dinamina de los portadores independiente de clatrina (CLICs) que sostienen el giro de membrana en el borde de guía (Howes y colaboradores., 2010).
Una serie de estudios elegantes implicaron SYNJ1 en el recielado de vesículas sinápticas en las neuronas (Cremona y colaboradores., 1999). En ratones, la supresión de SYNJ1 causó la elevación de PI(4,5)P2 de estado permanente, la acumulación de vesículas recubiertas de clatrina y un retraso en la redisponibilidad de vesícula post-endocítica (Maní y colaboradores., 2007). Estas observaciones sugieren que la desfosforilacíón de PI(4,5)P2, que permitiría el cubrimiento de la cubierta de vesícula, implica el fenotipo. En analogía, las presentes células mamarias agotadas de SYNJ2 exhibieron acumulación intracelular de EGFR activo. El estado de ubicuitinación del receptor y los marcadores de la ruta endocítica indicaron que el tráfico es detenido en la clasificación de endosomas, donde los receptores internalizados son normalmente detenidos para ya sea recielado o degradación. Concebiblemente, el defecto es debido a una incapacidad para desensamblar proteínas de enlace de PI(4,5)P2 asociados con el recubrimiento de vesícula o con sus extremos de cometas de actina (Kaksonen y colaboradores., 2003). De esta manera, en similitud con los defectos en la transmisión sináptica observada en la ablación de SYNJ1, la pérdida de SYNJ2 deteriora severamente la migración e invasión de célula debido al tráfico detenido de moléculas de superficie esenciales para la motilidad.
La elevación observada de PI(3)P y PI(3,5)P2 (Figura 5C), reguladores de endosomas tempranos y tardíos, respectivamente, en células agotadas de SYNJ2 propone mecanismos de tráfico adicionales. Una función reguladora para PI(3,5)P2 se ha reforzado por la identificación de múltiples enlazadores, tales como integrinas y varias proteínas Rab (Catimel y colaboradores., 2008). PI(3)P se fosforila por PIKfyve, una 5-quinasa implicada en el ciclado entre endosomas y la red trans-Golgi, la ruta que suministra MTL-MMP a invadopodios (Poincloux y colaboradores., 2009). Por consiguiente, además de la desfosforilación de PI(4,5)P2, SYNJ2 probablemente procesa PI(3,5)P2 a un ajuste fino de la acumulación de PI(3)P a los endosomas tempranos y coordina tanto la exocitosis de MTL-MMP como el recielado de integrinas, asi como EGFR.
Cuando se introduce en animales, las células shSYNJ2 MDA-MB-231 severamente pierden el potencial metastático, debido a la habilidad reducida para alcanzar los ganglios linfáticos y los vasos sanguíneos (Figuras 13A-H). En un intento para integrar estos resultados y los fenotipos in vitro, resumidos en la Figura 15 están los mecanismos que implican las funciones de SYNJ2 en la motilidad celular. Por consiguiente, un evento clave abarca la regulación hacia arriba inducida por EGF de SYNJ2, y el agotamiento consecuente de tres fosfoinositidas: PI (4,5)P2, PI(3,4,5)P3 y PI(3,5)P2. La desfosforilación de PI(4,5)P2 mediada por SYNJ2 está en paralelo por la degradación de PI(4,5)P2 por fosfolipasa C-gamma y la fosforilación de PI3K, que genera PI(3,4,5)P3. Colectivamente, la estimulación de las tres enzimas por EGP disocia un grupo de enlazadores de PI(4,5)P2 de la membrana de plasma, y también genera vesículas endocitlcas libres de PI(4,5)P2. Concurrentemente, SYNJ2 convierte PI(3,4,5)P3 en PI(3,4)P2, que es esencial para la formación de invadopodios. En línea con este modelo, se ha reportado que PI3K es necesario para la formación de invadopodios. Una vez en el lugar, PI(3,4)P2 se enlaza TKS5 y nuclea un complejo de Dinamina y centrado de Cortactina que permite a la Cofilina generar extremos barbados de actina dentro de los invadopodios. De acuerdo con los presentes resultados, SYNJ2 está involucrado en las siguientes etapas de maduración de invadopodios, específicamente la secreción de MMPs y el suministro de MT1-MMP y otras moléculas de superficie, tal como CD44. De una manera similar, SYNJ2 controla el suministro de EGFR e integrina al borde de guia, y probablemente activa Cofilina, un evento de pivote evita la formación de protuberancias lamelipodiales.
En linea con la contribución de SYNJ2 a la migración de célula in vitro y la metástasis en animales, el presente estudio de especímenes de cáncer de mama observó regulación hacia arriba significativa de mRNA de SYNJ2 y niveles de proteína en subtipos agresivos de la enfermedad. Además, utilizando datos de los dos grupos, una asociación entre la expresión alta de mRNA de SYNJ2 y la supervivencia más corta de pacientes de cáncer de mama se observó.
En resumen, el presente estudio atribuye los eventos de iniciación de metástasis esenciales a la activación local inducida por EGF de PI3K y la regulación hacia arriba global de SYNJ2, cuya acción secuencial en PI(4,5)P2 regula la dinámica de actina en el borde de guía, así como genera PI(3,4)P2, la señal de invadopodios. Además, el presente estudio identificó varios compuestos que selectivamente inhibieron la generación de PI(3,4)P2 por SYNJ2.
Aunque la invención se ha descrito en conjunción con modalidades especificas de la misma, es evidente que muchas alternativas, modificaciones y variaciones serán evidentes para aquellos expertos en la téenica. Por consiguiente, se propone abarcar todas de tales alternativas, modificaciones y variaciones que se encuentran dentro del espíritu y alcance amplio de las reivindicaciones adjuntas.
Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente en su totalidad por referencia en la especificación, al mismo grado como si cada publicación, patente o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia. Además, la cita o identificación de cualquier referencia en esta solicitud no debe ser considerada como una admisión de que tal referencia está disponible como la técnica previa para la presente invención. Al grado que se utilizan encabezados de sección, no se deben considerar como necesariamente limitantes.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2), caracterizado porque es para el uso en la prevención de metástasis de tumor con la condición de que el tumor no sea glioma.
2. Un inhibidor de sinaptojanina 2 (SYNJ2) y un inhibidor de un receptor de superficie de célula, caracterizado porque está asociado con un inicio o progresión de cáncer para el uso en el tratamiento de cáncer.
3. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el receptor de superficie de célula asociado con el inicio o progresión de cáncer es una tirosina quinasa de receptor.
4. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la tirosina quinasa de receptor es un receptor de ErbB.
5. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el receptor ErbB es el Receptor de Factor de Crecimiento Epidérmico (EGFR).
6. Un método para identificar un inhibidor putativo de metástasis de tumor, el método caracterizado porque comprende analizar el procesamiento mediado por SYNJ2 de PI (3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia de un agente de prueba, en donde un procesamiento disminuido de PI(3,4,5)P3 a PI(3,4)P2 en la presencia del agente de prueba como se compara al mismo en su ausencia es indicativo de un inhibidor putativo de metástasis de tumor.
7. Un método in vitro para pronosticar cáncer en un sujeto en necesidad del mismo, el método caracterizado porque comprende determinar un nivel o actividad de SYNJ2 en una célula de cáncer del sujeto, en donde una regulación hacia arriba en el nivel de actividad del SYNJ2 en la célula de cáncer del sujeto comparado con el mismo en una célula de una muestra de control no afectada, es indicativa de una pobre prognosis.
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque además comprende aumentar la prognosis utilizando un método estándar Gold.
9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el método estándar Gold comprende la detección de un marcador.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el marcador se selecciona del grupo que consiste de HER-2 y receptor de estrógeno (ER).
11. El inhibidor para uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la metástasis es dependiente de EGF.
12. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 2 o el método de la reivindicación 7, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama.
13. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el inhibidor de SYNJ2 se selecciona del grupo que consiste de una molécula pequeña, un anticuerpo, un péptido y un agente de silenciamiento de ácido nucleico y opcionalmente, en donde la molécula pequeña se selecciona de las moléculas listadas en la Tabla 2.
14. Un articulo de manufactura para el tratamiento de cáncer o prevención de metástasis de cáncer, caracterizado porque comprende un material de empaquetamiento que empaqueta un inhibidor de SYNJ2 y un inhibidor de un receptor de superficie celular asociado con un inicio o progresión de cáncer.
15. Los inhibidores para uso de conformidad con la reivindicación 2 o el artículo de manufactura de la reivindicación 14, caracterizado porque el inhibidor del receptor de superficie celular asociado con el inicio o progresión de cáncer es un anticuerpo.
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